Αφηρημένο

Ιστορικό

Πρωτεομική αναμένεται να διαδραματίσουν καθοριστικό ρόλο στον καρκίνο ανακάλυψη βιοδεικτών. Αν και έχει γίνει εφικτό να αναλυθούν ταχέως πρωτεϊνών από ακατέργαστα κυτταρικά εκχυλίσματα χρησιμοποιώντας φασματομετρία μάζας, πολύπλοκη σύνθεση του δείγματος εμποδίζει αυτό το είδος της μέτρησης. Ως εκ τούτου, για την αποτελεσματική ανάλυση proteome, καθίσταται ζωτικής σημασίας για να εμπλουτίσουν τα δείγματα για τις ουσίες που παρουσιάζουν ενδιαφέρον. Παρά ότι το ένα τρίτο των πρωτεϊνών σε ευκαρυωτικά κύτταρα πιστεύεται ότι φωσφορυλιώνεται σε κάποιο σημείο στη διάρκεια του κύκλου ζωής τους, μόνο ένα μικρό ποσοστό των ενδοκυττάριων πρωτεϊνών φωσφορυλιώνεται σε μια δεδομένη στιγμή.

Μεθοδολογία /Principal Εκτίμηση

σε αυτό το έργο, έχουμε εφαρμόσει τεχνικές χρωματογραφίας εμπλουτισμού φωσφοπεπτιδίου να μειωθεί η πολυπλοκότητα των ανθρώπινων κλινικών δειγμάτων. Μια νέα μέθοδος για υψηλής απόδοσης πεπτίδιο χαρακτηριστικών των δειγμάτων ανθρώπινου όγκου, χρησιμοποιώντας Παράλληλη IMAC και MALDI-TOF MS, περιγράφεται. Έχουμε εφαρμόσει αυτή τη μεθοδολογία για την ανάλυση ανθρώπινη φυσιολογική και τον καρκίνο του πνεύμονα δείγματα στην αναζήτηση νέων βιοδεικτών. Χρησιμοποιώντας μια υψηλή επαναληψιμότητα φασματική αλγόριθμο επεξεργασίας για την παραγωγή του πεπτιδίου μάζα προφίλ με ελάχιστη διακύμανση μεταξύ των δειγμάτων, γραμμική διακρίνουσα με βάση και την απόφαση δέντρο με βάση τα μοντέλα ταξινόμησης δημιουργήθηκαν. Τα μοντέλα αυτά μπορούν να διακρίνουν την κανονική από δείγματα όγκων, όπως επίσης και διαφοροποίηση των διαφόρων μη μικροκυτταρικός καρκίνος του πνεύμονα ιστολογικά υποτύπους.

Συμπεράσματα /σημαντικότητα

Μία νέα, βελτιστοποιημένη μέθοδος παρασκευής του δείγματος και μια προσεκτική δεδομένα στρατηγική απόκτηση περιγράφεται για υψηλής απόδοσης πεπτίδιο χαρακτηριστικών των μικρών ποσοτήτων των ανθρωπίνων κανονικών δειγμάτων πνεύμονα και καρκίνο του πνεύμονα. Δείχνουμε ότι ο κατάλληλος συνδυασμός των αξιών έκφρασης πεπτίδιο είναι σε θέση να διακρίνει φυσιολογικού πνεύμονα από μη-μικρά δείγματα καρκίνου του πνεύμονα και μεταξύ των διαφόρων ιστολογικών υπότυπων. Η μελέτη μας κάνει τονίζουν το μεγάλο δυναμικό της πρωτεομικής στο μοριακό χαρακτηρισμό του καρκίνου

Παράθεση:. Gámez-Pozo Α, Sánchez-Navarro I, Nistal Μ, Calvo Ε, Madero R, Díaz E, et al. (2009) MALDI προφίλ των Ανθρωπίνων Καρκίνο του Πνεύμονα υποτύπους. PLoS ONE 4 (11): e7731. doi: 10.1371 /journal.pone.0007731

Συντάκτης: William C. S. Cho, Queen Elizabeth Hospital, το Χονγκ Κονγκ

Ελήφθη: 3, Ιουλίου 2009? Αποδεκτές: 8 Οκτωβρίου 2009? Δημοσιεύθηκε: 5 του Νοεμβρίου, 2009

Copyright: © 2009 Gámez-Pozo et al. . Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση: Επιχορήγηση υποστήριξης : FIS cp05 /00248, FIS PI050668 και Red Tematica de Investigacion Cooperativa en Καρκίνο (RTICC, RD06-0020-1022) από Fondo de Investigacion Sanitaria (Instituto de Salud Carlos III, Ministerio Επιστημών e Innovación, Ισπανία). Επιχορήγησης η οποία χρηματοδοτήθηκε από το Fundacion Mutua Madrilena. Α Gamez-Pozo είναι ο αποδέκτης μιας υποτροφίας από το Ministerio de Educacion, Ισπανία. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Στις δυτικές χώρες, ο καρκίνος του πνεύμονα αποτελεί την πρώτη αιτία θανάτου από καρκίνο σχετίζονται [1]. Το συνολικό ποσοστό επιβίωσης 5 ετών είναι 15% και δεν έχει βελτιωθεί εδώ και πολλές δεκαετίες. Αυτό συμβαίνει κυρίως επειδή οι περίπου τα δύο τρίτα των καρκίνων του πνεύμονα ανακαλύφθηκε σε προχωρημένα στάδια. Επιπλέον, ακόμη και μεταξύ των ασθενών σε πρώιμα στάδια που αντιμετωπίζονται κατά κύριο λόγο από τη χειρουργική επέμβαση με θεραπευτική πρόθεση, 30-55% θα αναπτύξει και θα πεθάνουν από μετάσταση υποτροπής [2].

