Αφηρημένο

Κεκτημένα χημειο-αντίσταση είναι ένας από τους βασικούς παράγοντες συνάφεια θανάτου από καρκίνο. Οι αναδυόμενες ενδείξεις υποδεικνύουν ότι miRNA και επιθηλιακά-μεσεγχυματικά μετάβαση παίζουν κρίσιμους ρόλους στην χημειο-αντίσταση σε καρκίνους. Εδώ, δείξαμε τη σύνδεση της πακλιταξέλης-αντίσταση με miR-375 υπερ-έκφραση και επιθηλιακά-μεσεγχυματικά μετάβαση προτροπής στον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας. Χρησιμοποιώντας διαφορετικά μοντέλα του τραχήλου της μήτρας καρκινικού κυττάρου, βρήκαμε ότι η πακλιταξέλη παροδικά επάγεται πάνω ρύθμιση του miR-375 έκφραση, η αναστολή του πολλαπλασιασμού, μετάβαση από επιθηλιακά μεσεγχυματικά προς φαινότυπο, και συνεπώς μειωμένη ευαισθησία paclitaxel. Αναγκαστική υπερ-έκφραση του miR-375 μπορεί να καταστείλει την έκφραση Ecadherin από ένα μονοπάτι απ ‘ευθείας στόχευση, η οποία οδήγησε στην αντίσταση πακλιταξέλη. Αντίθετα, η εκ νέου έκφραση του Ecadherin αντιστράφηκε μερικώς επιθηλιακά-μεσεγχυματικά φαινότυπο μετάβασης και miR-375 που επάγεται πακλιταξέλη αντίσταση. Τα ευρήματά μας υποδεικνύουν ότι η πακλιταξέλη επαγόμενη miR-375 υπερ-έκφραση διευκολύνει τη διαδικασία μετάβασης επιθηλιακά-μεσεγχυματικά μέσω απευθείας στόχευση Ecadherin, η αναστολή του πολλαπλασιασμού, και κατά συνέπεια οδηγεί σε χημειο-αντίσταση του τραχήλου της μήτρας καρκινικά κύτταρα. Μια αντιστροφή της έκφρασης miR-375 ή Ecadherin μπορεί να είναι μια νέα θεραπευτική προσέγγιση για την αντιμετώπιση χημειο-αντίσταση στον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας

Παράθεση:. Shen Υ, Zhou J, Li Υ, Ye F, Wan Χ, Lu W, et al. (2014) miR-375 Mediated Επίκτητης χημειοθεραπείες-Αντίσταση στον Καρκίνο του Τραχήλου της Μήτρας με τη διευκόλυνση της EMT. PLoS ONE 9 (10): e109299. doi: 10.1371 /journal.pone.0109299

Επιμέλεια: Zhi-Ming Zheng, Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας – Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 28, Οκτώβρη του 2013? Αποδεκτές: 10, Σεπτεμβρίου, 2014? Δημοσιεύθηκε: 16 Οκτωβρίου 2014

Copyright: © 2014 Shen et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Οι συγγραφείς θα ήθελα να αναγνωρίσω τη συνεχή οικονομική στήριξη από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (επιχορήγηση Νο 81172475 και 81172474), το Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της επαρχίας Zhejiang της Κίνας (Grant Νο Z2110056, LQ13H160005 και Y2110206). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

οι αναδυόμενες αποδείξεις έχουν αποκαλύψει ότι χημειο-αντίσταση συνδέεται με επιθηλιακά μεσεγχυματικά μετάβαση (ΕΜΤ) σε καρκινικά κύτταρα, και την απόκτηση του χημειο-αντίστασης σε καρκινικά κύτταρα συνοδεύεται από μία μετάβαση από ένα επιθηλιακό προς έναν φαινότυπο μεσεγχυματικά [ ,,,0],1] – [3]. Για παράδειγμα, διάφορα ανθεκτικά σε φάρμακο καρκίνους, συμπεριλαμβανομένου ορθοκολικού καρκίνου κύτταρα οξαλιπλατίνη ανθεκτικά [4], η πακλιταξέλη ανθεκτικά ωοθηκών καρκινικά κύτταρα [5], και gefitinib ανθεκτικά καρκινικά κύτταρα πνεύμονα [6], παρουσιάζουν τη μετάβαση από επιθηλιακά προς μεσεγχυματικά φαινότυπο κατά μήκος με απώλεια των επιθηλιακών μορίου προσκόλλησης Ecadherin και ένα κέρδος των μεσεγχυματικών δεικτών όπως βιμεντίνη, Ncadherin, και ινονεκτίνη. Πιο πρόσφατες μελέτες έχουν επίσης δείξει ότι παράγοντες χημειοθεραπείας μπορεί να διευκολύνει την επιθηλιακά σε μεσεγχυματικά φαινοτυπική μετασχηματισμός σε υπολειμματικό καρκίνο επιζών κύτταρα τα οποία μπορεί να είναι ένα από τα κρίσιμα στάδια στην επίκτητη αντοχή φαρμάκου σε καρκίνους [7], [8]. Έτσι, απόκτηση EMT γίνεται ένα κλειδί διαδικασία που συμβάλλουν στους κακοήθεις φαινοτύπους των καρκινικών κυττάρων σε αντίσταση στη χημειοθεραπεία. Ως εκ τούτου, η παρέμβαση της διαδικασίας EMT έχει προταθεί ως θεραπευτική προσέγγιση κατά αποκτήσει χημειο-αντίσταση.

Τα microRNAs (miRNAs) δρουν ως σημαντικοί ρυθμιστές γονιδίων στο ανθρώπινο γονιδίωμα και ανώμαλη έκφραση τους μπορεί να προωθήσει όχι μόνο Tumori-γένεση και της επιθετικότητας του όγκου αλλά επίσης και αντίσταση στη χημειοθεραπεία [9]. Πιο πρόσφατα, οι μελέτες έχουν αποκαλύψει ότι miRNAs διαδραματίζουν πρωταγωνιστικό ρόλο στη διαμόρφωση EMT, όπως miR-200S που ρυθμίζει EMT μέσω αναστολής της ZEB1 /2, ένας καταστολέας της μεταγραφής του Ecadherin [1], [10], [11]. Πρόσφατα αναφέρθηκε ότι η έκφραση του miR-375 μειώθηκε σε καρκινικά κύτταρα του τραχήλου της μήτρας [12] και εκτελείται υπερ-έκφραση του miR-375 ανέστειλε σημαντικά τον πολλαπλασιασμό και αποκλείστηκαν G1-S μετάβαση του κυτταρικού κύκλου [13]. Σε μια άλλη μελέτη, παρατηρήσαμε περαιτέρω ότι miR-375 ήταν ρυθμισμένα προς τα πάνω στην τραχηλική κύτταρα και ιστούς πακλιταξέλη αγωγή, και της αναγκαστικής υπερ-έκφραση του miR-375 μειωμένη ευαισθησία paclitaxel σε καρκίνο του τραχήλου [14]. Ωστόσο, η ρύθμιση της αντίστασης στα φάρμακα ακριβής μοριακός μηχανισμός που υποτακτικός miR-375 μένει να διερευνηθεί. Με το miRNA στοχεύει πρόβλεψη γονιδίων, βρήκαμε μια θέση σύνδεσης μεταξύ του miR-375 και Ecadherin 3′-UTR, η οποία ανέφερε ότι Ecadherin ήταν ένας πιθανός άμεσο στόχο του miR-375. Ως εκ τούτου, μπορούμε να υποθέσουμε ότι το miR-375 μπορεί να συμμετέχει στη ρύθμιση της EMT και απέκτησε πακλιταξέλη αντίσταση του τραχήλου της μήτρας τα καρκινικά κύτταρα.

