Αφηρημένο

Fangchinoline είναι ένα bisbenzylisoquinoline αλκαλοειδές που απομονώνεται από Radix

Stephaniae tetrandrae

S. Moore. Fangchinoline και αναλογική δομή του, tetrandrine, παρουσίασαν άμεση συγγένεια σύνδεσης με ανασυνδυασμένη ανθρώπινη πρωτεασώματος β1 υπομονάδα και ανέστειλε επίσης τη δραστηριότητά της

in vitro

. Σε καλλιεργημένα προστάτη PC-3 κύτταρα και LNCaP κύτταρα, fangchinoline μπορούσε δοσοεξαρτώμενο αναστέλλουν τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και κασπάσης-σαν δραστηριότητα των κυτταρικών πρωτεασώματος που διαμεσολαβείται από πρωτεασώματος β1 υπομονάδα. Το ανασταλτικό αποτέλεσμα των fangchinoline επί κασπάσης-σαν δραστηριότητα του πρωτεασώματος παρατηρήθηκε επίσης σε καθαρισμένα ανθρώπινα ερυθροκύτταρα 20S πρωτεασώματος. Σε κύτταρα PC-3, που επάγεται fangchinoline διακοπή του κυτταρικού κύκλου σε G0 /G1 φάση και απόπτωση. Θεραπεία της PC-3 που φέρουν όγκο γυμνοί ποντικοί με fangchinoline ανέστειλε την ανάπτυξη του όγκου, που προκαλείται από απόπτωση και επίσης προκάλεσε μείωση στη δραστηριότητα του πρωτεασώματος σε ξενομοσχεύματα όγκου. Δοσοεξαρτώμενη και χρονο-εξαρτώμενη συσσώρευση των πρωτεϊνών ουβικουιτινωμένης και σημαντικά υποστρώματα πρωτεασώματος όπως ρ27, Βαχ και ΙκΒ-α παρατηρήθηκαν σε κύτταρα fangchinoline φάρμακο. Υπερ-έκφραση του πρωτεασώματος β1 υπομονάδα από το πλασμίδιο διαμόλυνση αυξημένη ευαισθησία των κυττάρων στην κυτταροτοξικότητα του fangchinoline ενώ knockdown του πρωτεασώματος β1 υπομονάδα βελτιώνονται κυτταροτοξικότητα fangchinoline σε PC-3 κύτταρα. Τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης προτείνεται ότι η αναστολή του πρωτεασώματος συμμετείχε στις αντικαρκινικές επιδράσεις του fangchinoline. Fangchinoline και ανάλογα τη δομή του μπορεί να είναι νέα αναστολείς φυσικό πρωτεασώματος που στοχεύουν β1 υπομονάδα

Παράθεση:. Li D, Lu Υ, Sun P, Feng L-X, Liu Μ, Hu L-H, et al. (2015) Αναστολή για Proteasome β1 υπομονάδας μπορεί να συνεισφέρει στην αντικαρκινικές επιδράσεις των Fangchinoline σε ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου του προστάτη. PLoS ONE 10 (10): e0141681. doi: 10.1371 /journal.pone.0141681

Επιμέλεια: Chih-Pin Chuu, Εθνική Έρευνα Υγείας Ινστιτούτα, την Ταϊβάν

Ελήφθη: 20 Μάρτη 2015? Αποδεκτές: 11 Οκτώβρη του 2015? Δημοσιεύθηκε: 29 Οκτωβρίου, 2015

