Αφηρημένο

Η δίκη EURTAC κατέδειξε ότι η κινάση της τυροσίνης αναστολέα (ΤΚΙ) erlotinib ήταν ανώτερη από τη χημειοθεραπεία ως θεραπεία πρώτης γραμμής για το προχωρημένο μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC) ότι το λιμάνι

EGFR

ενεργοποιώντας μεταλλάξεις σε ένα κυρίως Καυκάσιο πληθυσμό. Βασισμένο σε EURTAC και πολλές ασιατικές μελέτες, αντι-

EGFR

TKIs είναι πρότυπο φροντίδας για

EGFR

με θετικό στη μετάλλαξη NSCLC. Επιδιώξαμε να επικυρώσει μια ταχεία multiplex

EGFR

δοκιμή μετάλλαξης ως διαγνωστική δοκιμασία σύντροφος για την επιλογή ασθενών για τη θεραπεία αυτή. Δείγματα από τη δίκη EURTAC προοπτικά ελέγχονται για

EGFR

μεταλλάξεις χρησιμοποιώντας ένα συνδυασμό των εργαστηριακών ανεπτυγμένων εξετάσεις (LDTs), και εκ των υστέρων δοκιμή με το Cobas

EGFR

μετάλλαξη δοκιμή (

EGFR

PCR test). Η

EGFR

αποτελέσματα της δοκιμής PCR συγκρίθηκαν με τα αρχικά αποτελέσματα LDT και αλληλουχίας Sanger, χρησιμοποιώντας ένα υποσύνολο των δειγμάτων από ασθενείς ελέγχονται για τη δίκη. Υπολειμματική ιστού ήταν διαθέσιμο από 487 (47%) από τους 1044 ασθενείς ελέγχονται για τη δίκη. Η

EGFR

δοκιμή PCR έδειξε υψηλό συμφωνία με τα αποτελέσματα LDT με μια συνολική συμφωνία 96,3%. Η κλινική έκβαση των ασθενών που ήταν

EGFR

-mutation ανιχνεύονται από τη δοκιμή

EGFR

PCR ήταν πολύ παρόμοια σε όλη την ομάδα EURTAC. Η συμφωνία μεταξύ του

EGFR

δοκιμή PCR και αλληλούχιση Sanger ήταν 90,6%. Στο 78,9% των ασύμφωνα δείγματα, η

EGFR

αποτέλεσμα της δοκιμής PCR επιβεβαιώθηκε με μια ευαίσθητη δοκιμασία βαθιά αλληλουχίας. Η αναδρομική αυτή μελέτη αποδεικνύει την κλινική χρησιμότητα του

EGFR

PCR δοκιμασία στην ακριβή επιλογή των ασθενών για αντι-

EGFR

ΤΚΙ θεραπεία. Η

EGFR

δοκιμή PCR επέδειξε βελτιωμένη απόδοση σε σχέση με αλληλουχίας Sanger

Παράθεση:. Benlloch S, Μποτέρο ML, Beltran-Alamillo J, Mayo C, Gimenez-Capitán Α, de Aguirre I, et al. (2014) Κλινική επικύρωση μιας PCR δοκιμασίας για την ανίχνευση του

EGFR

Μεταλλάξεις σε μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα: Αναδρομική Δοκιμές Δείγματα από το EURTAC Trial. PLoS ONE 9 (2): e89518. doi: 10.1371 /journal.pone.0089518

Συντάκτης: John D. Minna, Πολυτεχνείου της Texas Southwestern Medical Center στο Ντάλας, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 23 του Ιούλη του 2013? Αποδεκτές: 21 Ιανουαρίου του 2014? Δημοσιεύθηκε: 25 Φεβρουαρίου, 2014

Copyright: © 2014 Benlloch et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη χρηματοδοτήθηκε από τη Roche. Οι χρηματοδότες συνέβαλαν στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή δεδομένων, την ανάλυση, η απόφαση για τη δημοσίευση και την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. BK, MS, WB, DC, GZ, JFP, LW είναι όλα τα τρέχοντα οι εργαζόμενοι της Roche . BK, DC, JFP και LW έχουν τις μετοχές στη Roche. BK και HJL είναι πρώην εργαζόμενοι της Roche και HJL έχει απόθεμα στο Roche και έχει υπηρετήσει ως σύμβουλος καταβληθεί. FS ήταν μια πληρωμένη σύμβουλος της Roche. SB, JBA, CM, AGC είναι εν ενεργεία υπαλλήλους της Πανγαία Biotech. MLB είναι ένας πρώην υπάλληλος Παγγαία. MT και SRyC έχουν τις μετοχές στην Παγγαία Biotech. IDA, CQ, JLR είναι εν ενεργεία υπαλλήλους της Ιατρικής Ογκολογίας Service-ICO, Νοσοκομείο Γερμανοί Trias i Pujol. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

Η αποτελεσματικότητα του πολλές νέες στοχευμένες θεραπείες του καρκίνου μπορεί να προβλεφθεί από την ανίχνευση ειδικών βιοδεικτών στον όγκο. Η FDA έχει δηλώσει ότι εάν η αναγνώριση ενός ειδικού βιοδείκτη απαιτείται για την ασφαλή και αποτελεσματική χορήγηση ενός φαρμάκου, ένα καλά επικυρωμένη εγκεκριμένο σύντροφος διαγνωστική δοκιμασία FDA απαιτείται για το εν λόγω φάρμακο. Η βέλτιστη διαδρομή έγκριση για μια νέα στοχευμένη θεραπεία και ο σύντροφός της διάγνωσης είναι μια παράλληλη διαδικασία κλινικής ανάπτυξης που περιλαμβάνει κλινικές δοκιμές για δοκιμαζόμενου παράγοντα, όπου ο διαγνωστικός έλεγχος για τα δοκιμαζόμενα χρησιμοποιείται είτε επιλέξτε ασθενείς για τις δοκιμές ή να προβλέψουν την ανταπόκριση στη θεραπεία, και άκρα ιδανικά με την έγκριση ταυτόχρονη υγειονομική αρχή του φαρμάκου και το διαγνωστικό τεστ. Επιτυχή παραδείγματα αυτού περιλαμβάνουν την από κοινού ανάπτυξη (και συν-έγκριση) της vemurafenib αναστολέα BRAF και δοκιμασία σύντροφος της διάγνωσης BRAF V600E μετάλλαξη για BRAF-μεταλλαγμένο μεταστατικό μελάνωμα [1], και το crizotinib αναστολέα ALK και το γονίδιο σύντηξης διαγνωστικές ALK σύντροφό του δοκιμή σε προχωρημένο ALK-σύντηξης θετικά μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC) ασθενείς. [2], [3], [4]

