Αφηρημένο

Τα υψηλά επαναλαμβανόμενα ρετροστοιχείων Alu θεωρείται ως κέντρα μεθυλίωσης στο γονιδίωμα. Η μεθυλίωση των προαγωγέων του γονιδίου θα μπορούσε να εξαπλώνεται από αυτούς. Υποστηρικτής μεθυλίωση του

MLH1

συχνά ανιχνεύονται σε καρκίνους, αλλά ο υποκείμενος μηχανισμός δεν είναι σαφής. Ο στόχος αυτής της μελέτης είναι να κατανοήσουμε εάν η μεθυλίωση των στοιχείων Alu συνδέεται με μεθυλίωση προαγωγού στο γονίδιο MLH1. Bisulfite γονιδιωματική αλληλούχιση χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση των CpG θέσεων του 5 ‘άκρο (προαγωγός, εξόνιο 1 και Alu περιέχει εσώνιο 1) του

MLH1

γονιδίου σε καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα και τους ιστούς, και του γαστρικού καρκινικούς ιστούς. Υπομεθυλίωση στα στοιχεία Alu και υπερμεθυλίωση των υποκινητών και των περιοχών μεταξύ των υποκινητών και των στοιχείων Alu ανιχνεύθηκαν σε δύο καρκινικές κυτταρικές σειρές και επτά καρκινικούς ιστούς. Ωστόσο, απομεθυλίωση ή υπομεθυλίωση του υποκινητή MLH1 και περιοχές μεταξύ προαγωγού και των στοιχείων Alu, και υπερμεθυλίωση στα στοιχεία Alu, εντοπίστηκαν στους φυσιολογικούς ιστούς.

MLH1

μεθυλίωση του υποκινητή μπορεί να εξαπλωθεί από Alu στοιχεία που βρίσκονται στο ιντρόνιο 1 του

MLH1

γονίδιο. Η

trans-δρώντα

στοιχεία σύνδεσης προς τις θέσεις μετάλλαξη θα μπορούσε να παίξει ένα ρόλο στη μεθυλίωση εξάπλωση

Παράθεση:. Wang Χ, Fan J, Liu D, Fu S, Ingvarsson S, Τσεν H (2011) Διάδοση των Alu μεθυλίωσης στο Διοργανωτή του

MLH1

γονιδίων στον καρκίνο του γαστρεντερικού συστήματος. PLoS ONE 6 (10): e25913. doi: 10.1371 /journal.pone.0025913

Επιμέλεια: Alfons Navarro, Πανεπιστήμιο της Βαρκελώνης, Ισπανία

Ελήφθη: 14 Ιούλη του 2011? Αποδεκτές: 13 Σεπτέμβρη του 2011? Δημοσιεύθηκε: 12 Οκτωβρίου 2011

Copyright: © 2011 Wang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από την Huazhong Πανεπιστήμιο Επιστήμης και Τεχνολογίας (2010MS034). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

MLH1

είναι ένα σημαντικό γονίδιο επιδιόρθωσης αταίριαστων βάσεων η οποία παίζει ρόλο στη διατήρηση της σταθερότητας του γονιδιώματος.

MLH1

δυσλειτουργία μπορεί να προκαλέσει ένα υψηλό ποσοστό των μεταλλάξεων του γονιδίου στο γονιδίωμα. Ο υποστηρικτής μεθυλίωση του

MLH1

, ειδικά η περιοχή C (-310 έως -240 σε σχέση με το κωδικόνιο έναρξης) που περιέχει 8 θέσεις CpG, είναι ένα συχνό συμβάν σε καρκίνο, η οποία θα μπορούσε να οδηγήσει σε απώλεια του

MLH1

έκφρασης [1] – [3]. Μέχρι σήμερα, ο μηχανισμός του

MLH1

μεθυλίωση είναι ασαφής. προηγούμενες μελέτες μας έχουν δείξει ότι

MLH1

μεθυλίωση μπορεί να σχετίζεται με το

MLH1

-93SNP [4], [5]. Ωστόσο, η μοριακή βάση πίσω από αυτό είναι άγνωστη.

