Αφηρημένο

Ιστορικό

Claudins είναι μεμβρανικές πρωτεΐνες που παίζουν κρίσιμο ρόλο στη σφιχτό κόμβο (TJ) σχηματισμό και τη λειτουργία. Μέλη της οικογένειας γονιδίων κλαουδίνης καταδειχθεί ότι ρυθμίζεται ανωμάλως, και να συμμετέχουν στην παθογένεση διαφόρων ανθρώπινων καρκίνων. Στην παρούσα μελέτη, αναφέρουμε ότι κλαουδίνης-11 (

CLDN11

) έχει σιγήσει στο γαστρικό καρκίνο

μέσω

υπερμεθυλίωση της περιοχής του υποκινητή του.

Μεθοδολογία /Κύρια Ευρήματα

Επίπεδα

CLDN11

μεθυλίωση και η έκφραση του mRNA μετρήθηκαν σε πρωτογενείς γαστρικό καρκινικούς ιστούς, noncancerous γαστρικού βλεννογόνου, και κυτταρικές σειρές γαστρικού προέλευσης χρησιμοποιώντας ποσοτική μεθυλίωση-ειδική PCR (qMSP) και ποσοτική ανάστροφης μεταγραφάσης-ΡΟΡ (qRT-PCR), αντίστοιχα. Αναλύσεις ζεύγη γαστρικών καρκίνων και παρακείμενο φυσιολογικό γαστρικό ιστούς αποκάλυψε υπερμεθυλίωση του

CLDN11

περιοχή του υποκινητή του γαστρικού καρκίνου, και αυτό υπερμεθυλίωση συσχετίστηκε σημαντικά με ρύθμιση προς τα κάτω των

CLDN11

έκφραση

vs.

φυσιολογικούς ιστούς. Η

CLDN11

περιοχή προαγωγού επίσης υπερμεθυλίωση σε όλες γαστρικού κυτταρικές σειρές καρκίνου που εξετάστηκαν σε σχέση με την κανονική αθανατοποιημένα γαστρικά επιθηλιακά κύτταρα. Επιπλέον,

CLDN11

έκφραση του mRNA ήταν αντιστρόφως ανάλογη με το επίπεδο μεθυλίωσης του. Θεραπεία της

CLDN11

-nonexpressing γαστρικά καρκινικά κύτταρα με 5-αζα-2′-δεοξυκυτιδίνης αποκατασταθεί

CLDN11

έκφρασης. Επιπλέον, siRNA μεσολάβηση νοκ ντάουν του

CLDN11

έκφρασης σε φυσιολογικά γαστρικά επιθηλιακά κύτταρα αυξημένη κινητικότητα και εισβολής τους.

Συμπεράσματα /Σημασία

Αυτά τα στοιχεία υποδηλώνουν ότι η υπερμεθυλίωση του

CLDN11

, οδηγώντας σε κατιούσα ρύθμιση της έκφρασης, συμβάλλει στην γαστρική καρκινογένεση, αυξάνοντας την κυτταρική κινητικότητα και τη διεισδυτικότητα. Μια περαιτέρω κατανόηση των μηχανισμών που διέπουν το ρόλο του κλαουδίνης πρωτεϊνών σε γαστρική καρκινογένεση είναι πιθανό να βοηθήσει στον εντοπισμό νέων προσεγγίσεων για τη διάγνωση και τη θεραπεία του καρκίνου του στομάχου

Παράθεση:. Agarwal R, Mori Υ, Cheng Υ, Jin Ζ, Ολαρού AV, Hamilton JP, et al. (2009) κατασιγάσει του κλαουδίνης-11 συνδέεται με αυξημένη εισβολής κύτταρα γαστρικού καρκίνου. PLoS ONE 4 (11): e8002. doi: 10.1371 /journal.pone.0008002

Επιμέλεια: Φατάχ Kashanchi, George Washington University School of Medicine, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 3 Αυγ του 2009? Αποδεκτές: 23 Οκτ 2009? Δημοσιεύθηκε: 24 Νοεμβρίου 2009

Copyright: © 2009 Agarwal et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από τις Ηνωμένες Πολιτείες Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας χορηγεί CA085069, CA138677 και CA146799 να SJ Μέλτζερ. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Καρκίνος στομάχου (GC) παραμένει η δεύτερη πιο κοινή αιτία θανάτου από καρκίνο παγκοσμίως. Είναι μία από τις πιο θανατηφόρες κακοήθειες και η κύρια αιτία των θανάτων από καρκίνο στις αναπτυσσόμενες χώρες, με συνολικά ποσοστά επιβίωσης 5 ετών κάτω του 20% [1], [2].

Οι μελέτες των GCs και προνεοπλαστική πρόδρομο τους βλάβες έχουν εντοπίσει αρκετές γενετικές και επιγενετικές αλλαγές, συμπεριλαμβανομένης της αστάθειας του μικροδορυφορικού DNA, σημειακές μεταλλάξεις, και η απώλεια της ετεροζυγωτίας (ΑΕ) που επηρεάζουν ογκοκατασταλτικά γονίδια (ΕΠΠΕ) [3] – [6]. Παρ ‘όλα αυτά, η μοριακή παθογένεση του GC είναι ακόμα ανεπαρκώς κατανοητή.

επιγενετικές διαταραχές είναι εξαιρετικά σημαντική για την ανάπτυξη και την εξέλιξη του καρκίνου [7]. Μεταγραφική απενεργοποίηση των ογκοκατασταλτικών γονιδίων μέσω παρεκκλίνουσα υπερμεθυλίωση υποστηρικτής των CpG νησίδων, προκαλώντας μόνιμη αδρανοποίηση των γονιδίων, είναι ένα σημαντικό επιγενετική μηχανισμό της TSG αδρανοποίησης.

Στο παρελθόν, οι μελέτες έχουν δημοσιευθεί σχετικά με υπερμεθυλίωση προαγωγού στην ΔΘ και προκαρκινικές προδρόμων τους [ ,,,0],8] – [10]. p16INK4a και p15INK4B ήταν μεταξύ των πρώτων γονίδια για να δείξει υπερμεθυλίωση στο GCs [11]. Η ομάδα μας και τους άλλους, στη συνέχεια ανακάλυψαν υπερμεθυλίωση του γονιδίου επιδιόρθωσης του hMLH1 DNA σε GCs παρουσιάζουν συχνές αστάθεια μικροδορυφορικού (MSI-H) [12] – [14]. Δείξαμε επίσης ότι η υπερμεθυλίωση του γονιδίου Ε-καντερίνη (Cdh1) εμφανίζεται συχνά σε GCs [15].