Σήμερα, ο καρκίνος του πνεύμονα είναι ταξινομημένο σύμφωνα με ιστολογικά κριτήρια. Οι τέσσερις κύριες υποκατηγορίες είναι: μικροκυτταρικός καρκίνος του πνεύμονα (SCLC), πλακώδες καρκίνωμα (SC), αδενοκαρκίνωμα (AC), και καρκίνωμα μεγάλου κυττάρου (LC). Κλινικά, τα τρία τελευταία θεωρούνται ως μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC), η οποία αντιπροσωπεύει περίπου το 85% όλων των καρκίνων του πνεύμονα [3]. Ακριβής διάγνωση και ταξινόμηση των καρκίνων είναι ζωτικής σημασίας για την επιλογή των κατάλληλων θεραπειών. Η έλευση του αποτελεσματικού στοχευμένες θεραπείες για τον καρκίνο του πνεύμονα, όπως τους αναστολείς του υποδοχέα του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα erlotinib και gefitinib, και την προοπτική της ανάπτυξης επιπλέον στοχευμένες θεραπείες, τόνισε τη σημασία της ακριβούς διάγνωσης [4].

Πρωτεϊνωματική είναι αναμένεται να διαδραματίσουν καθοριστικό ρόλο στον καρκίνο ανακάλυψη βιοδεικτών. Αν και έχει γίνει εφικτό να αναλυθούν ταχέως πρωτεϊνών από ακατέργαστα εκχυλίσματα κυττάρων χρησιμοποιώντας φασματομετρία μάζας, την πολυπλοκότητα δείγμα περιπλέκει αυτές τις μελέτες [5], [6]. Ως εκ τούτου, για την αποτελεσματική ανάλυση πρωτεώματος είναι απαραίτητο να εμπλουτίσει τα δείγματα για τους αναλύτες ενδιαφέροντος [7]. Παρά το γεγονός ότι το ένα τρίτο των πρωτεϊνών σε ευκαρυωτικά κύτταρα πιστεύεται ότι φωσφορυλιώνεται σε κάποιο σημείο στη διάρκεια του κύκλου ζωής τους, μόνο ένα μικρό ποσοστό των ενδοκυττάριων πρωτεϊνών είναι φωσφορυλιωμένη σε κάθε δεδομένη στιγμή [8], [9]. Έτσι, ένα καθαρισμό ή τον εμπλουτισμό βήμα που απομονώνει φωσφορυλιωμένη είδη θα μείωνε την πολυπλοκότητα και την αύξηση της ευαισθησίας [10].

MALDI προφίλ είναι μια από τις πιο πολλά υποσχόμενες τεχνικές για τη μείωση του χάσματος μεταξύ πρωτεομική υψηλής απόδοσης και κλινική [7] , [11]. MALDI MS μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως μέθοδος υψηλής απόδοσης με εξαιρετική ευαισθησία [6], επιτρέποντας τις μελέτες συμβιβασμούς μεγάλες σειρές ασθενών, και έχει τη δυνατότητα να φέρει επανάσταση στην έγκαιρη διάγνωση πολλών ασθενειών [12]. Αυτή η ικανότητα έχει παραδειγματικά με MALDI πρωτεΐνη προφίλ σε δείγματα όγκων, η οποία επέτρεψε τον προσδιορισμό των δεικτών που θα μπορούσαν να συσχετιστούν με ιστολογική αποτελέσματα αξιολόγησης και των ασθενών μέσω στατιστικής ανάλυσης [13], [14]. Στην εργασία αυτή, εφαρμόσαμε τεχνικές εμπλουτισμού φωσφοπεπτιδίου σε μικρές ανθρώπινα κλινικά δείγματα με βάση Ακινητοποιημένη Χρωματογραφία Συνάφειας Μετάλλου (IMAC) για τη μείωση του δείγματος πολυπλοκότητα. Για την ανίχνευση νέων βιοδεικτών, έχουμε ορίσει μια ροή εργασίας ανάλυση των δεδομένων εφαρμόζοντας γραμμική διακρίνουσα με βάση και την απόφαση δέντρο με βάση τις μεθόδους ταξινόμησης για την ανάλυση προφίλ του πεπτιδίου από την κανονική και καρκίνο δείγματα ανθρώπινου πνεύμονα με φασματομετρία μάζας.

Μέθοδοι

Ηθική δήλωση

κατά τη στιγμή της αρχικής διάγνωσης, όλοι οι ασθενείς είχαν δώσει τη συγκατάθεσή υπό την έννοια ότι τα δείγματα όγκου τους θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν για ανακριτικούς σκοπούς. Θεσμική έγκριση από επιτροπή δεοντολογίας μας ελήφθη για τη διεξαγωγή της μελέτης (Comité Ético de Investigación Clínica, Νοσοκομείο Universitario Λα Παζ). Τα δεδομένα αναλύθηκαν ανώνυμα. Οι ασθενείς κατόπιν γραπτής συγκατάθεσης έτσι ώστε τα δείγματα και τα κλινικά δεδομένα θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν για ανακριτικούς σκοπούς

Δείγμα επιλογή

Κατεψυγμένα δείγματα από ασθενείς που διαγνώστηκαν με καρκίνο του πνεύμονα:. (15 αδενοκαρκίνωμα (AC), 15 πλακωδών καρκίνωμα (SC) και 14 μεγάλες καρκίνωμα (LC) δείγματα) και 15 φυσιολογικού πνεύμονα (NL) δείγματα που ανακτώνται από το Τμήμα Παθολογίας του Νοσοκομείου Universitario Λα Παζ (Μαδρίτη, Ισπανία). Τα ιστοπαθολογικά χαρακτηριστικά του κάθε δείγματος επανεξετάστηκαν από έναν έμπειρο πνεύμονα παθολόγο για να επιβεβαιωθεί η διάγνωση και το περιεχόμενο των όγκων. Επιλέξιμοι δείγματα είχαν να περιλαμβάνει τουλάχιστον το 50% των κυττάρων του όγκου.