Alu είναι ένα από τα επαναλαμβανόμενα στοιχεία στο γονιδίωμα, το οποίο είναι υπερμεθυλιωμένο σε φυσιολογικά κύτταρα [6]. Οι Alu στοιχεία πιστεύεται ότι είναι κέντρα μεθυλίωση στο γονιδίωμα [7]. Στον καρκίνο, η μεθυλίωση προαγωγό γονιδίου μπορεί να εξαπλωθεί από γειτονικά επαναληπτικών στοιχείων [7]. Graff et al. [8] χαρτογραφηθεί τα μοτίβα μεθυλίωσης του

Ε-καδερίνης

και

νοη Hippel-Lindau

ογκοκατασταλτικών γονιδίων σε φυσιολογικά και νεοπλασματικά κύτταρα, και βρήκαν ότι υπάρχουν όρια μεταξύ των μη μεθυλιωμένων προαγωγούς και το κοντινό υπερμεθυλιωμένων Alu στοιχεία, για να διατηρηθεί η μη μεθυλιωμένη κατάσταση των προαγωγών σε φυσιολογικά κύτταρα, και ότι τα όρια μπορούν να υπερισχύει προοδευτικά με μεθυλίωση των στοιχείων Alu, καταλήγοντας σε μεθυλίωση προαγωγού σε νεοπλασία.

Τρία Alu στοιχεία έχουν ταυτοποιηθεί στο ιντρόνιο 1 του

MLH1

ψάχνοντας μια βάση δεδομένων της ανθρώπινης επαναληπτικών στοιχείων Alu (Εικ. 1). Δεν υπάρχουν στοιχεία Alu στο

MLH1

περιοχή του υποκινητή. Η κατάσταση μεθυλίωσης του κάθε τόπου CpG μέσα Alu στοιχεία του

MLH1

δεν έχει εντοπίσει. Είναι πιθανό ότι

MLH1

μεθυλίωση υποστηρικτής εμφανίζεται από κοντινά στοιχεία Alu. Για να ελεγχθεί αυτό, αναλύσαμε την κατάσταση μεθυλίωσης όλων των CpG θέσεων του

MLH1

5 ‘άκρο (περιοχή C που περιέχει υποκινητή, το εξώνιο 1 και πλειοψηφία του ενδονίου 1) (Εικ. 1) σε ορθοκολικό καρκίνο κύτταρα και ιστούς , γαστρικό καρκινικούς ιστούς και φυσιολογικούς ιστούς με χρήση θειώδους γονιδιωματικής αλληλουχίας, και διαπίστωσε ότι Alu στοιχεία στο ιντρόνιο 1 του

MLH1

είναι μεθυλιωμένος, και οι υποστηρικτές και οι περιοχές μεταξύ

MLH1

υποκινητές και τα στοιχεία Alu οι υπερμεθυλίωση σε καρκίνους. Ωστόσο, στους φυσιολογικούς ιστούς είναι Alu στοιχεία υπερμεθυλίωση, και οι υποστηρικτές και οι περιοχές μεταξύ των δικαιούχων και τα στοιχεία Alu δεν μεθυλιώνονται ή μεθυλιωμένος.

Υπάρχουν τρεις Alu στοιχεία στο ιντρόνιο 1, των οποίων τα μεγέθη και τις θέσεις φαίνονται από αριθμοί νουκλεοτιδίων. Τα σχετικά μεγέθη και τις θέσεις των 27 PCR αμπλικόνια απεικονίζεται από τολμηρές γραμμές, οι οποίες καλύπτουν μια περιοχή -339 έως 116 + 2876.

Η

Υλικά και Μέθοδοι

Δήλωση Ηθικής

η έρευνα αυτή έχει εγκριθεί από το διοικητικό συμβούλιο αναθεώρηση της Huazhong Πανεπιστήμιο Επιστήμης και Τεχνολογίας. Λάβαμε δείγματα ιστού με γραπτή εν επιγνώσει συναίνεση από τους συμμετέχοντες στη μελέτη. Η επιτροπή δεοντολογίας ενέκρινε ειδικά τις διαδικασίες.