Στην παρούσα μελέτη, διαπιστώσαμε για πρώτη φορά ότι η πακλιταξέλη αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό, προκαλεί EMT, και μέχρι -regulates έκφραση του miR-375 ταυτόχρονα σε τραχήλου της μήτρας τα καρκινικά κύτταρα. Και miR-375 υπερ-έκφραση αναστέλλεται άμεσα η έκφραση Ecadherin και να διευκολυνθεί η πακλιταξέλη-αντίσταση. Έτσι, υπάρχει μια διακριτή θετικό μηχανισμό ανάδρασης μεταξύ πακλιταξέλη, miR-375, και EMT που οδηγεί στο απέκτησε φαινοτύπων χημειο-αντίσταση του τραχήλου της μήτρας τα καρκινικά κύτταρα. Μια τέτοια ρυθμιστική βρόχου ανάδρασης αποτελέσματα miR-375 υπερ-έκφραση, η επιθηλιακή προς έναν μετασχηματισμό φαινοτυπική μεσεγχυματικά, και κατά συνέπεια απόκτηση του paclitaxel-αντίστασης. Εν πάση περιπτώσει, θα μπορούσε να το πιστέψει ότι ένα διάλειμμα ενός τέτοιου βρόχου ανάδρασης θα, τουλάχιστον εν μέρει, να ξεπεράσουν χημειο ανθεκτικότητας στο στον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας.

Υλικά και Μέθοδοι

Ασθενείς και δείγματα

Τα δείγματα καρκινικού ιστού συλλέχθηκαν από 23 ασθενείς με αυχενική πλακώδες καρκίνωμα με ΦΥΓΩ (2009) στάδιο ΙΒ

2 ή ΙΙΑ

2 που υποβλήθηκαν σε νεο-επικουρική χημειοθεραπεία που ακολουθείται από τον τύπο ΙΙΙ ριζική υστερεκτομή μεταξύ 1 Νοέμβρη 2008 και 30 Μαΐου 2010 στο Νοσοκομείο Γυναικών, της Ιατρικής Σχολής του Πανεπιστημίου Zhejiang. Η συλλογή όλων των δειγμάτων εγκρίθηκε από την Επιτροπή Δεοντολογίας για την κλινική έρευνα από το Νοσοκομείο Γυναικών, της Ιατρικής Σχολής του Πανεπιστημίου Zhejiang και λήφθηκαν γραπτές πληροφορημένες συγκαταθέσεις.

Όλοι οι ασθενείς υποβλήθηκαν σε 2 κύκλους της ενδοφλέβιας νεο-επικουρική χημειοθεραπεία ( πακλιταξέλη 135 mg /m

2 και σισπλατίνη 75 mg /m

2, διάστημα 3 εβδομάδων) πριν από τη χειρουργική επέμβαση. Η επίδραση της χημειοθεραπείας αξιολογήθηκε σύμφωνα με τα Κριτήρια Αξιολόγησης απόκρισης σε συμπαγείς όγκους (RECIST) [15] όπως περιγράφηκε προηγουμένως

14. Από όλους τους 23 ασθενείς, η μέση ηλικία ήταν 36,5 έτη (εύρος 20 έως 65 ετών), είχε προ και μετά τη χημειοθεραπεία δείγματα τραχηλικού καρκίνου. Η συγκεκριμένη σύνθεση κάθε δειγμάτων προσδιορίστηκαν από έναν έμπειρο παθολογοανατόμο.

Κυτταρική καλλιέργεια και EMT προτροπής

Δύο ανθρώπινο καρκίνο του τραχήλου κυτταρικές σειρές, SiHa και CaSki καλλιεργήθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως

14. Ανθρώπινη ανασυνδυασμένη ΤΟΡ-β1 και EGF-β ελήφθησαν από ProSpec-Tany Techno Gene Ltd (Ισραήλ), χρησιμοποιούνται αντίστοιχα σε μία τελική συγκέντρωση των 5 ng /ml και 2 ng /ml. Οι καρκινικές κυτταρικές γραμμές σπάρθηκαν 1 × 10

5 /φρεάτιο σε τρυβλία 6 φρεατίων και επωάστηκαν σε μέσο χωρίς ορό επί μία νύκτα και έπειτα υποβλήθηκε σε επεξεργασία με ΤΟΡ-β1 ή EGF-β για 72 ώρες αντίστοιχα, για την επαγωγή της EMT.

RNA Extraction και Real-Time RT-PCR

Σύνολο RNA που περιέχουν miRNAs εξήχθησαν από υγρό άζωτο διατηρημένα ιστούς ή τα κύτταρα που συλλέγονται με χρήση 1 ml αντιδραστηρίου ΤΡΙΖΟΙ (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή. cDNA συντέθηκε με τη PrimeScript RT Kit αντιδραστήριο (Takara Otsu, Shiga, Japan). Ποσοτική RT-PCR (qRT-PCR) για miRNA και mRNA διεξήχθη όπως περιγράφεται προηγουμένως

14. Οι αλληλουχίες όλων των εναρκτήρων δίδονται στον Πίνακα 1.

