Αφηρημένο

Mesothelin, ένα αντιγόνο διαφοροποίησης παρούσα σε μια σειρά από κακοήθειες όπως το μεσοθηλίωμα, των ωοθηκών, του πνεύμονα και του παγκρέατος, έχει μελετηθεί ως ένας δείκτης για τη διάγνωση και ένας στόχος για ανοσοθεραπεία. Εμείς, ωστόσο, ενδιαφέρθηκαν για την αξιολόγηση των αποτελεσμάτων της άμεσης στόχευσης του Mesothelin στην βιωσιμότητα των καρκινικών κυττάρων ως το πρώτο βήμα προς την ανάπτυξη μιας νέα θεραπευτική στρατηγική. Αναφέρουμε εδώ ότι το γονίδιο ειδικού σίγηση για Mesothelin με διαφορετικές μεθόδους (siRNA και microRNA) μειωμένη βιωσιμότητα των καρκινικών κυττάρων από διαφορετικές προελεύσεις, όπως μεσοθηλίωμα (H2373), ο καρκίνος των ωοθηκών (Skov3 και Ovcar-5) και του καρκίνου του παγκρέατος (MIAPaCa2 και Panc-1 ). Επιπλέον, η διεισδυτικότητα των καρκινικών κυττάρων μειώθηκε επίσης σημαντικά κατά την εν λόγω θεραπεία. Στη συνέχεια ερευνήθηκε προ-ογκογόνο χαρακτηριστικά σηματοδότηση των κυττάρων κατά mesothelin-σίγηση η οποία αποκάλυψε μια σημαντική μείωση της φωσφο-ERK1 και ΡΙ3Κ /ΑΚΤ δραστικότητα. Ο μοριακός μηχανισμός της μειωμένης διεισδυτικότητας συνδέθηκε με την μειωμένη έκφραση του β-κατενίνης, ένας σημαντικός δείκτης της ΕΜΤ (επιθηλιακό-μεσεγχυματικά μετάβαση). Ero1, μια πρωτεΐνη που εμπλέκεται στην εκκαθάριση διπλωμένη πρωτεΐνες και ένα μέλος της ER-Stress (ενδοπλασματικό δίκτυο-στρες) μονοπατιού επίσης μειώθηκε αισθητά. Επιπλέον, Mesothelin σίγηση προκάλεσε σημαντική αύξηση στο κλάσμα των καρκινικών κυττάρων σε S-φάση. Στο επόμενο στάδιο, η θεραπεία των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών (OVca429) με ένα φακοϊό εκφράζουν αντι-mesothelin microRNA οδήγησε σε σημαντική απώλεια βιωσιμότητας, διεισδυτικότητα, και μορφολογικές αλλοιώσεις. Ως εκ τούτου, προτείνουμε την αναστολή της Mesothelin ως μια πιθανή στρατηγική μυθιστόρημα για τη στόχευση των ανθρωπίνων κακοηθειών

Παράθεση:. Wang Κ, Bodempudi V, Liu Ζ, Borrego-Diaz E, F Yamoutpoor, Meyer A, et al. (2012) Αναστολή της Mesothelin ως στρατηγική μυθιστόρημα για τη στόχευση των καρκινικών κυττάρων. PLoS ONE 7 (4): e33214. doi: 10.1371 /journal.pone.0033214

Επιμέλεια: Λιν Ζανγκ, University of Pennsylvania School of Medicine, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 7η, Σεπτεμβρίου του 2011? Αποδεκτές: 5 Φεβρουαρίου 2012? Δημοσιεύθηκε: 2 Απριλίου του 2012

Copyright: © 2012 Wang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Έρευνα στο εργαστήριο F. Farassati υποστηρίζεται από το «All in για Cure», «μεσοθηλίωμα Ίδρυμα Εφαρμοσμένης Έρευνας (MARF)», «Marsha Rivkin Ινστιτούτου για τον Καρκίνο των ωοθηκών (MRC)» και «Flight συνοδός Ιατρικό Ινστιτούτο Έρευνας (FAMRI)». Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Mesothelin (MSLN), ένα αντιγόνο διαφοροποίησης μεμβράνη πλάσματος, εκφράζεται σε πολύ υψηλά επίπεδα σε αρκετούς ανθρώπινους καρκίνους, συμπεριλαμβανομένων σχεδόν όλων μεσοθηλιώματα [1] και παγκρεατικής αδενοκαρκινώματα [2], [3], όπως φρεάτια ως περίπου 70 % των καρκίνων των ωοθηκών [4], [5] και το 50% των αδενοκαρκινωμάτων του πνεύμονα [6], [7]. MSLN ανιχνεύεται σε πάνω από το 70% του προστίμου αναρροφήσεις βελόνα (FNA) του παγκρέατος αδενοκαρκινώματα [2]. Μια άλλη πρόσφατη μελέτη έδειξε υπεζωκοτική έκχυση MSLN ως ένας χρήσιμος δείκτης για ανίχνευση κακόηθες μεσοθηλίωμα υπεζωκότα [8]. MSLN εκφράζεται επίσης σε ποσότητες ιχνών σε φυσιολογικά μεσοθηλιακών κυττάρων.

MSLN

γονίδιο κωδικοποιεί ένα πολυπεπτίδιο 69-kDa που περιέχει υδρόφοβη αλληλουχία στο άκρο καρβοξυλίου το οποίο αφαιρείται και αντικαθίσταται με φωσφατιδυλινοσιτόλη. MSLN γονίδιο περιέχει 17 εξόνια στο ανθρώπινο χρωμόσωμα 16p13.3 και το cDNA MSLN είναι 2138-bp μακρύ, με ένα ανοικτό πλαίσιο ανάγνωσης 1884 ζευγών βάσεων.

Μεταλλαγμένα ποντίκια με απενεργοποίηση και των δύο αντιγράφων του γονιδίου MSLN παρήχθησαν με ο σκοπός της μελέτης της λειτουργίας αυτής της πρωτεΐνης, αν και δεν ανιχνεύσιμες ανωμαλίες έχουν αναφερθεί για αυτό το φαινότυπο [9] https://clincancerres.aacrjournals.org/cgi/content/full/10/12/3937 – Β8 # Β8. Ένα άλλο σύνολο μελέτες έχουν εισαχθεί MSLN ότι εμπλέκονται στην προσκόλληση επειδή τα κύτταρα ΝΙΗ3Τ3 επιμολυσμένα με ένα φορέα έκφρασης MSLN ήταν πιο δύσκολο να απομακρυνθούν από τα πιάτα καλλιέργειας από τα μη επιμολυσμένα κύτταρα [1]. Η δυνατότητα ενός ρόλου για MSLN στην προσκόλληση υποστηρίζεται από μια μελέτη που δείχνει ότι MSLN δεσμεύεται με CA125 (MUC 16), ένα μέλος των βλεννίνης οικογένεια γλυκοπρωτεϊνών, και ότι τέτοια αλληλεπίδραση διαμεσολαβεί προσκόλληση κυττάρου [4]. Με βάση αυτά τα ευρήματα, οι συγγραφείς πρότειναν ότι μπορεί να υπάρχει ένα σημαντικό ρόλο για CA125 και MSLN στη μεταστατική εξάπλωση του καρκίνου [4]. Επίσης, mesothelin αλληλεπίδραση με MUC 16 προτάθηκε για να διευκολυνθεί η περιτοναϊκή μετάσταση [10].

