Αφηρημένο

Τα microRNAs (miRNAs) είναι μικρά μη-κωδικοποίησης RNA με ρυθμιστικό ρόλο, τα οποία εμπλέκονται σε ένα ευρύ φάσμα των φυσιολογικών και παθολογικών διαδικασιών, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου. Μια κοινή στρατηγική για την αναγνώριση του miRNAs εμπλέκονται στον μετασχηματισμό κυττάρου είναι να συγκρίνει τα κακοήθη κύτταρα σε φυσιολογικά κύτταρα. Εδώ έχουμε επικεντρωθεί στην αναγνώριση των miRNAs που ρυθμίζουν την επιθετική φαινοτύπου των κυττάρων μελανώματος. Για να αποφευχθούν οι διαφορές οφείλονται σε γενετικό υπόβαθρο, μια συγκριτική υψηλής απόδοσης miRNA προφίλ διεξήχθη σε δύο ισογονιδιακές ανθρώπινες κυτταρικές σειρές μελανώματος που εμφανίζουν σημαντικές διαφορές σε καθαρό πολλαπλασιασμό, την εισβολή και το σχηματισμό σωλήνα δραστηριότητές τους. Αυτή η εξέταση αποκάλυψε δύο μεγάλες ομάδες των διαφορικά εκφρασμένων miRNAs. Έχουμε σκεφτεί ότι miRNAs πάνω ρυθμισμένα με την πιο επιθετική κυτταρική γραμμή συμβάλει ογκογόνο χαρακτηριστικά, ενώ τα κάτω ρυθμισμένα miRNAs είναι κατασταλτικές όγκου. Αυτή η υπόθεση εξετάστηκε περαιτέρω πειραματικά σε πέντε miRNAs κατασταλτική υποψήφιος όγκου (MIR-31, -34a, -184, -185 και -204) και σχετικά με μία υποψήφια ογκογόνο miRNA (MIR-17-5p), όλα εκ των οποίων δεν έχουν ποτέ αναφερθεί πριν το δερματικό μελάνωμα. Αξίζει να σημειωθεί ότι, όλες οι υποψήφιες Κατασταλτικός-miRNAs ανέστειλε καθαρό πολλαπλασιασμό, εισβολή ή σωλήνα σχηματισμό, ενώ miR-17-5p ενισχυμένο πολλαπλασιασμό των κυττάρων. miR-34a και miR-185 περαιτέρω δειχθεί να αναστέλλουν την ανάπτυξη ξενομοσχευμάτων μελανώματος όταν εμφυτεύονται σε ποντίκια SCID-NOD. Τέλος, όλοι οι έξι υποψήφιες miRNAs εντοπίστηκαν σε 15 διαφορετικές μεταστατικό μελάνωμα δείγματα, που βεβαιώνουν για την φυσιολογική σημασία των ευρημάτων μας. Συλλογικά, τα ευρήματα αυτά μπορεί να αποδειχθεί καθοριστική για την κατανόηση των μηχανισμών της νόσου και για την ανάπτυξη νέων θεραπευτικών και στάσης τεχνολογίες για το μελάνωμα

Παράθεση:. Greenberg E, Hershkovitz L, Itzhaki O, Χατζμπού S, Nemlich Υ, Ortenberg R, et al. (2011) Ο κανονισμός του Καρκίνου Επιθετική χαρακτηριστικά γνωρίσματα σε μελάνωμα κύτταρα από Τα microRNAs. PLoS ONE 6 (4): e18936. doi: 10.1371 /journal.pone.0018936

Επιμέλεια: Donald Gullberg, Πανεπιστήμιο του Μπέργκεν, Νορβηγία

Ελήφθη: έκτης Δεκέμβρη του 2010? Αποδεκτές: 13 του Μαρτίου 2011? Δημοσιεύθηκε: 25 Απριλίου 2011

Copyright: © 2011 Greenberg et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Gal Markel υποστηρίζεται από το Ίδρυμα Recanati Ιατρικής Έρευνας (# 6713). Noam Shomron υποστηρίζεται από επικεφαλής επιστήμονας του Κράτους, Υπουργείο Υγείας, το Ισραήλ (# 3 με 4.876)? Το Ίδρυμα Kurz-Lion? Το Πανεπιστήμιο του Τελ Αβίβ, Ιατρική Σχολή, Schreiber Ίδρυμα? και το Φιλανθρωπικό Ταμείο Wolfson Οικογένεια. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

το μελάνωμα, μια επιθετική κακοήθεια που προκύπτουν από μελανοκύτταρα, είναι ένας από τους κύριους απειλητικών για τη ζωή κακοήθειες της εποχής μας. Ενώ αντιπροσωπεύει σχεδόν το 4% όλων των καρκίνων του δέρματος, προκαλεί το 75% των θανάτων από καρκίνο του δέρματος που σχετίζονται με όλο τον κόσμο και θεωρείται ότι είναι η πιο κοινή κακοήθεια μοιραία των νεαρών ενηλίκων [1]. Ο μετασχηματισμός και η ανάπτυξη της μετάστασης απαιτεί σταδιακή απόκτηση των επιθετικών χαρακτηριστικών. Αυτά περιλαμβάνουν, για παράδειγμα, ανεξέλεγκτη ανάπτυξη, αντοχή σε απόπτωση, κινητικότητα, πρωτεολυτική ικανότητα και την πρόσφυση (που επισκοπείται στο [2], [3]). Επιπλέον, πλαστικότητα των κυττάρων μελανώματος είναι εμφανής από την ικανότητά τους να σχηματίζουν δομών τύπου σωλήνα [4]. Αυτά τα λειτουργικά αγγειακές δομές που μοιάζουν αποτελούνται από καρκινικά κύτταρα [5] και η παρουσία τους σχετίζεται με κακή πρόγνωση [6], [7]. Πρόσφατη εξέλιξη της στοχευμένη θεραπεία για το μελάνωμα τονίζει τη σημασία της μοριακής οριοθέτηση των υποκείμενων μηχανισμών παθογένεσης [8].