Ωστόσο, σε ορισμένες περιπτώσεις, η έξυπνη βιοδείκτες για μια στοχευμένη θεραπεία δεν αναγνωρίζονται μέχρι μετά το φάρμακο πρώτα εγκριθεί. Ως παράδειγμα, η αντι-

EGFR

cetuximab αντισώματος εγκρίθηκε για πρώτη φορά στις ΗΠΑ για τη θεραπεία του μεταστατικού καρκίνου του παχέος εντέρου κατά το 2004. Πολλές αναδρομικές και προοπτικές μελέτες στη συνέχεια αποκάλυψε ότι οι όγκοι φιλοξενούν

KRAS μεταλλάξεις

ήταν πολύ απίθανο να ανταποκριθεί στο cetuximab. Τον Ιούλιο του 2009, η FDA απαιτούνται αλλαγές στην επισήμανση για cetuximab και ένα άλλο αντι-

EGFR

panitumumab αντισωμάτων απαιτεί ότι οι ενδείξεις και τη χρήση κρατικών δεν υπήρχε το όφελος της θεραπείας με τα φάρμακα για τους ασθενείς των οποίων οι όγκοι είχαν

KRAS

μεταλλάξεις στο κωδικόνιο 12 ή 13, σε μια εποχή που δεν υπήρχαν FDA-εγκριθεί διαγνωστικές δοκιμασίες για

KRAS

μεταλλάξεις. [5] Μόνο αργότερα, τον Ιούλιο του 2012, έκανε μια

KRAS

δοκιμή μετάλλαξης να λάβει την έγκριση του FDA, με βάση τα αποτελέσματα της μια προοπτική τυχαιοποιημένη μελέτη, τονίζοντας τις προκλήσεις της εκ των υστέρων επικύρωση μιας διαγνωστικής δοκιμασίας σύντροφος αφού οι πιλοτικές δοκιμές του φαρμάκου έχει ολοκληρωθεί. [6]

Η αντι-

EGFR

ΤΚΙ erlotinib είχε αρχικά εγκριθεί για όλους τους ασθενείς με προχωρημένο ΜΜΚΠ που είχαν προχωρήσει σε χημειοθεραπεία πρώτης γραμμής. Μια σειρά από μεταγενέστερες μελέτες διαπίστωσε ότι οι ασθενείς με

EGFR

μεταλλαγμένου NSCLC είχε μεγάλη πιθανότητα να ανταποκριθούν σε αυτές ΤΚΙ, οδηγώντας σε δοκιμές στη ρύθμιση πρώτης γραμμής για

EGFR

μεταλλαγμένου καρκίνο. [7], [8], [9], [10], [11], [12], [13] Τέσσερις προοπτικές τυχαιοποιημένες κλινικές δοκιμές μελετηθεί σε ασιατικούς πληθυσμούς έδειξαν ότι erlotinib και gefitinib οδήγησε σε βελτιωμένη επιβίωση χωρίς εξέλιξη σε σύγκριση με το χημειοθεραπεία για τη θεραπεία πρώτης γραμμής σε ασθενείς με NSCLC με

EGFR

μεταλλάξεις. [7], [8], [9], [13] Άλλες κλινικές μελέτες σε μικτές ομάδες εθνικότητα έχουν συνάψει με παρόμοια αποτελέσματα. [10], [12]

Η EURTAC δίκη ήταν μια τυχαιοποιημένη κλινική μελέτη φάσης 3 για την αξιολόγηση της ασφάλειας και της αποτελεσματικότητας της erlotinib σε σύγκριση με το πρότυπο με βάση την πλατίνα χημειοθεραπεία για τη θεραπεία πρώτης γραμμής του πληθυσμού των ασθενών με προχωρημένο

EGFR

-mutation ανιχνεύεται NSCLC σε μεγάλο βαθμό Καυκάσιος πληθυσμός των ευρωπαίων ασθενών. ασθενείς erlotinib-θεραπεία παρουσίασαν σημαντική βελτίωση στη διάμεση PFS (9,7 μήνες έναντι 5,2 μηνών) σε σύγκριση με τη χημειοθεραπεία. Οι ασθενείς που ήταν στο σκέλος της erlotinib είχε επίσης ένα σημαντικά υψηλότερο ποσοστό των απαντήσεων (58% έναντι 15%) στον πληθυσμό με πρόθεση για θεραπεία. [11] Αυτή η δίκη έχει υποβληθεί για πρώτη ένδειξη γραμμή της erlotinib στο

EGFR

μεταλλαγμένα ασθενείς με NSCLC.