Σε μοντέλα, όπως ο καρκίνος των ωοθηκών, αναλύσεις συσχέτισης μεταξύ της έκφρασης MSLN, παθολογικές μεταβλητότητα και τα κλινικά αποτελέσματα έδειξαν ότι η έκφραση υψηλής MSLN συσχετιζόταν θετικά με χημειο-αντίσταση σε ασθενείς επιθηλιακό καρκίνο ωοθηκών και σύντομο χρόνο επιβίωσης των ασθενών [12]. MSLN και άλλος δείκτης HE4 έχουν πρόσφατα μελετηθεί για την αξία τους ως δείκτες για την ανίχνευση του καρκινώματος ωοθηκών [5], [11]. Από άλλες κακοήθειες την ομόλογη προς MSLN γονίδιο, δηλαδή

Erc

βρέθηκε να είναι υπερ-εκφράζεται σε αρουραίο νεφρικό καρκίνωμα [12], [13]. Σε ασθενείς με γαστρικό καρκίνο, η ομάδα θετικού MSLN είχαν σημαντικά περισσότερες κομβικές συμμετοχή και σημαντικά βαθύτερη προσβολή όγκου από την αρνητική ομάδα MSLN [14]. Είναι ενδιαφέρον, το ποσοστό επιβίωσης 5-ετών βρέθηκε να είναι υψηλότερη σε MSLN θετική ομάδα σε αυτή τη μελέτη.

Αρκετές μελέτες έχουν δείξει σημαντικές αλληλεπιδράσεις μεταξύ των οδών που εμπλέκονται στην ανάπτυξη κακοήθους φαινοτύπου και MSLN σηματοδότησης. Για παράδειγμα, MSLN βρέθηκε να επάγει την έκφραση μεταλλοπρωτεϊνασών μήτρας 7 (ΜΜΡ-7) [15] ή για να ενισχύσει τα επίπεδα έκφρασης της ιντερλευκίνης 6 (IL-6) [16]. Έκφραση mesothelin επίσης φέρεται να προσδίδουν αντοχή σε απόπτωση σε απόκριση παράγοντα νέκρωσης όγκων άλφα (TNF-alpha) [17]. Το γονίδιο MSLN διαφορικά ρυθμίζεται από τα μέλη της Wnt σηματοδοτικό μονοπάτι [18]. Επίσης, σε μαστικά επιθηλιακά κύτταρα C57MG ποντικού, MSLN ήταν up-ρυθμίζεται από Wnt-1. Είναι ενδιαφέρον ότι, οι όγκοι με συστατική ενεργοποίηση της οδού σηματοδότησης Wnt, όπως οι καρκίνοι των ωοθηκών και του παγκρέατος, έχουν υψηλή έκφραση MSLN. Πρόσθετες μελέτες για να καθορίσουν την πλήρη λειτουργία MSLN καθώς και το ρόλο των MSLN στην καρκινογένεση. Η πολύ περιορισμένη διανομή MSLN σε φυσιολογικούς ιστούς απεικονίζει MSLN έναν κατάλληλο υποψήφιο για θεραπεία όγκου-ειδικά. Αν και στρατηγικές, όπως χρησιμοποιώντας μονοκλωνικά αντισώματα που στοχεύουν ενάντια MSLN έχουν δοκιμαστεί πριν από τις [19], [20], [21], [22], [23], [24], η επίδραση της άμεσης αναστολής της MSLN στη βιωσιμότητα του καρκίνου κύτταρα παραμένει να διερευνηθεί. Εκτός από τις μεταφραστικές διακλαδώσεις των ερευνών αυτών, οι πληροφορίες που λαμβάνονται είναι χρήσιμη για την αξιολόγηση του ρόλου της MSLN στη βιολογία του καρκίνου. Στην εργασία αυτή, μελετήσαμε τα αποτελέσματα της αποσιώπησης MSLN στη βιωσιμότητα, διεισδυτικότητα και κυτταρικές οδούς σε καρκινικά κύτταρα που προέρχονται από το μεσοθηλίωμα, του παγκρέατος και των ωοθηκών σηματοδότησης. Επιπλέον, φίμωση MSLN από ένα φακοϊό εκφράζουν αντι-mesothelin microRNA (miRNA) βρέθηκε επίσης να μειωθεί σημαντικά η βιωσιμότητα και διεισδυτικότητα των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών. Έχουμε επίσης διερευνηθεί το αποτέλεσμα της αποσιώπησης MSLN σε κυτταρικές χαρακτηριστικά των καρκινικών κυττάρων και την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου σηματοδότησης, προκειμένου να κατανοήσουν τις περαιτέρω οδών που εμπλέκονται στην βιολογική ρόλο αυτού του αντιγόνου.

Υλικά και Μέθοδοι

Γραμμές κυττάρων και των χημικών ουσιών

BxPC3, κύτταρα H2373, Ovcar5 και Skov3 (όλα ελήφθησαν από την αμερικανική συλλογή καλλιέργειας ιστού, www.atcc.gov εκτός από H2373 που λήφθηκε από εθνικό Ινστιτούτο καρκίνου, NCI) καλλιεργήθηκαν σε RPMI-1640 μέσο το οποίο συμπληρώθηκε με 10% ορό εμβρύου βοός (FBS) (Sigma, St Louis, ΜΟ). Ovcar3 είναι καλλιεργήθηκαν σε RPMI-1640 με 10% FBS με την προσθήκη 2 mM L-γλουταμίνη και 10 μg /ml ινσουλίνη. ΝΙΗ3Τ3, PANC1, Maipaca2 (από την ATCC), και OVca429 κυττάρων [25] καλλιεργήθηκαν σε Τροποποίηση του Dulbecco Μέσου Eagle (ϋΜΕΜ) (Sigma) συμπληρωμένο με 10% FBS. HUVEC κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε F-12K μέσο συμπληρωμένο με 0.1 mg /ml ηπαρίνη, 0,05 mg /ml συμπλήρωμα ανάπτυξης ενδοθηλιακών κυττάρων, και 10% FBS. ΗΤ1080 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε MEME συμπληρωμένο με 10% FBS. Τα παραπάνω μέσα συμπληρώθηκαν με πενικιλλίνη (100 IU /ml) και στρεπτομυκίνη (100 mg /ml) (Sigma). 293FT κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε ϋΜΕΜ (υψηλή γλυκόζη) συμπληρωμένο με 10% FBS, 0,1 mM ΜΕΜ μη-απαραίτητο αμινοξύ, 1 mM Ε-γλουταμίνη, και 1 mM ΜΕΜ πυροσταφυλικό νάτριο. ΗΤ1080, ΝΙΗ3Τ3, και HUVEC κύτταρα αγοράστηκαν από την ATCC (Manassas, VA). 297FT κύτταρα αγοράστηκαν από την Invitrogen (Carlsbad, CA).