Τα microRNAs (miRNAs) είναι μικρά, μη-κωδικοποίησης, 19-22 νουκλεοτιδίων μόρια μακράς RNA, τα οποία λειτουργούν ως ειδικά επιγενετική ρυθμιστές της γονιδιακής έκφρασης μέσω της αναστολής της μετάφρασης πρωτεϊνών, οδηγώντας σε υποβάθμιση mRNA, ή και τα δύο [9], [10]. Μετά την επεξεργασία από τον διακριτικό μεταγραφές φουρκέτα τους και φορτώνονται σε πρωτεΐνη Argonaute του συγκροτήματος φίμωση, το ζευγάρι miRNAs με κυτταροπλασματικό mRNA για να κατευθύνουν μετα-μεταγραφικό καταστολή. Η «σπόροι» περιοχή, η οποία βρίσκεται μεταξύ των νουκλεοτιδίων 2 έως 8 της ώριμης miRNA, συνδέεται με συμπληρωματικές περιοχές σε μη-μεταφρασμένη περιοχή 3 ‘(3’-UTR) του mRNA στόχου. Μέχρι σήμερα, κοντά στα 1.000 ανθρώπινα miRNAs έχουν ταυτοποιηθεί [11], τα οποία πιστεύεται ότι ρυθμίζουν σε περισσότερο από το 50% των ανθρώπινων γονιδίων [12].

miRNAs εμπλέκονται στη ρύθμιση πολλών βιολογικών διαδικασιών, όπως η εμβρυϊκή ανάπτυξη, η διαφοροποίηση των κυττάρων, του κυτταρικού κύκλου, απόπτωση και την αγγειογένεση (που επισκοπείται στο [13]). Είναι, επίσης, εμπλέκονται άμεσα στην ανάπτυξη καρκίνου, εξέλιξη και μετάσταση

in-vitro

,

in-vivo

και αναφέρεται ακόμη και σε ασθενείς [10], [14]. Σε ορισμένες περιπτώσεις, ο καρκίνος διευκολύνεται από την απώλεια ορισμένων miRNAs, όπως miR-15/16 σύμπλεγμα σε χρόνια λεμφοκυτταρική λευχαιμία [15], miR-34a στους ραγοειδείς μελάνωμα [16] και miR-31 στο μεσοθηλίωμα [17]. Η απώλεια αυτών των miRNAs ενισχύει διεισδυτικότητα, τη μετανάστευση και τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων. Σε άλλες περιπτώσεις, ο καρκίνος διευκολύνεται από την υπερ-έκφραση άλλων miRNAs, όπως miR-17-92 σύμπλεγμα [13], [18], η οποία προωθεί τη μετανάστευση και την εισβολή σε διάφορες κακοήθειες.

Επί του παρόντος, μας γνώσεων σχετικά με τους ρόλους των miRNAs στην ανάπτυξη του μελανώματος και την εξέλιξη εξακολουθεί να είναι περιορισμένη. Πρόσφατα, αρκετές συγκριτικές miRNA προφίλ μελέτες των φυσιολογικών μελανοκυττάρων και των κυττάρων μελανώματος αποκάλυψε: 1) Ομάδες miRNAs που σχετίζεται με κακοήθη μετασχηματισμό, την εξέλιξη και μεταστατικό δυναμικό [19]? 2) Ειδικά προφίλ έκφρασης που σχετίζεται με κατάστασης μεταλλάξεων και την επιβίωση [20]? 3) Διαφορικές miRNA μοτίβα σε μελάνωμα νεαρούς ενήλικες και ενήλικες μεγαλύτερης ηλικίας [21]? και 4) Πρόβλεψη της επιβίωσης μετά την επανάληψη [22]. Όμως καμία από αυτές τις μελέτες περιγράφονται miRNAs που καθορίζουν άμεσα επιθετικό χαρακτηριστικά του δερματικού μελανώματος, όπως η ενισχυμένη πολλαπλασιασμό, κινητικότητα και εισβολή. Λίγοι ανασταλτική miRNAs εντοπίστηκαν στο μελάνωμα, συμπεριλαμβανομένων των miR-34a (ραγοειδές μελάνωμα) [16], miR-193b [23], αφήστε-7α [24], και miR-211 [25], [26], ενώ miR-182 [27] και miR-221/222 [28] έδειξαν να διεγείρουν μεταστατικό δυναμικό των κυττάρων μελανώματος. Λαμβάνοντας υπόψη την κριτική αξιολόγηση των επιθετικών έναντι μη επιθετικό μελάνωμα, και το δυναμικό των θεραπευτικών, θεωρούμε επιτακτική ανάγκη να μάθουν τα μοριακά γεγονότα του επιθετικού μελανώματος.

Εδώ θα επικεντρωθεί στην αναγνώριση υψηλής απόδοσης των miRNAs που εμπλέκονται άμεσα στον καθορισμό της επιθετικής φαινοτύπου των κυττάρων μελανώματος. Δύο ισογονιδιακό μελανώματος κυτταρικές σειρές με ένα διαφορετικό επιθετικό μοτίβο, τα εξαιρετικά επιθετική κύτταρα C8161 και τα ελάχιστα επιθετική κύτταρα c81-61, υποβλήθηκαν σε διαφορική σάρωση υψηλής απόδοσης των miRNAs. Υποθέσαμε ότι λόγω της ισογονιδιακών υπόβαθρο των κυττάρων, τα διαφορικά εκφραζόμενα ομάδες miRNA θα εμπλουτισθεί για miRNAs με άμεση επίδραση στην επιθετική χαρακτηριστικά μελανώματος. Πράγματι, παρέχουμε πειραματικά στοιχεία

in-vitro

,

in-vivo

και σε κλινικά δείγματα μελανώματος που προηγουμένως γνωστό όγκο κατασταλτική και miRNAs όγκο προώθηση ταιριάζει αυτή την υπόθεση. Αξιοσημείωτα, περιγράφουμε νέες miRNAs με λίγες πληροφορίες σχετικά με το ρόλο τους στον καρκίνο, όπως miR-185. Οι επιστημονικοί και μεταφραστική επιπτώσεις αυτής της μελέτης συζητήθηκαν.