Η

Δοκιμασία πολλαπλασιασμού των κυττάρων και MTS Δοκιμασία

Για να προσδιοριστεί η επίδραση της miR-375 και paclitaxel επί του πολλαπλασιασμού των κυτταρικών σειρών του τραχήλου της μήτρας, ο τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων προσδιορίστηκε με δοκιμασία ΜΤΤ και δοκιμασία κυτταρικού πολλαπλασιασμού CFSE CellTrace σε 24, 48, 72, 96 ώρες και 5 ημέρες αντίστοιχα. Για τα πειράματα της βιωσιμότητας, του τραχήλου της μήτρας τα καρκινικά κύτταρα με ή χωρίς 10 ηΜ αγωγή με πακλιταξέλη 72 ώρες οι επιστρώθηκαν (SiHa, 3 × 10

3 /φρεάτιο σε πλάκα 96-φρεατίων και 2 × 10

5 πλάκας /φρεάτιο σε 6 φρεατίων ? CaSki, 2 × 10

3 /φρεάτιο σε πλάκα 96-φρεατίων και 1 × 10

5 /φρεάτιο σε πλάκα 6 φρεατίων) και καλλιεργήθηκαν όλη τη νύκτα. Στην δοκιμασία ΜΤΤ η απορρόφηση των δειγμάτων μετρήθηκε με έναν αναγνώστη φασματοφωτόμετρο στα 490 nm. Δοκιμασία πολλαπλασιασμού κυττάρων CellTrace CFSE διεξήχθη με χρώση ενεργοποιημένων με τον καρκίνο του τραχήλου CellTrace CFSE βαφή κυτταρικού πολλαπλασιασμού (2,5 μΜ) (Invitrogen) και να αναλύσει τη χρήση με κυτταρομετρία ροής με φίλτρα διέγερσης και εκπομπής 488 nm. Μια in vitro paclitaxel χημειο-ευαισθησία του τραχήλου καρκινικών κυττάρων αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας δοκιμασία MTS (Promega, Madison, WI) όπως περιγράφηκε προηγουμένως [12]. Τέσσερις αναπαράγουν φρεάτια χρησιμοποιήθηκαν για κάθε ανάλυση, και τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα.

Ανάλυση Western Blot

Ένα σύνολο 50 mg πρωτεΐνη διαχωρίστηκε με μετουσίωση 8-15% SDS-πολυακρυλαμιδίου ηλεκτροφόρηση πηκτής. Ανάλυση Western διεξήχθη όπως περιγράφηκε προηγουμένως [12]. Οι μεμβράνες αναλύθηκαν με πυκνομετρία με σύστημα απεικόνισης Versadoc? Model 3000 (BioRad) χρησιμοποιώντας Ποσότητα Ένα λογισμικό. Ανάλυση διασποράς με διόρθωση Bonferroni για πολλαπλές δοκιμές χρησιμοποιήθηκε για να προσδιοριστεί η σημασία. Τα πρωτογενή αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν ήταν αντι-Ncadherin (1:5000), αντι-Ecadherin (1:2000), αντι-φιβρονεκτίνης (1:1000), αντι-βιμεντίνη (1:1000) και αντι-ακτίνης (1:2000) ως ενδογενής έλεγχος, όλα από Epitomics Βιοτεχνολογίας (Epitomics).

η ανοσοϊστοχημεία

τμήματα (πάχους 6 μm) του καρκινικού ιστού κόπηκαν από paraffinised 23 ζευγάρια της αυτο-ζεύγη προ-και μετα-χημειοθεραπεία του τραχήλου της μήτρας δείγματα καρκίνου, και η ανάλυση ανοσοϊστοχημείας και βαθμολόγησης περιγράφηκαν προηγουμένως

12. Τα πρωτογενή αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν για την ανάλυση ανοσοϊστοχημεία ήταν αντι-Ecadherin αντίσωμα (1:1000) και αντίσωμα αντι-ακτίνης ως ενδογενής έλεγχος (1:2000), τόσο από Epitomics Βιοτεχνολογίας (Epitomics).

Lentivirus κατασκευή και επιμόλυνση

Για να δημιουργήσετε miR-375 και Ecadherin υπερέκφραση σταθερές επιμολύνσεις, του τραχήλου της μήτρας τα καρκινικά κύτταρα επιμολύνθηκαν με βραδέος ιού φορείς έκφρασης. Το πλασμίδιο κατασκευή και φακοϊού πακέτο ήταν πλήρης σε GENECHEM Εταιρείας. Οι αλληλουχίες προ-miR-375 ενισχύθηκαν και κλωνοποιήθηκαν στον φορέα pGCsil-GFP χρησιμοποιώντας τους ακόλουθους εκκινητές: (Εμπρός) HSA-προ-miR-375-XhoI-F, ACCGCTC GAGCCCCGCGACGAGCCCCTCGC? (Reverse) HSA-προ-mi-R-375-MfeI-R, ACCGCAATTGAAAAAGCCTCACGCGAGCCGAACG. Η-Cdh1 HSA (CDS) γονίδιο ενισχύθηκε και κλωνοποιήθηκε σε έναν φορέα pGC-FU-GFP χρησιμοποιώντας τους ακόλουθους εκκινητές: (Εμπρός) 5′-GAGGATCCCCGGGTACCGGTCGCCACCATGGGCCCTTGGAGCCGCAG-3 ‘, (Reverse) 5′-TCATCCTTGTAGTCGCTAGCGTCGTCCTCGCCGCCTCCGTACATG-3’. Οι ιοί συσκευασίες έγιναν σε κύτταρα ΗΕΚ 293 Τ μετά την συνδιαμόλυνση των 20 mg pGCsil-GFP-προ-miR-375 φορέα ή φορέα pGC-GFP-Cdh1 με 15 mg του πλασμιδίου πακεταρίσματος pHelper 1,0 Vector και 10 mg του πλασμιδίου φακέλου pHelper 2,0 φορέα χρησιμοποιώντας Lipofectamine 2000. οι ιοί συλλέχθηκαν 48 ώρες μετά την επιμόλυνση, και προσδιορίστηκαν οι ιικοί τίτλοι. Οι τίτλοι του ιού που χρησιμοποιείται στη μελέτη αυτή ήταν της τάξεως των 5 × 10

8~2 × 10

9 TU /mL.

Για να δημιουργήσετε miR-375 και Ecadherin υπερέκφραση σταθερό επιμολύνσεις, του τραχήλου της μήτρας τα καρκινικά κύτταρα επιμολύνθηκαν με φορείς έκφρασης λεντοϊού όπως περιγράφηκε προηγουμένως [12]. ΜΟΙ = 5 χρησιμοποιήθηκε για SiHa και ΜΟΙ = 10 χρησιμοποιήθηκε για CaSki. Μετά 4~7 d επιμόλυνσης, σταθεροί κλώνοι επιλέχθηκαν με GFP με κυτταρομετρία ροής και συλλέχθηκαν για περαιτέρω πειραματισμό. Ένα άδειο φορέα pGC FU-GFP-NC-LV χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικός μάρτυρας.