Η πλειοψηφία των ενεργοποίηση

οι EGFR

μεταλλάξεις που βρίσκονται στα εξώνια 19 (45%) και 21 (40-45%). [14], [15], [16], [17], [18], [19], [20] Κατευθυντήριες γραμμές από οργανισμούς όπως ASCO, CAP /ΑΜΡ, και NCCN συνιστούν τη χρήση των αντι

EGFR

TKIs ως πρώτης γραμμής θεραπεία σε ασθενείς με

EGFR

μεταλλαγμένου προχωρημένο NSCLC με βάση τα αποτελέσματα αυτών των πιλοτικές κλινικές μελέτες. [21], [22], [23] Οι πρόσφατες συστάσεις από CAP /IASLC /AMP συμβουλεύει την ταυτοποίηση των μεταλλάξεων του EGFR παρόν σε & gt? Εκ των οποίων το 1% εξόνιο 19 διαγραφές και ένα λογαριασμό εξόνιο 21 μετάλλαξη (L858R) για περισσότερο από το 90% όλων των μεταλλάξεων. [24] Καμία από τις κατευθυντήριες γραμμές που καθορίζει τη μέθοδο δοκιμής που πρέπει να χρησιμοποιείται, ωστόσο οι Cobas

EGFR

δοκιμή μετάλλαξης είναι CE-IVD εγκριθεί και είναι πρόσφατα εγκεκριμένο από τον FDA. [25]

Εδώ παρουσιάζουμε την αναδρομική ανάλυση μιας κλινικής μελέτης επικύρωσης του

EGFR

PCR δοκιμασία σε ένα υποσύνολο των δειγμάτων καρκίνου του πνεύμονα από ασθενείς ελέγχονται για τη δίκη EURTAC. Η

EGFR

δοκιμή PCR επέδειξε βελτιωμένη ροή του δείγματος σε σχέση με τις LDTs ​​που χρησιμοποιούνται στη δοκιμή EURTAC, επιτρέποντας

EGFR

διαλογής μετάλλαξη σε ένα μόνο προσδιορισμό με ένα χρόνο μιας ημέρας σειρά-γύρω. Η

EGFR

δοκιμή PCR έδειξε ανώτερη ευαισθησία και ειδικότητα σε σύγκριση με τα συμβατικά αλληλουχίας Sanger.

Μέθοδοι

Οι βασικοί στόχοι της μελέτης ήταν 1) να συσχετιστούν οι κλινικές εκβάσεις (PFS, BORR ) από την υποομάδα των διαθέσιμων δειγμάτων που ελέγχθηκαν από το

EGFR

δοκιμή PCR με τα αποτελέσματα από το σύνολο του πληθυσμού EURTAC, και 2) να συγκρίνουν την αναλυτική απόδοση του

EGFR

PCR δοκιμασία με εκείνη του η αρχική LDT και αλληλουχίας Sanger, χρησιμοποιώντας μαζικά παράλληλα Pyrosequencing (MPP) για την επίλυση διαφορών που παρατηρούνται μεταξύ των άλλων 3 μεθόδους δοκιμών.

στη δοκιμή EURTAC, 1.044 ασθενείς από τα νοσοκομεία στη Γαλλία, την Ιταλία, την Ισπανία και εξετάστηκαν χρησιμοποιώντας το LDT. Για τη μελέτη αυτή, όλα τα δείγματα που αναλύθηκαν υπό αναδρομικά IRB έγκριση από τον Κοπέρνικο IRB (00001313). Site specific IRB έγκριση από κάθε κλινικό χώρο και γραπτή συγκατάθεση από όλους τους ασθενείς είχε χορηγηθεί πριν από τη φάση τη διεξαγωγή της μελέτης της NCT00446225. [11], [26] Σε 487 περιπτώσεις, υπολειμματική δείγματα ήταν διαθέσιμα για επανεξέταση με την

EGFR

δοκιμή PCR (Σχήμα 1). Μια ενιαία ενότητα 5 μm με τουλάχιστον 10% περιεκτικότητα σε όγκο από κάθε ένα από τα 487 δείγματα που χρησιμοποιήθηκαν για το

EGFR

PCR δοκιμασία. Γονιδιακού DNA από τα υπάρχοντα έκλουσμα, ή προέρχονται από πρόσθετες ενότητες δοκιμάστηκε σε αλληλουχίας Sanger και MPP. Ο Πίνακας 1 παραθέτει τα δημογραφικά στοιχεία των ασθενών ελέγχονται για τη δίκη EURTAC από το LDT, υπο-κατηγοριοποιούνται από τους ασθενείς ελέγχονται ή δεν έχουν δοκιμαστεί από τη δοκιμή

EGFR

PCR. επιλεγμένους ασθενείς που συμμετείχαν στη μελέτη EURTAC χρησιμοποιούσαν μια εργαστηριακή δοκιμή ανεπτυγμένες, επικυρωμένη από το Εργαστήριο Ογκολογίας (ICO-Νοσοκομείο Γερμανοί Trias i Pujol, Μπανταλόνα, Ισπανία) που αποτελείται από τρεις μεθόδους. [26] Σε αυτή τη μελέτη, ένα ενιαίο PCR- με βάση δοκιμασία για την ανίχνευση

χρησιμοποιήθηκε EGFR

μεταλλάξεις. Οι λεπτομέρειες της αναλυτικής απόδοσης αυτής της ανάλυσης έχουν περιγραφεί προηγουμένως [27]

δείγματα Ε1:. μπλοκ όγκου δεν είναι διαθέσιμο για ανάλυση. Ε2 δείγματα: υλικό όγκου ανεπαρκής για την ανάλυση. LDT = εργαστηριακή δοκιμή ανεπτυγμένες.

Η

Στατιστικές εκτιμήσεις

Μετάλλαξη Εντοπίστηκε (MD) ορίστηκε ως η παρουσία είτε ένα εξώνιο 19 διαγραφή ή μετάλλαξη L858R. Μετάλλαξη δεν Εντοπίστηκε (MND) ορίστηκε ως η απουσία των δύο εξόνιο 19 διαγραφές και την μετάλλαξη L858R. λογισμικού SAS /STAT® χρησιμοποιήθηκε για όλες τις αναλύσεις των δεδομένων.