Anti-mesothelin siRNA διατάχθηκε από Qiagen (Valencia, CA). Συντέθηκε το δίκλωνο μορφή με Alexa Fluor 488 (AF488) συζευγμένο με το 3 ‘άκρο του κλώνου νόημα του. Η ολιγο siRNA επαναιωρήθηκε στο παρεχόμενο ρυθμιστικό διάλυμα σε τελική συγκέντρωση αποθέματος 20 μΜ.

siRNA ηλεκτροδιάτρησης

10

7-5 × 10

7 κύτταρα επαν αιωρήθηκε σε 270 μΙ Ορίί-ΜΕΜ και αναμίχθηκαν με 30 μΙ διαλύματος στοκ 20 μΜ siRNA και ηλεκτροδιάτρηση (~ 240 V, ένας παλμός για 20 χιλιοστά του δευτερολέπτου), έτσι ώστε η τελική συγκέντρωση του αντι-mesothelin siRNA ήταν 2 μΜ. Τα φωτεινότερα κύτταρα, δηλαδή, τα κύτταρα με το μεγαλύτερο μέρος του siRNA, επιλέχθηκαν με βάση την παρουσία του Alexa Fluor 488 ετικέτα στο 3 ‘άκρο του siRNA μορίου χρησιμοποιώντας FACS.

Προσδιορισμός πολλαπλασιασμού κυττάρων

προσδιορισμός πολλαπλασιασμού κυττάρων πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας WST-1 κιτ από την Millipore (Billerica, ΜΑ) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Εν συντομία, 2.000 κύτταρα (ταξινόμηση κατά FACS) επιστρώθηκαν σε κάθε φρεάτιο μιας μικροπλάκας 96-φρεατίων σε τελικό όγκο 100 μΙ. Στη συνέχεια, 10 μΙ /φρεάτιο WST-1 αντιδραστηρίου προστέθηκε και η πλάκα επωάστηκε για 1 ώρα σε πρότυπες συνθήκες καλλιέργειας. Κατά τη διάρκεια της επώασης, τα βιώσιμα κύτταρα μετατρέπουν αντιδραστήριο WST-1 σε φορμαζάνη χρωστικής από την κυτταρική μιτοχονδριακή αφυδρογονάση. Μετά από αυτή την επώαση, η απορρόφηση μετρήθηκε στα 440/600 nm.

Κυττάρων εισβολή δοκιμασία

Η πλάκα θαλάμων Matrigel εισβολής και καλλιέργειας ιστών Falcon σύντροφος λήφθηκαν από την BD Biosciences (San Jose, CA) . Για πειράματα ελέγχου siRNA και αντι-mesothelin κύτταρα siRNA επεξεργασμένα (30,000 κύτταρα /φρεάτιο) επιστρώθηκαν σε πλάκα 24 φρεατίων και επωάζονται στους 37 ° C με 5% CO

2. Σαράντα οκτώ ώρες αργότερα, τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν σε 100% μεθανόλη και χρωματίσθηκαν σε 0,05% κρυσταλλικό ιώδες και φωτογραφήθηκαν για την οπτική μετρήσει τον αριθμό των εισέβαλαν κυττάρων. Για σχετικές lentivirus πειράματα τα κύτταρα προ-αγωγή με φακοϊό για 3 ημέρες και στη συνέχεια εισάγονται με την δοκιμασία θαλάμου Boyden για -21 ώρες.

Western ανάλυση κηλίδος

Τα κύτταρα λύθηκαν σε 5, 24, και 48 ώρες μετά την ηλεκτροπόρωση με 1 χ ρυθμιστικό διάλυμα κυτταρικής λύσης. Τριάντα μικρογραμμάρια πρωτεϊνών για κάθε δείγμα φορτώθηκε 4-20% SDS πολυακρυλαμιδίου (Bio-Rad, CA). Οι πρωτεΐνες στη συνέχεια μεταφέρθηκαν σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης. Η μεμβράνη αποκλείστηκε, πλύθηκε και επωάστηκε με τα διάφορα πρωτογενή αντισώματα όπως mesothelin (Abcam, ΜΑ και LS Bio, WA) και β-ακτίνη (Cell Signaling Technology, ΜΑ), ακολουθούμενο από το συζευγμένο με HRP δευτερογενές αντίσωμα. Μετά από διεξοδική πλύση, το στύπωμα εκτέθηκε σε ECL (GE Healthcare, NJ) και αυτοραδιογραφία.

κυτταρικού κύκλου δοκιμασία

δοκιμασία κυτταρικού κύκλου διεξήχθη σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Εν συντομία, περίπου 10

6 κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές χρησιμοποιώντας διάλυμα CycleTEST PLUS Ρυθμιστικό (BD Biosciences, Cat. 340242). Τα κύτταρα επαναιωρήθηκαν σε 1 ml του ίδιου ρυθμιστικού. Για τη χρώση των κυττάρων, προστέθηκαν και επωάστηκαν για 10 λεπτά σε RT 250 μl του διαλύματος Α και 200 ​​μΐ Διάλυμα Β. Ψυχρό διάλυμα C (200 μΐ) προστέθηκε και επωάστηκε στους 4 ° C για 10 λεπτά. Τα κύτταρα διηθούνται μέσω ενός 35 μm κύτταρο σουρωτήρι και αναλύθηκαν με FACSort κυτταρόμετρο ροής.