Μια έρευνα του γονιδιώματος-ευρεία πιλοτική μικροσυστοιχιών με βάση διεξήχθη από την ομάδα μας, που εκτελούνται για να ανακαλύψουν νέες επιγενετικώς σιγήσει γονιδίων σε γαστρική καρκινογένεση, εντοπίστηκαν κλαουδίνης-11 (

CLDN11

), ένα σφιχτό κόμβο (TJ) πρωτεΐνη, ως πιθανός στόχος των επιγενετικών αδρανοποίησης γαστρικών καρκίνων (αδημοσίευτα δεδομένα).

κλαουδίνης-11 ανήκει στην οικογένεια των κλαουδίνης πρωτεϊνών, το οποίο περιέχει περισσότερα από 23 μέλη. Τα μέλη της οικογένειας κλαουδίνης εκφράζεται σε υψηλά ιστοειδικό τρόπο σε μία ποικιλία φυσιολογικών και νεοπλασματικών ιστών [16]. Claudins είναι διαμεμβρανικές πρωτεΐνες που παίζουν σημαντικό ρόλο στο σχηματισμό και τη λειτουργία TJ. TJs είναι διακυτταρικές συνδέσεις κρίσιμες για τη μεταφορά των διαλυμένων ουσιών παρακυτταρικής, καθώς και στη διατήρηση της κυτταρικής πολικότητας. Τα καρκινικά κύτταρα συχνά παρουσιάζουν δομικές και λειτουργικές ελλείψεις στην TJs τους [17].

Τα τελευταία χρόνια, ένας αριθμός μελετών έχουν αποδείξει την έκτοπον έκφρασιν κλαουδίνης πρωτεϊνών σε διάφορους τύπους καρκίνου [18], [16]. Αρκετές από αυτές τις μελέτες διαπιστώθηκε απορύθμιση της έκφρασης της πρωτεΐνης κλαουδίνης

μέσω

υπερμεθυλίωση προαγωγού. Η υπερμεθυλίωση επαγόμενη αποσιώπηση του κλαουδίνης-7 έκφραση αναφέρθηκε προηγουμένως στο μητρικό [19] και του παχέος [20] καρκινωμάτων. Κλαουδίνης-6 είναι επίσης επιγενετικώς σιγήσει στον καρκίνο του μαστού [21], ενώ claudins -3 και -4 είναι επιγενετικώς ρυθμίζονται στα καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών [22], [23].

Η τρέχουσα εντοπίζει μελέτη και εκθέσεις, να γνώση μας για πρώτη φορά, ότι ο

CLDN11

περιοχή προαγωγέα είναι υπερμεθυλιωμένο σε ιστούς GC και κυτταρικές σειρές. Επιπλέον, ενώ

CLDN11

mRNA εκφράστηκε σε όλα τα πρωτογενή noncancerous γαστρικού βλεννογόνου ιστούς, καθώς και σε μια αθανατοποιημένη φυσιολογικό γαστρικό επιθηλιακή κυτταρική γραμμή, σίγησε σε όλους τους ιστούς GC και εξετάστηκαν κυτταρικές σειρές. Είναι ενδιαφέρον, siRNA μεσολάβηση προς τα κάτω ρύθμιση του

CLDN11

στο

CLDN11

εκφράζοντα γαστρικά κύτταρα συσχετίστηκε επίσης με τον καρκίνο που σχετίζονται με τις αλλαγές φαινοτυπικά, συγκεκριμένα αυξημένη κινητικότητα των κυττάρων και εισβολής.

Υλικά και Μέθοδοι

γραμμές κυττάρων και ιστών Κλινική δείγματα

Απαθανάτισε ανθρώπινη φυσιολογική γαστρικά επιθηλιακά κύτταρα (HFE145) ελήφθησαν από τον Dr. Duane T. Smoot (Πανεπιστήμιο Howard) και GC κυτταρικές σειρές AGS, SIIA, ΜΚΝ28, KATOIII, και SNU-1 ελήφθησαν από την ATCC. Όλες οι κυτταρικές σειρές καλλιεργήθηκαν και διατηρήθηκαν σε RPMI 1640 συμπληρωμένο με 10% εμβρυϊκό ορό βοοειδούς και 1% διάλυμα αντιβιοτικό-αντιμυκητικό (Invitrogen).

Paired πρωτογενή γαστρικού φυσιολογικών και καρκινικών ιστών συλλέχθηκαν στο Νοσοκομείο Johns Hopkins ( JHH). Τα δείγματα καταψύχθηκαν αμέσως μετά την εκτομή.

Ηθική Δήλωση

Johns Hopkins University (JHU) Institutional Review Board (IRB) έγκριση αποκτήθηκε για όλες τις περιπτώσεις που περιλαμβάνονται στη μελέτη. Περιπτώσεις ελήφθησαν από JHU χειρουργικής παθολογίας κάτω JHU IRB-εγκεκριμένη 02-07-19-05e απαλλαγής βάσει του κανόνα 45 CFR 46.101 (β), η οποία παραιτείται από τις απαιτήσεις για τη χορήγηση της συγκατάθεσης του ασθενούς.

Καθαρισμός και προετοιμασία του Γενωμικό DNA και ολικό RNA

το γονιδιακό DNA εξήχθη από snap-κατεψυγμένα δείγματα ιστού ή κυτταρικές σειρές χρησιμοποιώντας ένα DNeasy Blood & amp? Tissue Kit (QIAGEN, Valencia, CA) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Ολικό RNA εκχυλίστηκε με το αντιδραστήριο ΤπζοΙ (Invitrogen). Εξάγεται το DNA και το RNA μετρήθηκαν με ένα NanoDrop ND-1000 Φασματοφωτόμετρο (NanoDrop, Wilmington, DE).