Copyright: © 2015 Li et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. η εργασία αυτή χρηματοδοτήθηκε εν μέρει από Shanghai Science & amp? Πρόγραμμα Υποστήριξη τεχνολογίας (13431900401), το Εθνικό Ίδρυμα Φύση Επιστημών της Κίνας (81373964), Shanghai Science & amp? τεχνολογικό πρόγραμμα δράσης για την καινοτομία (15140904800), το Εθνικό Επιστημονικό & amp? Τεχνολογία Μεγάλου Έργου της Κίνας (2014ZX09301-306-03), και το δωδέκατο πενταετές Εθνικό Επιστήμης & amp? Πρόγραμμα Υποστήριξη τεχνολογίας (2012BAI29B06). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου. Nanjing Tianyi Bioscience Co Ltd, παρέχεται υποστήριξη με τη μορφή των μισθών για τους συγγραφείς YL, αλλά δεν είχε καμία πρόσθετη ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου. Οι συγκεκριμένοι ρόλοι αυτών των συγγραφέων αρθρωτά στο τμήμα «συγγραφέας εισφορές»

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Yu Lu απασχολείται από Nanjing Tianyi Bioscience ΣΙΑ Ε.Π.Ε. Δεν υπάρχουν διπλώματα ευρεσιτεχνίας, τα προϊόντα στην ανάπτυξη, ή διατίθενται στην αγορά προϊόντα με δηλώνω. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών, όπως περιγράφεται λεπτομερώς σε απευθείας σύνδεση στον οδηγό για τους συγγραφείς.

Εισαγωγή

Proteasome έχει αναδειχθεί ως ένα σημαντικό και αποτελεσματικό στόχος για αντικαρκινική θεραπεία [1]. Στον έλεγχο μας αναστολέων φυσικό πρωτεασώματος, fangchinoline και tetrandrine, δύο bisbenzylisoquinoline αλκαλοειδή απομονωθεί από αποξηραμένα ρίζα του

Stephaniae tetrandrine

S. Moore (οικογένεια, Menispermaceae), γνωστή και ως Fangji στην Κίνα, βρέθηκαν να έχουν άμεση συγγένεια δέσμευσης με ανασυνδυασμένη ανθρώπινη πρωτεασώματος β1 υπομονάδα και επίσης ανέστειλε τη δραστηριότητά του

in vitro

. Fangji είναι μια παραδοσιακή κινεζική ιατρική (TCM), το οποίο είχε χρησιμοποιηθεί στην κλινική ως αναλγητικό, αντιρευματικά, και αντιυπερτασικό φάρμακο για μεγάλο χρονικό διάστημα στην Κίνα [2, 3]. Αναφέρθηκαν δραστηριότητες του Fangji περιλαμβάνονται αντικαρκινικές επιδράσεις [2, 4], αντι-φλεγμονώδη αποτελέσματα [5], καρδιαγγειακές επιδράσεις [6, 7], και το κ.λπ. Η κύρια ενεργά συστατικά του Fangji είχαν βρεθεί να είναι fangchinoline και tetrandrine [2 ]. Οι χημικές δομές των fangchinoline και tetrandrine δείχθηκε στο Σχήμα 1Α και 1Β Σχήμα, αντίστοιχα. Καθαρισμένα tetrandrine είχε εισαχθεί από την Κίνα Food and Drug Administration για να χρησιμοποιηθεί στην κλινική για θεραπεία φλεγμονωδών ασθενειών όπως η πυριτίαση [8] και χρησιμοποιήθηκε επίσης στη θεραπεία του καρκίνου [9]. Σε ό, τι γνωρίζουμε, ούτε οποιαδήποτε καθαρισμένη ένωση που απομονώνεται από Fangji ούτε ακατέργαστο εκχύλισμα Fangji είχαν αναφερθεί πριν να έχουν επιπτώσεις πρωτεασώματος αναστολής. Πρωτεασώματος είναι γνωστό ότι παίζει ρόλο στην ανάπτυξη του καρκίνου, φλεγμονωδών ασθενειών και καρδιαγγειακών ασθενειών [10]. Ως εκ τούτου, θα μπορούσε να είναι ενδιαφέρον να μελετήσει κατά πόσον η αναστολή του πρωτεασώματος συμμετέχει στις επιπτώσεις της fangchinoline, tetrandrine καθώς Fangji.