Σύνολο εκχύλιση πρωτεΐνης, διαλυτοποίηση, και την πέψη

Τα δείγματα κόπηκαν σε ένα κρυοστάτη Leica CM3050S, αποκτώντας 10 τμήματα των 10 μικρών πάχους κάθε. Ο ιστός υποβλήθηκε σε επεξεργασία με αντιδραστήριο ΤΚΙζοΙ (Invitrogen, Carsbald, CA, USA) ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή. Τα ιζήματα επαναιωρήθηκαν σε υδροχλωρική γουανιδίνη 6Μ και θερμάνθηκαν 10 λεπτά στους 95 ° C με ανάδευση. Ακολούθως, προστέθηκαν 950 μΙ 50 mM διττανθρακικού αμμωνίου (ρΗ 7-9) ανά δείγμα. συγκέντρωση δείγματος πρωτεΐνης μετρήθηκε με ΜϊογοΒΟΑ Kit Protein Assay (Pierce-Thermo Scientific, Rockford, IL, USA). Η θρυψίνη MS βαθμού χρυσό (Promega, Madison, WI, USA) προστέθηκαν σε κάθε δείγμα σε σχέση 1:50. Η πέψη διεξήχθη όλη τη νύχτα στους 37 ° C. Το χωνεμένο δείγμα χωρίστηκε σε δύο κλάσματα.

Parallel IMAC (PIMAC)

IMAC-Fe (III) με βάση διεξήχθη σε ένα δείγμα από χωνεμένη πρωτεΐνη με PHOS-Επιλέξτε σιδήρου Affinity Gel (Sigma -Aldrich, St. Louis, ΜΟ, USA) ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή. IMAC-based Ga (III) πραγματοποιήθηκε στο άλλο υποπολλαπλάσιο πέψη πρωτεΐνης με φωσφοπεπτιδίου Απομόνωση Kit (Pierce-Thermo Scientific, Rockford, IL, USA) ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή. Τα δείγματα φυλάχθηκαν στους -20 ° C μέχρι την περαιτέρω ανάλυση.

ανάλυση φωσφοπεπτιδίου με φασματομετρία μάζας

μιγμάτων πεπτιδίων ξηράνθηκαν κενό και διαλύθηκε σε ένα διάλυμα που περιέχει ακετονιτρίλιο (30%) και ΤΡΑ (0,1% ). Μετά το μπάνιο-κατεργασία με υπερήχους (3 λεπτά), τα πεπτίδια ήταν 1:01 αναμίχθηκαν με είτε α-κυανο-4-υδροξυκινναμωμικού οξέως (CHCA) ή 2,5-διυδροξυβενζοϊκό οξύ (DHB) που χρησιμοποιούνται ως μήτρες. Ένας όγκος 0,5 μΙ κατατέθηκε στην MALDI πλάκα και διατηρήθηκε σε θερμοκρασία δωματίου έως ότου ξηρανθεί. Τα φάσματα MALDI-MS (δύο αντίγραφα) μετρήθηκαν σ ‘ένα φασματόμετρο μάζας Bruker Ultraflex TOF /TOF MALDI (Bruker-Daltonics, Billerica, ΜΑ, USA) [15] στον τρόπο θετικού ιόντος ανακλαστήρα. Για την ταυτοποίηση πρωτεϊνών, τα ιόντα πεπτίδιο ενδιαφέροντος αποτέλεσαν αντικείμενο ανάλυσης MALDI-MS /MS στον τρόπο TOF /TOF, και η αντίστοιχη MS /MS φάσματα μεταφέρθηκαν μέσω του προγράμματος MS BioTools (Bruker-Daltonics, Billerica, ΜΑ, USA) ως εισροές για να αναζητήσετε τη βάση δεδομένων NCBInr χρησιμοποιώντας το λογισμικό ΜΑΣΚΩΤ (Matrix Science, Λονδίνο, Ηνωμένο Βασίλειο) [16].

Διαφορικές επιλογή m /z κορυφές

ClinProTools (CPT) του λογισμικού 2.1 (Bruker-Daltonics , Billerica, ΜΑ, USA) χρησιμοποιήθηκε για να επιλέξετε διαφορικό m /z κορυφές μεταξύ των δειγμάτων υποτύπων (NL, AC, SC και LC). Φάσματα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία ως εξής:

Η κανονικοποίηση όλων των φασμάτων για Σύνολο Ion τους Count,

επαναβαθμονόμηση των φασμάτων για κάθε άλλη χρήση των πιο σημαντικές κορυφές m /z,

Baseline αφαίρεση και m /z ανίχνευσης κορυφής.

η

Μόλις τυποποιημένη και να προσαρμόζεται, CPT επιλέγει μάζα σειρές οι οποίες θεωρήθηκαν ως m /z κορυφές, και υπολογίζει το εμβαδόν των κορυφών για κάθε φάσματος [17]. Τα φάσματα χωρίστηκαν σε δύο ομάδες (Set 1 και 2 Set), οι οποίες περιλαμβάνουν μια διαφορετική μέτρηση κηλίδα ανά δείγμα. Κάθε σύνολο χωρίστηκε σε τέσσερις ομάδες φάσματα ανάλογα με τους συνδυασμούς μεταξύ MALDI μήτρας και IMAC μετάλλων (ΜΧ-Mt) που χρησιμοποιούνται για την απόκτησή τους (DHB-Fe, DHB-Ga, CHCA-Fe και CHCA-Ga). Κάθε μία από αυτές τις ομάδες φάσματα στη συνέχεια χωρίζεται σε ιστολογικές υποομάδες (NL, AC, SC και LC) και αναλύθηκαν ξεχωριστά με CPT. Ρυθμίσεις CPT ήταν S /N & gt? 3 και Savitzky-Golay εξομάλυνσης (1 κύκλος, σειρά m /z = 5) [18]. Ο συνδυασμός αυτών των καταλόγων δίνει μια συνδυασμένη Mx-Ματ m /z λίστα αιχμής. Τότε θα περιλαμβάνονται όλα τα φάσματα ενός συνδυασμού Mx-Ματ σε CPT για τη μέτρηση όλων των κορυφών m /z στον ανταποκριτή σε συνδυασμό Mx-Ματ m /z λίστα αιχμής. Κορυφές με Kruskal-Wallis τιμή p & gt? 0.1 απορρίφθηκαν. Επελέγησαν Κοινό m /z κορυφές μεταξύ δύο συνόλων. Τέλος, Pearson δοκιμή μεταξύ τιμών εμβαδόν κάθε κορυφής m /z επιτευχθεί Set 1 και 2 σετ για όλα τα δείγματα διεξήχθησαν και m /z κορυφές με r & lt? 0,4 αποκλείστηκαν. Έτσι, πήραμε τέσσερις τελικούς καταλόγους Mx-Ματ του m /z κορυφές: DHB-Fe, DHB-Ga, CHCA-Fe και λίστες CHCA-Ga. Επιλεγμένα m /z κορυφές θεωρήθηκαν συνεπείς κορυφές.