στατιστικές κλινική μελέτη έκβασης

Οι καμπύλες επιβίωσης Kaplan-Meier χρησιμοποιήθηκαν για την αξιολόγηση της PFS με τη μέθοδο της θεραπείας (χημειοθεραπεία ή ερλοτινίμπη) μεταξύ των ασθενών που εγγράφηκαν στη δοκιμή EURTAC και διαλογή με το LDT καθώς και το υποσύνολο των ασθενών που προσδιορίσθηκαν να είναι μετάλλαξη-θετικά με τη δοκιμασία

EGFR

PCR. Μη παραμετρική δοκιμασία log-rank διεξήχθη για να εκτιμήσει PFS μεταξύ των ασθενών που τυχαιοποιήθηκαν σε χημειοθεραπεία ή erlotinib. Η αναλογία κινδύνου (χημειοθεραπεία εναντίον erlotinib) σε σχέση με το PFS υπολογίστηκε επίσης. Καλύτερη συνολική ανταπόκριση ήταν η καλύτερη απάντηση που καταγράφονται από την έναρξη της θεραπείας μέχρι την εξέλιξη της νόσου και BORR (Best συνολικό ποσοστό ανταπόκρισης) συνοψίζεται με όρια εμπιστοσύνης 95% σύμφωνα με τις μεθόδους Pearson-Clopper με βάση την εκτίμηση ερευνητές για κάθε σκέλος θεραπείας.

στατιστικά στοιχεία αναλυτική απόδοση

Για την αναλυτική απόδοση, μια ανάλυση συμφωνία έγινε μεταξύ του

EGFR

PCR αποτέλεσμα της δοκιμής και της δοκιμής LDT. ανίχνευση μεταλλάξεων του εξόνιο 19 διαγραφές και μεταλλάξεις L858R αναλύθηκαν στο σύνολό τους. Ξεχωριστά, το

EGFR

δοκιμή PCR συγκρίθηκε επίσης με αλληλουχίας Sanger και MPP με CLIA-πιστοποιημένο εργαστήριο. Για τις αναλύσεις η συμφωνία, υπολογίστηκαν η θετική ποσοστιαία συμφωνία (ΟΛΠ), αρνητικό ποσοστό συμφωνίας (NPA), και το συνολικό ποσοστό συμφωνίας (OPA) με τα αντίστοιχα διαστήματα εμπιστοσύνης 95% (ΠΙ). Επιπλέον, 3-way αναλύσεις χρησιμοποιώντας MPP και μια δεύτερη μέθοδος αναφοράς έγινε για να επιλύσετε τα αποτελέσματα ασυμφωνίας.

μεθόδων δοκιμών Μετάλλαξη

EGFR PCR Test.

Το

EGFR

PCR δοκιμασία (Cobas

EGFR Mutation Test

, Roche Molecular Systems, Inc, Branchburg, NJ, USA) είναι ένας CE-IVD σήμανση multiplex αλληλόμορφο-ειδική δοκιμασία που βασίζεται στην PCR έχουν σχεδιαστεί για την ανίχνευση 41 μεταλλάξεων στα εξόνια 18, 19, 20, και 21 σε FFPET δείγματα ανθρώπινης NSCLC. [28] το DNA απομονώθηκε χρησιμοποιώντας το Cobas DNA Kit Παρασκευή δείγματος (Roche Molecular Systems, Branchburg, NJ). [29] Ένα ελάχιστο 150 ng γενωμικού DNA είναι απαραίτητη για την ενίσχυση PCR, το οποίο μπορεί τυπικά να απομονωθεί από ένα μόνο τμήμα FFPET 5 μm. Η

EGFR

έκδοση λογισμικού δοκιμή PCR χρησιμοποιείται στην παρούσα μελέτη σχεδιάστηκε για να ανιχνεύσει 29 διαγραφές στο εξόνιο 19 και 2 παραλλαγές L858R στο εξόνιο 21. Macrodissection συνιστάται μόνο αν το περιεχόμενό του όγκου είναι μικρότερη από το 10%? σύλληψη λέιζερ μικροδιατομής δεν απαιτείται. Η

EGFR

PCR δοκιμασία εκτελέστηκε ανά ένθετο της συσκευασίας του κατασκευαστή και τα αποτελέσματα αυτόματα αναλυθούν και να αναφέρεται. Το όριο ανίχνευσης έχει επικυρωθεί έως 5% μεταλλαγμένα αλληλόμορφα. Η ροή εργασίας από την απομόνωση DNA για αναφορά αποτελεσμάτων μπορεί να πραγματοποιηθεί σε περίοδο ενός 8 ώρες. [27]

LDT.

Οι ασθενείς στη μελέτη EURTAC σαρώθηκαν χρησιμοποιώντας ένα συνδυασμό των μεθόδων που αναπτύχθηκαν από Εργαστήριο Ογκολογίας, ICO-Νοσοκομείο Γερμανοί Trias i Pujol, Βαρκελώνη, Ισπανία. [11] Εν ολίγοις, EGFR ενεργοποίηση μεταλλάξεων στα εξόνια 19 και 21 είχαν αρχικά προσδιοριστεί με προσδιορισμό της αλληλουχίας Sanger και επιβεβαιώθηκε με ανάλυση μήκους θραύσματος για το εξόνιο 19 διαγραφές (FAM σημασμένο εκκινητή σε ένα ΑΒΙ PRISM 3130 αναλυτή DNA (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) και με δοκιμασία Taqman για εξόνιο 21 (L858R) μετάλλαξης. Όλα τα δείγματα όγκων ήταν από την αρχική βιοψία λαμβάνεται πριν από κάθε επεξεργασία και πριν από την τυχαιοποίηση. οι εξετάσεις πραγματοποιήθηκαν σε ≥ 2 χιλιοστά