Κανονική και τον καρκίνο δείγματα

Δύο καρκίνο του παχέος εντέρου κυτταρικές σειρές, RKO και SW48, με

MLH1

μεθυλίωση υποκινητή [2] παραγγέλθηκαν από η κινεζική Ακαδημία Επιστημών (Σαγκάη, Κίνα). Συνολικά 188 του παχέος εντέρου και του γαστρικού 27 καρκινικούς ιστούς με συμφωνημένα φυσιολογικό βλεννογόνο ελήφθησαν από Tongji νοσοκομείο (Wuhan, Κίνα). Το περιφερικό αίμα ενός υγιούς ατόμου ελήφθη επίσης από Tongji νοσοκομείο (Wuhan, Κίνα).

Κυτταρική καλλιέργεια και απομόνωση DNA

Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε ϋΜΕΜ συμπληρωμένο με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό στους 37 ° C με

2 ατμόσφαιρα 5% CO. DNA εκχυλίζεται από τα κύτταρα, τους ιστούς του καρκίνου, η κανονική βλεννογόνο και τα δείγματα αίματος χρησιμοποιώντας το κιτ απομόνωσης DNA (Sangon, Σαγκάη, Κίνα) και TIANamp γονιδιωματική κιτ DNA (Tiangen, Πεκίνο, Κίνα).

Χαρακτηρισμός των όγκων

Όλοι οι όγκοι αξιολογήθηκαν για μικροδορυφορική αστάθεια (MSI) χρησιμοποιώντας πέντε μικροδορυφόρων επαναλήψεις (BAT25, BAT26, D2S123, D5S346, και D17S250), όπως περιγράφηκε προηγουμένως [1]. Για τους θετικούς όγκους MSI, το εκχυλισμένο DNA μετετράπη χρησιμοποιώντας ΕΖ μεθυλίωσης του DNA Kit (Zymo Research Corporation, Orange, CA, USA).

MLH1

μεθυλίωσης σε κυτοσίνες σε -250 και -252 σε σχέση με το κωδικόνιο έναρξης εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας συνδυάστηκαν διθειώδους ανάλυση περιορισμού (COBRA) με BstUI [1].

Ανοσοϊστοχημική (IHC) χρώση

χρώση IHC για πρωτεΐνες MLH1 πραγματοποιήθηκε σε τομές 5 μm από εμπεδωθεί με παραφίνη όγκου και γειτονικό φυσιολογικό ιστό μπλοκ με αντίσωμα MLH1 (ab92312, Abcam, UK). Οι τομές αποπαραφινώθηκαν, επανυδατώθηκαν, και ξεπλένεται σε νερό της βρύσης πριν από ανάκτηση αντιγόνου με βρασμό σε 0,01 Μ κιτρικού ρυθμιστικού διαλύματος (ρΗ 6,0) δύο φορές για 5 λεπτά. Οι τομές επωάστηκαν με αντισώματα όλη τη νύχτα στους 4 ° C. χρώση IHC οπτικοποιήθηκε με τη χρήση του Strep ABC Complex /χρένο peroxidise (HPR). Οι όγκοι βαθμολογήθηκαν από την ένταση της χρώσης ως αρνητική, ασθενώς θετικά, μετρίως θετικά και ισχυρά θετικά.