Διαχωριστική Ανάλυση και την παραγωγή μοντέλο

Διαχωριστική Ανάλυση του κάθε τελικού Mx-Ματ m /z λίστες κορυφής πραγματοποιήθηκε σε SPSS 9.0. m /z κορυφές που περιλαμβάνονται σε κάθε διακρίνουσα μοντέλο συμπεριλήφθηκαν σε ένα δεύτερο Σταδιακή Διαχωριστική Ανάλυση, η οποία επέτρεψε τη δημιουργία ενός παγκόσμιου προτύπου διακρίσεων, συμπεριλαμβανομένων m /z κορυφές από όλους τους συνδυασμούς Mx-Mt.

Εποπτευόμενοι ιεραρχική ομαδοποίηση

Εν συντομία, ένας φορέας έχει εκχωρηθεί σε κάθε ψευδο-προϊόν, και αυτός ο φορέας χρησιμοποιείται για τον υπολογισμό των αποστάσεων μεταξύ αυτού του ψευδο-στοιχείο και όλα τα υπόλοιπα στοιχεία ή ψευδο-αντικείμενα χρησιμοποιώντας την ίδια μετρική ομοιότητας που χρησιμοποιήθηκε για τον υπολογισμό η αρχική μήτρα ομοιότητας. Οι αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν σε BRB-ArrayTools v3.6.1 αναπτύχθηκε από τον Δρ Richard Simon και η Amy Peng Lang.

αλγόριθμο σύνολο απόφαση-δέντρο

Με στόχο την επιλογή κορυφές που θα μπορούσε να γίνει διάκριση μεταξύ ιστολογικών υποτύπων των δειγμάτων καρκίνου του πνεύμονα, χτίσαμε ένα πολυ-αιχμής ταξινομητή χρησιμοποιώντας AdaBoost απόφαση δέντρο με βάση ταξινομητή σύνολο [19], [20]. Τρεις ανεξάρτητες αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν: AC εναντίον (SC + LC), LC εναντίον (AC + SC) και SC εναντίον (AC + LC) χρησιμοποιώντας το τελικό DHB-Ga m /z λίστα αιχμής. Κανονικοποιημένη m /z τιμές έντασης κορυφή από Set1 χρησιμοποιήθηκαν ως σύνολο εκπαίδευσης. Κανονικοποιημένη m /z τιμές έντασης κορυφή από SET2 χρησιμοποιήθηκαν ως σύνολο ελέγχου. 200 επαναλήψεις πραγματοποιήθηκαν σε όλες τις περιπτώσεις. Η περιοχή κάτω από την ROC (Λήψη χαρακτηριστική λειτουργική) καμπύλη (AUC) ισούται με την πιθανότητα σωστά ταξινόμηση ενός ζεύγους δειγμάτων, το καθένα για μια ξεχωριστή κατηγορία, και χρησιμοποιείται ως μέτρηση της απόδοσης ταξινομητή (20). Οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν σε R έκδοση 2.4 με το λογισμικό Boost πακέτο έκδοση 1,0 με μηδέν και SPSS 9.0.

Στατιστικές αναλύσεις για τις προσδιοριζόμενες κορυφές

Μετά την ταυτοποίηση πρωτεϊνών με MS /MS, ANOVA (όταν αυτό είναι δυνατόν ) και Kruskall-Wallis αναλύσεις εκτελέσθηκαν για να αξιολογήσουν διαφορές στην έκφραση αυτών των πρωτεϊνών στα διάφορα ιστολογικά υποτύπους. U Mann-Whitney είχε εφαρμοστεί για τη μελέτη των διαφορών ανάμεσα σε δύο υποομάδες μετά από αναλύσεις Kruskall-Wallis. Στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με SPSS 9.0.

Η ανοσοϊστοχημεία

φορμόλη-σταθερό, μπλοκ ιστού εγκλεισμένα σε παραφίνη, εκπρόσωπος της NSCLC διάγνωση, ανασύρθηκαν ακόλουθη ρουτίνα ιστοπαθολογική αξιολόγηση. Τα τμήματα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία χρησιμοποιώντας ένα Dako Autostainer καθολικό σύστημα χρώσης (Dako, Glostrup, Δανία). Για τη μελέτη αυτή, 3,5 μm τομές ανοσοχρώση με μονοκλωνικό αντίσωμα Ck8 (1:100 αραίωση? Novacastra, Newcastle upon Tyne, Ηνωμένο Βασίλειο). Δύο φέτες ιστού από κάθε δείγμα αξιολογήθηκαν.

Αποτελέσματα

Ο πρωταρχικός σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν να ελεγχθεί αν τρυπτική προφίλ πεπτίδιο, το οποίο λαμβάνεται από την κανονική και όγκου δείγματα ανθρώπινου πνεύμονα χρησιμοποιώντας PIMAC και MALDI- TOF MS τεχνικών, θα μπορούσαν διάκριση φυσιολογικού πνεύμονα (NL) από καρκίνο του πνεύμονα, καθώς επίσης και μεταξύ των πιο κοινή μορφή καρκίνου του πνεύμονα ιστολογική υποτύπους: αδενοκαρκίνωμα (AC), καρκίνωμα μεγάλου κυττάρου (LC) και πλακώδες καρκίνωμα (SC). Μόνο 49 από τα 59 δείγματα που επιλέχθηκαν για την ανάλυση που ακολουθεί, επειδή τα δείγματα χωρίς ελάχιστη περιεκτικότητα των κυττάρων του όγκου κατά 50% απορρίφθηκαν. Έτσι, 15 NL, 14 AC, 9 LC και 11 δείγματα SC στη συνέχεια αναλύθηκαν. Το φάσμα μάζας που παράγονται για κάθε δείγμα τυπικά περιείχε αρκετές εκατοντάδες κορυφές με S /N & gt?. 3 [5]