Κατασκευή του φορέα που εκφράζει miRNA

σχεδιάστηκαν και συντέθηκαν τρία μιμείται miRNA στοχεύει το πλήρες μήκος του γονιδίου της ανθρώπινης mesothelin ( αριθμό πρόσβασης γονίδιο: NM_005823.4). Κάθε σχεδιαστεί miRNA μιμούνται ήταν 64 νουκλεοτίδια σε μήκος, συμπεριλαμβανομένης της μερικής πλευρικής αλληλουχίας, φουρκέτα miRNA, και ωριμάζουν miRNA (με πλάγια γράμματα /υπογραμμισμένα) που προέρχεται από το γονίδιο-στόχο ως εξής: 1-TGCTG

ATAGCAGCAGGTCCAATGGGA

GTTTTGGCCACTGACTGACTCCCATT GCCTGCTGCTAT? 2-TGCTG

TTCATGTTCTGGAAAGCAAGG

GTTTTGGCCACTGACTGACCCTTGCT TCAGAACATGAA? και 3-TGCTG

TTTACTGAGCGCGAGTTCTCT

GTTTTGGCCACTGACTGACAGAGA ACTCGCTCAGTAAA.

Χρησιμοποιώντας το BLOCK-iT Pol II miR RNAi φορέα έκφρασης κιτ (Invitrogen, CA), έχουμε ανόπτηση και κλωνοποιήθηκε τα ολίγο που κωδικοποιεί τον μηχανικής προ-miRNA στη θέση κλωνοποίησης (ACGA και CAGG) του pcDNA φορέων 6.2-GW /EmGFP-miR που πλαισιώνεται από τις δύο πλευρές να επιτρέψουν κατευθυντική κλωνοποίηση ή σωστή διαδικασία της προ-miRNA. εισήχθη εντός του 3′-UTR του EmGFP Το προ-miRNA γονίδιο-καθοδηγείται από υποκινητές ροΙ II. EmGFP επιτρέπει την παρακολούθηση της έκφρασης του miRNA, παρέχοντας μια ισχυρή συσχέτιση μεταξύ EmGFP και της έκφρασης των miRNAs. Κάθε πλασμίδιο αλληλουχήθηκε για να επιβεβαιώσει τις εισαχθεί διπλής έλικας ολίγο miRNA. Τα πλασμίδια που εκφράζουν ηλεκτροδιατρήθηκαν σε κύτταρα Ovcar5 ή κύτταρα Skov3, και αναλύθηκαν με FACS για να εξασφαλιστεί η ορθή έκφραση των miRNA σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών.

Δημιουργία λεντοικής σωματίδια που εκφράζουν miRNA

Ο κλώνος εισόδου ήταν που δημιουργούνται από το συνδυασμό pMSLNmiR3 με pDONR 221 κατασκεύασμα χρησιμοποιώντας ένζυμο BP Clonase II. Η κασέτα miRNA μεταφέρθηκε στο pLenti6.3 /ΝΑ /φορέα V5-DEST περιέχουν θέσεις attR1-attR2 χρησιμοποιώντας LR Clonase II για να δημιουργήσει το τελικό φορέα λεντοϊού MSLNmiR3. Επιπλέον, δημιουργήσαμε ένα φορέα λεντοϊού που κωδικοποιεί ομελέτα miRNA (αρνητικός μάρτυρας) (TGCTGAAATGTACTGCGCGTGGAGACCTTTTGGCCACTGACTGACGTCTCCAC GCGCAGTACATTT) (Invitrogen) που δεν στοχεύει κανένα γνωστό ανθρώπινο γονίδιο. Η έκφραση του miRNA οδηγείται από CMV προαγωγέα. Οι εισαχθεί ακολουθίες mir3 και κωδικοποιημένα miRNA επιβεβαιώθηκαν με ανάλυση αλληλουχίας.

Παραγωγή, τιτλοδότηση και η μόλυνση λεντοικής σωματιδίων

Η MSLNmiR3 ή αρνητικός μάρτυρας φακοϊού ήταν επιμολυσμένα με ViraPower μείγμα συσκευασίας (Invitrogen, CA ) εντός 293FT ανθρώπινα κύτταρα χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη 2000 σε Ορίί-ΜΕΜ Ι μέσο (Invitrogen, CA) και καλλιεργήθηκαν όλη τη νύκτα. Τα κύτταρα τοποθετήθηκαν υπό βλαστισιδίνη (10 μg /ml) επιλογή για 72 ώρες. Το υπερκείμενο συλλέχθηκε και λεντοϊού σωματίδια συμπυκνώθηκαν χρησιμοποιώντας Lenti-X Concentrator (Clontech, CA). Λεντοϊών απόθεμα αραιώθηκε σε σειριακές δεκαπλάσιες να μολύνει τα κύτταρα ΗΤ1080. Σαράντα οκτώ ώρες μετά τη μόλυνση, τα κύτταρα αξιολογήθηκαν με FACS και η τιτλοδότηση υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας τον τύπο [FXC /V] xD, όπου «F» είναι η συχνότητα του GFP-θετικά κύτταρα? «C» είναι ο συνολικός αριθμός των κυττάρων στο φρεάτιο κατά τον χρόνο της μεταγωγής? «V» είναι ο όγκος του εμβόλια σε mL? και «D» είναι φακοϊό αραίωση. Ovca429 κύτταρα μολύνθηκαν με φακοϊό σωματίδια στο MOI~30 παρουσία πολυβρενίου (10 μg /ml) όλη τη νύκτα. Η δοκιμασία κυτταρικού πολλαπλασιασμού διεξήχθη μετά τη μόλυνση στα δεικνυόμενα χρονικά σημεία.

Η κυτταρομετρία ροής

Τα καλλιεργημένα κύτταρα διαχωρίστηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα διαστάσεως κυττάρων (Sigma-Aldrich, ΜΟ) και πλύθηκαν δύο φορές σε ρυθμιστικό διάλυμα MACS (PBS συν EDTA και 0,5% αλβουμίνη βόειου ορού) (Miltenyi Biotec, CA). Ένα σύνολο 2 × 10

5 κυττάρων (100 μΙ) επωάστηκαν με mesothelin μονοκλωνικό αντίσωμα (τελική συγκέντρωση, 1 μg /ml) (Cat # ab3362, Abcam, ΜΑ) πάνω σε πάγο για 1 ώρα στο σκοτάδι. Τα κύτταρα στη συνέχεια πλύθηκαν δύο φορές με ρυθμιστικό MACS, επανα-εναιωρήθηκαν σε 100 μΙ ενός δευτερογενούς αντισώματος (1:200 αραίωση, APC συζευγμένο IgG? BD Biosciences, NJ), και επωάστηκαν σε πάγο για 1 ώρα στο σκοτάδι. Τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές και αναλύθηκαν σε αναλυτή LSRII (BD Biosciences, NJ) χρησιμοποιώντας το λογισμικό FACS Diva έκδοση 6.1. Τα κύτταρα χρωματίστηκαν με δευτερεύον αντίσωμα μόνο συμπεριλήφθηκαν για να αποδειχθεί η εξειδίκευση του αντισώματος.