Bisulfite γονιδιωματικής αλληλουχίας

Για δείγματα COBRA-θετικά, η κατάσταση μεθυλίωσης του

MLH1

5 ‘άκρο προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας διθειώδους γονιδιωματική αλληλούχιση. Συνολικά υπήρχαν 27 PCR αμπλικονίων σχεδιασμένο για να καλύψει την περιοχή από -339 έως 116, + 2876, σε σχέση με τη θέση έναρξης μετάφρασης (Εικ. 1). Οι εκκινητές που χρησιμοποιούνται δείχνονται στον Πίνακα S1. PCR πραγματοποιήθηκε στους 95 ° C για 5 λεπτά που ακολουθείται από 40 κύκλους των 95 ° C για 30 sec, 55-61 ° C για 45 δευτερόλεπτα και 72 ° C για 1 λεπτό με μια τελική επέκταση στους 72 ° C για 7 λεπτά. Μία θερμή εκκίνηση χρησιμοποιήθηκε με την προσθήκη του ενζύμου κατά τη διάρκεια του πρώτου κύκλου στους περίπου 72 ° C, μετά από ένα χρόνο προεπώασης 5 λεπτά στους 95 ° C. Τα προϊόντα PCR ελέγχθηκαν σε 2% πηκτή αγαρόζης και στη συνέχεια κλωνοποιήθηκε εντός του φορέα peasy-T1 (διαγονιδιακής Biotech, Beijing, Κίνα). Η αποικία PCR διεξήχθη για τη διαλογή των θετικών αποικιών. Οι κλώνοι με τα σωστά μεγέθη των προϊόντων PCR υποβλήθηκαν σε καθορισμό αλληλουχίας σε αλληλουχητή ΑΒΙ με τερματιστές χρωστικής (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Με τα αποτελέσματα αλληλουχίας των πέντε κλώνων, η συχνότητα μεθυλίωσης προσδιορίστηκε για κάθε θέση CpG.

Μετάλλαξη διαλογής

Το

MLH1

5 ‘άκρο για ανάλυση μεθυλίωσης προσδιορίστηκε η αλληλουχία χρησιμοποιώντας το αμετάτρεπτοι DNA από τα καρκινικά κύτταρα και τους ιστούς. Τα 10 ζεύγη εκκινητών που χρησιμοποιούνται φαίνονται στον Πίνακα 1. Η PCR εκτελέστηκε στους 95 ° C για 5 λεπτά που ακολουθείται από 35 κύκλους των 95 ° C για 30 sec, 58-66 ° C για 30 δευτερόλεπτα και 72 ° C για 1 λεπτό με μια τελική επέκταση στους 72 ° C για 7 λεπτά. Στη συνέχεια, τα προϊόντα της PCR άμεσα αλληλουχία χρησιμοποιώντας το sequencer ΑΒΙ.

Η

Αποτελέσματα

Προβολή του παχέος εντέρου και του γαστρικού ιστού καρκίνου δείγματα με MLH1 μεθυλίωση υποστηρικτής

Από το 188 παχέος εντέρου και 27 γαστρικό καρκινικούς ιστούς, 48 ορθοκολικό και 9 γαστρικός καρκίνος δείγματα βρέθηκαν να έχουν MSI θετικό φαινότυπο. Τα MSI θετικά δείγματα εξετάστηκαν στη συνέχεια για μεθυλίωση προαγωγού MLH1, και 4 του παχέος και 3 γαστρικός καρκίνος δείγματα εμφάνισαν μεθυλίωση MLH1 προαγωγό (Εικ. 2).

Οι τέσσερις ορθοκολικούς καρκίνους (C8T, C15T, C35T και C156T) και 3 γαστρικών καρκίνων (G9T, G19T και G24T) αναλύθηκαν. Σύμβολο «-». Σημαίνει ότι τα προϊόντα της PCR αφομοιώθηκαν χωρίς να

BstUI

, και «+» σημαίνει την πέψη με το

BstUI

Η

Σύλλογος MLH1 μεθυλίωσης και αρνητική ή ασθενής έκφραση του MLH1

οι επτά MLH1 δείγματα μεθυλίωση, μαζί με τα γειτονικά φυσιολογικούς ιστούς τους, αναλύθηκαν για την έκφραση MLH1 χρησιμοποιώντας χρώση IHC. Και οι επτά καρκινικών ιστών έδειξαν αρνητικά ή ασθενώς θετική έκφραση του MLH1, και των παρακείμενων φυσιολογικών ιστών τους είχαν ισχυρή έκφραση (Εικ. 3).