2 του ιστού που ελήφθη από ένα έως τρία slides τομών ιστού 4-micron που υποβλήθηκαν σε σύλληψη λέιζερ μικροδιατομής να εμπλουτίσει για την παρουσία καρκινικών κυττάρων. DNA εκχυλίζεται χρησιμοποιώντας ένα πρότυπο εργαστηριακό πρωτόκολλο και δοκιμάστηκαν σε ένα μόνο χώρο στην Ισπανία Εργαστήριο Ογκολογίας για

EGFR

ενεργοποίηση μεταλλάξεων στο εξόνιο 19 και 21 χρησιμοποιώντας μία προηγουμένως περιγραφείσα μέθοδο. Ο μέσος χρόνος ολοκλήρωσης ήταν περίπου 5 ημέρες. [26]

Bi-directional αλληλουχίας Sanger.

Όλα τα δείγματα που ελέγχθηκαν από το

EGFR

δοκιμή PCR ελέγχθηκαν επίσης με ανάλυση της αλληλουχίας Sanger χρησιμοποιώντας DNA από FFPET δείγματα που παρασκευάζονται από το cobas DNA Kit Προετοιμασία των δειγμάτων και η αλληλουχία με 2 × αμφίδρομη αλληλουχίας Sanger με CLIA-πιστοποιημένο εργαστήριο (SeqWright, Houston, TX, USA) χρησιμοποιώντας ένα επικυρωμένο πρωτόκολλο. Επαναλάβετε αλληλούχιση Sanger εκτελέστηκε για να συγκριθεί η ανίχνευση του

EGFR

μεταλλάξεων από γειτονικά τμήματα του ιστού για την ελαχιστοποίηση τυχόν επιπτώσεις της ετερογένειας ιστού που χρησιμοποιούνται για την

EGFR

PCR δοκιμασία σε σχέση με τα αρχικά αποτελέσματα LDT. Επίσης, τα πρωτόκολλα αλληλουχίας ποικίλουν από εργαστήριο όσον αφορά το ποσοστό του όγκου του περιεχομένου /δείγμα που απαιτεί macrodissection. DNA που απομονώθηκε με την cobas DNA Kit Προετοιμασία δειγμάτων και χρησιμοποιούνται για αλληλούχιση απαιτείται ≥10% περιεκτικότητα σε όγκο. Μέσος χρόνος ολοκλήρωσης με τα αποτελέσματα ήταν 7 ημέρες. Το εκτιμώμενο όριο ανίχνευσης είναι περίπου 20% μεταλλαγμένα αλληλόμορφα. [30]

μαζικά παράλληλη Pyrosequencing (MPP).

Τα δείγματα με έγκυρη

EGFR αποτελέσματα των δοκιμών

PCR με επαρκή DNA απομένει από την αρχική εξαγωγή ελέγχθηκαν με μέθοδο MPP (454 GS τιτάνιο, 454 Life Sciences, Branford, CT, USA) με CLIA-πιστοποιημένο εργαστήριο (SeqWright, Houston, TX, USA) χρησιμοποιώντας ένα επικυρωμένο πρωτόκολλο. [31] Αυτή η μέθοδος είναι μια διαδικασία 5-7 την ημέρα που περιλαμβάνει την παραγωγή αμπλικονίου, συγκέντρωση, απολίνωση, γαλάκτωμα PCR, ενίσχυση και μαζικά παράλληλη Pyrosequencing με χειροκίνητη ανάλυση δεδομένων. Το εκτιμώμενο όριο ανίχνευσης για την δοκιμασία είναι 1,25% μεταλλαγμένα αλληλόμορφα. [27] Η μέθοδος MPP χρησιμοποιήθηκε για να καταδείξει την εκτέλεση της δοκιμής EGFR PCR σε μια πιο ευαίσθητη μέθοδος και ως μεσολαβητής για αποκλίνοντος περιπτώσεις παρατηρήθηκαν μεταξύ του LDT ή επανάληψης Sanger προσδιορισμού αλληλουχίας. Προκειμένου να διαφυλαχθεί η ιδιωτική ζωή του ασθενούς που σχετίζεται με δοκιμαστεί κλινικά δείγματα, τα αποτελέσματα αλληλουχίας των πρώτων MPP ήταν ανώνυμες και παρουσιάζονται στον Πίνακα S1.

Αποτελέσματα

Δείγμα δημογραφικά

487 (47%) από 1.044 δείγματα ελέγχονται για τη δίκη EURTAC χρησιμοποιώντας LDTs ​​ήταν διαθέσιμα για τη δοκιμή χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία

EGFR

PCR. Η ροή των δειγμάτων μέσω της μελέτης παρουσιάζεται στην Εικόνα 1. δημογραφικά στοιχεία των ασθενών και τα αρχικά χαρακτηριστικά του όγκου για όλους τους ασθενείς με κατάσταση LDT φαίνονται στον Πίνακα 1. Δεν υπήρχαν σημαντικές διαφορές μεταξύ των υποσυνόλων των ασθενών εξετάστηκαν και οι ασθενείς δεν δοκιμάζονται από την

δοκιμή EGFR

PCR (p & gt? 0,05) για κάθε κατάσταση LDT (μετάλλαξη ανιχνεύτηκε, μετάλλαξη δεν ανιχνεύονται) με την εξαίρεση της χώρας της κλινικής εξέτασης

τα κλινικά αποτελέσματα για τους ασθενείς με βάση τα αποτελέσματα των δοκιμών EGFR PCR.