Αποτελέσματα και Συζήτηση

Αποφασίσαμε να αξιολογηθούν τα αποτελέσματα της αποσιώπησης MSLN χρησιμοποιώντας μικρής παρεμβαλλόμενο RNA (siRNA). Μηχανιστικά, αυτά τα 19-21 ολιγομερή μπορεί να προσδεθεί σε μια ειδική αλληλουχία που να ταιριάζουν σε αγγελιαφόρο RNA-στόχο τους (mRNAs) και τα σημαία για καταστροφή από ένα σύμπλοκο που αναφέρεται ως RNA επαγόμενη φίμωση σύμπλοκο (RISC). Για να επιτευχθεί αυτό, η αλληλουχία του mRNA MSLN αναλύθηκε με εξειδικευμένο λογισμικό (Qiagen, CA) και αλληλουχίες για siRNA ολιγομερή ανιχνεύθηκαν. Μία από αυτές τις αλληλουχίες (5′-CTGGACGTCCTAAAGCATAAA-3 ‘) επιλέχθηκε λόγω του υψηλότερου βαθμού εξειδίκευση κατά MSLN. Το ολιγομερές αντι-MSLN siRNA συνετέθη (σε δίκλωνο μορφή) και συζευγμένο με Alexa Fluor 488 στο 3’-άκρο της αίσθησης κλώνου της (Qiagen, CA). Το Σχήμα 1Α δείχνει την αλληλουχία mRNA για ανθρώπινο MSLN και τη θέση δέσμευσης για αντι-MSLN siRNA.

(Α) Αντι-mesothelin siRNA σχεδιάστηκε σε μία μεσαία θέση αλληλουχίας σε mRNA mesothelin. (Β) Από τη στιγμή ηλεκτροδιάτρηση με αντι-mesothelin siRNA, τα επίπεδα έκφρασης του mesothelin ήταν σημαντικά μειωμένη σε H2373 κύτταρα. Αρνητική siRNA ελέγχου δεν προκάλεσε τέτοια μείωση. Κάτω πάνελ δείχνει τα αποτελέσματα της ταινίας πυκνομετρία συγκρίνοντας την ένταση της έκφρασης mesothelin μετά ηλεκτροπόρωση H2373 κυττάρων με siRNA. (Γ) Αντι-mesothelin siRNA δεν επηρέασε τα επίπεδα έκφρασης της β-ακτίνης, ένα σπίτι-κρατώντας πρωτεΐνη, ως αποδεικτικά στοιχεία για την ιδιαιτερότητα αυτής της αντι-mesothelin siRNA για το στόχο της. (D) ρυθμό πολλαπλασιασμού των κυττάρων είναι H2373 σημαντικά (ρ & lt? 0,05) μειωμένη στο 48 ώρες μετά την ηλεκτροδιάτρηση με 40% των τιμών για τις αρνητικές κύτταρα κατεργασμένα ελέγχου. Μια ανάκαμψη σε υψηλότερα ποσοστά πολλαπλασιασμού παρατηρείται οφείλεται στην εκκαθάριση των siRNA από τα κύτταρα σε μεταγενέστερα χρονικά σημεία σε αρμονία με τις προηγούμενες μελέτες μας. πάνελ Callout δείχνουν την πυκνότητα των κυττάρων σε κάθε ομάδα της μελέτης στις 48 ώρες μετά την ηλεκτροδιάτρηση. κύτταρα (Ε) ΝΙΗ3Τ3 είναι άκυρα της mesothelin και το ρυθμό πολλαπλασιασμού τους, δεν επηρεάζεται από την έκθεση στον αντι-mesothelin siRNA (ποντίκι). πίνακες επεξήγησης δείχνουν την πυκνότητα των κυττάρων σε 48 ώρες μετά την ηλεκτροδιάτρηση.

Η

Για να διερευνήσουν τις επιπτώσεις των αντι-MSLN siRNA για την έκφραση της MSLN, χρησιμοποιήσαμε την ανθρώπινη μεσοθηλιώματος κυτταρική σειρά H2373. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1Β, μια φορά σε ηλεκτροδιάτρηση με το αντι-MSLN siRNA, η έκφραση του MSLN ήταν ιδιαίτερα μειωμένη ήδη 24-48 ώρες μετά την ηλεκτροδιάτρηση σε σύγκριση με τα κύτταρα που κατεργάζονται αρνητικό έλεγχο. Δεν παρατηρήθηκαν αλλαγές στην έκφραση του β-ακτίνης (ένα γονίδιο προϊόν σπίτι διατήρησης) μετά από έκθεση των κυττάρων στο αντι-MSLN siRNA (σχήμα 1C).

συνέχεια αποφάσισε να δοκιμάσει το ρυθμό πολλαπλασιασμού του καρκίνου κύτταρα σε αυτές τις συνθήκες. Όπως φαίνεται στο σχήμα 1Δ, μια σημαντική μείωση (ρ & lt? 0.005) στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων μεσοθηλιώματος παρατηρήθηκε ήδη 48 ώρες μετά την ηλεκτροδιάτρηση. Είναι σημαντικό να σημειωθεί ότι ρυθμό πολλαπλασιασμού των κυττάρων ελέγχου siRNA-κατεργασία σε κάθε χρονικό σημείο μετρήθηκε και στη συνέχεια κλιμακώνεται ως 100%. Ο ρυθμός πολλαπλασιασμού των αντι-MSLN κύτταρα επεξεργασμένα siRNA υπολογίστηκε και κλιμακώνεται ως ένα κλάσμα των τιμών ελέγχου. Τα πάνελ επεξήγηση αντιπροσωπεύουν την πυκνότητα των κυττάρων των δοκιμής και ελέγχου αγωγή πληθυσμών σε υποδεικνυόμενους χρόνους μετά την ηλεκτροδιάτρηση. Είναι ενδιαφέρον ότι ο ρυθμός πολλαπλασιασμού των siRNA-κατεργασμένων κυττάρων άρχισε να αυξάνει σε 72-96 ώρες μετά την ηλεκτροδιάτρηση. Αυτό οφείλεται στην παροδική φύση των διαμόλυνση με ηλεκτροδιάτρηση η οποία είναι η μέθοδος που χρησιμοποιείται σε αυτά τα πειράματα για να εισαγάγει αντι-MSLN siRNA στα κύτταρα. Με άλλα λόγια, όσο περνάει ο χρόνος, η συγκέντρωση των siRNA στα επεξεργασμένα κύτταρα θα μειώσει επιτρέποντας μια ανάκαμψη του πολλαπλασιασμού. Έχουμε παρατηρήσει αυτό το φαινόμενο σε άλλες μελέτες μας που αφορούν συγκεκριμένες γονιδιακή σίγηση [26], [27]. Μόλις η ίδια διαδικασία εφαρμόστηκε σε κύτταρα ΝΙΗ3Τ3 (void του MSLN), δεν παρατηρήθηκε καμία στατιστικώς σημαντικές αλλαγές στην βιωσιμότητα (το siRNA που χρησιμοποιείται σε αυτό το πείραμα μπορεί να συνδέονται προς MSLN mRNA ποντικού) (σχήμα 1 Ε).