Αποτελέσματα

Διαφορικές επιθετικότητας του μελανώματος ισογονιδιακές κυτταρικές σειρές

Η ιδιαίτερα επιθετική (ΣΟΕ) C8161 και κακώς επιθετικό (ΠΣΟ) c81-61 δερματικό κυτταρικές σειρές μελανώματος προήλθαν από διαφορετικές μεταστάσεις από τον ίδιο ασθενή [29]. Η διαφορική επιθετική φαινότυπος των κυττάρων HAG και PAG επιβεβαιώθηκε με τέσσερις διαφορετικές λειτουργικές δοκιμασίες: πολλαπλασιασμός, εισβολή μέσω Matrigel, σχηματισμός σωλήνα σε Matrigel και σχηματισμό όγκων σε ποντίκια ξενομοσχευμένων. Πράγματι, τα κύτταρα HAG εμφανίζονται σημαντικά υψηλότερες ικανότητες πολλαπλασιασμό, την εισβολή και ο σχηματισμός σωλήνα

in-vitro

, από PAG κύτταρα (Σχήμα 1, A-C). Επιπλέον, υποδόρια ένεση 1 × 10

6 HAG κύτταρα σχημάτισαν όγκους σε ποντίκια SCID-NOD εντός πέντε ημερών μετά την ένεση, με μέσο μέγεθος ξενομοσχεύματος 780 mm

3 με την ημέρα 30. Σε αντίθεση, η έγχυση 1 × 10

6 ΠΣΟ κύτταρα δεν αναπτύσσονται σε μετρήσιμους όγκους εντός 30 ημερών (Σχήμα 1D). Μικρούς όγκους PAG (-200 mm

3) παρατηρήθηκαν & gt? 90 ημέρες μετά την ένεση των κυττάρων PAG (τα δεδομένα δεν φαίνονται)

(Α) Πολλαπλασιασμός προσδιορίστηκε με τυποποιημένες ΧΤΤ χρωματομετρική δοκιμασία 24 ώρες μετά την σπορά. . Ο αριθμός των κυττάρων HAG προσδιορίστηκε ως 100%. Το σχήμα δείχνει ένα αντιπροσωπευτικό πείραμα από τα τρία που εκτελούνται? (Β) Το ποσοστό των κυττάρων που εισβάλλουν δοκιμάστηκαν σε προσδιορισμό Matrigel εισβολή 20 ώρες. Τα αποτελέσματα διορθώθηκαν για ρυθμό πολλαπλασιασμού. Το σχήμα δείχνει ένα αντιπροσωπευτικό πείραμα από τα τρία που εκτελούνται? (C) κύτταρα ή κύτταρα HAG PAG ελέγχθηκαν για δραστικότητα σχηματισμού σωλήνα. Αντιπροσωπευτικές μικροφωτογραφίες ολόκληρο πεδίο φαίνεται από ένα αντιπροσωπευτικό πείραμα, από τα τρία που εκτελούνται? (Δ) Οι μέσες μάζες όγκου που σχηματίζεται σε ποντίκια SCID-NOD 30 ημέρες μετά την ένεση του 1 × 10

6 κύτταρα των κυτταρικών σειρών ΣΟΕ ή PAG. Κάθε ομάδα περιελάμβανε τουλάχιστον έξι ποντίκια.

Η

Διαφορικές προφίλ έκφρασης των miRNAs μεταξύ ΣΟΕ και τα κύτταρα ΠΣΟ

Η αξιοσημείωτη διαφορά φαινοτυπική μεταξύ των δύο ισογονιδιακές σειρές μελανώματος περιελάμβανε την πλατφόρμα για τη μελέτη επιγενετική ρύθμιση της επιθετικής χαρακτηριστικά από miRNAs. Μια συγκριτική υψηλής απόδοσης χαρακτηριστικών των miRNAs έγινε. Είναι σημαντικό, ένα σύνολο από 81 miRNAs εκφράστηκαν σε υψηλότερα επίπεδα στο ΣΟΕ σε σύγκριση με τα PAG κύτταρα (ΣΟΕ

υψηλή). Ένα άλλο σύνολο των 69 miRNAs εκφράστηκε σε χαμηλότερα επίπεδα στο ΣΟΕ σε σύγκριση με τα PAG κύτταρα (ΣΟΕ

χαμηλή). Μια ομάδα 48 miRNAs από τις 81 ΣΟΕ

υψηλή miRNAs δεν εκφράζεται σε όλα τα κύτταρα PAG (Εικόνα 2Α), ενώ το 56 miRNAs από τις 69 ΣΟΕ

χαμηλή miRNAs δεν ανιχνεύθηκαν σε κύτταρα ΣΟΕ (Σχήμα 2Β). Το υπόλοιπο των διαφορικά εκφρασμένων miRNAs βρέθηκαν στις δύο κυτταρικές σειρές σε διαφορετικές, ποσοτικά, ποσά (Σχήμα 2C). Υποθέσαμε ότι αυτά τα συμπλέγματα miRNA θα εμπλουτισθεί για miRNAs που εμπλέκονται στην άμεση ρύθμιση των διακεκριμένων φαινοτυπικές διαφορές. Πιο συγκεκριμένα, έχουμε σκεφτεί ότι οι ΣΟΕ

χαμηλή miRNAs θα εμπλουτίζεται σε miRNAs αντιπροσωπεύουν κατασταλτικές επιδράσεις στις διάφορες λειτουργίες των κυττάρων π.χ. πολλαπλασιασμό (Καταπιεστικό miRNAs), ενώ οι ΣΟΕ

υψηλή miRNAs θα εμπλουτίζεται σε miRNAs με ογκογόνο ή όγκο προώθηση αποτελέσματα (Ογκογόνες miRNAs) (Σχήμα 2).

(Α) Ο κατάλογος των miRNAs που είναι εκφράζεται στα κύτταρα HAG, αλλά όχι στα κύτταρα PAG? (Β) Ο κατάλογος των miRNAs που εκφράζονται στα κύτταρα PAG, αλλά όχι στα κύτταρα ΣΟΕ? (Γ) σχετική έκφραση miRNAs που εκφράζονται τόσο HAG και τα κύτταρα PAG. Έκφραση HAG-to-PAG αναλογία (Υ-άξονας) φαίνεται ως 2∧-ΔΔCt. ΣΟΕ

χαμηλή αντιπροσωπεύει miRNAs με χαμηλή αναλογία ΣΟΕ-to-PAG. ΣΟΕ

υψηλή αντιπροσωπεύει miRNAs με υψηλή αναλογία ΣΟΕ-to-PAG.