Μάζα εντάσεις σήματος των τρυπτικών πεπτιδίων που προέρχονται από πολύπλοκα μίγματα πρωτεϊνών που προκαλείται από διάφορους παράγοντες, δηλαδή σχετική συγκέντρωση πρωτεΐνης , μεταβάλλοντας ενζυματική αποδοτικότητα πέψη, και εξαρτώνται από την αλληλουχία της αποτελεσματικότητας εκρόφησης /ιοντισμού. Πραγματοποιήσαμε μια άκρως αναπαραγώγιμη διαδικασία επεξεργασίας για την απόκτηση φασμάτων κορυφή προφίλ με υψηλό βαθμό αντιστοιχίας στη σειρά δειγμάτων. επιλέγεται Συνεπής κορυφές m /z ακολουθούσαν αυτά τα κριτήρια: μάζα κορυφές έπρεπε να είναι παρούσα σε δύο σημεία δείγματος και τη συσχέτιση Pearson μεταξύ εντάσεων κάθε μέγιστο επίπεδο που επιτυγχάνεται σε Σετ 1 και 2 σετ για όλα τα δείγματα θα έπρεπε να είναι & gt? 0,4. συντελεστή συσχέτισης Pearson μέση ήταν 0,8 για τις κορυφές DHB και 0,65 για τις κορυφές CHCA. Η πρόσθετη απαίτηση (Kruskal-Wallis τιμή p & lt? 0,1) εφαρμόστηκε για να συμπεριλάβει κορυφές με διακριτική εξουσία μεταξύ των υποτύπων του δείγματος. Αυτά τα κριτήρια παρέχεται μια συνεπής και επαναλήψιμη μεθοδολογίας, όπως φαίνεται από το συντελεστή συσχέτισης Pearson μέση του επιλεγμένων κορυφών μάζας.

Ερευνήσαμε την επικάλυψη μεταξύ των κορυφών που επιλέγονται από καθένα από τους συνδυασμούς Μχ-Mt (Σχήμα S1). Συνολικά, 97 συνεπής κορυφές μάζας εντοπίστηκαν στους τέσσερις συνδυασμούς Mx-Mt. Όσον αφορά μήτρες MALDI, 81 κορυφές μετρήθηκαν σε DHB και 41 CHCA αναλύσεις. Contrastingly, 80 κορυφές μετρήθηκαν σε Ga-based IMAC και 42 σε Fe-based IMAC αναλύσεις. Σε αμφότερες τις περιπτώσεις, το 25 επικαλυπτόμενες κορυφές βρέθηκαν. Μόνο τέσσερις κορυφές ήταν σταθερά παρόν σε όλες τις συνενώσεις Mx-Mt.

Μόλις είχε επιλεγεί οι συνεπείς κορυφές, μια Σταδιακή Διαχωριστική ανάλυση πραγματοποιήθηκε σε κάθε τελικό κατάλογο κορυφή Mx-Mt. Ως εκ τούτου, τέσσερις διακριτική μοντέλα κατασκευάστηκαν και τα σήματα μάζας που εμπλέκονται σε κάθε μοντέλο που περιλαμβάνεται στον πίνακα S1. Όλα αυτά τα διακρίνουσα μοντέλα ήταν σε θέση να κατατάξει τα δείγματα σε τέσσερις ομάδες, που αντιστοιχούν σε NL, AC, SC και LC. Τα ποσοστά των ταξινομείται ορθώς δείγματα από κάθε μοντέλο και να αφήσει-one-out ποσοστά διασταυρωμένης επικύρωσης των ταξινομείται ορθώς δείγματα εμφανίζονται στον πίνακα S1. Μια δεύτερη Σταδιακή Διαχωριστική ανάλυση πραγματοποιήθηκε με κορυφές που περιλαμβάνονται στα τέσσερα μοντέλα Mx-Ματ Διαχωριστική (22 κορυφές) για να αποφευχθεί συμπεριλαμβανομένων θορυβώδη σήματα μάζας στην ανάλυση. Το Global Model περιλαμβάνεται 9 κορυφές m /z και ταξινομείται ορθώς 98,0% των δειγμάτων (48 από 49) στην LOOCV.

Πραγματοποιήσαμε μια Εποπτευόμενοι Ιεραρχική Κέντρο βάρους Σύνδεση Ομαδοποίηση χρησιμοποιώντας τα 9 κορυφές που περιλαμβάνονται στο παγκόσμιο μοντέλο. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1, υπάρχουν δύο κύριες ομάδες, διαχωρίζοντας δείγματα φυσιολογικού πνεύμονα από τα περισσότερα δείγματα όγκου. Ωστόσο, δεν υπάρχει τέλειο διαχωρισμό μεταξύ ιστολογικών υποτύπων. Με σκοπό την επιλογή μάζας σήματα που θα μπορούσαν να χαρακτηρίζουν τα δείγματα από ένα ιστολογικό υπότυπο, σε σύγκριση με άλλους υπότυπους των δειγμάτων NSCLC, AdaBoost απόφαση δέντρο με βάση σύνολο ταξινομητής διεξήχθη. Τρεις ανεξάρτητες αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν: AC εναντίον (SC + LC), LC εναντίον (AC + SC) και SC εναντίον (AC + LC), χρησιμοποιώντας δεδομένα της κατηγορίας 1 ως σύνολο εκπαίδευσης και τα δεδομένα της κατηγορίας 2, όπως ορίζεται από δοκιμή ο τελικός κατάλογος κορυφή DHB-Ga. Η περιοχή κάτω από την καμπύλη (AUC) από ROC υπολογίστηκε για κάθε σύγκριση τόσο της κατάρτισης και σετ δοκιμής. Ελήφθη η σχετική επίδραση κάθε κορυφής σε μοντέλο παραγωγής. Η περιοχή κάτω από την καμπύλη ROC και κορυφαία κορυφές για κάθε σύγκριση παρουσιάζονται στον Πίνακα 1.