Ποσοτική ειδική της μεθυλίωσης PCR (qMSP) για κλαουδίνης-11

Genomic DNA που ελήφθησαν από 36 δείγματα ασθενών περιλαμβάνει 18 GC και 18 συμφωνημένα noncancerous βλεννογόνου του στομάχου (NS) ιστούς, καθώς επίσης και από διάφορες κυτταρικές σειρές γαστρικού, υποβλήθηκαν σε qMSP. qMSP διεξήχθη όπως περιγράφεται προηγουμένως, με μικρές τροποποιήσεις [24]. Εν συντομία, διθειώδες θεραπεία γονιδιωματικού ΟΝΑ πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ένα EpiTect κατεργασία όξινου θειώδους Kit (QIAGEN, Valencia, CA). Μια MSP amplicon και ανιχνευτή TaqMan να ανιχνεύει τελείως μεθυλιωμένο DNA σχεδιάστηκαν για να περιλαμβάνουν πολλαπλές θέσεις CpG στην περιοχή 5′-UTR του

CLDN11

γονίδιο.

CLDN11

-ειδικών εκκινητών και αλληλουχίες ανιχνευτή που χρησιμοποιήθηκαν ήταν: πρόσθιος εκκινητής 5 ‘CGCGATTGGTCGGCGCGTTTC 3’? αντίστροφο εκκινητή 5 ‘GACGAAAACAACAACGCTACT 3’? TaqMan ανιχνευτής 5’TCGGAGTCGCGGGGTTTAAAGAG 3 ‘. CpGenome καθολική μεθυλιωμένο ϋΝΑ (Chemicon International, Temecula, CA) χρησίμευσε ως θετικός έλεγχος, και διαδοχικές αραιώσεις που χρησιμοποιήθηκαν για να σχεδιαστεί μια πρότυπη καμπύλη. qMSP με ανιχνευτή TaqMan πραγματοποιήθηκαν σε iQ5 θερμικό ανακυκλωτή (BioRad, Hercules, CA) χρησιμοποιώντας iQ Supermix (

ibid.

). Πενήντα κύκλοι ενίσχυσης PCR αρχίζοντας με 50 ng του κατεργασμένου με όξινο θειώδες γονιδιωματικού DNA διεξήχθησαν εις τριπλούν, σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Duplex PCR με αλληλουχίες β-ακτίνης (ACTB) εκκινητή και ανιχνευτή που δεν περιέχουν CpGs διεξήχθησαν για ομαλοποίηση. Οι αλληλουχίες εκκινητών και ανιχνευτών που χρησιμοποιήθηκαν ήταν όπως δημοσιεύθηκε προηγουμένως [24]. Κανονικοποιημένη τιμή μεθυλίωσης (NMV) ορίστηκε ως εξής: NMV = (

CLDN11-S

/

CLDN11-FM

) /(

ACTB-S

/

ACTB -FM

) * 100, όπου

CLDN11-S

και

CLDN11-FM

αντιπροσωπεύουν

CLDN11

επίπεδα μεθυλίωσης στο δείγμα και πλήρως μετουσιωμένο DNA, αντίστοιχα, ενώ

ACTB-S

και

ACTB-FM

αντιστοιχούν σε

β-ακτίνης

στο δείγμα και πλήρως μετουσιωμένο DNA, αντίστοιχα. Ολόκληρο-γονιδιώματος ενισχυμένου DNA (WGA) χρησιμοποιήθηκε ως μη μεθυλιωμένη αρνητικός μάρτυρας.

Ποσοτική PCR αντίστροφης μεταγραφής-Ανάλυση

Το

CLDN11

αμπλικόνιο RT-PCR σχεδιάστηκε για να επικαλύπτει ένα σύνορο ιντρονίου-εξονίου, προκειμένου να αποκλείσει γονιδιακό DNA (

ζ

DNA) ενίσχυση. Primer αλληλουχίες, όπως δημοσιεύεται προηγουμένως [18]. One-βήμα qRT-PCR διεξήχθη όπως περιγράφηκε προηγουμένως [24], με τη χρήση Quantitect SYBRA RT-PCR κιτ (Qiagen, Valencia, CA), σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή.

CLDN11

έκφραση ομαλοποιήθηκε να

β

ακτίνης έκφρασης. Ολικό RNA από κύτταρα HFE145 χρησιμοποιήθηκε για την πρότυπη καμπύλη. (

CLDN11-S

/

CLDN11-C

) /(

ACTB-S

/

ACTB-C

), όπου

CLDN11- S

και

CLDN11-C

αντιπροσωπεύουν

CLDN11

επίπεδα έκφρασης του mRNA των mRNAs του δείγματος δοκιμής και ελέγχου, αντίστοιχα, ενώ η

ACTB-S

και

ACTB -C

αντιστοιχούν στο

επίπεδα έκφρασης β-ακτίνης στα mRNAs δείγμα δοκιμής και ελέγχου, αντίστοιχα.

5-Αζα-2′-δεοξυκυτιδίνη (5-Αζα-dC) Θεραπεία

AGS είναι μια κυτταρική γραμμή GC εκδηλώνεται υπερμεθυλίωση του

CLDN11

υποκινητή σε συνδυασμό με απούσα

CLDN11

έκφραση του mRNA. 5-αζα-2′-δεσοξυκυτιδίνη (5-αζα-dC) επεξεργασία των κυττάρων πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [24]. Εν συντομία, η κυτταρική γραμμή GC AGS (ATCC αριθμός καταλόγου CRL-1739) εμβολιάζεται σε πυκνότητα 2 × 10

5 κύτταρα /ml σε μια φιάλη Τ-75. Εικοσιτέσσερις ώρες αργότερα, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 1 μΜ 5-αζα-DC για 72 ώρες. Τα μέσα που περιέχουν 5-αζα-dC αντικαταστάθηκε με προσφάτως παρασκευασμένων μέσων κάθε 24 ώρες. Τα κύτταρα στη συνέχεια συλλέχθηκαν για ολική εκχύλιση RNA. Ολικά RNA από κύτταρα AGS πριν και μετά τη θεραπεία 5-αζα-dC υποβλήθηκαν σε ποσοτική ανάλυση σε πραγματικό χρόνο RT-PCR.

μικρό παρεμβαλλόμενο RNA Νοκ ντάουν Πειράματα

CLDN11

-ειδικές oligos siRNA αγοράστηκαν από Ambion, Inc. (Austin, ΤΧ). Η κυτταρική γραμμή HFE145, η οποία είναι

CLDN11

θετική, επιλέχτηκε για να μελετηθεί η επίδραση της κλαουδίνης-11 knockdown για τη μετανάστευση και εισβολή ιδιότητες των γαστρικών κυττάρων. Τα πειράματα διεξήχθησαν όπως περιγράφεται προηγουμένως (Agarwal

et al.