Α και Β αντιπροσωπεύουν μια ορθοκολικού όγκου (Τ) και το παρακείμενο φυσιολογικό ιστό (Ν ) αντίστοιχα? Γ και Δ εμφανίσει ένα γαστρικού όγκου (Τ) και το παρακείμενο φυσιολογικό ιστό (Ν). Α: αρνητική χρώση? C: ασθενής χρώση? Β και Δ:. Ισχυρή χρώση

Η

Σύγκριση των προτύπων μεθυλίωσης MLH1 μεταξύ κανονικών και καρκίνους

Ένα σύνολο των 93 CpG χώρων που βρίσκονται στην περιοχή αναλύονται μετρήθηκαν για την κατάσταση μεθυλίωσης χρήση θειώδους γονιδιωματικής αλληλουχίας (Εικ. 4). Οι δύο ορθοκολικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές, τέσσερις MSI positve παχέος καρκινικούς ιστούς, και τρία MSI θετικό γαστρικό καρκινικούς ιστούς έδειξαν διαφορετικά πρότυπα σε σχέση με τον αρνητικό ορθοκολικό ιστό MSI καρκίνο, την κανονική του παχέος εντέρου και του γαστρικού βλεννογόνου και του περιφερικού αίματος (Εικ. 5). Η MSI αρνητικό καρκίνο του παχέος εντέρου ιστού, η κανονική του παχέος εντέρου και του γαστρικού βλεννογόνου και του περιφερικού αίματος εμφανίζεται καμία μεθυλίωσης στο

MLH1

υποστηρικτής, και απομεθυλίωση ή υπομεθυλίωσης (λιγότερο από 50%) στις περιοχές μεταξύ φορέων και τα στοιχεία Alu, ενώ οι περιοχές εντός ή προς τα κάτω των στοιχείων Alu εκτίθενται υπερμεθυλίωση (πάνω από 50%). Αντίθετα, για τα καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα και ιστούς (MSI θετική) και το γαστρικό καρκινικούς ιστούς (MSI θετική), η

Οι MLH1

υποστηρικτές και οι περιοχές μεταξύ των δικαιούχων και τα στοιχεία Alu υπερμεθυλίωση, με εξαίρεση μια πολύ λίγοι sites μεθυλιωμένος CpG. Ωστόσο, οι περιοχές εντός ή προς τα κάτω του στοιχεία Alu έδειξαν ένα ορισμένο βαθμό υπομεθυλίωσης ή απομεθυλίωση σε σύγκριση με φυσιολογικούς ιστούς. Επιπλέον, η υπομεθυλίωση και απομεθυλίωση είχαν συχνότερα φαίνεται στα παχέος εντέρου και του γαστρικού καρκίνου ιστούς (MSI θετικό) σε σύγκριση με τα ορθοκολικό καρκίνο κύτταρα (Εικ. 5).

Οι θέσεις CpG υπογράμμισε. Οι κλώνοι 1, 3 και 4 εμφανίζονται μεθυλίωση, και οι κλώνοι 2 και 5 δεν μεθυλίωση. Η συχνότητα μεθυλίωση της θέσης CpG είναι 60%. WT, άγριου τύπου? CT, μετατροπή τύπου.

Η

Συνολικά 93 οι θέσεις CpG αναλύονται. Ωστόσο, 92 θέσεις CpG μπορεί να δει κανείς στην κανονική του παχέος βλεννογόνου, λόγω μιας μετάβασης από G σε Α σε μία θέση CpG μεταξύ Alus 1 και 2. •, ▴, ▪, □, △ και ○ αντιπροσωπεύουν συχνότητα μεθυλίωση του 100%, 80%, 60%, 40%, 20% και 0, αντίστοιχα. 80% υποδεικνύει ότι ένα από τα 5 κλώνους, 4 επέδειξαν μεθυλίωση σε μία θέση CpG. RKO και SW48: παχέος κύτταρα? C8T, C15T, C35T, C156T: MSI θετική παχέος ιστούς του καρκίνου? C161T: MSI καρκίνο του παχέος αρνητική? C161N: C161T συμφωνημένα φυσιολογικό ιστό? και G9T, G19T και G24T:. MSI θετική γαστρικών καρκίνων