επόμενο βήμα, αποφασίσαμε να δοκιμαστούν τα αποτελέσματα φίμωση MSLN σε άλλα κύτταρα MSLN εκφράζουν συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου κυτταρικών γραμμών ωοθηκών και του παγκρέατος και να συγκρίνουν τέτοια αποτελέσματα με τα δεδομένα μας σχετικά με τα κύτταρα μεσοθηλιώματος. Τα επίπεδα έκφρασης του MSLN σε ένα πάνελ του παγκρέατος και των ωοθηκών καρκινικά κύτταρα εξετάστηκαν χρησιμοποιώντας westem αποτύπωση όπως φαίνεται στο σχήμα 2Α. MIAPaCa2, BxPC3 και PANC1 (παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές) και Skov3 και Ovcar3 (καρκινικές κυτταρικές σειρές των ωοθηκών) έδειξε αυξημένα επίπεδα έκφρασης MSLN ενώ HUVEC (ανθρώπινα ενδοθηλιακά κύτταρα ομφάλιας φλέβας) και ΝΙΗ3Τ3 κύτταρα παρέμειναν αρνητικά για MSLN όπως αναμένεται. Η ηλεκτροδιάτρηση όλων των προαναφερθέντων κυτταρικές σειρές καρκίνου οδήγησε σε σημαντική μείωση της βιωσιμότητας τους (σχήμα 2Β-2D, τα αποτελέσματα εμφανίζονται για Skov3, BxPC3 και MIAPaCa2). Για άλλη μια φορά παρατηρήθηκε ανάκαμψη του πολλαπλασιασμού λόγω εκκαθάριση των siRNA από παγκρέατος και των ωοθηκών καρκινικά κύτταρα. Το χρονικό πλαίσιο για αυτή την ανάκαμψη ήταν μεταβλητή μεταξύ αυτών των κυτταρικών σειρών λόγω της σχετικής ρυθμό κάθαρσης τους siRNA.

(Α) Mesothelin πρωτεΐνη ανιχνεύθηκε σε καρκίνο του παγκρέατος κυτταρικές σειρές, PANC1, MIAPaCa2 και BxPC3 και των ωοθηκών καρκινικά κύτταρα Skov3 και Ovcar3. ΝΙΗ3Τ3 και HUVEC κύτταρα τα οποία είναι κενό mesothelin χρησιμοποιήθηκαν για να αποδειχθεί η ειδικότητα του αντισώματος mesothelin. κύτταρα (Β) Skov3 είχε μειώσει τον πολλαπλασιασμό την ημέρα 3 μετά την ηλεκτροπόρωση με αντι-mesothelin siRNA έως περίπου 50% του αρνητικού μάρτυρα. πάνελ Callout δείχνουν την πυκνότητα του κυττάρου σε κάθε χρονικό σημείο. (C-D) Δύο παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές, BxPC3 και MIAPaCa, ελέγχθηκαν για την έκβαση της αποσιώπησης mesothelin στον πολλαπλασιασμό τους. Σε αμφότερες τις περιπτώσεις παρατηρήθηκε σημαντική απώλεια του πολλαπλασιασμού, εντούτοις για BxPC3 η πτώση ξεκινά σε μεταγενέστερα χρονικά σημεία σε σύγκριση με τα κύτταρα MIAPaCa. Και για τα δύο κύτταρα, για άλλη μια φορά, μια ανάκαμψη σε υψηλότερα ποσοστά πολλαπλασιασμού παρατηρείται σε μεγαλύτερη χρονικά σημεία, λόγω της εκκαθάρισης των siRNA από τα κύτταρα. πάνελ Callout δείχνουν την πυκνότητα του κυττάρου σε κάθε χρονικό σημείο.

Η

Ενώ όλα τα καρκινικά κύτταρα παρουσίασαν σημαντική απώλεια βιωσιμότητας μετά από ηλεκτροδιάτρηση με αντι-MSLN siRNA, κύτταρα χωρίς έκφραση MSLN όπως ΝΙΗ3Τ3 δεν το έκανε εμφανίζουν σημαντικές μεταβολές στα ποσοστά πολλαπλασιασμό τους μία φορά ηλεκτροδιατρήθηκαν με αντι-MSLN siRNA (στόχευση MSLN ποντίκι). Ως εκ τούτου, τα φυσιολογικά κύτταρα, με πολύ χαμηλή ή καθόλου έκφραση MSLN δεν θα επηρεαστεί από τη στρατηγική αυτή συνεπάγεται την ιδιαιτερότητα των βιολογικών αποτελεσμάτων των MSLN φίμωση για κακοήθη κύτταρα. Ως εκ τούτου, η αναστολή της MSLN μπορεί να θεωρηθεί ως μια πιθανή στρατηγική για την στόχευση όγκων όπως το μεσοθηλίωμα, των ωοθηκών και του καρκίνου του παγκρέατος με ειδικό τρόπο κύτταρο. Πρόσφατες κλινικές μελέτες με τη χρήση μονοκλωνικών αντισωμάτων έναντι MSLN έχουν επίσης αναφερθεί να είναι καλά ανεκτές σε ασθενείς που επιβεβαιώνει ελάχιστη in-vivo παρενέργειες για MSLN στόχευση στρατηγικές [28], [29]. Αυτό έχει ιδιαίτερη σημασία λόγω των περιορισμένων επίπεδα έκφρασης mesothelin στο υπεζωκότα, περικάρδιο και την περιτοναϊκή μεμβράνες [30], [31].