(Α) Χημική δομή της fangchinoline. (Β) Χημική δομή της tetrandrine. (C) σε πραγματικό χρόνο δέσμευσης μετρήσεις συγγένεια fangchinoline στην ανασυνδυασμένη πρωτεασώματος β1 υπομονάδα πρωτεΐνης. (D) σε πραγματικό χρόνο δέσμευσης μετρήσεις συγγένεια tetrandrine στην ανασυνδυασμένη πρωτεασώματος β1 υπομονάδα πρωτεΐνης. δραστηριότητες (Ε) Enzyme ανασυνδυασμένης πρωτεασώματος β1 υπομονάδα με ή χωρίς την παρουσία των fangchinoline σε διαφορετικές συγκεντρώσεις. δραστηριότητες (F) Enzyme ανασυνδυασμένης πρωτεασώματος β1 υπομονάδα με ή χωρίς την παρουσία των tetrandrine σε διαφορετικές συγκεντρώσεις. Τα δεδομένα ήταν στατιστικά αποτελέσματα από τρία ανεξάρτητα πειράματα.

Η

Τόσο fangchinoline [2, 11-14] και tetrandrine [4, 15-26], είχε αναφερθεί ότι έχουν αντικαρκινικές επιδράσεις

in vitro

και

in vivo

. Στην παρούσα μελέτη, επικεντρώνεται στην μελέτη των αντικαρκινικές επιδράσεις της fangchinoline. Προηγούμενες εκθέσεις έδειξαν ότι, fangchinoline θα μπορούσε να προκαλέσει διακοπή του κυτταρικού κύκλου [11, 13, 14, 27] και την απόπτωση [2, 14, 27] σε καλλιεργημένα καρκινικά κύτταρα. Υπήρχε επίσης μια έκθεση σχετικά με τις δραστηριότητες κατά του καρκίνου του fangchinoline

in vivo

[13]. Στην παρούσα μελέτη, οι αντικαρκινικές επιδράσεις του fangchinoline αξιολογήθηκαν σε καλλιεργημένα κύτταρα PC-3, καλλιεργημένα LNCaP κύτταρα και PC-3 που φέρουν όγκο γυμνούς ποντικούς. Και οι δύο ελέγχθηκαν τα ανασταλτικά αποτελέσματα των fangchinoline σχετικά με τις δραστηριότητες των κυτταρικών πρωτεασώματος σε καρκινικά κύτταρα και σχετικά με τις δραστηριότητες των καθαρισμένων ανθρώπινων 20S πρωτεασώματος. Η απόδοση του πρωτεασώματος ως στόχος για τη θεραπεία του καρκίνου βασίστηκε στο γεγονός ότι το σύστημα ουμπικουιτίνης πρωτεασώματος ήταν υπεύθυνη για την αποδόμηση των πολλών σημαντικών ενδοκυτταρικών πρωτεϊνών που εμπλέκονται σε κρίσιμες κυτταρικές διεργασίες όπως την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου, πολλαπλασιασμό και την απόπτωση [28-30]. Επομένως, οι επιδράσεις της θεραπείας fangchinoline στην αποικοδόμηση των σημαντικών υποστρωμάτων πρωτεασώματος όπως ρ27 η οποία έπαιξε ρόλο στην πρόοδο του κυτταρικού κύκλου, Βαχ που εμπλέκονται στην απόπτωση, και ΙκΒ που σχετίζονται με ΝΡ-κΒ μονοπάτι [31] περαιτέρω ελέγχθηκαν στην παρούσα μελέτη. Επιπλέον, παρατηρήσαμε επίσης την επίδραση της υπερέκφρασης του πρωτεασώματος β1 υπομονάδος ή knockdown του πρωτεασώματος β1 υπομονάδα για την ευαισθησία των κυττάρων στο κυτταροτοξικότητα του fangchinoline.