Η

Η επιλογή των miRNAs για συγκεκριμένες λειτουργικές δοκιμασίες

Είμαστε εστιάζεται κυρίως στην ΣΟΕ

χαμηλή miRNAs, τα οποία είναι προφανώς όγκου-κατασταλτικό και θα μπορούσε να αποτελέσει τη βάση για νέες γραμμές θεραπείας για το μελάνωμα. miRNAs με πιθανούς όγκους κατασταλτική αναλύθηκαν για προέβλεψε στόχους με αλγόριθμο TargetScan [30] και για τις πληγείσες βιολογικών διεργασιών με τη Μιράντα (miRpath) αλγόριθμο [31]. Όλα τα δυνητικά επηρεάζονται βιολογικές διεργασίες κατατάχθηκαν σύμφωνα με την συνολική αξία P, με ένα cut-off & lt? 0,01. Περαιτέρω έμφαση στις ισχυρές διεργασίες έχει ενεργοποιηθεί επιλέγοντας βιολογικές διαδικασίες που περιλάμβαναν τουλάχιστον 30 υποψήφια γονίδια-στόχους. Αξίζει να σημειωθεί ότι, αυτά τα υπολογιστικά βήματα υπογράμμισε τέσσερις βιολογικές διαδικασίες που είναι άκρως εμπλέκονται στον καρκίνο, συμπεριλαμβανομένων Wnt μονοπάτι (82 γονίδια, P = 1,7 × 10

-9), εστιακή πρόσφυση (100 γονίδια, P = 8,6 × 10

– 9), ΜΑΡΚ μονοπατιού (120 γονίδια, P = 2 × 10

-7) και φωσφατιδυλινοσιτόλης οδός (35 γονίδια, P = 7,2 × 10

-3). Είκοσι εννέα από τα miRNAs είχαν προβλεφθεί να στοχεύσετε τις τέσσερις διαδικασίες, με μόνο 12 έχουν αναφερθεί να ασκήσει πειραματικά μια κατασταλτική επίδραση σε οποιαδήποτε καρκίνου.

Συνολικά, πέντε υποψήφιες Κατασταλτικός miRNAs, τα οποία δεν έχουν μελετηθεί σε μελάνωμα, επελέγησαν για κλωνοποίηση και πειραματικές δοκιμές. Τρεις miRNAs ήταν εντός του εύρους της έκφρασης (miR-34a, miR-185 και miR-204, το Σχήμα 2C) και δύο που είχαν σιγήσει (miR-31 και miR-184, Σχήμα 2Β) στα κύτταρα ΣΟΕ. επελέγη ως παράδειγμα για τις υποψήφιες Ογκογόνες miRNA (Σχήμα 2C) miR-17. Η διαφορική έκφραση του καθενός από αυτά τα miRNAs ελέγχθηκε σε δύο ανεξάρτητα σκευάσματα RNA (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα). έχουν διαφορετικούς ρόλους του miR-17, miR-31 και miR-34a στον καρκίνο έχουν αναφερθεί στο παρελθόν, αν και ποτέ δεν το δερματικό μελάνωμα. Αντίθετα, υπάρχουν ελάχιστα στοιχεία σχετικά με τους ρόλους των miRNAs -184, -185 και -204 στον καρκίνο. Exemplar προβλέψει οι ρόλοι σε βιολογικά και μοριακές λειτουργίες που αφορούν αυτά τα miRNAs συνοψίζονται στον συμπληρωματικό πίνακα S1 [32].

προφίλ έκφρασης επιλεγμένων miRNAs σε κλινικά δείγματα μελανώματος

Δεκαπέντε ασθενείς που προέρχονται από πρωτογενείς καλλιέργειες του μελανώματος αναλύθηκαν για το επίπεδο έκφρασης των επιλεγμένων miRNAs. Όλες οι καλλιέργειες μελανώματος καθιερώθηκαν από απομακρυσμένες μεταστάσεις. Πρόσθετα στοιχεία για τους ασθενείς που παρέχονται στο συμπληρωματικό πίνακα S2. Όπως ήταν αναμενόμενο, μια σημαντική μεταβλητότητα σε έκφραση miRNA παρατηρήθηκε μεταξύ των μεμονωμένων δειγμάτων, κυρίως του miR-31 (Σχήμα 3). Το μέσο επίπεδο έκφρασης των περισσότερων υποψήφιων Κατασταλτικός miRNAs στα κλινικά δείγματα ήταν μεταξύ των αντίστοιχων τιμών miRNA στα κύτταρα PAG και ΣΟΕ, εκτός από miR-185 και miR-31. Ενώ το μέσο επίπεδο του miR-185 ήταν πολύ κοντά στα κύτταρα PAG, miR-31 επίπεδα σαφώς υψηλότερα ακόμη και από τα κύτταρα PAG (Σχήμα 3). Αντίθετα, η μέση έκφραση του υποψηφίου ογκογόνος miR-17 μεταξύ των κλινικών δειγμάτων ήταν ακόμη υψηλότερο από ό, τι στα κύτταρα HAG (Σχήμα 3). Τα πρότυπα έκφρασης miRNA σε κλινικά δείγματα άμεσα δείχνει ότι οι περισσότερες υποψήφιες Καταπιεστικό miRNAs, εκτός από miR-31, εκφράζονται σε σημαντικά χαμηλότερα επίπεδα από τον υποψήφιο ογκογόνος miR-17 (Σχήμα 3). Τα αποτελέσματα αυτά συμφωνούν με την υπόθεση μας και δείχνουν ότι η προσέγγιση που χρησιμοποιείται για την αναγνώριση λειτουργικών Κατασταλτικός και Ογκογόνες miRNAs έχει φυσιολογικώς σχετική αιτιολογία.

Η έκφραση των υποψηφίων Κατασταλτικός ή Ογκογόνες miRNAs, όπως αναφέρεται, στο ΣΟΕ (ριγέ μπαρ), PAG (γκρι ράβδοι) και 15 χαμηλού περάσματος πρωτογενείς καλλιέργειες του μεταστατικού μελανώματος (μαύρες μπάρες). Οριζόντια γραμμή απεικονίζει τη μέση έκφραση. Υ-άξονας δείχνει την απόλυτη έκφραση του κάθε miRNA μετά από κανονικοποίηση στην U6 ενδογενούς ελέγχου σε κάθε δείγμα, και παρουσιάζεται ως 1 /ΔΟΙ.

Η

Κανονισμός της επιθετικής φαινοτύπου των κυττάρων μελανώματος από τις υποψήφιες Κατασταλτικός miRNAs

Προσδιορισμός των miRNAs που αναστέλλουν την επιθετική φαινότυπο του μελανώματος θα μπορούσε να αποτελέσει τη βάση για την ανάπτυξη νέων πλατφορμών για τη θεραπεία του καρκίνου. Προκειμένου να αξιολογηθεί η λειτουργική επίδραση του υποψήφιου Καταπιεστικό miRNAs στις επιθετικές χαρακτηριστικά του μελανώματος, κλωνοποιήσαμε και σταθερά τους υπερ-εκφράζεται σε κύτταρα HAG να αξιολογήσει τα αποτελέσματά τους in-vitro και in-vivo. Ένα κενό φορέα χρησίμευσαν ως έλεγχος. Μια υπερ-έκφραση τουλάχιστον 50-πλάσια επιβεβαιώθηκε με πραγματικού χρόνου PCR (Σχήμα 4Α). Ο φαινότυπος των μεταγόμενων κυττάρων ελέγχθηκε

in-vitro

για δραστηριότητες πολλαπλασιασμό, την εισβολή και σχηματισμού σωλήνα. Αξιοσημείωτα, μία ουσιαστική και συνεπής αναστολή των καθαρών πολλαπλασιασμού που παρέχει το miR-31, miR-34a, miR-184 και miR-185 σε σύγκριση με το κύτταρο ελέγχου (Σχήμα 4Β). miR-204 δεν ανέστειλε τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων HAG (Σχήμα 4Β). Σε αντίθεση, miR-204 ανέστειλε σημαντικά την δραστηριότητα εισβολής των κυττάρων HAG (Σχήμα 4C). Εισβολή παρομοίως αναστέλλεται από miR-184, αλλά όχι από το άλλο Καταπιεστικό miRNAs (Σχήμα 4C).