λουσιφεράσης Δοκιμασία Δραστηριότητα

Για να διερευνηθεί αν η έκφραση Cdh1 ρυθμιζόταν από το miR-375, ένα psicheck-2 dual -luciferase φορέα έκφρασης στόχου miRNA (psicheck-2 -UTR διάνυσμα) χρησιμοποιήθηκε για την εκτέλεση του προσδιορισμού της δραστικότητας λουσιφεράσης. Το άγριο και μεταλλαγμένων τύπου 3′-UTR του Cdh1 περιέχουν προέβλεψε miR-375 θέση πρόσδεσης συντέθηκε και εισήχθη εντός της περιοχής 3′-UTR στα κατάντη του γονιδίου λουσιφεράσης πυγολαμπίδας του psicheck-2 φορέα (psicheck-2 -UTR) χρησιμοποιώντας το Xho περιοριστικές θέσεις Ι και NotI εγώ. Όλα τα κατασκευάσματα επιβεβαιώθηκαν με αλληλούχιση. Μετά συνεπιμολύνθηκαν με miR-375 μιμείται (20 μΜ) και οι φορείς αναφοράς (0.2 μg /mL), λουσιφεράση δραστηριότητες μετρήθηκαν στις 24 ώρες χρησιμοποιώντας ένα Dual-Glo σύστημα δοκιμασίας λουσιφεράσης (Promega). Σχετική δραστικότητα λουσιφεράσης σε όλα τα σχήματα αναφέρεται σε λουσιφεράση πυγολαμπίδας δραστηριότητες κανονικοποιήθηκαν προς λουσιφεράση της Renilla. Οι τιμές των κυττάρων με κενό φορέα psicheck-2 ορίστηκαν εξίσου σε 1.

Στατιστική Ανάλυση

Τα πειράματα επαναλήφθηκαν τουλάχιστον τρεις φορές. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέση τιμή ± s.e.m. t-test ανεξάρτητος μαθητής ή ένας ANOVA χρησιμοποιήθηκε για να συγκρίνει τις συνεχείς μεταβλητές. δοκιμή συντελεστή συσχέτισης Pearson χρησιμοποιήθηκε για να εκτιμηθεί η συσχέτιση μεταξύ δύο συνεχείς μεταβλητές. P & lt?. 0.05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική

Αποτελέσματα

Η πακλιταξέλη που προκαλείται από EMT και ανέστειλε τον πολλαπλασιασμό ταυτόχρονα σε τραχήλου της μήτρας τα καρκινικά κύτταρα

Όταν η μορφολογία της συνήθως καλλιεργούνται τραχήλου της μήτρας τα καρκινικά κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με ή χωρίς πακλιταξέλη εξετάστηκαν με μικροσκοπία, παρατηρήσαμε ότι SiHa κύτταρο αυξήθηκε ως σφικτά συσκευασμένα «λιθόστρωτο» -όπως επιθηλιακά κύτταρα, ενώ κύτταρα κατεργασμένα με πακλιταξέλη φάνηκε ατρακτοειδόμορφα σχήμα πεπλατυσμένο και έχασε την πλειοψηφία των κυττάρου-κυττάρου επαφές τους. (Σχήμα 1α) Εν τω μεταξύ, η έκφραση της πρωτεΐνης Ecadherin μειώθηκε (10,5% ~66.6% και 43,75% ~67.6% κάτω από 5 ηΜ έως 20 ηΜ αγωγή με πακλιταξέλη αντίστοιχα) και οι εκφράσεις Ncadherin και πρωτεΐνης ινωδονεκτίνης αυξήθηκαν με έναν δοσο-απόκρισης τρόπος. (Σχήμα 1β) Παρόμοιες επιδράσεις παρατηρήθηκαν επίσης σε κύτταρα CaSki. (Σχήμα 1β, Εικόνα S1).

(α) Ορατή μορφολογικές αλλαγές από το «πλακόστρωτο» -όπως στο «ινοβλαστών» -όπως κυττάρων παρατηρήθηκε σε SiHa μετά την αγωγή με πακλιταξέλη 72 ώρες. Οι αντιπροσωπευτικές κυττάρων με μορφολογικές αλλαγές σημάνθηκαν (β) Ανοσοκηλίδωση μέτρησαν την έκφραση του Ecadherin και άλλων σχετικών EMT πρωτεΐνες (βιμεντίνη, Ncadherin, και ινωδονεκτίνης) του τραχήλου της μήτρας καρκινικά κύτταρα (SiHa και CaSki) κάτω από διαφορετικές ποσότητες (0, 5, 10, 20 ηΜ) αγωγή με πακλιταξέλη. Η έκφραση της πρωτεΐνης Ecadherin μειώθηκε και οι εκφράσεις του βιμεντίνης, Ncadherin, και πρωτεΐνη ινωδονεκτίνης αυξήθηκαν σε κύτταρα επεξεργασμένα με πακλιταξέλη για 72 ώρες σε μια δόση-απόκριση τρόπο. Όλες οι εκφράσεις των πρωτεϊνών κανονικοποιήθηκαν SS-ακτίνης και τα δεδομένα σε ιστογράμματα που παρουσιάζονται ως μέση τιμή τριπλού δείγματα από τρία ανεξάρτητα πειράματα. Όλες οι μπάρες σφάλματος s.e.m. υποδεικνύεται (** P≤0.01, * p ≤ 0,05). (C, d) Η παροδική αναστολή του πολλαπλασιασμού των κυττάρων και μορφολογικές αλλαγές που προκαλούνται από την πακλιταξέλη παρατηρήθηκαν. Οι αλλαγές πολλαπλασιασμό σε κύτταρα SiHa και CaSki μετά τη χορήγηση paclitaxel αναλύθηκαν με πολλαπλασιασμό CellTrace CFSE κυττάρων (γ) και ΜΤΤ δοκιμασία (δ) στις 24 ώρες, 72 ώρες, 96 ώρες, ημέρα 5, ημέρα 7, ημέρα 14, και ημέρα 21, αντίστοιχα. Ο ρυθμός πολλαπλασιασμού του paclitaxel κατεργάζεται SiHa και CaSki κύτταρα μειώθηκε σημαντικά κατά την ημέρα 7 και αποκαθίσταται κατά την ημέρα 21 μετά την χορήγηση πακλιταξέλης. Τα επέζησαν κύτταρα CaSki αποκαταστάθηκαν σε φυσιολογική μορφολογία κατά την ημέρα 21 μετά τη χορήγηση paclitaxel.