, 2005). Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε τρυβλία 6 φρεατίων επιμολύνθηκαν με siRNA δίπολα χρησιμοποιώντας LipofectAMINE 2000 (Invitrogen), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Mock-επιμολύνσεις και μη ειδική siRNA δίπολα χρησιμοποιήθηκαν ως αρνητικοί έλεγχοι. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή για 48 έως 72 ώρες για να επιτρέψει τη μέγιστη knockdown, μετά την οποία είχαν είτε συλλέχθηκαν για ανάλυση Western blot ή να χρησιμοποιηθούν για δοκιμασίες μετανάστευσης και εισβολής.

Western Blot ανάλυση των κλαουδίνης-11 σε γαστρικό Κυτταρικές Γραμμές

κυτταρικές καλλιέργειες Συρρέουσες πλύθηκαν με HBSS (Invitrogen) και τα προϊόντα λύσης ολικού κυττάρου έγιναν χρησιμοποιώντας ρυθμιστικό διάλυμα λύσης: 62,5 mmol /L Tris-HCl (ρΗ 6.8), 10% γλυκερόλη, και 2% SDS. Η συγκέντρωση πρωτεΐνης προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας ένα κιτ δοκιμασίας δικιγχονινικού οξέος (BCA) (Pierce, Rockford, IL). Είκοσι μικρογραμμάρια ολικών πρωτεϊνών διαχωρίστηκαν με 10% έως 20% SDS-PAGE σε πηκτώματα Τπδ-Γλυκίνη (Invitrogen) και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες διφθοριούχου πολυβινυλιδενίου (Millipore Corp., Bedford, ΜΑ). Οι μεμβράνες αποκλείστηκαν με 5% άπαχο ξηρό γάλα, πλύθηκαν σε ρυθμιστικό TBST, και ανιχνεύθηκαν με αντι-κλαουδίνης-11 αντίσωμα (Zymed, San Francisco, CA). Οι κηλίδες στη συνέχεια πλύθηκαν και επωάστηκαν σε χρένο δευτερεύον αντίσωμα συζευγμένο με υπεροξειδάση (αντι-κουνελιού IgG: 1:10,000? Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ). Για την ανίχνευση, χημειοφωταύγειας διεξήχθη χρησιμοποιώντας ένα ενισχυμένο κιτ χημειοφωταύγειας (Amersham Pharmacia Biotech).

εισβολής κυττάρων και μετανάστευση Δοκιμασία

εισβολής siRNA επιμολυσμένα κύτταρα προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας επικαλυμμένα με Matrigel ένθετα θαλάμου εισβολή (24-καλά-format με 8-μm πόρους, BD Biosciences) χρησιμοποιώντας μια τροποποιημένη δοκιμασία θαλάμου Boyden [25]. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε περίπου 80% συρροή και άνευ ορού όλη τη νύκτα. Την ημέρα της δοκιμασίας, τα κύτταρα θρυψινοποιήθηκαν και μετρήσεις βιώσιμων κυττάρων που λαμβάνονται. Περίπου 50.000 κύτταρα επιστρώθηκαν πάνω στην κορυφή του καθενός από κάθε φίλτρου σε μέσο χωρίς ορό. Ένας ίσος όγκος του ιδίου μέσου που περιείχε 20% FCS τοποθετήθηκε στον κάτω θάλαμο (

δηλ.

, Το καλά κάτω από το φίλτρο) να ενεργεί ως χημειοελκτικό. Οι πλάκες δοκιμασίας επωάζονται στους 37 ° C για μέχρι 48 ώρες. Κύτταρα που δεν μεταναστεύουν ή εισβάλλουν μέσω των πόρων των ενθέτων Transwell με το χέρι απομακρύνθηκαν με ένα βαμβάκι. Κύτταρα παρόν στο κάτω μέρος της μεμβράνης μονιμοποιήθηκαν σε ψυχρή μεθανόλη για 10 λεπτά και στη συνέχεια χρωματίζονται με 0,01% κρυσταλλικό ιώδες σε 20% αιθανόλη. Μετά από 10 λεπτά επώαση, τα φίλτρα πλύθηκαν καλά με νερό και αιωρήθηκε σε 200 μΙ 5% οξικό οξύ και 5% μεθανόλη. Χρωματομετρική αναγνώσεις λήφθηκαν σε OD

595. Τα πειράματα επαναλήφθηκαν τουλάχιστον τρεις φορές, με τριπλούν σε κάθε πείραμα. Για να αξιολογηθεί η κυτταρική μετανάστευση, οι προσδιορισμοί διεξήχθηκαν ουσιαστικά όπως παραπάνω, εκτός του ότι τα κύτταρα επιστρώθηκαν πάνω σε μη επικαλυμμένων (Matrigel χωρίς) ένθετα.

Στατιστική Ανάλυση

Οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση t του Student -test (SPSS, έκδοση 16), με το

σ

& lt?. 0.05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική

Αποτελέσματα και Συζήτηση

Εμείς δοκιμάστηκε για πρώτη φορά την υπόθεσή μας ότι η

CLDN11

προαγωγός υπερμεθυλίωση και ότι αυτή η υπερμεθυλίωση συσχετίζεται αντίστροφα με την

CLDN11

έκφραση του mRNA σε πρωτογενείς ιστούς GC. Αξιόπιστες πρωτογενή γαστρικού φυσιολογικών και καρκινικών ιστών συλλέχθηκαν στο Johns Hopkins Hospital (JHH). Τα δείγματα ελήφθησαν αμέσως μετά την εκτομή και snap-κατεψυγμένα μέχρι τη χρήση. Μόνο περιπτώσεις που λαμβάνονται με ενημερωμένη συγκατάθεση, όπως εγκρίθηκε από το Διοικητικό Συμβούλιο αναθεώρηση Θεσμικών (IRB) συμπεριλήφθηκαν σε αυτό το έργο. Γενωμική DNA που ελήφθησαν από 36 κλινικά δείγματα, που αποτελείται από 18 GC και 18 ταιριάζουν noncancerous γαστρικού βλεννογόνου (NS) ιστούς.

CLDN11

επίπεδα μεθυλίωσης προαγωγό σε αυτά τα δείγματα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας ποσοτική πραγματικού χρόνου μεθυλίωσης-ειδική PCR (qMSP). Το Σχήμα 1Α απεικονίζει την κανονικοποιημένη τιμή μεθυλίωσης (NMV),

δηλ.