Η θερμότητα Χάρτης των εποπτευόμενων Ιεραρχική Κέντρο βάρους Σύνδεση Ομαδοποίηση των κανονικοποιημένων τομείς αιχμής m /z, σε δύο διαστάσεις, για τα 49 δείγματα και τα 9 m /z κορυφές που περιλαμβάνονται στο παγκόσμιο μοντέλο διακρίνουσα.

η

ταυτότητας MS /MS κάποιων κορυφών m /z επιλέγονται από διακριτική και AdaBoost αναλύσεις έγινε με MALDI-TOF /TOF ( Πίνακας S2). Προκειμένου να αξιολογηθεί διαφορές στις προσδιορισμένες σήματα πεπτιδίου μεταξύ ιστολογικών υποτύπων, ANOVA και Kruskal-Wallis αναλύσεις διεξήχθησαν. β-σφαιρίνης μάζα σήματα έδειξαν μια σημαντικά μειωμένη ένταση σε δείγματα όγκων, σε σύγκριση με την κανονική εκείνες των πνευμόνων, ενώ GAPDH και β-ακτίνης κορυφές έδειξαν αυξημένη ένταση σε δείγματα όγκων. Ck8 ένταση κορυφής μειώθηκε σε μεγάλο καρκινώματα σε σύγκριση με αδενοκαρκίνωμα και τα δείγματα πλακώδες καρκίνωμα.

Το μοτίβο της έκφρασης με ανοσοϊστοχημεία (IHC) ορισμένων από αυτούς τους δείκτες αναλύθηκε. Η ανθρώπινη πρωτεΐνη Atlas (https://www.proteinatlas.org/) [21] δείχνει την έκφραση και ο εντοπισμός των πρωτεϊνών σε μια μεγάλη ποικιλία ανθρώπινων φυσιολογικών και καρκινικών ιστών, καθώς επίσης και κυτταρικές σειρές με τη βοήθεια της IHC. προφίλ έκφρασης IHC για β-ακτίνη και GAPDH αξιολογήθηκαν σε αυτή τη χρήσιμη βάση δεδομένων. Υπάρχει μια αυξημένη έκφραση β-ακτίνης σε ορισμένα δείγματα καρκίνου του πνεύμονα σε σύγκριση με την κανονική αυτά. Ωστόσο, η έκφραση GAPDH στον καρκίνο του πνεύμονα είναι ιδιαίτερα μεταβλητή. Επιπλέον, θα πραγματοποιηθεί IHC ανάλυση της έκφρασης Ck8 σε πέντε AC, LC και SC δείγματα. Θετικά κύτταρα για Ck8 ανοσοχρώση βρέθηκαν σε όλα τα δείγματα LC και AC. Αντιθέτως, μόνο τρία από τα πέντε δείγματα SC έδειξε θετική χρώση. Θετικά χρωματισμένο δείγματα έδειξαν κατά μέσο όρο 20-70% χρώση των κυττάρων (Σχήμα 2).

Ck8 ανοσοχρώση (μεγέθυνση χ 40). Τα βέλη δείχνουν προς κύτταρα όγκου. (Α) Πλακώδες καρκίνωμα του πνεύμονα δείχνει αρνητική χρώση καρκινικών κυττάρων. Πνεύμονα επιθήλιο δείχνει θετική χρώση. (Β) Πλακώδες καρκίνωμα του πνεύμονα θετική χρώση. (C, D) καρκίνωμα μεγάλου κυττάρου του πνεύμονα που δείχνουν διαφορετικούς βαθμούς θετική χρώση. (Ε, F) αδενοκαρκίνωμα του πνεύμονα που δείχνουν διαφορετικούς βαθμούς θετική χρώση.

Η

Συζήτηση

Παγκόσμια προφίλ γονιδιακής έκφρασης έχει βελτιώσει την κατανόησή μας της ιστολογικής ετερογένεια των μη μικρών κυττάρων καρκίνο του πνεύμονα και έχει εντοπίσει πιθανούς βιοδείκτες και υπογραφές γονίδιο για την ταξινόμηση των ασθενών με σημαντικά διαφορετικά αποτελέσματα επιβίωσης [22]. Μια ολοκληρωμένη κατανόηση των μηχανισμών πίσω από την καρκινογένεση, την εξέλιξη του όγκου και της μετάστασης θα απαιτήσει μια σε βάθος ανάλυση της όχι μόνο το γονιδίωμα, αλλά και η proteome [23]. Αναλύσεις σε επίπεδο γονιδίου δεν μπορεί να ανιχνεύσει τις βιολογικές λεπτές αποχρώσεις που εισάγεται μέσω μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις των πρωτεϊνών και ως εκ τούτου απαιτεί μία πρωτεομική προσέγγιση [5], [24].

αναπαραγωγιμότητας έχει δειχθεί να συμβιβαστεί πρωτεΐνη προφίλ σε όλα τα στάδια, από τις μεθόδους πεπτίδιο απομόνωση για να δοκιμάσετε τα φάσματα απόκτησης και επεξεργασίας [5], [11], [25], [26]. Σε αυτή τη μελέτη, έχουμε εφαρμόσει εμπλουτισμού φωσφοπεπτιδίου χρωματογραφικές τεχνικές για τη μείωση της πολυπλοκότητας των δειγμάτων ανθρώπινου καρκίνου του πνεύμονα και αναλύθηκαν απομονώνονται πεπτιδίων με MALDI-TOF MS. Περιγράφουμε μια μέθοδο επιλογής μάζα κορυφή η οποία αποδίδει ένα αναπαραγώγιμο προφίλ πεπτίδιο από πειράματα MALDI MS με χρήση ClinProTools. Groseclose et al. περιγράφεται ένας περιορισμός της χρήσης CPT είναι ότι κορυφές που μπορεί να είναι σημαντική μεταξύ ένα μικρό υποσύνολο των φασμάτων σε μια ομάδα, μπορεί να καταστεί ασήμαντο όταν ο μέσος όρος με το άλλο φάσματα σε αυτή την ομάδα [5]. Προκειμένου να αξιολογηθεί ως πολλές κορυφές όσο το δυνατόν, πραγματοποιήσαμε ένα προηγούμενο στάδιο στην επιλογή κορυφή χρησιμοποιώντας CPT. Σε κάθε ανάλυση Mx-Ματ, όλα τα φάσματα από ένα και μόνο υποτύπου δείγματος εισήχθησαν το CPT, απόκτηση υποτύπου χαρακτηριστικό λίστα αιχμής. Μόλις ελήφθησαν όλες οι λίστες υπότυπο, μια νέα λίστα δημιουργήθηκε από τον συνδυασμό, συμπεριλαμβανομένων όλων των κορυφών σε αυτές τις λίστες υπότυπο. Στη συνέχεια, τα φάσματα από όλους τους υποτύπους δείγμα περιλήφθηκαν στο CPT, και μετρήθηκαν όλα κορυφές σε αυτήν την συνδυασμένη λίστα. Επιβεβαιώσαμε ότι ορισμένοι διακρίνουσα κορυφές αποκλείσθηκαν κατά φάσματα από όλους τους υποτύπους δείγμα περιλαμβάνονται άμεσα σε CPT και τυπική ανάλυση γίνεται.