Η

Επιπλέον, μια παροδική αναστολή του πολλαπλασιασμού των κυττάρων που προκαλείται από την πακλιταξέλη παρατηρήθηκε με κυτταρομετρία ροής και ΜΤΤ. SiHa και CaSki κύτταρα καλλιεργούνται συνήθως με 10 ηΜ paclitaxel, μετά από 72 ώρες, η πακλιταξέλη απομακρύνθηκαν και τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν με πλήρες μέσο συνεχώς, εν συνεχεία οι αλλαγές πολλαπλασιασμό σε κύτταρα SiHa και CaSki πριν και μετά την χορήγηση paclitaxel αποκαλύπτεται στις 24 ώρες, 72 h, 96 h, ημέρα 5, ημέρα 7, ημέρα 14, και ημέρα 21, αντίστοιχα. Όπως έδειξε στο Σχήμα 1γ, 1δ, ο ρυθμός πολλαπλασιασμού του paclitaxel κατεργάζεται SiHa και CaSki κύτταρα την ημέρα 7 ήταν σημαντικά μειωμένη (SiHa, ρ = 0,002 και ρ = 2,3 × 10

-5? CaSki, ρ = 3.1 × 10

-4 και p = 1.2 × 10

-5 αντίστοιχα), σε σύγκριση με εκείνη του μάρτυρα, και αποκατασταθεί στα επίπεδα πριν από τη θεραπεία του φαρμάκου την ημέρα 21. την ίδια στιγμή, η «καλντερίμια» -όπως μορφολογικές αλλαγές που προκαλείται από την πακλιταξέλη σε επέζησαν κύτταρα και να επαναφέρονται στην κανονική μορφολογία κατά την ημέρα 21. αυτά τα γεγονότα δείχνουν ότι η πακλιταξέλη αναστέλλει παροδικά τον πολλαπλασιασμό και επάγει την EMT ταυτόχρονα σε τραχήλου της μήτρας τα καρκινικά κύτταρα, αλλά όλα αυτά τα paclitaxel που προκαλείται από τις αλλαγές αντιστράφηκε μετά τη διακοπή του φαρμάκου.

η πακλιταξέλη up-ρυθμίζει miR-375 κατά τη διάρκεια της επαγωγής EMT και τον πολλαπλασιασμό αναστολή

Είχαμε διερευνηθούν miR-375 έκφρασης επιφέρει αλλαγές που εμπλέκονται στην επαγόμενη από την πακλιταξέλη EMT και τον πολλαπλασιασμό αναστολή του τραχήλου της μήτρας τα καρκινικά κύτταρα, και η σαφής δοσοεξαρτώμενη επίδραση της πακλιταξέλης σε miR-375 υπερ-έκφραση παρατηρήθηκε

14. Επιπλέον, η προοδευτική επάνω ρυθμισμένη έκφραση του miR-375 κορυφώθηκε την ημέρα 7 μετά τη χορήγηση paclitaxel, σταδιακά μειώθηκε μετά την πακλιταξέλη αφαιρεθεί και να αποκατασταθεί στο επίπεδο πριν από την φαρμακευτική αγωγή σε περίπου την ημέρα 21

14. Επιπλέον, υπήρχε μια ισχυρή αρνητική συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης του miR-375 και η σχετική αναλογία πολλαπλασιασμό της αυχενικής καρκινικών κυττάρων (SiHa, r = -0,472, P = 1,52 × 10

-3? CaSki, r = -0.835 , P = 3,03 × 10

-4). (Εικόνα S2) Τα στοιχεία μας αποκάλυψε ότι η πακλιταξέλη επάνω ρυθμισμένη έκφραση του miR-375 και ανέστειλε τον πολλαπλασιασμό ταυτόχρονα σε τραχήλου της μήτρας τα καρκινικά κύτταρα, αλλά και οι δύο αλλαγές paclitexel που προκαλείται αντιστράφηκε μετά τη διακοπή του φαρμάκου, γεγονός που υποδηλώνει ότι ορισμένα από του τραχήλου της μήτρας τα καρκινικά κύτταρα να επιβιώσουν σε πακλιταξέλη, πιθανώς όμως ανάντη που ρυθμίζουν την έκφραση του miR-375 και την απόκτηση κακοήθη μεσεγχυματικά φαινοτύπων, τότε αναπτύσσει ένα δυναμικό να μειώσει τον πολλαπλασιασμό και να αντισταθεί τοξικότητα των φαρμάκων. Αυτά συσχέτισης δείχνουν ότι το miR-375 υπερ-έκφραση μπορεί να έχει αιτιώδη ρόλο στη χημειοθεραπεία EMT.

MiR-375 μεσολαβεί EMT με απευθείας στόχευση Ecadherin

Με miRDB και TargetScan ανάλυση των προγραμμάτων αναζήτησης, βρεθεί μια προβλεπόμενη σύνδεση του miR-375 με Cdh1 (Ecadherin) 3′-UTR, η οποία ανέφερε ότι Ecadherin ήταν ένας πιθανός άμεσο στόχο του miR-375 (Σχήμα 2γ). Για να διαπιστωθεί επίσης ότι Ecadherin είναι ένα γονίδιο στόχος του miR-375, έχουμε κατ ‘αρχάς ανάλυση της σχέσης μεταξύ Ecadherin και την έκφραση του miR-375 στην τραχήλου της μήτρας τα καρκινικά κύτταρα κάτω από διαφορετικές ποσότητες αγωγή με πακλιταξέλη. Όπως έδειξε στην Εικόνα 1β και το Σχήμα S2, η έκφραση του miR-375 σε κύτταρα ήταν εμφανώς άναρχη με τρόπο που εξαρτάται δόσης κατά τη διάρκεια της διαδικασίας ΕΜΤ paclitaxel επαγόμενη, καθώς και πρωτεΐνη Ecadherin και miR-375 έκφρασης αντίστροφα συσχετίζεται (r = -0.752, P = 2.32 × 10

-4). Στη συνέχεια χρησιμοποιήσαμε περαιτέρω δοκιμασία δραστικότητας λουσιφεράσης για να επιβεβαιωθεί η σύνδεση του miR-375 στο 3′-UTR του Ecadherin. (Σχήμα 2c).

(α) τις εικόνες αντίθεσης φάσης του καρκίνου του τραχήλου κύτταρα μολύνονται με τον προ-miR-375 ή αρνητικός φορέας λεντοϊού και μάρτυρα αναφοράς. (Β) μέτρηση Ανοσοκηλίδωση των πρωτεϊνών που σχετίζονται με Ecadherin και EMT στο τραχηλικό καρκίνο tercells μολύνθηκαν με τον φορέα φακοϊό προ-miR-375 ή αρνητικό. (Γ) Η προβλεπόμενη duplex σχηματισμό μεταξύ της ανθρώπινης Cdh1 (Ecadherin) 3′-UTR και miR-375. Μια μειωμένη δραστικότητα λουσιφεράσης παρατηρήθηκε μετά από συνεπιμόλυνση του Ecadherin 3′-UTR άγριου τύπου διάνυσμα με miR-375, αλλά όχι μεταλλαγμένη ή κενό φορέα (ρ = 0.014). Τα δεδομένα σε ένα-c παρουσιάστηκαν ως ο μέσος όρος των τριπλών δειγμάτων από ανεξάρτητα πειράματα. Όλες οι μπάρες σφάλματος s.e.m. υποδεικνύεται (** P≤0.01, * p ≤ 0,05).