, Ο λόγος της μεθυλιωμένης αξίας του

CLDN11

περιοχή υποκινητή σε κάθε δείγμα σε μια πλήρως μεθυλιωμένο DNA ελέγχου.

CLDN11

NM

Vs

ήταν σημαντικά υψηλότερα σε δείγματα GC ό, τι σε αντιστοιχία ιστούς τους NS (

P

& lt? 0.001). Για να εκτιμηθεί κατά πόσον

CLDN11

υπερμεθυλίωση προαγωγού σε GCs συνδέθηκε με αποσιώπηση του

CLDN11

έκφρασης,

CLDN11

επίπεδα mRNA μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας ποσοτική πραγματικού χρόνου (qRT-PCR) σε RNAs που εξάγονται από τα 36 δείγματα που χρησιμοποιούνται για την ανάλυση μεθυλίωσης. Όπως καταδεικνύεται στο Σχήμα 1Β, κανονικοποιημένες τιμές έκφρασης (Νεφς) του

CLDN11

σε δείγματα GC ήταν σημαντικά χαμηλότερα από ό, τι σε ζεύγη δειγμάτων NS (

P

& lt? 0.001). Αυτά τα δεδομένα διαπιστώσει ότι

CLDN11

υπερμεθυλίωση προαγωγού συσχετίζεται με μειωμένη ή σιγήσει

CLDN11

έκφραση mRNA σε πρωτογενή GCs.

Αυτό το σχήμα δείχνει τη μεθυλίωση προαγωγού και τα επίπεδα έκφρασης του mRNA της

CLDN11

σε ζεύγη γαστρικό καρκίνο (GC) και noncancerous γαστρικού βλεννογόνου (NS) ιστούς. Α) Ποσοτική μεθυλίωσης-ειδική PCR (qMSP) για

CLDN11

στην πρωτοβάθμια ιστούς. Γονιδιωματικό ϋΝΑ που εξάγεται από 18 GC και 18 συμφωνημένα ιστοί NS υποβλήθηκαν σε ανάλυση χρησιμοποιώντας qMSP MSP amplicon και TaqMan ανιχνευτής σχεδιάστηκε για να συμπεριλάβει πολλαπλές θέσεις CpG στην περιοχή 5′-UTR του

CLDN11

γονίδιο. CpGenome καθολική μεθυλιωμένο ϋΝΑ (Chemicon International, Temecula, CA) χρησιμοποιήθηκε ως ένα πλήρως μεθυλιωμένα θετικός έλεγχος. Duplex PCR με αλληλουχίες β-ακτίνης (ACTB) εκκινητή και ανιχνευτή που δεν περιέχουν CpGs διεξήχθησαν για ομαλοποίηση. Κανονικοποιημένη τιμή μεθυλίωσης (NMV) ορίστηκε ως εξής: NMV = (

CLDN11-S

/

CLDN11-FM

) /(

ACTB-S

/

ACTB -FM

) * 100, όπου

CLDN11-S

και

CLDN11-FM

αντιπροσωπεύουν

CLDN11

επίπεδα μεθυλίωσης στο δείγμα και πλήρως μετουσιωμένο DNA, αντίστοιχα, ενώ

ACTB-S

και

ACTB-FM

αντιστοιχούν σε

β-ακτίνης

στο δείγμα και πλήρως μετουσιωμένο DNA, αντίστοιχα. Αυτή η μονοδιάστατη διάγραμμα διασποράς δείχνει σημαντικά υψηλό

CLDN11

επίπεδα μεθυλίωσης υποστηρικτής στα δείγματα GC σε σύγκριση με τα δείγματα NS (

P

& lt?

0.001

). Ολόκληρο-γονιδίωμα ενισχυμένου DNA (WGA) που χρησιμοποιείται ως ένα μη μεθυλιωμένο αρνητικός έλεγχος δεν έδειξε καμία ενίσχυση. Η

P

αξία υπολογίστηκε με τη χρήση t-test του Student ζεύγη. Β)

CLDN11

έκφραση mRNA σε γαστρικό ιστούς. Το συνολικό RNA που εξάγεται από 18 ζεύγη NS και δείγματα GC υποβλήθηκαν σε

CLDN11

συγκεκριμένο RT-PCR.

CLDN11

έκφραση mRNA ομαλοποιήθηκε στο

β-ακτίνης

έκφραση mRNA σε κάθε δείγμα. Η

P

αξία υπολογίστηκε με τη χρήση t-test του Student ζεύγη. Το οικόπεδο αυτό αποδεικνύει ότι οι

CLDN11

επίπεδα έκφρασης του mRNA ήταν σημαντικά χαμηλότερα σε μη ανιχνεύσιμα στα δείγματα GC, ενώ τα περισσότερα από τα αντίστοιχα δείγματα NS είχαν ανιχνεύσιμα

CLDN11

επίπεδα του mRNA (

P

& lt?

0.001

). Γ) οικόπεδο 2D-διασποράς μεθυλίωσης υποκινητή και αξιών έκφραση mRNA σε ιστούς GC.

CLDN11

αποσιώπηση της έκφρασης του mRNA συνδέεται με υπερμεθυλίωση προαγωγού σε ασθενείς GC. Αυτό το δισδιάστατο διάγραμμα διασποράς δείχνει τιμές NEV (Υ-άξονας) και τις αξίες NMV (άξονας Χ) στα 18 ζεύγη NS και δείγματα GC.

Η

Στη συνέχεια, θα αξιολογηθούν

CLDN11

μεθυλίωση προαγωγού και έκφραση σε κυτταρικές σειρές γαστρικού. Απαθανάτισε ανθρώπινη φυσιολογική γαστρικά επιθηλιακά κύτταρα (HFE145) και κυτταρικές γραμμές GC AGS, SIIA, ΜΚΝ28, KATOIII, και SNU-1 μελετήθηκαν. Όλες οι κυτταρικές γραμμές που εξετάστηκαν GC (AGS, SIIA, ΜΚΝ28, KATOIII, και SNU-1) έδειξε υπερμεθυλίωση προαγωγού, ενώ δεν παρατηρήθηκε μεθυλίωσης σε αθανατοποιημένα κανονική HFE145 κύτταρα (Σχήμα 2Α).