Αξίζει να σημειωθεί ότι κατά τη χρήση DHB ως MALDI μήτρα παρέχεται μεγαλύτερο αριθμό μάζας κορυφές ως σε σύγκριση με CHCA. Ομοίως, η προσέγγιση IMAC Ga-based παράγει περισσότερη μάζα σήματα σε σύγκριση με τη δοκιμασία που βασίζεται σε Fe. Επιπλέον, οι κατάλογοι κορυφής που προέρχονται από τα φάσματα DHB έδειξε υψηλότερη μέση συσχέτιση μεταξύ των συνόλων δεδομένων. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι MALDI αναλύσεις χρησιμοποιώντας Ga-based IMAC και DHB ως MALDI μήτρα είναι πιο αναπαραγώγιμα και παρέχει υψηλότερο αριθμό σημάτων μάζας. Οι κορυφές που προσδιορίζονται προέρχεται από πρωτεΐνες υψηλής έκφρασης και τις υπόλοιπες διακρίσεις πεπτίδια δεν μπορούσαν να εντοπιστούν από MALDI MS. Εναλλακτικές στρατηγικές αναγνώρισης θα πρέπει να ελέγχονται προκειμένου να αυξηθεί η αναγνώριση των σημάτων χαμηλής έντασης σε μελέτες MALDI MS.

Διαχωριστική αναλύσεις μας επέτρεψε να διαχωρίσετε φυσιολογικά δείγματα πνεύμονα και NSCLC και να εντοπίσει τα πεπτίδια που καλύτερη διάκριση μεταξύ φυσιολογικών και νοσούντων ιστούς, όπως φαίνεται από ομαδοποίηση ανάλυση (Σχήμα 1). Ωστόσο, το έργο αυτό δεν είναι συνήθως προβληματική λόγω των σημαντικών διαφορών μεταξύ των φυσιολογικών και καρκινικών ιστών. Τι αποδεικνύει δυσκολότερο είναι να βρει διαφορές μεταξύ των διακριτών ιστολογικών υποτύπων. Όπως έδειξε στο Σχήμα 1, υπάρχουν δύο κύριες ομάδες των δειγμάτων καρκίνου του πνεύμονα, συμπεριλαμβανομένων αδενοκαρκινώματα και μεγάλων κυττάρων καρκινώματα ξεχωριστά, αλλά τα δείγματα ακανθοκυτταρικό καρκίνωμα χωρίζονται μεταξύ αυτών των ομάδων.

Έχει περιγραφεί ότι ταξινομητές σύνολο ξεπερνούν μόνο απόφαση δέντρα ταξινομητή έχοντας μεγαλύτερη ακρίβεια και μικρότερα σφάλματα πρόβλεψης, όταν εφαρμόζεται σε σύνολα δεδομένων πρωτεομική [27]. Έτσι, εξετάσαμε αν AdaBoost αναλύει θα μπορούσε να κατατάξει τα διάφορα δείγματα NSCLC σωστά. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι AdaBoost μπορεί να διακρίνει δείγματα ενός καρκίνου του πνεύμονα ιστολογικές υποτύπο από τις άλλες δύο. Η χρήση της τεχνικής επαναλήψεων ως σύνολο δοκιμής μας επέτρεψε να εκτιμήσει την ευρωστία της μεθοδολογίας που χρησιμοποιήθηκε.

Τα στοιχεία μας δείχνουν ότι τόσο GAPDH και β-ακτίνης έχουν σημαντικά αυξημένη έκφραση σε δείγματα καρκίνου του πνεύμονα. Η υπερέκφραση του GAPDH σε ανθρώπινους καρκίνους του πνεύμονα περιγράφηκε προηγουμένως από Tokunaga et al [28] και υπάρχουν πολλές δημοσιεύσεις που δείχνουν αυξημένη έκφραση GAPDH στο μητρικό [29], παγκρεατικό [30] και του τραχήλου της μήτρας [31], [32] ανθρώπινων καρκίνων. Από την άλλη πλευρά, πολλές μελέτες έδειξαν ότι β-ακτίνης εκφράζονται διαφορικά σε ανθρώπινο καρκίνο (ανασκόπηση στο 28). Και οι δύο πρωτεΐνες έδειξαν αυξημένα επίπεδα σε ηπατώματος αρουραίου [33]. Επιπλέον, τα προφίλ έκφρασης IHC για την β-ακτίνη και GAPDH, αξιολογείται η ανθρώπινη πρωτεΐνη Atlas, ήταν εξαιρετικά μεταβλητή σε δείγματα καρκίνου του πνεύμονα. Αυτά τα αποτελέσματα αμφισβητούν τη χρήση αυτών των πρωτεϊνών ως προϊόντα καθαρισμού οικιακής στην πρωτεομική ανάλυση των δειγμάτων καρκίνου.