Η

Για να ελέγξετε αν η ρύθμιση προς τα πάνω του miR-375 συνέβαλαν στην πακλιταξέλη επαγόμενη EMT, τα αποτελέσματα του miR-375 υπερ-έκφραση στο οι εκδηλώσεις αυτές αξιολογήθηκαν. Η έκφραση του miR-375 αναλύθηκε με πραγματικού χρόνου PCR κατά τη δεύτερη εβδομάδα, τρίτη εβδομάδα και το πρώτο μήνα μετά την προ-miRNA λεντοϊού σταθερή επιμόλυνση. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2α και 2β, η αναγκαστική υπερ-έκφραση του miR-375 που επάγεται διαδικασία EMT στην τραχηλική καρκινικών κυττάρων, που χαρακτηρίζεται από την απόκτηση της κυτταρικής μορφολογίας που ομοιάζουν με ινοβλάστη, η καταστολή της έκφρασης Ecadherin (65% ~69.2%), και την ενίσχυση της vimentin, Ncadherin, και την έκφραση ινονεκτίνης, παρόμοια με τα αποτελέσματα που παρατηρήθηκαν στα κύτταρα αντιμετωπίζονται πακλιταξέλη.

Έτσι, τα ευρήματά μας υποδεικνύουν ότι το miR-375 υπερ-έκφραση προάγει την πακλιταξέλη που προκαλείται EMT εν μέρει με την άμεση στόχευση Ecadherin στον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας κύτταρα.

EMT ρυθμίζει την ευαισθησία πακλιταξέλη, αλλά δεν miR-375 έκφρασης

Για να προσδιορίσετε αν EMT μπορούν να ρυθμίζουν miR-375 έκφρασης αντιστρόφως, η επόμενη σειρά πειραμάτων πραγματοποιήθηκε. Εμείς που προκαλείται EMT από τον TGF-β1 ή EGF-β του τραχήλου της μήτρας τα καρκινικά κύτταρα (SiHa και CaSki) και παρατήρησαν την επίδραση του EMT την ευαισθησία πακλιταξέλη και miR-375 έκφρασης. Παρακινημένοι από τον TGF-β1 ή EGF-β, του τραχήλου της μήτρας τα καρκινικά κύτταρα υποβλήθηκε σε ΕΜΤ συνοδευτικά ορατές μορφολογικές αλλαγές (Εικόνα 3α), όπως η εμφάνιση μιας ατράκτου-όπως το σχήμα σε κύτταρα, και μεταβολή δείκτη EMT, συμπεριλαμβανομένης της μειωμένης έκφρασης πρωτεΐνης Ecadherin (28,5% ~ 65,8% για τον ΤΟΡ-β1 και 47,5% ~67.6% για EGF-β), καθώς και η αυξημένη Ncadherin, βιμεντίνη, και η έκφραση πρωτεΐνης φιμπρονεκτίνης (Σχήμα 3c). Ωστόσο, η έκφραση του miR-375 δεν άλλαξε κατά τη διάρκεια του TGF-β1 ή προκαλείται από EGF-β διαδικασίας EMT στην τραχήλου της μήτρας τα καρκινικά κύτταρα (SiHa,

σ

= 0,538? CaSki

σ

= 0,542) (Εικόνα 3d).

(α) Ορατό μορφολογικές αλλαγές στα SiHa και CaSki κάτω TGF-β1 ή EGF-β προτροπής. (Β) ανάλυση των MTS πακλιταξέλη ευαισθησία του τραχήλου καρκινικά κύτταρα. (Γ) Ανοσοστύπωμα ανάλυση των Ecadherin και άλλων πρωτεϊνών που σχετίζονται με EMT μετά TGF-β1 ή επαγωγή EGF-β. (Δ) miR-375 έκφρασης σε SiHa και CaSki κάτω TGF-β1 ή EGF-β προτροπής. Τα δεδομένα σε b-d παρουσιάστηκαν ως μέσος όρος των τριπλών δειγμάτων από ανεξάρτητα πειράματα. Όλες οι μπάρες σφάλματος s.e.m. υποδεικνύεται (** P≤0.01, * p ≤ 0,05).

Η

Επιπλέον, έχουμε οριοθετείται την ευαισθησία των ναρκωτικών των κυττάρων που υφίστανται EMT χρησιμοποιώντας δοκιμασία MTS. Η ευαισθησία paclitaxel μειώθηκε σημαντικά σε κύτταρα SiHa και CaSki μετά ΤΟΡ-β1 ή διέγερση EGF-β σε σύγκριση με ελέγχους καλλιέργειας χωρίς ορό (Σχήμα 3Β). Οι τιμές IC50 ήταν αυξημένες σε SiHa και CaSki με 5 ng /ml ΤΟΡ-β1 (95.81 ± 2.53 ηΜ και 66.66 ± 2.32 ηΜ αντίστοιχα, SiHa,

σ

= 0.032? CaSki,

p

= 0.023) ή 2 ng /ml EGF-β διέγερση (96,74 ± 2,47 nM και 94,78 ± 1,72 nM, αντίστοιχα, SiHa,

σ

= 0.038? CaSki

σ

= 0,028) σε σύγκριση με ορό ελέγχους -δωρεάν πολιτισμό (24,54 ± 1,37 nM, και 23,98 ± 2,62 nM, αντίστοιχα).

Τα ευρήματά μας δείχνουν ότι ο TGF-β1 ή EGF-β επάγει EMT, αλλά η δόση δεν μεταβάλλει miR-375 έκφρασης του τραχήλου της μήτρας τα καρκινικά κύτταρα, και μεσεγχυματικών κυττάρων που μοιάζουν με του τραχήλου της μήτρας τα καρκινικά κύτταρα που επάγεται από ΤΟΡ-β1 ή EGF-β είναι τυπικά πακλιταξέλη ανθεκτικά. Η σημαντικά ρυθμισμένη προς τα πάνω έκφραση του miR-375 στην πακλιταξέλη αντιμετωπίζονται κύτταρα του τραχήλου Caner διεγείρεται με πακλιταξέλη, αλλά δεν EMT.