από τους 174 ασθενείς που συμμετείχαν στην EURTAC δίκη, δείγματα από 134 (77%) ασθενείς ήταν διαθέσιμοι για τη δοκιμή χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία

EGFR

PCR. Εξαιρουμένων 11 ασθενείς με μη έγκυρο

EGFR

αποτελέσματα της δοκιμής PCR και 7 ασθενείς με αποτέλεσμα

EGFR

μετάλλαξη δεν ανιχνεύθηκε, συνολικά 116 (67%) των ασθενών ανιχνεύθηκαν μετάλλαξη από το

EGFR

PCR δοκιμασία και αξιολογήθηκαν ως προς την ανάλυση της κλινικής έκβασης (57 ασθενείς στο σκέλος χημειοθεραπείας και 59 στο σκέλος erlotinib). Τα κλινικά αποτελέσματα (PFS, BORR, και OS) παρουσιάζονται στον Πίνακα 2. Μεταξύ

EGFR

PCR δοκιμασία θετικούς ασθενείς, που έλαβαν αγωγή με erlotinib είχαν σημαντικά παρατεταμένη PFS σε σύγκριση με ασθενείς που έλαβαν θεραπεία με χημειοθεραπεία (p-value & lt ? 0,0001, δοκιμασία log-rank)? η διάμεση PFS ήταν 10,4 μήνες (95% CI: 8,0 έως 13,8 μήνες) και 5.4 μήνες (95% CI: 04.04 – 06.08 μήνες) για τους ασθενείς που έλαβαν θεραπεία με ερλοτινίμπη ή χημειοθεραπεία, αντίστοιχα (Σχήμα 2). Η ΥΕ με βάση το μοντέλο αναλογικού κινδύνου του Cox μειώθηκε κατά 66% (HR 0,34? [95% CI: 0,21 – 0,54]) για τους ασθενείς στην erlotinib έναντι χημειοθεραπείας βραχίονα. Ένα χρόνο μετά την τυχαιοποίηση, ένα υψηλότερο ποσοστό των ασθενών στην erlotinib σε σύγκριση με τον βραχίονα χημειοθεραπεία ήταν ελεύθερη συμβαμάτων (45% [95% CI: 32% έως 59% έναντι 6% [95% CI: 0% έως 15%], αντίστοιχα)

η

BORR ήταν υψηλότερη σε ασθενείς στο σκέλος erlotinib (59,3% [95% CI: 45,7% έως 71,9%].) σε σύγκριση με το σκέλος χημειοθεραπείας (14,0% [95% CI: 6,3% έως 25,8%]). Οι ασθενείς στο σκέλος της erlotinib ήταν πολύ πιο πιθανό να ανταποκριθούν στη θεραπεία από τους ασθενείς στο σκέλος χημειοθεραπείας (αναλογία πιθανοτήτων 8,93, [95% CI: 3,59 – 22,19])

Δεν υπήρχε σημαντική διαφορά στο OS μεταξύ. τα σκέλη θεραπείας (25,8 μήνες στο σκέλος erlotinib (95% CI: 16,1 – 30,0) και 20,8 μήνες στο σκέλος χημειοθεραπεία (95% CI: 17,3 – 29,4) (p-value δοκιμασία log-rank = 0,5381))

PFS, BORR και OS αποτελέσματα για

EGFR

δοκιμή PCR θετικούς ασθενείς δεν διέφεραν σημαντικά από εκείνα που λαμβάνονται σε όλους τους ασθενείς που συμμετείχαν στη μελέτη EURTAC γεγονός που υποδηλώνει ότι το

EGFR

PCR δοκιμασία θετικούς ασθενείς είναι αντιπροσωπευτικά του συνόλου EURTAC εγγεγραμμένοι ασθενείς.

Για τις 7 περιπτώσεις όπου η

EGFR

PCR αποτέλεσμα της δοκιμής ήταν μετάλλαξη δεν ανιχνεύθηκε και ασύμφωνα με το LDT, δύο υποθέσεις επιλύονται υπέρ της LDT από MPP, τρεις περιπτώσεις επιλυθεί υπέρ του

EGFR

δοκιμή PCR και ένα δείγμα ήταν έγκυρη για δύο Sanger και MPP και το άλλο ήταν σε συμφωνία μεταξύ του

EGFR

PCR δοκιμασία και Sanger αλλά όχι MPP (Πίνακας S2). Anecdotally, 6 από τους 7 ασθενείς υποβλήθηκαν σε θεραπεία με erlotinib και μόνο ένας ασθενής πέτυχε μεγαλύτερη ή ίση προς το διάμεσο PFS βασίζεται στην LDT ή τη δοκιμή

EGFR

PCR.

σύγκριση δοκιμής EGFR PCR και τα αποτελέσματα LDT

Μεταξύ 432 δείγματα με έγκυρα αποτελέσματα τόσο από το

EGFR

δοκιμή PCR και LDT, ΟΛΠ, NPA και OPA ήταν 94,2% (146/155, CI: 89,3%, 96,9 %), 97,5% (270/277, CI: 94,9%, 98,8%) και 96,3% (416/432, CI: 94,1%, 97,7%), αντίστοιχα (Πίνακας 3). Έτσι υπήρξε μια υψηλή αντιστοιχία μεταξύ της αρχικής LDT και

EGFR αποτελέσματα των δοκιμών

PCR. Μεταξύ των δέκα έξι δείγματα με αντικρουόμενα αποτελέσματα, οι

EGFR

αποτέλεσμα της δοκιμής PCR επιβεβαιώθηκε από MPP σε 68,8% (11/16) περιπτώσεις (Πίνακας S3).