CLDN11

επίπεδα mRNA εκτιμήθηκαν χρησιμοποιώντας qRT-PCR σε RNA που καθαρίστηκε από τις κυτταρικές γραμμές, ενώ κλαουδίνης-11 πρωτεϊνική έκφραση αναλύθηκε με κηλίδωση Western. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2Β, οι 5 σειρές καρκίνου δεν παρουσίασαν ανιχνεύσιμη έκφραση του

CLDN11

mRNA ή πρωτεΐνης, ενώ HFE145 κύτταρα εκδηλώνεται υψηλό

CLDN11

επίπεδα έκφρασης. Το εύρημα αυτό αποδεικνύει ότι

CLDN11

είναι συντονισμένα υπερμεθυλιωμένο και προς τα κάτω σε GC κυτταρικές γραμμές σε σχέση με το φυσιολογικό γαστρικό επιθηλιακά κύτταρα (NGECs).

Αυτό το σχήμα δείχνει τη μεθυλίωση προαγωγού κλαουδίνης-11, τα επίπεδα έκφρασης του mRNA και έκφραση της πρωτεΐνης στο γαστρικό κύτταρα γραμμές. Α) Ποσοτική μεθυλίωσης-ειδική PCR (qMSP) για

CLDN11

. Γενωμικό DNAs απομονώθηκε από αθανατοποιημένα ανθρώπινα κανονικά γαστρικά επιθηλιακά κύτταρα (HFE145) και κυτταρικές γραμμές GC AGS, SIIA, ΜΚΝ28, KATOIII, και SNU-1 που λαμβάνεται από την ATCC αναλύθηκαν με qMSP. Αυτό το σχήμα δείχνει ότι η περιοχή προαγωγού του

CLDN11

γονίδιο υπερμεθυλίωση σε όλες τις κυτταρικές GC γραμμών σε σχέση με HFE145 κύτταρα. Β)

CLDN11

έκφραση mRNA σε γαστρικό κυτταρικές σειρές. Ολικά RNAs από διαφορετικές κυτταρικές σειρές γαστρικού υποβλήθηκαν σε ποσοτική πραγματικού χρόνου RT-PCR ανάλυση. Όπως μπορεί να φανεί σε αυτό το σχήμα, HFE145 κύτταρα εξέφρασαν πολύ υψηλά επίπεδα του

CLDN11

mRNA, ενώ οι πέντε καρκινικές κυτταρικές γραμμές που εξετάστηκαν είχαν

CLDN11

έκφραση πολύ χαμηλά ή μη ανιχνεύσιμα mRNA. Γ) Ανάλυση Western blot της κλαουδίνης-11 έκφραση σε κυτταρικές σειρές γαστρικού. Σύνολο κυτταρολύματα που λαμβάνονται από διάφορες κυτταρικές σειρές γαστρικού ανιχνεύθηκαν με το αντίσωμα αντι-κλαουδίνης-11. Αυτό το σχήμα δείχνει ότι, ενώ η αθανατοποιημένη κανονική γαστρικού επιθηλίου κυτταρική σειρά, HFE145, εκφρασμένη άφθονη πρωτεΐνη κλαουδίνης-11, δεν θα μπορούσε να ανιχνευθεί σε διάφορες κυτταρικές σειρές GC. Αντι-β-ακτίνης αντίσωμα χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης.

Η

Για να επικυρώσετε την περαιτέρω αποσιώπηση της

CLDN11

έκφραση με υπερμεθυλίωση, θα αντιμετωπίζεται το κύτταρο GC γραμμή AGS με τον παράγοντα απομεθυλίωσης, 5-αζα-2-δεοξυκυτιδίνη (5-αζα-dC, 1 μΜ), για διάφορα χρονικά διαστήματα. Ολικά RNA εξάγεται πριν από

vs.

Μετά τη θεραπεία υποβλήθηκαν σε qRT-PCR για

CLDN11

. Όπως μπορεί να φανεί στο Σχήμα 3, σε κάθε χρονικό σημείο,

CLDN11

mRNA έγινε εκ νέου εκφράζεται κατά την αγωγή με 5-αζα-dC, επιβεβαιώνοντας ότι

CLDN11

έχει σιγήσει υπερμεθυλίωση προαγωγού στην AGS GC κύτταρα.

AGS είναι μια κυτταρική γραμμή GC εκδηλώνεται υπερμεθυλίωση το

CLDN11

υποκινητή σε συνδυασμό με απούσα

CLDN11

έκφραση του mRNA. Αυτά τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 5-αζα-dC, ένα παγκόσμιο παράγοντα απομεθυλίωσης. Ολικό RNA από κύτταρα AGS πριν και μετά τη θεραπεία 5-αζα-άΟ υποβλήθηκαν σε ποσοτική πραγματικού χρόνου RT-PCR ανάλυση για

CLDN11

έκφραση mRNA. Η

Υ-άξονας

αντιπροσωπεύει τη μέση μεταβολή φορές στα επίπεδα έκφρασης του

CLDN11

mRNA μετά από αγωγή 5-αζα-dC σε διάφορα χρονικά σημεία, σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα. κύτταρα AGS, όταν υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 5-αζα-dC, εμφάνισαν μια εξαρτώμενη από το χρόνο αύξηση του

CLDN11

έκφραση mRNA μέχρι 72 ώρες της θεραπείας. Αυτή η αποκατάσταση του

CLDN11

έκφραση μετά από 5-αζα-dC θεραπείας υποστηρίζει την υπόθεσή μας ότι κλαουδίνης-11 σιγήσει υπερμεθυλίωση προαγωγού σε κύτταρα GC.

Η

Τα μέλη της οικογένειας πρωτεϊνών κλαουδίνης έχουν έχουν εμπλακεί στη ρύθμιση της κυτταρικής προσκόλλησης, εισβολή και τη μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων [25] – [27]. Ως εκ τούτου, είμαστε δίπλα διερευνηθεί εάν

CLDN11

κινητικότητα επιρροές κυττάρων ή εισβολής. HFE145 κύτταρα, τα οποία εκφράζουν άφθονο

CLDN11

, επιλέχθηκαν για τη μελέτη των επιπτώσεων της

CLDN11

νοκ ντάουν στις επεμβατικές και μεταναστευτικές ιδιότητες των γαστρικών επιθηλιακών κυττάρων. Παροδικές διαμολύνσεις siRNA διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας

CLDN11-

ειδικά δίπολα siRNA. Επιμόλυνση με

CLDN11

-ειδικά siRNA διπόλων αποτελεσματικά καταστέλλονται κλαουδίνης-11 επίπεδα πρωτεΐνης με & gt? 90%, ενώ η έκφραση παρέμεινε αμετάβλητος σε ψευδώς ή να ελέγχουν τα κύτταρα siRNA-αγωγή (Εικόνα 4Α). προσδιορισμούς κυττάρων κινητικότητα και εισβολή διεξήχθησαν σε κύτταρα siRNA επιμολυσμένα χρησιμοποιώντας ένα τροποποιημένο σύστημα δοκιμασίας Boyden θαλάμου [25]. Είναι ενδιαφέρον ότι, όπως φαίνεται στα Σχήματα 4Β και 4C, η αναστολή της

CLDN11

έκφραση σε HFE145 κυττάρων αυξήθηκε σημαντικά τα μεταναστευτικά και επεμβατικές δυνατότητες αυτών των κυττάρων, αντίστοιχα.