Συλλογικά, τα αποτελέσματα μας πρότεινε την εμπλοκή της αναστολής πρωτεασώματος σε αντι -cancer επιπτώσεις της fangchinoline

in vitro

και

in vivo

. Τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης συμβάλλουν στην κατανόηση του μηχανισμού αντι-όγκου των fangchinoline καθώς Fangji.

Υλικά και Μέθοδοι

Χημικά

Fangchinoline με καθαρότητα πάνω από 98% και tetrandrine με καθαρότητα πάνω από 98% και οι δύο αγοράστηκαν από τη Σαγκάη Πηγή Leaf Technology Co, Ltd (Σαγκάη, Κίνα). Fangchinoline ή tetrandrine διαλύθηκε σε DMSO στη συγκέντρωση του 0,1 Μ ως διάλυμα παρακαταθήκης και αποθηκεύεται στους -20 ° C. Φθορισμογόνα πεπτιδικά υποστρώματα Ζ-Ile-AMC για τον έλεγχο πρωτεασώματος κασπάσης-όπως (C-L) δραστηριότητα και Ζ-ARR-AMC για τον έλεγχο πρωτεασώματος θρυψίνη-όπως (T-L) δραστηριότητα ήταν από Calbiochem, Merck. Φθορογόνο πεπτίδιο υπόστρωμα Suc-LLVY-AMC για τον έλεγχο πρωτεασώματος τύπου χυμοτρυψίνης (CT-L) δραστικότητα ήταν από την Sigma-Aldrich. Άλλα χημικά αντιδραστήρια, εκτός εάν ειδικά σημειώνεται, αγοράστηκαν από την Sigma-Aldrich.

Κυτταροκαλλιέργεια

Ανθρώπινο PC-3 καρκίνου του προστάτη κύτταρα και ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα του προστάτη LnCap αγοράστηκαν από την Cell Resource Center του Σαγκάη Ινστιτούτα Βιολογικών Επιστημών, κινεζική Ακαδημία Επιστημών. PC-3 κύτταρα και LNCaP κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε RPMI 1640 συμπληρωμένο με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό, 100 μονάδες /κ.εκ πενικιλλίνη και 100 μg /mL στρεπτομυκίνης και διατηρήθηκαν στους 37 ° C και 5% CO

2. Εμβρυϊκό βόειο ορό, RPMI 1640, πενικιλλίνη και στρεπτομυκίνη ήταν όλοι από Hyclone.

πλασμονίου επιφανείας βιοαισθητήρα συντονισμού ανάλυση

Η ανασυνδυασμένη ανθρώπινη πρωτεασώματος β1 υπομονάδα, προϊόν γονιδίου PSMB6, εκφράστηκε ως His-Tag πρωτεϊνών χρησιμοποιώντας Escherichia coli, και κατόπιν καθαρίστηκε με χρωματογραφία συγγένειας όπως αναφέρθηκε στην προηγούμενη μελέτη μας [32]. Οι συγγένειες δέσμευσης fangchinoline ή tetrandrine σε ανασυνδυασμένο πρωτεασώματος υπομονάδα καταλυτικής β1, αναλύθηκαν