έψαξαν και για τη διερεύνηση της επιστέγασμα της αποσιώπησης MSLN στην εισβολής τα καρκινικά κύτταρα. Μετάσταση ως το πιο καταστροφικό αποτέλεσμα των κακοηθειών παίζει σημαντικό ρόλο στην παθογένεση του καρκίνου. Ως εκ τούτου, είναι ένα λογικό βήμα για τη μελέτη του αποτελέσματος της αποσιώπησης mesothelin στις ικανότητες των καρκινικών κυττάρων να εισβάλουν. Αυτό είναι επίσης μια σημαντική ανησυχία σχετικά με την επεμβατική φύση των κακοηθειών που μελετήθηκαν στην παρούσα εργασία. Για τον σκοπό αυτό χρησιμοποιήσαμε ένα μοντέλο in-vitro με βάση τη μελέτη των δυνατοτήτων των κυττάρων να εισβάλλουν μέσω ενός στρώματος από matrigel ως μοντέλο για μετάσταση (τροποποιημένη δοκιμασία διαμερίσματος Boyden). Αξιολογήσαμε την ικανότητα εισβολής των κυττάρων H2373, Skov3 και BxPC3 άπαξ θεραπεία με αντι-MSLN και τον έλεγχο siRNA (Σχήμα 3Α-3C). Και στις τρεις περιπτώσεις, παρατηρήθηκε μία σημαντική μείωση της διηθητικότητας. Η μειωμένη ικανότητα εισβολής όλων των ελεγχθέντων καρκινικών κυττάρων έχει ιδιαίτερη κλινική σημασία λόγω του υψηλού μεταστατικού φύση αυτών των ασθενειών.

(Α) Όταν δοκιμάστηκε σε μία τροποποιημένη δοκιμασία διαμερίσματος Boyden, ο εισβολής H2373 κυττάρων μεσοθηλιώματος μειώνεται σημαντικά (p & lt? 0,05) κατά mesothelin αποσιώπηση. Ηλεκτροδιαπήδηση κύτταρα εισήχθησαν στους θαλάμους εισβολή για αυτό το πείραμα και εισέβαλαν κύτταρα μετρήθηκαν και φωτογραφήθηκαν μετά από 48 ώρες. πάνελ Callout αντιπροσωπεύουν την πυκνότητα των κυττάρων εισέβαλαν χρωματίστηκαν με κρυσταλλικό ιώδες. (Β-Ο) Skov3 και BxPC3 κύτταρα τόσο εμφανίζουν μια σημαντική (ρ & lt? 0,05) μείωση σε διεισδυτικότητα τους κατά mesothelin σίγηση σε τιμές κάτω από το 20% του αρνητικού μάρτυρα. πάνελ Callout αντιπροσωπεύουν την πυκνότητα των κυττάρων εισέβαλαν χρωματίστηκαν με κρυσταλλικό ιώδες. (D) Σίγαση mesothelin προκαλεί μια σημαντική μείωση στην ενεργοποίηση (φωσφορυλίωση) του ERK1 (αλλά όχι ΕΚΚ2) και φωσφο-ΑΚΤ. Επιπλέον, η έκφραση της β-κατενίνης, ενός γνωστού δείκτη EMT, ήταν μειωμένη. Slug, ένας άλλος παράγοντας μεταγραφής που εμπλέκονται στην EMT έδειξαν μια μικρή αύξηση σύμφωνα με την παρούσα κατάσταση. Από δείκτες ER-στρες, Ηρώ-1 ήταν μειωμένη, ενώ Μπιπ ήταν ελαφρώς αυξημένα. (Ε) Εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου μεταβάλλεται από mesothelin φίμωση κυρίως από την αύξηση του ποσοστού των κυττάρων σε S-φάση. Το ποσοστό των κυττάρων σε κάθε φάση δείχνεται στο άνω πάνελ και αντιπροσωπευτικά κυτταρομετρία ροής δεδομένων προσφέρεται στο κάτω πάνελ. Τα G1, S και G2 επιλογές αναγράφεται σε κάθε γραφική παράσταση που δείχνει μια αύξηση του πληθυσμού S φάση των κυττάρων.

Η

Για το σκοπό αυτό, είχαμε παρατηρήσει την απώλεια βιωσιμότητας και διεισδυτικότητα σε ένα εύρος καρκινικών κυττάρων κατά την φίμωση της MSLN. Προκειμένου να μελετήσουμε κάπως του μοριακού μηχανισμού της οποίας στηρίζονται αυτές φαινοτυπικές αλλαγές αξιολογήσαμε το επίπεδο /έκφραση ενεργοποίηση μερικές από τις πιο σημαντικές πρωτεΐνες σηματοδότησης που εμπλέκονται σε νεοπλασματικά μετασχηματισμού H2373 κύτταρα (Σχήμα 3D). μονοπάτια τελεστές κατάντη του πρωτο-ογκογονιδίου Ras [32], [33], [34], όπως η ενεργοποίηση του ERK1 /2 (εξωκυτταρική κινάση σχετιζόμενο με σήμα), φωσφατιδυλινοσιτόλη 3-κινάση (ΡΙ3Κ /ΑΚΤ) και ρ38 (p38- κινάση) μελετήθηκαν για το σκοπό αυτό. Παρατηρήσαμε ότι κατά MSLN αποσιώπηση, φωσφο-ERK1 και τα επίπεδα ενεργοποίησης φωσφο-AKT ήταν βαθιά μειώθηκαν, ενώ τα επίπεδα της φωσφο-ρ38 παρέμεινε αμετάβλητη (σχήμα 3D). Με τη συμμετοχή του ERK στον πολλαπλασιασμό και τη μετάσταση [35], [36] και επίσης η συμμετοχή του ΡΙ3Κ μονοπατιού /ΑΚΤ στην προστασία έναντι της απόπτωσης [37], μια μείωση στην ενεργοποίηση αυτών των οδών σηματοδότησης μπορεί να εξηγήσει τα αντι-πολλαπλασιαστικά αποτελέσματα της αποσιώπησης MSLN . Ωστόσο, p38-μονοπάτι [38] (που συμμετέχουν στο στρες σηματοδότηση, απόπτωση και γήρανση) φάνηκε να παραμένουν αναλλοίωτα μετά την αναστολή της MSLN. Δεδομένου ότι ρ38-κινάση δρα ως μονοπάτι αναστολής αύξησης, είναι κατανοητό ότι η ικανότητα των κυττάρων να υποστούν αναστολή ανάπτυξης ή /και την απόπτωση (υπαγορεύεται από ρ38-κινάσης) παραμένει ανεπηρέαστη από φίμωση MSLN.