HFE145 κυτταρική γραμμή, η οποία είναι claudin- 11 θετικές επιλέχθηκε για τη μελέτη του ρόλου των κλαουδίνης-11 knockdown για τη μετανάστευση και εισβολή ιδιότητες των γαστρικών κυττάρων. Τα κύτταρα επιμολυσμένα με

CLDN11

συγκεκριμένο ολίγο siRNA. Mock επιμολύνσεις και μη ειδική siRNA δίπολα χρησιμοποιήθηκαν ως αρνητικοί έλεγχοι. Α) Ανάλυση Western blot του siRNA μεσολαβεί κλαουδίνης-11 knock-down στο HFE145 κύτταρα. HFE145 κύτταρα επιμολύνθηκαν με

CLDN11

– ειδικά και μη-ειδικά δίπολα siRNA ελέγχου, όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. Μετά από 48 έως 72 ώρες, το σύνολο των προϊόντων λύσης κυττάρου παρασκευάστηκαν και αναλύθηκαν για έκφραση κλαουδίνης-11. Η επιμόλυνση του κλαουδίνης ειδικά oligos siRNA είχε ως αποτέλεσμα & gt? 90% μείωση στην έκφραση της πρωτεΐνης, ενώ τα επίπεδα της κλαουδίνης πρωτεΐνης στα κύτταρα ελέγχου δεν μεταβλήθηκαν σημαντικά. Β) δοκιμασία κυττάρων Boyden θάλαμο εισβολής. Η ικανότητα εισβολής των siRNA-επιμολυσμένα κύτταρα προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας θάλαμο με Matrigel εισβολής, χρησιμοποιώντας μία τροποποιημένη δοκιμασία θαλάμου Boyden. Τα πειράματα επαναλήφθηκαν τουλάχιστον τρεις φορές, με τριπλούν σε κάθε πείραμα. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύονται εδώ είναι η μέση μεταβολή φορές σε εισβολή των siRNA-επιμολυσμένα κύτταρα σε σύγκριση με τα ψευδο επιμολύνσεις. Όπως καταδεικνύεται στο σχήμα αυτό, siRNA knockdown του κλαουδίνης-11 οδηγεί σε μια αύξηση στην κυτταρική εισβολή HFE145 κυττάρων. Γ) Δύο θάλαμο δοκιμασίας κυτταρικής μετανάστευσης. Τα αποτελέσματα του κλαουδίνης-11 knockdown για τη μετανάστευση των κυττάρων HFE145 συγκρίθηκαν με μέτρηση του αριθμού των κυττάρων που μεταναστεύουν μέσω των μη επικαλυμμένων φίλτρων (αντί των φίλτρων matrigel-επικάλυψη). Οι ράβδοι σε αυτό το σχήμα αντιπροσωπεύουν μέσες φορές αλλαγή στη μετανάστευση των κυττάρων siRNA επιμολυσμένα σύγκριση με τα ψευδο-μεταμολυσμένα κύτταρα ελέγχου. Όπως μπορεί να φανεί σε αυτό το σχήμα, η μείωση του κλαουδίνης-11 επίπεδα της πρωτεΐνης σχετίζεται με αυξημένη κινητικότητα των κυττάρων.

Η

Η τρέχουσα μελέτη έτσι επιβεβαιώνει την υπόθεση ότι

CLDN11

, μια σφιχτή πρωτεΐνη διασταύρωση, έχει σιγήσει στο GC μέσω υπερμεθυλίωση προαγωγού, και αυτά τα δεδομένα υποστηρίζουν τη συμμετοχή των

CLDN11

στον έλεγχο της κυτταρικής GC εισβολής και της μετανάστευσης

Ανάδοχος υπερμεθυλίωση είναι γνωστό ότι σχετίζονται. με μεταγραφική αποσιώπηση ορισμένων γονιδίων. Μεθυλίωσης του DNA μπορεί να παρεμβαίνουν με πρόσδεση των παραγόντων μεταγραφής των οποίων οι θέσεις σύνδεσης περιέχουν CpG δινουκλεοτίδια. Χρησιμοποιώντας το πρόγραμμα λογισμικού TFSEARCH, εμείς σαρωθεί το

CLDN11

αλληλουχία βρέθηκε να υπερμεθυλίωση στο γαστρικό καρκινικούς ιστούς και κυτταρικές σειρές,

δηλαδή

., Το αμπλικόνιο qMSP (-104 έως +4 βάσεων σε σχέση με το η μεταγραφική θέση έναρξης για

CLDN11

). Αυτή η σάρωση προσδιορίζονται υποθετικές θέσεις πρόσδεσης για Sp1 και GATA-1 και GATA-2. Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι η υπερμεθυλίωση προαγωγέα DNA συμβάλλει στην αποσιώπηση του

CLDN3

και

CLDN4

σε κυτταρικές σειρές των ωοθηκών, εν μέρει

μέσω

μεθυλίωσης επαγόμενη διατάραξη της δέσμευσης του Sp1 να συγγενές θέση σύνδεσης του (22, 23). Επιπλέον, τα μέλη της οικογένειας ΟΑΤΑ έχει αποδειχθεί ότι είναι θετικοί ρυθμιστές του

CLDN11

μεταγραφής [28]. Περαιτέρω μελέτες είναι πλέον επιβεβλημένη προκειμένου να αξιολογήσει κατά πόσον υπερμεθυλίωση αυτών των χώρων παρεμποδίζει τη σύνδεση των μεταγραφικών παραγόντων, και πως μια τέτοια διαταραχή μπορεί να επηρεάσει

CLDN11

μεταγραφή του γονιδίου.