(Α) Επαλήθευση της υπερ-έκφραση του miRNAs σε μεταχθέντα HAG, σε σύγκριση με ψευδο-μετατραπέντων κυττάρων. Υ-άξονας δηλώνει φορές αλλαγή πάνω Mock-μεταγωγή κύτταρα. (Β) Καθαρή πολλαπλασιασμό των μορφομετατροπέων μετρήθηκε ποσοτικά με τυποποιημένη δοκιμή ΧΤΤ. Ο αριθμός των κυττάρων προσδιορίστηκε 48 ώρες μετά την σπορά. Ο αριθμός των Mock-μεταχθέντα προσδιορίστηκε ως 100%. Το σχήμα δείχνει ένα αντιπροσωπευτικό πείραμα από τρία που εκτελούνται. (C) δραστηριότητα Εισβολή της μεταχθέντα ήταν ποσοτικά με ανάλυση 20 h-Matrigel εισβολής, με διόρθωση για πολλαπλασιασμό. Ο ρυθμός εισβολή του Mock-μετατραπέντων κυττάρων προσδιορίστηκε ως 100%. Το σχήμα δείχνει ένα αντιπροσωπευτικό πείραμα από 3 που εκτελούνται. * Υποδηλώνει P & lt? 0,05, ** υποδηλώνει P & lt? 0.01 (2-tailed

t-test

)

Η

δραστηριότητα σχηματισμού Tube ουσιαστικά αναστέλλεται από miR-34a και miR-185. , και πιο ήπια από miR-31 και miR-184, αλλά όχι από miR-204, σε σύγκριση με τον έλεγχο (Σχήμα 5, Α-Ρ). Η ποσοτικοποίηση του συνολικού μήκους του σωλήνα πραγματοποιήθηκε με τη χρήση ImageJ. Είναι σημαντικό ότι η ποιοτική αξιολόγηση της μικρογραφική συλλαμβάνει (Σχήμα 5, Α-Ρ) συμφώνησε με την ποσοτική ανάλυση συνολικού μήκους (Σχήμα 5G). Οι διαφορικές επιδράσεις του miRNAs δεν μπορούσε απλώς να αποδοθεί σε διαφορική υπερέκφραση εντάσεις τους (Σχήμα 4Α). Σχεδόν όλα τα κύτταρα ήταν βιώσιμα όταν προσδιορίζεται, όπως είναι εμφανές από & lt? 5% θετική χρώση trypan blue (τα δεδομένα δεν φαίνονται)

ικανότητα σχηματισμού Tube of μεταχθέντα δοκιμάστηκε σε 3D καλλιέργεια, 24 ώρες μετά την σπορά.. Κάθε πείραμα διεξήχθη σε φρεάτια εις τριπλούν. (Α) έναν εκπρόσωπο μικροφωτογραφία ενός 3D κουλτούρα Mock-μεταγωγή κύτταρα ΣΟΕ? (Β-F) Εκπρόσωπος μικροφωτογραφίες των miRNA-μεταγωγή κύτταρα ΣΟΕ, όπως υποδεικνύεται σε κάθε εικόνα. Όλες οι εικόνες συλλήφθηκαν υπό × 40 μεγέθυνση. Όλες οι εικόνες (Α-Ρ) προήλθαν από το ίδιο αντιπροσωπευτικό πείραμα παρουσιάζεται, από τα τρία που εκτελούνται. (G) σχηματισμός σωλήνων μετρήθηκε ποσοτικά χρησιμοποιώντας το ImageJ αναλύσει σκελετό plugin. Το σχήμα δείχνει το μέσο μήκος υπολογίζεται για κάθε προϊόν μορφοτροπής από όλους μικροφωτογραφίες σταματούν σε όλα τα τρία πειράματα που πραγματοποιήθηκαν. * Υποδηλώνει P & lt? 0,05, ** υποδηλώνει P & lt? 0.01 (2-tailed

t-test

)

Η

Στο σύνολό τους, οι πέντε υποψήφιες Κατασταλτικός miRNAs όντως άσκησαν σημαντικές ανασταλτικές επιδράσεις στην. διάφορα επιθετικά χαρακτηριστικά των κυττάρων μελανώματος. Αυτό συμφωνεί με σημαντική προς τα κάτω ρύθμιση τους στα κύτταρα HAG (Σχήμα 2) και η συνολική χαμηλή έκφραση τους σε κλινικά δείγματα (Σχήμα 3). Αυτό ενισχύει επίσης υψηλής απόδοσης μας miRNA διαλογής και τονίζει την αξιοπιστία του.

Διευκόλυνση της επιθετικής φαινοτύπου των κυττάρων μελανώματος από τις υποψήφιες Ογκογόνες miRNA

Από το λειτουργικό ρόλο των miRNA 17-92 clusters »στον καρκίνο είναι καθιερωμένη, αλλά ποτέ δεν έχει δοκιμαστεί σε δερματικό μελάνωμα, αξιολογήσαμε miR-17 για την επίδρασή της στην επιθετικότητα των κυττάρων PAG. miR-17 κλωνοποιήθηκε και σταθερώς υπερ-εκφράζεται στα κύτταρα PAG. Ένα κενό φορέα χρησίμευσαν ως έλεγχος. Μια 25-πλάσια υπερ-έκφραση του miR-17 πιστοποιήθηκε με πραγματικού χρόνου PCR (Σχήμα 6Α). Σημαντικά, miR-17-μεταδιηγερμένα κύτταρα PAG εμφανίζεται μια σημαντικά ενισχυμένη πολλαπλασιαστική δράση (Σχήμα 6Β), αλλά όχι επεμβατική ικανότητα (Σχήμα 6C) ή δραστικότητα σχηματισμού σωλήνα (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα). Αυτά τα αποτελέσματα υποστηρίζουν τα δυνητικά ογκογόνο επιδράσεις του miR-17 σε μελάνωμα.