Το αποτέλεσμα της siRNA μεσολάβηση νοκ ντάουν της MSLN σε επιθηλιακά-μεσεγχυματικά μετάβασης (EMT) [39], [40], ένα βιολογικό πρόγραμμα για την ενίσχυση των μεταστατικών δυνατότητες, ερευνήθηκε επίσης από την ομάδα μας. EMT είναι ένα σημαντικό βιολογικό βήμα προς την επίτευξη μιας μεταστατικό φαινότυπο από τα καρκινικά κύτταρα [41]. Βήτα-κατενίνη, ένα από Wnt κατάντη μορίων και επίσης ένα σημαντικό παράγοντα σηματοδότηση σε EMT, βρέθηκε να είναι σημαντικά μειωμένη κατά την αποσιώπηση MSLN (σχήμα 3D, το μεσαίο πάνελ). Slug, ένας άλλος μεταγραφικός καταστολέας που εμπλέκονται στην EMT βρέθηκε να αυξηθεί κάπως κατά MSLN φίμωση [42]. Με σκέψεις για το ρόλο της γυμνοσάλιαγκας στην καταστολή της Ε-καδχερίνη [43] θα ήταν ένα λογικό επόμενο βήμα για την αξιολόγηση των επιπέδων έκφρασης της Ε-καδχερίνη κατά mesothelin αποσιώπηση. Ωστόσο, δεν παρατηρήθηκε σημαντική αλλαγή δεν παρατηρήθηκε στα επίπεδα του Ε-καδερίνης (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Ως εκ τούτου, η σταδιακή αύξηση των επιπέδων της πρωτεΐνης αυτής, δεν μπορεί να επηρεάσει θετικά τις δυνατότητες EMT των καρκινικών κυττάρων φορά mesothelin έχει σιγήσει.

Δεν ήταν επίσης ενδιαφέρονται για τη διερεύνηση των επιπέδων έκφρασης των δεικτών που εμπλέκονται στη ρύθμιση της ΕΚ- στρες. καταστάσεις στρες διακόπτοντας ER λειτουργία οδηγούν σε συσσώρευση των αναδιπλωμένη πρωτεϊνών στο ER η οποία αναφέρεται ως ER-Stress [44], [45]. Μετά από τέτοιες συνθήκες μια ολοκληρωμένη ομάδα μονοπάτια σηματοδότησης ενεργοποιείται με αποτέλεσμα την ξεδιπλωμένη απόκριση πρωτεΐνης (UPR) [46], [47]. Μετά συνέχιση της UPR απόκρισης και αν τα μη διπλωμένη πρωτεΐνες δεν εκκαθαρίζονται μηχανισμός θα ενεργοποιηθεί για να επάγει τον κυτταρικό θάνατο. Ύπαρξη χρόνιων παθήσεων ER-στρες γίνεται ολοένα και πιο εμφανής στα καρκινικά κύτταρα [47]. Ως εκ τούτου, θα ήταν μυθιστόρημα και έχει ενδιαφέρον να δούμε αν οι αλλαγές στην πορεία ER-στρες θα μπορούσε να συμβάλει στην έκβαση της MSLN φίμωση στα καρκινικά κύτταρα.

ER-διαμένουν πρωτεΐνη ενδοπλασματικό oxidoreductin-1 (Ero1), ένα από τα μόρια εμπλέκει σε μονοπάτι ER-στρες, οξειδώνει πρωτεΐνη δισουλφίδιο ισομεράση (PDI), η οποία, με τη σειρά του, εισάγει δισουλφιδίου ζώνες με τις πρωτεΐνες του ER [48]. Η σημαντική μείωση που παρατηρήθηκε σε Ero1 κατόπιν MSLN σίγηση μπορεί να οδηγήσει σε μειωμένη ικανότητα των καρκινικών κυττάρων να διπλώσει και σαφή πρωτεΐνες που οδηγούν σε τελικό θάνατο τους (Σχήμα 3D, κάτω πάνελ). Επίσης, μια αυξημένη έκφραση παρατηρήθηκε σε Bip (αυλού δέσμευσης πρόδρομη πρωτεΐνη), ένα μοριακών συνοδών που συμμετέχουν στην πρόληψη πρωτεΐνη συσσωμάτωσης [49]. Όπως η παρατήρηση μπορεί να είναι ενδεικτική των αυξημένων επιπέδων της πρωτεΐνης που εκτυλίσσονται κατά MSLN αποσιώπηση τα επίπεδα Μπιπ συνήθως ανέκυψαν στο κελί για την καταπολέμηση του συνυπολογισμού των εκτυλίχθηκε πρωτεϊνών [50].

Η τελευταία φαινοτυπικά χαρακτηριστικό μελετηθεί σε MSLN-σιγήσει κυττάρων ήταν η εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου. Η κύρια μεταβολή που παρατηρήθηκε σε αυτά τα κύτταρα ήταν μια σημαντική αύξηση (~ 50%) στο κλάσμα των κυττάρων στην S-φάση απεικονίζει έναν αποκλεισμό σε εξέλιξη από S έως φάση G2 (Σχήμα 3Ε).

Η τρέχουσα προσέγγιση για προώθηση ανασταλτική θεραπεία RNA σε προ-κλινικές και κλινικές μελέτες στηρίζεται κυρίως στη χρήση φακοϊούς, προκειμένου να εκφράσουν και να παραδώσει τα μόρια siRNA με συνεχή τρόπο [51], [52], [53]. Για το σκοπό αυτό, και για να παραχθεί ένα μεταφραστικό εργαλείο για στόχευση καρκινικών κυττάρων με βάση την αναστολή της MSLN, αποφασίσαμε να αναπτύξει ένα φακοϊό εκφράζουν αντι-MSLN miRNA. Τέτοια εργαλείο μπορεί να χρησιμοποιηθεί στο μέλλον για την περαιτέρω αξιολόγηση της προ-κλινική αξία του συγκεκριμένου γονιδίου MSLN σίγηση ως μία θεραπευτική προσέγγιση.

Ως σύντομο ριβονουκλεϊκό οξύ μόρια (RNA) (~ 22 νουκλεοτίδια) που βρίσκονται σε όλα τα ευκαρυωτικά κύτταρα, miRNAs είναι μετα-μεταγραφικό ρυθμιστές που δεσμεύονται με συμπληρωματικές αλληλουχίες επί μεταγραφών mRNA στόχο. Αυτό έχει ως αποτέλεσμα μεταγραφική καταστολή και ειδική γονιδιακή σίγηση [54], [55]. Μόλις μια σειρά τριών αλληλουχιών miRNA (miR1, miR2 και mir3, οι σχετικές θέσεις που φαίνεται στο σχήμα 4Α, άνω πάνελ) επιλέχθηκαν, το καθένα από αυτά κλωνοποιήθηκε σε ένα πλασμίδιο έκφρασης (pcDNA6.2-GW /EmGFP, Invitrogen) και ηλεκτροδιατρήθηκε σε κύτταρα Ovcar5. Όλα τα πλασμίδια ηλεκτροδιατρήθηκαν αποτελεσματικά εντός των κυττάρων (με βάση την έκφραση GFP) (Σχήμα 4Α, μεσαίο πλαίσιο). Δύο από τα σχεδιασμένα miRNAs (miR1 και mir3) από τα τρία σιγήσει MSLN αποτελεσματικά, όπως αποκαλύφθηκε με κηλίδωση Western (σχήμα 4Α, κάτω πάνελ).