Η

Σύγκριση του EGFR PCR αποτελέσματα των δοκιμών με Sanger αλληλουχίας

από 487 δείγματα εξετάστηκαν χρησιμοποιώντας το

EGFR

PCR δοκιμασία και αλληλουχίας Sanger, 406 έδωσαν έγκυρα αποτελέσματα με τις δύο μεθόδους (38 ήταν άκυρα και από τις δύο μεθόδους, πέντε ήταν άκυρο από

EGFR

δοκιμή PCR και 38 άκυρα αλληλουχίας Sanger). Ο ΟΛΠ, NPA και OPA για

EGFR

δοκιμή PCR σε σύγκριση με αλληλουχίας Sanger ήταν 96,6% (112/116, CI: 91,7%, 98,7%), 88,3% (256/290, CI: 84,1%, 91,5 %) και 90,6% (368/406, CI: 87,4%, 93,1%? Πίνακας 4), αντίστοιχα. Μεταξύ 38 αντικρουόμενα αποτελέσματα μεταξύ των

EGFR

δοκιμή PCR και αλληλούχιση Sanger, MPP συμφώνησε με την

EGFR

PCR αποτέλεσμα της δοκιμής σε 30 (78,9%) περιπτώσεις (Πίνακας S4). αλληλουχίας Sanger ανιχνεύεται ένα L858R δεν ανιχνεύονται από MPP και απέτυχε να ανιχνεύσει 22 εξόνιο 19 διαγραφές και 7 μεταλλάξεις L858R επιβεβαιώνεται από MPP. Τέσσερις αποτελέσματα MPP ήταν άκυρες, και τα υπόλοιπα τέσσερα αποτελέσματα που συμφωνήθηκε με Sanger. Το φάσμα των εκατό μεταλλαγμένα αλληλόμορφα των περιπτώσεων έχασε από Sanger ήταν 3% έως 60%, με αρκετά δείγματα (n = 16) κάτω από το εκτιμώμενο όριο ανίχνευσης για Sanger.

Η

Συζήτηση

Αυτή η μελέτη υποστηρίζει τη σκοπιμότητα της εκτέλεσης μιας αναδρομική κλινική επικύρωση ενός διαγνωστικό τεστ από τους υποψήφιους, θεραπευτικές κλινικές δοκιμές. Η

EGFR

αποτελέσματα της δοκιμής PCR ήταν πολύ συγκλίνουσες (& gt? 96%) με τα αποτελέσματα LDT χρησιμοποιείται για την επιλογή των ασθενών για τη δίκη EURTAC. Κατά συνέπεια, PFS και BORR του υποσυνόλου των ασθενών με

EGFR

μεταλλάξεις που ανιχνεύονται με το

EGFR

PCR δοκιμασία ήταν συγκρίσιμη με την πλήρη ομάδα των ασθενών που συμμετείχαν στη μελέτη EURTAC, την επικύρωση έτσι η χρήση της δοκιμής

EGFR

PCR για την επιλογή ασθενών για θεραπεία με αντι

EGFR

TKIs όπως erlotinib. Η διάμεση επιβίωση PFS ήταν 9,7 έναντι 10,4 μήνες για την ομάδα erlotinib και 5,2 έναντι 5,4 μηνών για τους LDTs ​​και

EGFR

PCR δοκιμασία, αντίστοιχα. Η BORR ήταν 58% έναντι 59,3% μηνών για την ομάδα erlotinib και 15% έναντι 14,0% για τους LDTs ​​και

δοκιμαστική EGFR

PCR, αντίστοιχα. Μεταξύ των 16 ασύμφωνα δείγματα μεταξύ του

EGFR

δοκιμή PCR και LDTs, μια τρίτη μέθοδο δοκιμής μετάλλαξη που συμφωνήθηκε με το

EGFR

PCR αποτέλεσμα της δοκιμής σε 11 περιπτώσεις. Επτά περιπτώσεις που εντοπίστηκαν μετάλλαξη από το

δοκιμαστική EGFR

PCR και μετάλλαξη δεν ανιχνεύονται από το LDT, 5 επιβεβαιώθηκαν από MPP. Αυτοί οι ασθενείς θα μπορούσαν να έχουν δυνητικά επωφεληθεί από αντι-

EGFR

ΤΚΙ θεραπεία. Η

EGFR

δοκιμή PCR είχε μια σειρά από τεχνικά πλεονεκτήματα σε σχέση με την LDT που χρησιμοποιείται στη δοκιμή EURTAC. Η απαιτούμενη LDT λέιζερ σύλληψη μικροδιατομής των πολλαπλών τομών ιστού και να συμμετέχουν 3 ξεχωριστές δοκιμασίες με διάμεσο χρόνο ολοκλήρωσης των 4,5 ημερών. Συγκριτικά ο

EGFR

δοκιμή PCR απαιτούνται macrodissection μόνο αν η περιεκτικότητα του όγκου ήταν & lt? 10% και μπορεί να γίνει σε μία ημέρα, χρησιμοποιώντας ένα μόνο τμήμα 5 μm. Επιπλέον, η

EGFR

δοκιμή PCR είναι ένα εμπορικά διαθέσιμο προσδιορισμό kit-based που παρέχει μια αυτοματοποιημένη αποτέλεσμα, αντί για μια χειροκίνητη διαδικασία υπόκειται σε ερμηνεία και η οποία μπορεί να πραγματοποιηθεί με οποιοδήποτε πιστοποιημένο κλινικό εργαστήριο.

περισσότερο από το 80% των δειγμάτων εξετάστηκαν σε αυτή τη μελέτη ήταν μικρά δείγματα βιοψίας. Το συνολικό ποσοστό μη έγκυρων για αλληλουχίας Sanger ήταν 15,6% (76/487) σε σύγκριση με το

EGFR

PCR δοκιμασία σε 9% (43/487). Ωστόσο, η μη έγκυρη τιμή για το υποσύνολο των δειγμάτων προερχομένων από εκτομή δείγματα ήταν 0% (0/109) πιθανόν λόγω της επαρκούς διαθεσιμότητας των ιστών. Έτσι, η δοκιμασία είναι εξαιρετικά ισχυρή όταν εκτελείται σε εκτομή δειγμάτων όγκου και έχει ποσοστό επιτυχίας 90% περίπου επί δειγμάτων βιοψίας, τα οποία είναι συχνά η μόνη δείγμα όγκου διαθέσιμα για τη δοκιμή σε NSCLC.