in vitro

χρησιμοποιώντας ένα Biacore 3000 όργανο (Biacore ΑΒ, Rapsgatan 7, S-754 50 Uppsala, Sweden), όπως αναφέρθηκε πριν από [33] . Εν συντομία, ανασυνδυασμένη πρωτεασώματος β1 υπομονάδα πρωτεΐνης ακινητοποιήθηκε σε πλακίδιο αισθητήρα CM5 ως συνδέτης σε 11.624,5 RU με Ν-αιθυλ-Ν ‘- (3-διμεθυλαμινοπροπυλο) καρβοδιιμίδιο και Ν-υδροξυηλεκτριμίδιο, σύμφωνα με τις τυποποιημένες διαδικασίες πρωτοταγή αμίνη-σύζευξη, και HBS- ΕΡ (10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0,005% (ν /ν) επιφανειοδραστικό Ρ20, ρΗ 7.4) χρησιμοποιήθηκε ως το τρέχον ρυθμιστικό. Εξισορρόπηση της γραμμής βάσης έγινε με συνεχή ροή HBS-ΕΡ μέσα από την επιφάνεια τσιπ επί 1 έως 2 ώρες. δεδομένα Biacore συλλέχθηκαν σε 25 ° C με HBS-ΕΡ ως ρέον ρυθμιστικό σε σταθερή ροή 20 μL /min. Fangchinoline ή tetradrine αραιώθηκε σειριακά στο τρέχον ρυθμιστικό σε 0, 2,4, 3,43, 4,90, 7,0, 10 και 20 μΜ. Τα δείγματα εγχύθηκαν μέσα στα κανάλια με ρυθμό ροής 20 μL /min, και ακολουθεί πλύση με το τρέχον ρυθμιστικό. Οι απαντήσεις δεσμευτικός καταγράφηκαν συνεχώς σε μονάδες απόκρισης (RU) σε συχνότητα 1 Hz ως διαγραμμάτων αισθητήρα και παρουσιάζεται ως μία συνάρτηση του χρόνου. Η ένωση (

k

α) και διάστασης (

k

δ) σταθερές ρυθμού, η σταθερά διαχωρισμού ισορροπίας () προσδιορίστηκαν με ανάλυση των αισθητηριόγραμμα-καμπύλες λαμβάνονται σε διαφορετικές συγκεντρώσεις της ένωσης με τη χρήση ΒΙΑ λογισμικό αξιολόγησης έκδοση 3.1 (Biacore) και το 1:. 1 Langmuir δεσμευτικός τοποθέτηση μοντέλο

Δοκιμασία της δραστικότητας του ενζύμου του ανασυνδυασμένου πρωτεασώματος καταλυτικής β1 υπομονάδα

Εν συντομία, καταλυτική δράση του ανασυνδυασμένου ανθρώπινου πρωτεασώματος β1 υπομονάδα ελέγχθηκε με την προσθήκη ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης β1 υπομονάδα (30 μg) σε 100 μL ρυθμιστικού διαλύματος πρωτεασώματος δοκιμασία δραστικότητας (10 mM Tris-HCL, ρΗ 7.8, 5 mM τριφωσφορική αδενοσίνη, 0,5 mM διθειοθρεϊτόλης και 5 mM MgCl

2 • 6Η

2O) που περιέχει 50 μΜ Ζ-LLE-AMC με την παρουσία fangchinoline ή tetrandrine σε διαφορετικές συγκεντρώσεις ή όχι. Η δραστηριότητα υδρολάσης της υπομονάδας του πρωτεασώματος καταλυτική β1 θα μπορούσε να απελευθερώσει το φθορογόνο συστατικό AMC από το υπόστρωμα Ζ-Ile-AMC και την απελευθέρωση της AMC μετρήθηκε μετά από επώαση 2 h με Microplate Reader Bio-Rad 550 με διέγερσης και εκπομπής μήκη κύματος 360 και 465 nm , αντίστοιχα.

ΜΤΤ δοκιμασία των επιδράσεων του fangchinoline επί του πολλαπλασιασμού των PC-3 κύτταρα και LNCaP κύτταρα

Τα ανασταλτικά αποτελέσματα του fangchinoline επί του πολλαπλασιασμού των PC-3 κύτταρα ή LNCaP κύτταρα παρατηρήθηκε ελέγχοντας βιωσιμότητα κυττάρου των κυττάρων με τη χρήση ΜΤΤ δοκιμασία όπως περιγράφεται προηγουμένως [33]. Εν συντομία, τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 96-φρεατίων σε πυκνότητα 5 χ 10