Ecadherin υπερέκφραση εξασθενίζει την ικανότητα miR-375 για να μεσολαβήσει EMT και πακλιταξέλη-αντίσταση

Ecadherin δεν είναι μόνο ένα σημαντικό μόριο στην έναρξη της EMT, αλλά και το σήμα κατατεθέν για την EMT και miR-375 μεσολαβεί EMT με απευθείας στόχευση Ecadherin.To διερεύνηση του ρόλου των Ecadherin στην EMT και την ευαισθησία πακλιταξέλη και να ελέγξετε αν η ρύθμιση προς τα πάνω ofEcadherin μπορεί να μετριάζει την επίδραση του miR-375 στην EMT και πακλιταξέλη-αντίσταση του τραχήλου της μήτρας τα καρκινικά κύτταρα? η Ecadherin υπερεκφράζεται lentviral φορέα pGC-σημαία-Cdh1 χρησιμοποιήθηκε. Εμείς αντίστοιχα επιμολυσμένα Ecadherin υπερεκφράζεται lentviral φορέα και αρνητικό έλεγχο σε κύτταρα SiHa και CaSki με και χωρίς miR-375 υπερ-έκφραση, και παρατήρησε ότι το αποτέλεσμα της αναγκαστικής υπερ-έκφραση Ecadherin επί ΕΜΤ και πακλιταξέλη-αντίσταση. Σε Ecadherin υπερεκφράζουν κλώνων με και χωρίς miR-375 υπερ-έκφραση, υπήρχε μια έντονη και σημαντική αύξηση στην έκφραση του Ecadherin (Σχήμα 4α). Στα κύτταρα χωρίς miR-375 υπερ-έκφραση, δεν παρατηρήθηκαν αξιοσημείωτες διαφορές της μορφολογίας και μεσεγχυματικών δείκτες σε κύτταρα SiHa και CaSki μετά Ecadherin υπερέκφραση, η οποία είναι πιθανώς επειδή γονικών κυττάρων τους ήδη παρουσίασαν επιθηλιακή φαινότυπο. Αντίθετα, στα κύτταρα με miR-375 υπερ-έκφραση, υπήρξε μια μετάβαση από απομονωμένα ινοβλαστικά κύτταρα να «λιθόστρωτο» -όπως επιθηλιακά κύτταρα. Εν τω μεταξύ, οι εκφράσεις του Ncadherin, βιμεντίνη, και φιμπρονεκτίνη μειώθηκαν σημαντικά μετά Ecadherin υπερέκφραση (Σχήμα 4α, 4c).

ανοσοαποτύπωσης (α) και MTS (β) ανάλυση των Ecadherin και άλλων συναφών EMT πρωτεΐνες σε SiHa με και χωρίς miR-375 υπερέκφραση μετά την επιμόλυνση φορέα φακοϊό Ecadherin εκφράζουν ή αρνητικό. Τα δεδομένα στο (α) και (β) παρουσιάστηκαν ως ο μέσος όρος των τριπλών δειγμάτων από ανεξάρτητα πειράματα. Όλες οι μπάρες σφάλματος s.e.m. υποδεικνύεται (** P≤0.01, * p≤0:05). (Γ) Μορφολογικές αλλαγές στα SiHa με και χωρίς miR-375 υπερ-έκφραση μετά την επιμόλυνση φορέα φακοϊό Ecadherin εκφράζουν ή αρνητικό. Τα αντιπροσωπευτικά κύτταρα με μορφολογικές αλλαγές είχαν επισημανθεί.

Η

Η πακλιταξέλη χημειο-ευαισθησία στη συνέχεια αξιολογούνται από δοκιμασίες MTS. Όπως ήταν αναμενόμενο, η ευαισθησία paclitaxel ήταν σημαντικά αυξημένη σε Ecadherin lentvirus επιμολυσμένα κύτταρα με και χωρίς miR-375 υπερέκφραση σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου. Οι τιμές IC50 μειώθηκε σε SiHa και CaSki με Ecadherin υπερέκφραση (12.82 ± 2.54 ηΜ και 7.62 ± 0.93 ηΜ, αντίστοιχα, SiHa,

σ

= 0.043? CaSki,

σ

= 0,038) σε σύγκριση με αρνητικοί μάρτυρες (20,73 ± 1,23 nM και 11,68 ± 0,62 nM, αντίστοιχα, SiHa,

σ

= 0,028? CaSki,

σ

= 0,021). Επιπλέον, η αντίσταση paclitaxel ήταν σημαντικά εξασθενημένη μετά Ecadherin ήταν αποτελεσματικά υπερ-εκφράζεται σε κύτταρα του τραχήλου με υπερ-εκφράζεται miR-375 σε σύγκριση με αρνητικό μάρτυρα (Σχήμα 4β). Οι τιμές IC50 μειώθηκε σε SiHa και CaSki με Ecadherin και miR-375 αντιμόλυνση (22.82 ± 3.54 nM και 13,68 ± 0,64 nM, αντίστοιχα, SiHa,

σ

= 0,033? CaSki,

p =

0,038) σε σύγκριση με SiHa και CaSki με αρνητικό μάρτυρα και miR-375 αντιμόλυνση (82,83 ± 2,23 nM και 20,31 ± 3,01 nM, αντίστοιχα, SiHa,

σ

= 0,032? CaSki,

σ

= 0.025 ). Τα αποτελέσματα μας αποκάλυψαν ότι Ecadherin υπερέκφραση σημαντικά ενισχυμένη ευαισθησία paclitaxel σε τραχήλου καρκινικά κύτταρα με ή χωρίς miR-375 υπερ-έκφραση, γεγονός που υποδηλώνει ότι Ecadherin υπερ-έκφραση αυξάνει δραματικά την ευαισθησία πακλιταξέλη, περαιτέρω, την εκ νέου έκφραση του Ecadherin αντιστρέφει, τουλάχιστον εν μέρει, ο φαινότυπος EMT και πακλιταξέλη-αντίσταση που προκαλείται από miR-375 στην τραχήλου της μήτρας τα καρκινικά κύτταρα.

miR-375 υπερ-έκφραση συσχετίζεται με την έκφραση Ecadherin στην μετα-χημειοθεραπεία ιστούς ανθρώπινου τραχηλικού καρκινώματος

Για να διαπιστωθεί η κλινική σημασία των miR-375 μεταξύ εκφράσεων Ecadherin υπό επιδράσεις χημειοθεραπείας, αξιολογήσαμε έκφραση miR-375 και Ecadherin σε 23 ζευγάρια του εαυτού ζεύγη πριν και μετά τη χημειοθεραπεία ανθρώπινου τραχηλικού καρκινικούς ιστούς. Η ανοσοχρώση για Ecadherin αποκάλυψε πιο εκτεταμένες και ισχυρότερη έκφραση σε προ-χημειοθεραπείας από εκείνο στο μετα-χημειοθεραπεία καρκινικών ιστών (Σχήμα 5). Ταυτόχρονα, miR-375 ήταν σημαντικά ρυθμισμένη προς τα πάνω (4,67 φορές) σε δείγματα τραχηλικού πακλιταξέλη επεξεργασμένα, Ecadherin και miR-375 έκφρασης αντίστροφα συσχετίζεται σε όλους τους ιστούς, συμπεριλαμβανομένων προ και μετά τη χημειοθεραπεία (r = -0.905, P = 1,81 × 10

-3) (Πίνακας S1).