αλληλούχισης Sanger έχει χρησιμοποιηθεί ευρέως για την ανιχνεύουν

EGFR

μεταλλάξεις. [30], [32] Παρόμοια με τα συνολικά άκυρη τιμές, για το 134

EGFR

μετάλλαξη που εντοπίστηκαν δείγματα LDT που συμμετείχαν στη μελέτη EURTAC, αλληλουχίας Sanger είχαν υψηλότερο άκυρο ποσοστό (15,7%) σε σύγκριση με 8,2% για τη δοκιμή

EGFR

PCR. Υπήρχαν επίσης 30 μετάλλαξη δεν ανιχνεύθηκε αποτελέσματα για αλληλούχιση Sanger (22,4%) και 7 μετάλλαξη δεν ανιχνεύθηκε αποτελέσματα για το

EGFR

δοκιμή PCR (5,2%). Με 21 άκυρα αποτελέσματα και 30 μετάλλαξη δεν ανιχνεύθηκε αποτελέσματα, αλληλουχίας Sanger θα έχουν ταξινομηθεί εσφαλμένα το 38% των ασθενών που εντάχθηκαν στη μελέτη EURTAC. Παρόμοιες άκυρο ποσοστά έχουν αναφερθεί σε τρεις άλλες μελέτες, υποδεικνύοντας ότι αυτή η μεθοδολογία έχει περιορισμούς όταν εφαρμόζονται σε DNA από δείγματα FFPET. [33], [34], [35] Επιπλέον, ο προσδιορισμός αλληλουχίας Sanger έδειξε μικρή ευαισθησία σε δείγματα που περιέχουν λιγότερο από 20-25% μεταλλαγμένα αλληλόμορφα. [35], [36], [37] Όταν συγκρίναμε τη συμφωνία μεταξύ έγκυρα αποτελέσματα για το

EGFR

δοκιμή PCR με αλληλουχίας Sanger (n = 406), υπήρχαν 38 ασύμφωνα περιπτώσεις εκ των οποίων 30 είχαν επιβεβαιωθεί από MPP. Είκοσι-εννέα από τις 30 περιπτώσεις που είχαν ως αποτέλεσμα μετάλλαξη ανιχνεύτηκε κατάσταση από το

EGFR

PCR δοκιμασία και θα κάνουν αυτοί οι ασθενείς που είναι επιλέξιμες για αντι-

EGFR

θεραπεία. Κακή ευαισθησία της αλληλουχίας Sanger εξηγεί έτσι τη σχετικά χαμηλή NPA σε σύγκριση με το

EGFR

δοκιμή PCR που παρατηρήθηκαν σε αυτή τη μελέτη.

Με δεδομένη την κρισιμότητα της

EGFR

δοκιμές μετάλλαξης στην επιλογή ειδικών θεραπειών για καρκίνους απειλητικές για τη ζωή, όπως προχωρημένο NSCLC, στιβαρό και ακριβές δοκιμασίες με την ταχεία χρόνο ολοκλήρωσης προτιμώνται. Πρόσφατες μελέτες διασφάλισης ποιότητας για να διαπιστώσει την κατάσταση μετάλλαξης ενός τυποποιημένου πίνακα των όγκων έχουν δείξει ότι διάφορα κλινικά εργαστήρια δεν εντοπίζουν σωστά την κατάσταση της μετάλλαξης του 100% των μελών της ομάδας, ακόμα και όταν χρησιμοποιείτε τα ίδια ή παρόμοια μεθόδων δοκιμών. [38 ], [39] για τις δοκιμασίες που περιλαμβάνουν την ανάλυση μετάλλαξη δείγματα όγκων, σημαντικοί παράγοντες που συμβάλλουν στην απόδοση της ανάλυσης περιλαμβάνουν αναλυτικά την τυποποίηση, την επικύρωση των αντιδραστηρίων και τη μεθοδολογία, εργαστηριακή εμπειρία, και την κατάλληλη συμμετοχή της παθολόγος.

Συμπερασματικά, τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης δείχνουν ότι οι cobas

EGFR

δοκιμή μετάλλαξης είναι ένα ιδιαίτερα ανθεκτικό και εξαιρετικά ακριβή διαγνωστική δοκιμασία σύντροφος για την επιλογή ασθενών για θεραπεία με αντι-

EGFR

θεραπείες, όπως η ερλοτινίμπη.

Υποστήριξη Πληροφορίες

πίνακα S1.

Εισαγωγή MPP Αποτέλεσμα

doi:. 10.1371 /journal.pone.0089518.s001

(PDF)

Πίνακας S2.

Αποτέλεσμα από δείγματα αντιφατικά μεταξύ του cobas EGFR δοκιμή PCR και LDT που συμμετείχαν στην κλινική δοκιμή (Cobas MND /LDT MD)

doi:. 10.1371 /journal.pone.0089518.s002

(PDF)

Πίνακας S3.

αποτελέσματα συμφωνία μεταξύ ασύμφωνα δοκιμές EGFR PCR και LDT

doi:. 10.1371 /journal.pone.0089518.s003

(PDF)

Πίνακας S4.

MPP προκύπτει από την ανάλυση ανάλυση των δειγμάτων ασύμφωνα μεταξύ δοκιμών EGFR PCR και αλληλούχιση Sanger

doi:. 10.1371 /journal.pone.0089518.s004

(PDF)

Ευχαριστίες

θα θέλαμε να αναγνωρίσουμε Patrick O’Donnell και Karen Yu για τη συμβολή τους σε αυτή τη μελέτη.