(Α) Επαλήθευση των miR-17-5p υπερ-έκφραση σε PAG προϊόντα μεταγωγής, σε σύγκριση με την μακέτα σε μεταγωγή κύτταρα. Υ-άξονας δηλώνει φορές αλλαγή πάνω Mock-μεταγωγή κύτταρα. (Β) Καθαρή πολλαπλασιασμό των μορφομετατροπέων ΠΣΟ ήταν ποσοτικά με τυποποιημένη δοκιμή ΧΤΤ. Ο αριθμός των κυττάρων προσδιορίστηκε 48 ώρες μετά την σπορά. Ο αριθμός των Mock-μεταχθέντα προσδιορίστηκε ως 100%. Το σχήμα δείχνει ένα αντιπροσωπευτικό πείραμα από 3 που εκτελούνται. (C) δραστηριότητα Εισβολή της ΠΣΟ μεταχθέντα ήταν ποσοτικά με ανάλυση 20 h-Matrigel εισβολής, με διόρθωση για πολλαπλασιασμό. Υ-άξονας δείχνει το ποσοστό των κυττάρων που εισέβαλαν. Το σχήμα δείχνει ένα αντιπροσωπευτικό πείραμα από τρία που εκτελούνται. ** Υποδηλώνει P & lt?. 0.01 (2-tailed

t-test

)

Η

miRNA με τη μεσολάβηση ρύθμιση των επιθετικών χαρακτηριστικών του μελανώματος

in-vivo

Η

στη βιολογία του καρκίνου,

in-vitro

αποτελέσματα συχνά δεν απηχούν κατ ‘ανάγκη

in-vivo

συμπεριφορά. Για το σκοπό αυτό, αξιολογήθηκαν περαιτέρω οι επιδράσεις των επιλεγμένων Καταπιεστικό miRNAs

in-vivo σε μοντέλα

μελάνωμα ξενομοσχεύματος. Η επίδραση της Κατασταλτικός miRNAs, miR-34a και miR-185 στην ανάπτυξη του όγκου μετρήθηκε μετά από υποδόρια ένεση 3 × 10

5 μεταχθέντα ΣΟΕ. μάζες όγκων παρακολουθήθηκαν για 28 ημέρες μετά την ένεση. Υπερ-έκφραση συγκεκριμένων miRNAs επιβεβαιώθηκε προ-ένεση (δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Σημαντικά, μια στατιστικά σημαντική αναστολή στην ανάπτυξη του όγκου παρατηρήθηκε σε αμφότερα miR-34a και miR-185 transducatnts, σε σύγκριση με τον έλεγχο των όγκων (Σχήμα 7Α). Συμφωνώ με αυτά τα αποτελέσματα,

ex-vivo

ζύγιση των μοσχευμάτων όγκου κατά τη λήξη των πειραμάτων επιβεβαίωσαν ότι η μέση μάζα του όγκου και των δύο miR-34a και miR-185 transducatnts ήταν χαμηλότερη από ό, τι Mock-μετάγονται όγκους (Σχήμα 7Β) . Η

in-vivo

υπερ-έκφραση των μετατραπέντων miRNAs επιβεβαιώθηκε στα εκφυτεύματα όγκου (Σχήμα 7C). Αυτά τα αποτελέσματα επιβεβαιώνουν τα αποτελέσματα της έκφρασης και λειτουργικές κατασταλτικά αποτελέσματα έδειξαν

in-vitro

(Σχήμα 4-5).

(α) παρακολούθηση της ανάπτυξης του όγκου σε ποντικούς SCID-NOD. Κάθε ομάδα αποτελούνταν από επτά ποντίκια. Ένα αντιπροσωπευτικό πείραμα από τα τέσσερα που εκτελούνται φαίνεται. Η στατιστική σημαντικότητα ελέγχθηκε με 2-tailed-ζεύγη

t-test

? (Β) Μέση βάρος των όγκων εκφυτευμένη μετά τη λήξη του πειράματος. Η στατιστική σημαντικότητα ελέγχθηκε με 2-tailed

t-test

? (Γ) Η υπερέκφραση του μετάγονται miRNAs επιβεβαιώθηκε κατά τη λήξη του πειράματος σε όλους τους όγκους με qPCR. * Υποδηλώνει P & lt?. 0.05

Η

Συζήτηση

Μέχρι σήμερα, οι περισσότερες προσπάθειες να χαρακτηρίζουν τους ρόλους των miRNAs στον καρκίνο γενικά ή ειδικότερα το μελάνωμα, έχουν επικεντρωθεί στη διαφορική προφίλ της κανονικής κυττάρων σε σύγκριση με κακοήθη κύτταρα ομόλογό τους [19], [20]. Η προσέγγιση αυτή επέτρεψε την ταυτοποίηση των miRNAs που συμμετέχουν στη διαδικασία της κακοήθους μετασχηματισμού. Εδώ είμαστε επικεντρώθηκε στην αναγνώριση των miRNAs που ρυθμίζουν άμεσα καρκίνου επιθετικά χαρακτηριστικά των κυττάρων μελανώματος. Ο στόχος αυτής της προσέγγισης ήταν να χαρτογραφήσει τις miRNAs που θα μπορούσαν να εμπλέκονται μηχανιστικά σε διαφορετικούς φαινοτύπους της νόσου και τελικά να οριοθετηθούν ρυθμιστικό ρόλο τους των επιθετικών χαρακτηριστικών του καρκίνου. Χρησιμοποιήσαμε δύο ισογονιδιακές συμφωνημένα κυτταρικές σειρές μελανώματος που προέρχονται από δύο διαφορετικά μεταστάσεων από τον ίδιο ασθενή. Αυτές οι κυτταρικές σειρές διαφέρουν σημαντικά σε επεμβατικές, πολλαπλασιαστικών και ογκογόνων ιδιοτήτων τους (Σχήμα 1). Λόγω του κοινόχρηστου γενετικό υπόβαθρο των κυττάρων, το σκεπτικό μας ήταν ότι η διαφορική έκφραση των miRNAs θα συσχετίζονται καλά με διαφορικό επιθετικό φαινότυπο τους.