4 κύτταρα /mL για PC-3 κυττάρων και 4 χ 10

4 κύτταρα /mL για LNCaP κύτταρα. Μετά από ολονύκτια καλλιέργεια, τα μέσα αλλάχθηκαν σε φρέσκο ​​μέσο που περιέχει διάφορες συγκεντρώσεις fangchinoline ή 0,1% DMSO (έλεγχος διαλύτη) για 24, 48 ώρες ή 72 ώρες. Η βιωσιμότητα των κυττάρων εκτιμήθηκε με μέτρηση της μιτοχονδριακής εξαρτώμενη μετατροπή του κίτρινου ΜΤΤ άλας τετραζολίου σε μωβ κρυστάλλους φορμαζάνης από μεταβολικά δραστικά κύτταρα. Η οπτική πυκνότητα (ανάλογη με τον αριθμό των ζωντανών κυττάρων) εκτιμήθηκε με Microplate Reader Bio-Rad 550 στα 570 nm. IC

50 τιμή (το ήμισυ της μεγίστης ανασταλτική συγκέντρωση) υπολογίστηκε με τη μέθοδο Logit.

Δοκιμασία κυτταρικών δραστηριοτήτων πρωτεασώματος του PC-3 κύτταρα και LNCaP κύτταρα

Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή είτε με έλεγχος διαλύτη (0,1% DMSO), fangchinoline σε διαφορετικές συγκεντρώσεις, ή 1 μΜ carfilzomib (θετικός έλεγχος) για 24 ώρες στους 37 ° C. Οι ενζυματικές δραστηριότητες της κυτταρικής πρωτεασώματος σε κυτταρολύματος μετρήθηκαν όπως αναφέρθηκε στο προηγούμενο έγγραφο μας [32]. Εν συντομία, τα κύτταρα συλλέχθηκαν, πλύθηκαν με PBS και στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε λύση σε ρυθμιστικό δοκιμασίας δραστικότητας πρωτεοσώματος για 30 λεπτά στους 4 ° C. Το ομογενοποίημα στη συνέχεια φυγοκεντρήθηκε στα 12,000 χ g για 30 λεπτά στους 4 ° C. Το υπερκείμενο συλλέχθηκε ως εκχύλισμα ολόκληρων κυττάρων και η περιεκτικότητα σε πρωτεΐνη στο υπερκείμενο μετρήθηκε με το αντιδραστήριο Bradford. Καταλυτική δραστηριότητες της κυτταρικής πρωτεασώματος προσδιορίστηκαν με την προσθήκη εκχυλίσματος ολόκληρων κυττάρων (που περιέχει 30 μg πρωτεΐνης) σε 100 μL ρυθμιστικού δοκιμασίας δραστικότητας πρωτεοσώματος που περιέχει 50 μΜ φθορισμογόνα πεπτιδικά υποστρώματα, όπως Ζ-LLE-AMC για την ανίχνευση δραστικότητα CL, Z-ARR-AMC για ανίχνευση δραστηριότητα TL ή Suc-LLVY-AMC για την ανίχνευση δραστηριότητα CT-L, αντίστοιχα. Η απελευθέρωση της AMC φθορογόνου από τα πεπτιδικά υποστρώματα μετρήθηκε στη συνέχεια όπως περιγράφεται παραπάνω.

Δοκιμασία δραστηριότητας CL καθαρισμένου ανθρώπινου 20S πρωτεασώματος

Το κιτ δοκιμασίας πρωτεάσωμα 20S αγοράστηκε από Enzo Life Sciences, Inc . (Farmingdale, NY 11735, USA). Το K

m, V

Οι μέγιστες τιμές της καθαρισμένης πρωτεασώματος 20S ανθρώπινων ερυθροκυττάρων για φθοριογονικών πεπτιδικού υποστρώματος Z-LLE-AMC μετράται σύμφωνα με τις οδηγίες που παρέχονται από τον κατασκευαστή. Η αδρανοποίηση καθαρισμένου πρωτεασώματος 20S ανθρώπινων ερυθροκυττάρων με fangchinoline προσδιορίστηκε με παρακολούθηση της υδρόλυσης του υποστρώματος με την παρουσία διαφόρων συγκεντρώσεων fangcinoline. Οι δοκιμασίες διεξήχθησαν στους 37 ° C σε ένα ρυθμιστικό διάλυμα αντίδρασης (50 μL) που περιείχε 50 mM Tris /HCL, ρΗ 7.5, 25 mM KCL, 10 mM NaCl, 1 mM ΜαΟΙ