Η

διαλογής μετάλλαξη στα καρκινικά κύτταρα και τους ιστούς

μεταλλάξεις στο

MLH1 5 ‘

τελειώσει για μεθυλίωση ανάλυση εξετάστηκαν στα 2 καρκινικά κύτταρα και 7 καρκινικούς ιστούς. Ένα ορθοκολικό και ένα γαστρικό καρκινικό ιστό βρέθηκαν να έχουν μεταλλάξεις σε σύγκριση με παρακείμενες φυσιολογικούς ιστούς τους (Εικ. 6). Μια παχέος εντέρου και ένα γαστρικό καρκίνο παρουσίασαν πανομοιότυπο ετερόζυγη μετάλλαξη, A → G, στον ίδιο χώρο, IVS1 681 bp. παρακείμενων φυσιολογικών ιστών τους δεν δείχνουν την μετάλλαξη, υποδεικνύοντας ότι είναι σωματικά και ογκο-ειδική.

Ένα ορθοκολικό και ένα γαστρικό καρκίνο, C15T και G19T, επέδειξε ένα πανομοιότυπο ετερόζυγη μετάλλαξη, Α → G, στο ίδιο ιστοσελίδα, IVS1 681 bp. παρακείμενων φυσιολογικών ιστών τους, C15N και G19N, δεν έδειξε την μετάλλαξη. Τα βέλη εμφανίζουν τις θέσεις των μεταλλάξεων.

Η

Συζήτηση

Τα μοτίβα μεθυλίωσης του Alu στοιχείων στο

MLH1

δεν έχουν προηγουμένως διερευνηθεί σε φυσιολογικούς ιστούς. Σε αυτή τη μελέτη, αναλύσαμε την κατάσταση μεθυλίωσης των CpG θέσεων εντός των τριών Alu στοιχεία που βρίσκονται στο ιντρόνιο 1 του

MLH1

, και βρέθηκε ότι και τα τρία στοιχεία Alu είναι σε επίπεδα του υπερμεθυλίωση σε φυσιολογικό ορθοκολικό και γαστρικό βλεννογόνο και περιφερικού αίματος (Εικ. 5). Είναι σύμφωνη με την προηγούμενη διαπίστωση ότι Alu στοιχεία είναι υπερμεθυλίωση στο κανονικό γαστρικό βλεννογόνο, τα επιθηλιακά του μαστού και του νεφρού ιστούς [6], [8]. Το MSI αρνητική ορθοκολικού όγκου εμφανίζεται πολύ παρόμοιο πρότυπο μεθυλίωσης στους φυσιολογικούς ιστούς (Σχ. 5). Κανονικά, η μεθυλίωση μέσα στα στοιχεία Alu δεν θα πρέπει να εξαπλωθεί στα παρακείμενα νησιά CpG λόγω απόφραξης από τα στοιχεία Sp1 [9], [10]. Εδώ προέκυψε ότι οι περιοχές ανάντη των στοιχείων Alu είναι μη μεθυλιωμένα ή μεθυλιωμένος εις την κανονική του παχέος εντέρου και του γαστρικού βλεννογόνου και του περιφερικού αίματος. Τα σαφή όρια δει μεταξύ υπερμεθυλιωμένων στοιχεία Alu και μεθυλιωμένος περιοχές πριν από αυτούς (Εικ. 5). Υπάρχουν αρκετές υπο-μεθυλιωμένα CpG θέσεις ανάντη των στοιχείων Alu στους φυσιολογικούς ιστούς, και αυτές οι τοποθεσίες CpG είναι έξω από την περιοχή C (Εικ. 5), προτείνοντας μια περιορισμένη εξάπλωση της Alu μεθυλίωσης σε φυσιολογικά κύτταρα. Μερικές περιοχές CpG γύρω ή μέσα στα στοιχεία Alu σε φυσιολογικούς ιστούς εμφανίζεται λιγότερο από 100% μεθυλίωση (Εικ. 5), γεγονός που υποδηλώνει ότι η μεθυλίωση των μεμονωμένων χώρων δεν είναι κλωνικά προέρχεται, ακόμη και αν το συνολικό πρότυπο μεθυλίωσης μεταδίδεται από κύτταρο σε κύτταρο. Σύμφωνα με αυτό, έχει δειχθεί ότι το γονίδιο φωσφοριβοσυλοτρανσφεράσης αδενίνης ποντίκι έχει προτύπων μεθυλίωσης που διαφέρουν μεταξύ των κυττάρων του ήπατος [10]. Ο μηχανισμός πίσω από αυτό θα μπορούσε να είναι ότι τα κέντρα μεθυλίωση των πανομοιότυπων γονιδίων σε διάφορα κύτταρα έχουν μεταβλητή δύναμη του σήματος που ταξιδεύουν προς τα πάνω ή προς τα κάτω [11].