(α) Ecadherin και miR-375 έκφρασης αντίστροφα συσχετίζεται σε όλους τους ιστούς, συμπεριλαμβανομένων προ και μετά τη χημειοθεραπεία (r = -0.905, P = 1,81 × 10

-3). (Β) Χρώση της έκφρασης της ανθρώπινης ειδικά Ecadherin σε τρεις εκπροσώπους (1 PD και 2 PR) (× 200). Μια μειωμένη έκφραση Ecadherin δείχθηκε στους ιστούς μετά από τη χημειοθεραπεία (p = 0,0023).

Η

Από όλους τους 23 ασθενείς, οι 19 ήταν χημειο-ευαίσθητα και 4 χημειο-αντίσταση, η υπερέκφραση του miR-375 είναι πιο σημαντικά σε ασθενείς χημειο-αντίσταση, σε σύγκριση μετα-χημειοθεραπεία ιστούς με τον εαυτό τους, σε συνδυασμό προ-χημειοθεραπείας ιστούς (6.7 ± 2.3 φορές σε χημειο-αντίσταση και 4,35 ± 0,63 φορές σε νόσο ευαίσθητη ασθενείς αντίστοιχα,

σ

= 0,033) . Αλλά θα πρέπει να σημειωθεί ότι δεν υπάρχει αρκετή ενέργεια για να καταλήξει στο συμπέρασμα ότι η έκφραση του miR-375 είναι υψηλότερη σε ασθενείς χημειο-αντίσταση, εν μέρει λόγω του μικρού μεγέθους του δείγματος για τους ασθενείς χημειο-αντοχής (Ν = 4).

Συζήτηση

χημειοθεραπείες-αντίσταση είναι ένας από τους βασικούς παράγοντες συνάφεια των υποτροπών και την εξέλιξη του καρκίνου. Η πλειονότητα των καρκινικών κυττάρων ανταποκρίνεται καλά αρχικά στη χημειοθεραπεία, αλλά τελικά αναπτύσσει αντίσταση μετά την έκθεση του φαρμάκου. Οι αναδυόμενες αποδείξεις έχουν αποκαλύψει ότι τα καρκινικά κύτταρα υφίστανται ΕΜΤ προάγει την κυτταρική επιβίωση και την αντίσταση στη χημειοθεραπεία [3]. Αν και έχει αναφερθεί ότι miRNAs μπορεί να παίζει πρωταγωνιστικό ρόλο στη διαμόρφωση της ΕΜΤ [16]? Ωστόσο, λεπτομερής κανονιστική διαδικασία παραμένει ανεξερεύνητο. miR-375 αρχικά βρέθηκε να εκφράζεται σε παγκρεατικών νησιδίων, όπου ρυθμίζει την έκκριση της ινσουλίνης και μεταβολισμό της γλυκόζης [17]. Πρόσφατα, miR-375 αναγνωρίστηκε ως σημαντικός ρυθμιστής στην ογκογένεση και εξέλιξης του καρκίνου? Ωστόσο, οι ακριβείς λειτουργίες αυτού του miRNA παραμένουν σε μεγάλο βαθμό ασαφής. miR-375 ταυτοποιήθηκε ως καταστολέας όγκων σε περισσότερες από καρκίνους, όπως γαστρικό καρκίνο [18], [19], ο καρκίνος του ήπατος [20], το κεφάλι και το λαιμό καρκίνωμα πλακωδών κυττάρων [21] και του προστάτη [22], αλλά παίζει ένας ογκογόνος ρόλο στον καρκίνο ΕΚα θετικούς μαστού [23], σε ασθενείς αδενοκαρκίνωμα του πνεύμονα [24], και HBV θετικές ασθενείς HCC [25]. Έτσι, αυτές οι αντικρουόμενες αναφορές σχετικά με τη σχέση μεταξύ επιπέδου miR-375 και του καρκίνου πρότεινε μια πιο πολύπλοκη και πιθανώς καρκίνο συγκεκριμένη σχέση. Σε μια άλλη μελέτη μας, παρατηρήσαμε τη συσχέτιση μεταξύ miR-375 υπερ-έκφραση και πακλιταξέλη ανθεκτικότητας στο στον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας

16. Εδώ, έχουμε συνδέσει άμεσα miR-375 στην διαδικασία EMT χημειοθεραπεία που προκαλείται από τον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας. Βρήκαμε για πρώτη φορά ότι η πακλιταξέλη αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό, επάγει ΕΜΤ, και up-ρυθμίζει miR-375 έκφραση σε έναν δοσο-εξαρτώμενο τρόπο ταυτόχρονα σε τραχήλου καρκινικά κύτταρα, αλλά όλες αυτές οι paclitaxel που προκαλείται από τις αλλαγές αντιστράφηκε μετά τη διακοπή του φαρμάκου. Μηχανιστικά, έκτοπη υπερέκφραση του miR-375 οδήγησε σε μειωμένη έκφραση Ecadherin και συνοδεύεται από επίκτητα χαρακτηριστικά μεσεγχυματικά και χημειο-αντίσταση του τραχήλου της μήτρας καρκινικά κύτταρα. Έτσι, τα ευρήματά μας πρότεινε ότι η πακλιταξέλη δεν εξαλείφει όλα τα καρκινικά κύτταρα του τραχήλου της μήτρας και μερικά των υπολειμματικών κυττάρων μπορεί να επιβιώσει υπό την έκθεση στο φάρμακο. Κατά τη διάρκεια αυτής της διαδικασίας, αυτά τα υπολειμματικά του τραχήλου της μήτρας τα καρκινικά κύτταρα με up-ρυθμίζεται η έκφραση του miR-375 ίσως έχουν μια δυνατότητα να αποκτήσουν μεσεγχυματικών φαινοτύπων, επιβραδύνει τον πολλαπλασιασμό, και να αντισταθεί στην τοξικότητα των φαρμάκων.