διαλογής υψηλής απόδοσης αποκάλυψε μια μεγάλη ομάδα των διαφορικά εκφρασμένων miRNAs μεταξύ υψηλής (ΣΟΕ ) και κακώς (PAG) -aggressive κυτταρικές σειρές μελανώματος (Σχήμα 2). Υποθέσαμε ότι ΣΟΕ

χαμηλή miRNAs είναι κατασταλτικά και ότι ΣΟΕ

υψηλή miRNAs είναι ογκογόνο. Πράγματι, παρέχουμε ουσιαστικές αποδείξεις που υποστηρίζουν την υπόθεσή μας, με την έκτοπη έκφραση των πέντε επιλεγμένες ΣΟΕ

χαμηλή miRNAs σε κύτταρα ΣΟΕ (σχήματα 4, 5, 7) και μία ΣΟΕ

υψηλή miRNA σε κύτταρα PAG, ως εκπρόσωπος αυτού ομάδα (Σχήμα 6). Αυτή είναι η πρώτη έκθεση που να αποδεικνύουν με επιτυχία μια συστηματική προσέγγιση για μια μεθοδολογική ταυτοποίηση των miRNAs που ρυθμίζουν άμεσα την επιθετική χαρακτηριστικά του καρκίνου. Ο πλούτος των προσδιορισμένων miRNAs που ρυθμίζουν τα χαρακτηριστικά των κυττάρων μελανώματος επιθετικότητα υποστηρίζει τη χρήση των ισογονιδιακές κυτταρικές σειρές με διαφορικό φαινότυπο ως πλατφόρμα ελέγχου.

Η έκφραση αυτών των miRNAs επικυρώθηκε σε πρωτογενείς καλλιέργειες 15 χαμηλού περάσματος, με το μέση στάθμη του miR-17 είναι υψηλότερο από εκείνο του Κατασταλτικός Mirs, επιβεβαιώνοντας έτσι τη φυσιολογική σημασία (Σχήμα 3). Η έκφραση αυτών των miRNAs θα πρέπει να μελετηθεί περαιτέρω στο μέλλον μικροσυστοιχίες εξέλιξης των ιστών, και την προγνωστική αξία τους δοκιμάζονται αναλόγως.

Στην παρούσα εργασία επικεντρώθηκε σε μια ομάδα, είτε καλά χαρακτηρισμένα miRNAs είναι γνωστό ότι έχει ένα ρόλο στην άλλες κακοήθειες (miR-17, miR-31 και miR-34a), και σε μια δεύτερη ομάδα σχετικά απλός miRNAs σε σχέση με το ρόλο τους στην κακοήθη διαδικασίες (miR-184, miR-185, miR-204). Αξιοσημείωτα, οι ρόλοι όλων αυτών των miRNAs δεν έχουν περιγραφεί ποτέ στο δερματικό μελάνωμα.

miR-31 αναφέρθηκε ότι ασκούν ανασταλτικά αποτελέσματα επί μετάσταση στον καρκίνο του μαστού [33], [34] και σε μεσοθηλίωμα [17] , ενώ έχει δυνατότητα ογκογόνο ρόλο ως κεφαλής και λαιμού καρκίνωμα πλακωδών κυττάρων και καρκίνου του πνεύμονα [35], [36]. miR-34a αναφέρθηκε επανειλημμένα ως κατασταλτικός miRNA σε πολλές κακοήθειες [37]. Τα αποτελέσματά μας συμφωνούν με την προτεινόμενη ανασταλτικό ρόλο για miR-34a και miR-31. Επιπλέον, miR-34a έχει προηγουμένως αναφερθεί για στόχευση c-Met [16]. Δεδομένου ότι c-Met έχει αναφερθεί να συμμετέχει σε διαδικασίες tubulogenesis μέσω του συστήματος c-Met /HGF [38], είναι δελεαστικό να υποθέσουμε ότι ο μηχανισμός με τον οποίο miR-34a αναστέλλει τον σχηματισμό σωλήνα είναι μέσω αυτού του γονιδίου. Οι ογκογόνο ιδιότητες του miR-17-5p συζητήθηκαν σε προηγούμενες δημοσιεύσεις σε άλλες κακοήθειες [13]. Σε συμφωνία με αυτές τις αναφορές, έκτοπη έκφραση του miR-17-5p στα κύτταρα PAG ενισχυμένο ρυθμό πολλαπλασιασμού (Σχήμα 6Β).

Αντίθετα, πολύ λίγα είναι γνωστά για το miR-184, miR-185 και ΜΙΚ 204 στον καρκίνο. Οι πιο πρόσφατες μελέτες σχετικά με miR-184 και miR-204 εστίαση σε ρόλους τους στην ανάπτυξη και μορφογένεση, το οποίο θα μπορούσε να προβλεφθεί υπολογιστικά (συμπληρωματικός Πίνακας S1). Οι λίγες δημοσιεύσεις σχετικά με miR-184 στον καρκίνο έδειξαν αντιφατικά αποτελέσματα, είτε κατασταλτικά [39] ή το ογκογόνο [40]. Μια ενιαία έκθεση έδειξε ότι το miR-204 ανέστειλε μετάσταση στο κεφάλι και το λαιμό ακανθοκυτταρικό καρκίνωμα [41]. Μια άλλη έκθεση περιγράφεται ρύθμιση προς τα κάτω του miR-204 σε εξαιρετικά επεμβατική μελανώματος υπο-line σε σύγκριση με μη επεμβατικό ισογονιδιακές αντίστοιχό του [19], υποστηρίζοντας τα ευρήματά μας αναφορικά με την δραστηριότητα εισβολή αναστολής του miR-204 (Εικ. 4C). miR-185 εξακολουθεί να είναι ως επί το πλείστον απλός, αλλά πρόσφατα αποδείχθηκε ότι ασκούν κατασταλτική δράση σε διάφορες κακοήθειες μέσω της στόχευσης Six1 ογκογονιδίου [42], [43]. Η μελλοντική πρόκληση θα είναι να οριοθετηθούν οι γονίδιο στόχο δικτύων αυτών των miRNAs και να κατανοήσουν τη μοριακή βάση για ογκο-κατασταλτικό ρόλο τους.