2, 0,1 μg 20S πρωτεασώματος και Ζ-LLE- AMC. Οι αντιδράσεις αφέθηκαν να προχωρήσουν επί 120 λεπτά, και τα δεδομένα φθορισμού συλλέχθηκαν κάθε 1 λεπτό, και στη συνέχεια χαράσσεται ως συνάρτηση του χρόνου. Η φαινόμενη σταθερά διαχωρισμού, K

i

app, προσδιορίσθηκε με μη γραμμική ελαχίστων προσαρμογή των κλασματικών ταχύτητα, ν

Ι /ν

0, ως συνάρτηση του [Ι], όπου v

i είναι η σταθερή κατάσταση υπολειμματική δραστικότητα του ενζύμου παρουσία του αναστολέα (Ι) και ν

0 είναι η αρχική ταχύτητα εν τη απουσία αναστολέα (). Η σταθερά διαστάσεως, Κ, υπολογίσθηκε από την προφανή σταθερά διάστασης, Κ

i

app, χρησιμοποιώντας την ακόλουθη έκφραση, όπου [S] είναι η συγκέντρωση του υποστρώματος και το Κ

m είναι η σταθερά δέσμευσης υποστρώματος () .

διέγερση διακοπή του κυτταρικού κύκλου και την απόπτωση με fangchinoline σε PC-3 κύτταρα

Η επαγωγή διακοπή του κυτταρικού κύκλου και την απόπτωση με fangchinoline σε PC-3 κύτταρα παρατηρήθηκε με τη χρησιμοποίηση ανάλυσης κυτταρομετρίας ροής όπως που περιγράφονται σε προηγούμενες εκθέσεις μας [32-34]. Εν συντομία, για ανάλυση κυτταρομετρίας ροής του κυτταρικού κύκλου, τα κύτταρα συλλέχθηκαν μετά από αγωγή, πλύθηκαν με PBS και στη συνέχεια μονιμοποιήθηκαν με 70% αιθανόλη στους 4 ° C για όλη τη νύχτα. Μετά PBS πλύσεις, τα κύτταρα επαναιωρήθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα χρώσης (10 mg /mL RNase Α και 5 mg /mL ιωδιούχο προπίδιο σε κρύο PBS) για 30 λεπτά στο σκοτάδι σε θερμοκρασία δωματίου και στη συνέχεια αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας κυτταρόμετρο ροής FACSCalibur. Για την ανάλυση κυτταρομετρίας ροής της απόπτωσης, Alexa Fluor 488 αννεξίνης V & amp? χρησιμοποιήθηκε PI /Dead κυτταρική απόπτωση Kit (Invitrogen). Τα κύτταρα συλλέχθηκαν μετά από αγωγή, πλύθηκαν με PBS και μετά επαναιωρήθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα δέσμευσης και μετά επωάστηκαν με ιωδιούχο Annexin V-FITC και προπιδίου για 15 λεπτά στο σκοτάδι σε θερμοκρασία δωματίου. Στη συνέχεια, ανάλυση κυτταρομετρίας ροής πραγματοποιήθηκε και η ανάλυση των δεδομένων έγινε με το λογισμικό CellQuest.