Cytokeratin 8 (Ck8) είναι ένα ενδιάμεσο πρωτεΐνη νήμα τύπου II που επίμονα εκφράζεται στις περισσότερες επιθηλιακές κακοήθειες [34], συμπεριλαμβανομένων όλων NSCLC υπότυποι [35]. Αυξημένα επίπεδα Ck8 σε ορούς έχουν συσχετιστεί με την εξέλιξη του όγκου και μειωμένη επιβίωση σε ασθενείς με NSCLC [36]. Σε αντίθεση με αυτές τις αναφορές, δεν παρατηρήσαμε αυξημένη έκφραση του Ck8 σε δείγματα όγκων από αναλύσεις MALDI-MS. Ωστόσο, ανακαλύψαμε ότι τα επίπεδα Ck8 μειώθηκαν σε μεγάλα δείγματα καρκίνωμα σε σύγκριση με φυσιολογικό πνεύμονα.

Για να εκτιμηθεί η χρησιμότητα της έκφρασης Ck8 ως βιοδείκτη μεγάλων κυττάρων καρκινωμάτων, εκτελέσαμε IHC αναλύσεις της έκφρασης Ck8 σε 15 δείγματα καρκίνου του πνεύμονα (πέντε AC, πέντε LC και πέντε SC). Κατά τη γνώμη μας, κανένα συμπέρασμα δεν μπορεί να γίνει για τη σχέση μεταξύ IHC και πεπτίδιο έκφραση προφίλ από τα δεδομένα μας. Αυτή η διαφορά μεταξύ των τεχνικών θα μπορούσε να οφείλεται σε εμπλουτισμό φωσφοπεπτιδίου πριν από την ανάλυση δείγματος ή θα μπορούσε να σημαίνει ότι τα κράτη μέλη προσεγγίσεις είναι πιο ευαίσθητα από IHC. Το πεπτίδιο που προσδιορίζονται από MALDI MS /MS (DVDEAYMNKVELES) περιέχει μια δυνητική θέση φωσφορυλίωσης στη Tyr204, που σχετίζεται με φωσφορυλίωση από ογκογόνους κινάσες [37]. Προηγούμενες μελέτες που αξιολογούν τη χρησιμότητα των Ck8 ως βιολογικός δείκτης στον καρκίνο του πνεύμονα δεν περιλαμβάνουν κανένα μεγάλο καρκίνωμα [35], [36].

Η μελέτη έχει κάποιους περιορισμούς. Έτσι, υπάρχει περιορισμένη ικανότητα να εντοπίσει δευτερεύουσες κορυφές μάζας που βασίζεται στην ανάλυση MS /MS του σχετικά πολύπλοκα μίγματα πεπτιδίων. Ωστόσο, MALDI MS έχει ορισμένα πλεονεκτήματα για βιοδεικτών ανακάλυψη: έκφραση της πρωτεΐνης και η σχετική δεδομένα ποσοτικοποίηση μπορεί να δημιουργηθεί για πολλαπλών δειγμάτων ιστού του ασθενούς σε ένα μόνο πείραμα. Από την άλλη πλευρά, η σύγκριση των IHC και πεπτιδίου προφίλ έκφρασης εκτιμά τη σχέση θα πρέπει να γίνει προσεκτικά, καθώς φαίνεται ότι πριν από τον εμπλουτισμό συγγένειας των δειγμάτων θα μπορούσε να εισαγάγει κάποια προκατάληψη.

Ωστόσο, η μελέτη μας δίνει έμφαση τις μεγάλες δυνατότητες της πρωτεομική στο μοριακό χαρακτηρισμό του καρκίνου. Ταυτοποίηση διαφορικά εκφραζόμενων πρωτεϊνών με PIMAC και MALDI-TOF /TOF MS διεξήχθη επί κλασματοποιημένο πέψης θρυπτικού προέρχεται από μικρές ποσότητες των ιστών που λαμβάνονται από φυσιολογικά δείγματα πνεύμονα και NSCLC. Χρησιμοποιώντας μια βελτιστοποιημένη μέθοδο προετοιμασίας του δείγματος και μια προσεκτική στρατηγική απόκτησης δεδομένων, ξεπεράσαμε την μεγάλη πρόκληση της αναπαραγωγιμότητας της MALDI MS-based πεπτίδιο προφίλ. Ανεξάρτητα από τη φύση των πεπτιδίων που προσδιορίζονται από MS /MS, ο κατάλληλος συνδυασμός των τιμών έκφρασης πεπτίδιο είναι σε θέση να διακρίνει φυσιολογικού πνεύμονα από δείγματα NSCLC και μεταξύ των διαφόρων NSCLC ιστολογικών υποτύπων. Οι μελλοντικές μελέτες που αποσκοπούν στη δημιουργία πεπτίδιο προφίλ ως ένα χρήσιμο εργαλείο για την ανακάλυψη νέων βιολογικών δεικτών με δυνατότητες διάγνωσης ή theragnostic ενδιαφέρον.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Εικόνα S1.

διαγράμματα Venn δείχνει m /z κορυφές επικάλυψη μεταξύ τελικούς καταλόγους m /z κορυφή από:. (Α) τέσσερις διαφορετικούς συνδυασμούς Mx-Ματ, (Β) ρητίνες IMAC, και (Γ) MALDI μήτρες

doi: 10.1371 /journal.pone.0007731.s001

(0,04 MB PPT)

πίνακα S1.

Ποσοστά σωστά ταξινομημένα δείγματα, αφήστε-το ένα έξω ποσοστά διασταυρωμένης επικύρωσης των ταξινομείται ορθώς δειγμάτων και κορυφές m /z που περιλαμβάνονται σε κάθε μοντέλο συνδυασμό διακρίνουσα Mx-Mt. Οι κορυφές με έντονους χαρακτήρες περιλαμβάνονται επίσης στο κορυφές z παγκόσμιο μοντέλο 9 m /διακρίσεις

doi:. 10.1371 /journal.pone.0007731.s002

(0,03 MB DOC)

Πίνακας S2.

διαφορικά εκφραζόμενο πεπτίδιο μάζες από την CHCA-MALDI φάσματα προσδιορίζονται από MALDI-TOF /TOF και μηχανή αναζήτησης ΜΑΣΚΩΤ. Ατομική ΜΑΣΚΩΤ ιόντα βαθμολογίες είναι σημαντική (p & lt? 0,05)

doi:. 10.1371 /journal.pone.0007731.s003

(0,03 MB DOC)