Η διακοπή των στοιχείων Sp1 διευκολύνει

de novo

μεθυλίωση των γειτονικών χώρων CpG [9], [10], [12], και επάγει επιγενετικές γονίδιο αδρανοποίησης [12]. Προτείνεται ότι Alu στοιχεία είναι τα κέντρα μεθυλίωσης στο γονιδίωμα [8]. Τα μοτίβα μεθυλίωσης των στοιχείων Alu στο

MLH1

μετουσιωμένο καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα RKO και SW48 δεν έχουν μελετηθεί στο παρελθόν. RKO και SW48 έχουν βρεθεί να έχουν μεθυλίωση στο

MLH1

περιοχή υποκινητή, ιδιαίτερα στην περιοχή C (-310 έως -240 σε σχέση με το κωδικόνιο έναρξης), η οποία προκαλεί ελαττωμένη

MLH1

έκφραση [2]. Σε αυτή τη μελέτη αναλύονται επίσης μοτίβα μεθυλίωσης στο

MLH1

υποστηρικτές, οι τρεις Alu στοιχεία και οι περιοχές μεταξύ των δικαιούχων και τα στοιχεία Alu. Σε σύγκριση με την κανονική του παχέος εντέρου και του γαστρικού βλεννογόνου και του περιφερικού αίματος, τα στοιχεία έδειξαν Alu υπομεθυλίωση ειδικά σε Alus 2 και 3 και στις δύο RKO και SW48. Επιπλέον, η περιοχή κατάντι του Alu 3 έδειξε υπομεθυλίωση τόσο RKO και SW48 (Εικ. 5). Ωστόσο, οι υποστηρικτές και ιδιαίτερα οι περιοχές μεταξύ φορέων και στοιχεία Alu ήταν υπερμεθυλίωση στο RKO και SW48 (Εικ. 5). Αυτό υποδηλώνει σαφώς ότι η

MLH1

μεθυλίωση υποστηρικτής εξαπλώνεται από τα κέντρα μεθυλίωση στο ιντρόνιο 1 του

MLH1

.