Τα καρκινικά κύτταρα συνήθως εμφανίζουν δομικές και λειτουργικές ανεπάρκειες στην TJs τους [17]. Αυτές οι ελλείψεις που σχετίζονται με την απώλεια της πολικότητας και της διαφοροποίησης. Ένας άλλος σημαντικός σύνδεσμος μεταξύ TJs και του καρκίνου είναι η απώλεια της ακεραιότητας TJ, με επακόλουθη διαρροή ή μεταφορά των προ-ογκογόνων ουσίες (όπως αυξητικοί παράγοντες ή θρεπτικών ουσιών) για την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων primordia, την προώθηση της ανάπτυξης του όγκου [29]. Επιπλέον, η απώλεια της πολικότητας, διαφοροποίηση, και συγκολλητικές ιδιότητες που συνδέονται με ελαττωματική λειτουργία TJ στον καρκίνο μπορεί να είναι κρίσιμη για την απόκτηση ενός μεταστατικού φαινοτύπου [30]. Μελέτες έχουν δείξει ότι ανωμαλίες σε TJ-συνδεόμενες πρωτεΐνες μπορεί να αντιπροσωπεύουν επιθηλιακά-μεσεγχυματικά μετάβαση (ΕΜΤ), αλλάζοντας έτσι τη διεισδυτικότητα και την κινητικότητα των καρκινικών κυττάρων.

Μετατροπίες στην έκφραση του TJ-σχετίζονται πρωτεΐνες, ιδιαίτερα κλαουδίνης πρωτεΐνες, έχουν δειχθεί σε έναν αριθμό καρκίνων. Πρόσφατες μελέτες από εμάς και άλλους έχουν δείξει μεταβολές στην κλαουδίνης ρύθμιση πρωτεΐνη σε διάφορους καρκίνους επιθηλιακής [18]. Τα μέλη της οικογένειας κλαουδίνης γονίδιο που εκφράζεται σε ένα εξαιρετικά ιστοειδική, καθώς και μια πολύ αναπτυξιακό στάδιο-ειδικό, τρόπο. Επιπλέον, ανάλογα με τον τύπο του καρκίνου, η έκφραση των πρωτεϊνών κλαουδίνης μπορεί να είναι είτε απορυθμίζεται ή κατιούσα ρύθμιση σε καρκινικά κύτταρα. Για παράδειγμα, αρκετές κλαουδίνης πρωτεΐνες υπερεκφράζονται σε καρκίνους του παχέος εντέρου, των ωοθηκών, του παγκρέατος και του προστάτη, ενώ μερικά είναι προς τα κάτω ρυθμισμένη στον καρκίνο του μαστού και καρκίνοι της κεφαλής και του αυχένα [16], [18]

Μελέτες έχουν αναφερθεί στο παρελθόν αλλαγές στην έκφραση προφίλ των μελών της οικογένειας κλαουδίνης να συνδέεται με GC. Σειριακή ανάλυση της έκφρασης γονιδίων (SAGE) προσδιόρισε το

CLDN18

γονιδίου ως μειωτικά στο GCs διαθέτει ένα εντερικό φαινότυπο [31]. Η

CLDN23

γονίδιο είναι επίσης προς τα κάτω σε GCs εντερικού τύπου [32]. Αντίθετα, Cunningham

et al.

Αναφερθεί

CLDN4

έκφραση να αυξηθεί σε εντερική μεταπλασία και του γαστρικού επιθηλίου δυσπλασία, τον εντοπισμό του γονιδίου αυτού ως δείκτη των πρόδρομων GC βλαβών [33]. Στην παρούσα μελέτη, βρήκαμε

CLDN11

έκφρασης πρέπει να ρυθμίζεται προς τα κάτω ή να σιγήσει στο GC

μέσω

υπερμεθυλίωση της περιοχής του υποκινητή του. Επιπλέον, βρήκαμε ότι σε αντίθεση με

CLDN18

και

CLDN23

,

CLDN11

έκφραση προς τα κάτω σε δείγματα ασθενών GC καθώς και σε κυτταρικές σειρές, ανεξαρτήτως της διάχυτης

vs .

εντερική υπότυπο.

κλαουδίνης-11, επίσης γνωστή ως ολιγοδενδροκυττάρων-ειδική πρωτεΐνη, εντοπίστηκε για πρώτη φορά να εκφράζεται ειδικώς στις σφικτές κλώνους διασταύρωση των ολιγοδενδροκυττάρων στον εγκέφαλο και σε κύτταρα Sertoli των αρουραίων και ποντικών [ ,,,0],34], [35]. Η απώλεια της έκφρασης κλαουδίνης-11, που οδηγεί σε διάσπαση του φράγματος TJ, συνδέεται με νευρολογικές και αναπαραγωγική ελλείμματα [36]. Μια πρόσφατη μελέτη ανέφερε υπερέκφραση και ο εσφαλμένος εντοπισμός του

CLDN11

από το φράγμα αίματος-όρχεων σε κύτταρα Sertoli για να συνδέονται με ενδοεπιθηλιακή νεοπλασία όρχεων σε άνδρες [37]. Τα δεδομένα στην παρούσα μελέτη αποδεικνύει ότι

CLDN11

εκφράζεται σε φυσιολογικό γαστρικό ιστούς και απαθανάτισε NGECs. Ωστόσο, τις πλήρεις λειτουργίες της στην κανονική του στομάχου, καθώς και σε γαστρική καρκινογένεση παραμένουν ασαφείς.

Σε μια προσπάθεια να διερευνήσει την πιθανή συμμετοχή του

CLDN11

σε GC, μελετήσαμε φαινοτυπικές αλλαγές που σχετίζονται με την αποσιώπηση της

CLDN11

έκφραση στο

CLDN11-

εκφράζουν γαστρικά επιθηλιακά κύτταρα (HFE145). Πολύ ενδιαφέροντα τρόπο, siRNA μεσολάβηση knockdown του

CLDN11

οδήγησε σε αυξημένη κινητικότητα κυττάρων και εισβολή.

Προηγούμενες μελέτες έχουν αναφέρει ειδική για τον καρκίνο φαινοτυπικές αλλαγές που πρέπει να συνδέονται με διακυμάνσεις στο κλαουδίνης έκφραση σε διάφορους τύπους καρκίνου . Η υπερέκφραση του κλαουδίνης-3 και κλαουδίνης-4 πρωτεϊνών σε κυτταρικές γραμμές καρκίνου ωοθηκών ως αποτέλεσμα αυξημένη εισβολή από αυτά τα κύτταρα [25].