Τα αποτελέσματα της κάθε επιμέρους miRNA δεν μπορεί προφανώς να είναι πανομοιότυπα μεταξύ

vitro σε

και

in-vivo

ρυθμίσεις. Για παράδειγμα, ενώ miRNAs-34α και -185 εμφάνισε ισχυρή αντι-πολλαπλασιαστικά αποτελέσματα

in-vitro

(Σχήμα 4Β), που επηρεάζονται πολύ περισσότερο συγκρατημένα ρυθμός ανάπτυξης όγκου

in-vivo

(Σχήμα 7Α ). Αυτό θα μπορούσε να αποδοθεί σε μια σημαντική διαφορά στην ένταση της έκφρασης μεταξύ

in-vitro

και

in-vivo

ρυθμίσεις (Σχήμα 4Α και 7C). Παρ ‘όλα αυτά, η

in-vivo

πειράματα υποδεικνύουν ότι ακόμη και όταν το επίπεδο υπερ-έκφρασης είναι σχετικά ασθενής (Σχήμα 7C), ένα πειραματικό αποτέλεσμα που θα λαμβάνει υπόψη διάφορες βιολογικές διεργασίες, όπως η ανάπτυξη του όγκου, μπορεί να αντανακλά ακόμα η κατασταλτικό αποτέλεσμα της υπερ-εκφράζεται miRNA (Σχήμα 7). Επιπλέον, αυτά τα πειράματα απλοποιήσει τη δυνατότητα της συνδυαστικής ρυθμιστικές επιδράσεις των διαφορετικών miRNAs, η οποία μπορεί να λειτουργήσει είτε σε συναυλία ή παρεμβολή [44]. Έτσι, μια συντονισμένη ρύθμιση προς τα κάτω και προς τα πάνω ρύθμιση των miRNAs μπορούν να διαμορφώσουν ένα συγκεκριμένο φαινότυπο, ακόμη και όταν οι αλλαγές σε κάθε επίπεδο έκφρασης των miRNAs δεν είναι ακραίες. Πράγματι, έχουμε παρατηρήσει διάφορες άμεσες και αντίστροφος στατιστική συσχέτιση μεταξύ της δοκιμάζεται Καταπιεστικό miRNAs στα κλινικά δείγματα μελανώματος, η οποία θα μπορούσε να προτείνει συνεργιστικές ή ανταγωνιστικές επιδράσεις μεταξύ τους (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα). Το αποτέλεσμα των αλληλεπιδράσεων μεταξύ των διαφόρων Κατασταλτικός miRNAs θα πρέπει να διερευνηθεί περαιτέρω να εμβαθύνει την κατανόησή μας για τη διαμόρφωση του φαινοτύπου με συνδυαστικές μορφές miRNA, και δεδομένου ότι συνεργιστική ανασταλτική συνδυασμοί θα μπορούσε να παρέχει μια σταθερή προβάδισμα για τις καινοτόμες θεραπεία.

Εν κατακλείδι, αυτό είναι η πρώτη έκθεση που απέδειξε με επιτυχία μια συστηματική προσέγγιση για την αναγνώριση των miRNAs που ρυθμίζουν άμεσα την επιθετική χαρακτηριστικά του καρκίνου. Εμείς περιγράφεται έξι miRNAs που συμβάλλουν στην επιθετική φαινότυπο του δερματικού μελανώματος τόσο

in-vitro

και

in-vivo

, και συνδέονται με αυτές τις παρατηρήσεις σε κλινικά δείγματα. Προσδιορισμός των miRNAs που διαμορφώνουν το επιθετικό φαινότυπο της νόσου μπορεί να οδηγήσει στην ανάπτυξη καινοτόμων μελλοντική θεραπεία και συστήματα μοριακή σταδιοποίηση. Πρόσφατες δημοσιεύσεις έδειξαν τη δυνατότητα στόχευσης πειραματικές μεταστάσεις μελανώματος με τη χρήση νανοσωματιδίων που μεταφέρουν miR-34a [45] ή ένα συνθετικό αγωνιστή miRNA [46].

Υλικά και Μέθοδοι

Δήλωση Ηθικής

Όλες οι εργασίες των ζώων στα ποντίκια έγινε μετά από έγκριση του Διοικητικού συμβουλίου Institutional Review της Sheba Medical Center (562/2010). Όλα τα κλινικά δείγματα που προέρχονται από ασθενείς, από τους οποίους οι καλλιέργειες μελανώματος ήταν καθιερώσει, λήφθηκαν μετά από έγκριση της επιτροπής δεοντολογίας του Υπουργείου Ισραήλ Υγείας (IMoH έγκριση Νο 3518/2004). Όλοι οι ασθενείς έχουν πρόθυμα υπέγραψε στον ενημερωμένο έντυπο συγκατάθεσης

Cells

Οι δύο ισογονιδιακές ανθρώπινο δερματικό κυτταρικές σειρές μελανώματος C8161 κύτταρα. (Πολύ επιθετική – ΣΟΕ) και η κακή επιθετική c81-61 (κακώς επιθετικό – PAG) [29] ευγενικά από τον Dr Mary Hendrix (Ερευνητικό Κέντρο για παιδιά Memorial, Σικάγο, ΗΠΑ). Αυτές οι κυτταρικές γραμμές προήλθαν από δύο διαφορετικές μεταστάσεις από τον ίδιο ασθενή. Πρωτογενείς καλλιέργειες μελανώματος αναπτύχθηκαν από αφαιρέθηκαν χειρουργικά μεταστατικές αλλοιώσεις μελανώματος (IMoH έγκριση Νο 3518/2004) και αναπτύχθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [47]. κύτταρα PAG αναπτύχθηκαν στο συμπλήρωμα μέσο F10 Ham με 15% FBS, Pen /Strep και 1 × ΜΙΤΟ + (BD Biosciences). Τα φυσιολογικά ανθρώπινα επιδερμικά μελανοκύτταρα διατηρήθηκαν σε ορό ελεύθερο μοναδικό μέσο (Promocell). 293Τ κύτταρα (ATCC) διατηρήθηκαν σε ϋΜΕΜ (Gibco /Invitrogen) που περιέχει 10% FBS (DMEM /FBS).

miRNA ανάλυση έκφρασης

Ολικό RNA απομονώθηκε χρησιμοποιώντας το mirVana miRNA κιτ απομόνωσης ( Ambion). διαλογής υψηλής απόδοσης των miRNA έγινε με PCR σε πραγματικό χρόνο χρησιμοποιώντας τη μορφή TLDA TaqMan microRNA κιτ (Applied Biosystems). Έκφραση των ειδικών miRNAs και U6 RNA (ως ενδογενής έλεγχος) εκτελέσθηκε ακολουθώντας την αντίστροφη μεταγραφή από & lt? 200 κλάσματα nt RNA, με τη χρήση των κιτ TaqMan microRNA (Applied Biosystems). επίπεδα αποκοπής για σημασίας προσδιορίστηκαν ως τουλάχιστον 4 φορές αναλογία μεταξύ των δειγμάτων που ελέγχθηκαν και τον κύκλο 36 ως όριο για το εύρος έκφρασης, με βάση την προηγούμενη αξιολόγηση μας αυτής της τεχνολογίας.