Επειδή οι κυτταρικές σειρές καλλιεργήθηκαν καρκίνου θεωρείται ότι έχει υψηλότερο βαθμό μεθυλίωσης από πρωτογενείς όγκους [13], αποφασίσαμε να αναλύσει τις πρωτογενείς όγκους για MLH1 πρότυπο μεθυλίωσης στις ίδιες περιοχές όπως τις κυτταρικές γραμμές. Μια κάπως χαμηλότερο βαθμό μεθυλίωσης ανιχνεύθηκε στην περιοχή προαγωγού MLH1 στην 4 MSI θετική ορθοκολικού και 3 MSI θετική γαστρικών καρκίνων σε σύγκριση με τις δύο κυτταρικές σειρές (Εικ. 5). Ωστόσο, υπερμεθυλίωση υποστηρικτές, ιδιαίτερα στις περιοχές C, και οι περιοχές μεταξύ φορέων και τα στοιχεία Alu δει σε όλες τις επτά καρκίνους που αναλύθηκαν. Ορισμένες περιοχές μέσα και γύρω από τα στοιχεία Alu προφανώς μεθυλιωμένος στους ιστούς όγκων. Ως εκ τούτου, τα δεδομένα από τους ιστούς του καρκίνου υποδηλώνουν έντονα ότι η μεθυλίωση εξαπλώνεται από τα στοιχεία Alu με την 5 ‘περιοχή του MLH1 σε MSI θετικά παχέος εντέρου και του γαστρικού καρκινικούς ιστούς, καθώς επίσης και στις ορθοκολικό καρκίνο κυτταρικές γραμμές. Alu υπομεθυλίωση έχει εντοπισθεί σε γαστρικά καρκινώματα και κυτταρικές σειρές μελανώματος [6], [14]. Μια άλλη επαναλαμβανόμενη αλληλουχία, LINE-1, έδειξε επίσης υπομεθυλίωση σε κακοήθεις όγκους στρώματος του γαστρεντερικού σωλήνα [15]. Υπομεθυλίωση μπορεί να αυξήσει την κακοήθη δυναμικό των όγκων με την πρόκληση συσσώρευση των χρωμοσωμικών ανωμαλιών ή μεθυλίωση εξάπλωση των υποκινητών των γονιδίων καταστολής του όγκου. Έτσι, η μεθυλίωση των επαναλαμβανόμενων αλληλουχιών μπορεί να είναι ένας χρήσιμος δείκτης για την αξιολόγηση κακοήθεια.

Ένα στοιχείο Sp1 εντοπίστηκε σε -119 του

MLH1

περιοχή του υποκινητή χρησιμοποιώντας τη μεταγραφή λογισμικό αναζήτησης παράγοντα (TFSEARCH ver.1.3 ). Για να διαπιστωθεί αν υπάρχουν μεταλλάξεις στο στοιχείο Sp1, εμείς αλληλουχία ολόκληρη την περιοχή που αναλύθηκαν ανωτέρω στις καρκινικές κυτταρικές σειρές και ιστούς. Δεν μεταλλάξεις στο στοιχείο Sp1 εντοπίστηκαν, αλλά ένα MSI θετική παχέος εντέρου και ένα MSI θετικό καρκίνο του στομάχου έδειξε την μετάλλαξη A → G, στον ίδιο χώρο, IVS1 681 bp του γονιδίου MLH1. Αυτή η περιοχή είναι μεταξύ του υποκινητή και στοιχεία Alu. εύρημα μας δείχνει ότι η περιοχή είναι ένας μεταλλάξεων hotspot στην παθογένεση του παχέος εντέρου και του γαστρικού καρκίνου. Θεωρούμε ότι η

trans-δρώντα

στοιχεία δέσμευση σε αυτό το site, ή άλλους δικτυακούς τόπους που είναι μεταξύ του υποψηφίου και τα στοιχεία Alu, μπορούν να συμμετέχουν στη διάδοση από τα στοιχεία Alu στην περιοχή του υποκινητή της μεθυλίωσης. Ως εκ τούτου, όσοι

trans-δράσης

στοιχεία θα μπορούσαν να συμπεριφέρονται ως θεματοφύλακες των κέντρων μεθυλίωσης, π.χ. Alu στοιχεία. Περαιτέρω μελέτες απαιτούνται προκειμένου να ψάξετε για όσους

trans-δράσης

στοιχεία, τα οποία θα μπορούσαν να είναι οι θεραπευτικοί στόχοι των καρκίνων στο μέλλον.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Πίνακα S1.

Ολιγονουκλεοτιδικοί αλληλουχίες των εκκινητών για την ανάλυση μεθυλίωσης.

doi:. 10.1371 /journal.pone.0025913.s001

(DOC)

Ευχαριστίες

Σας ευχαριστούμε την Άννα Yates για κριτικά την αναθεώρηση του χειρογράφου