πειράματα ξενομοσχεύματος PC-3 όγκου

Αρσενικά γυμνά ανοσοανεπαρκείς ποντικούς Balb /c-nu-ηυ, ηλικίας 4 εβδομάδων αγοράστηκαν από τη Σαγκάη Πειραματικό Κέντρο ζώων. Όλες οι διαδικασίες που αφορούν τα ζώα είχαν εγκριθεί από την Επιτροπή Θεσμικών Ζωικά Φροντίδα και Χρήση της Σαγκάης Ινστιτούτο της Materia Medica, Κινεζική Ακαδημία Επιστημών. Την ημέρα 0, κύτταρα PC-3 (8 × 10

6 κύτταρα) εναιωρήθηκαν σε 0.2 κ.εκ. άνευ ορού RPMI 1640 εμβολιάστηκαν s.c. στο δεξί πλευρό του κάθε ποντικού (έξι ποντικοί ανά ομάδα). 14 ημέρες μετά τον εμβολιασμό, τα ποντίκια χωρίστηκαν τυχαία σε 3 ομάδες και άρχισε ένεση είτε με τον έλεγχο του οχήματος ή fangchinoline στα 25 mg /kg (ΙΡ., QD) ή 50 mg /kg (ΙΡ., QD). μεγέθη του όγκου μετρήθηκαν κάθε 4 ημέρες χρησιμοποιώντας δαγκάνες και οι όγκοι τους υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας ένα πρότυπο τύπο: πλάτος

2 x μήκος /2. Ο σχετικός όγκος του όγκου (RTV) ορίστηκε ως η αναλογία του όγκου του όγκου σε ένα υποδεικνυόμενο χρόνο και τον όγκο του όγκου κατά την έναρξη της φαρμακευτικής αγωγής. Το βάρος του σώματος μετρήθηκε ημερησίως. Την ημέρα 30 μετά τον εμβολιασμό, οι ποντικοί θυσιάστηκαν με CO

2 εισπνοή και όγκων ξενομοσχευμάτων αποκόπηκαν. Για να απεικονίσει την απόπτωση σε ξενομοσχεύματα όγκου, την επισήμανση TUNEL διεξήχθη για την ανίχνευση αποπτωτικών πυρήνων χρησιμοποιώντας In Situ Death Detection Kit (Roche Molecular Biochemicals). Εν συντομία, νεοπλασματικά ξενομοσχεύματα σταθεροποιήθηκαν με διάλυμα φορμαλίνης 10% σε θερμοκρασία δωματίου για 24 ώρες και στη συνέχεια ενσωματώνονται με παραφίνη. Τα δείγματα θερμάνθηκαν για 1 ώρα από νερό Bath-Slide Drier (LEICA Η1 1220, γερμανικά), επωάστηκαν με διμεθυλοβενζόλιο για δύο φορές (8 min κάθε φορά) και μετά επωάστηκαν με 100%, 95%, 90% και 85% αιθανόλη για δύο φορές ( 3 λεπτά το καθένα). Τα δείγματα στη συνέχεια επωάστηκαν με 0,1 Μ ρυθμιστικό κιτρικού (ρΗ 6,0) για την ακτινοβόληση μικροκυμάτων. Μετά από πλύση με PBS για δύο φορές (3 λεπτά κάθε φορά), φέτες επωάστηκαν με ρυθμιστικό αντίδρασης (από το In Situ Death Detection Kit) σε υγρή ατμόσφαιρα στους 37 ° C για 1 ώρα. Οι φέτες στη συνέχεια πλύθηκαν με PBS τρεις φορές (3 λεπτά έκαστο) προς απομάκρυνση μη ενσωματωμένου τριφωσφορική δεοξυουριδίνη φλουορεσκεΐνη. Οι πυρήνες βάφτηκαν αντίθετα με 4,6-διαμιδινο-2-φαινυλινδόλη (ϋΑΡΙ) 1 μg /mL για 3 λεπτά και στη συνέχεια πλύθηκαν με PBS τρεις φορές (3 λεπτά το καθένα). Οι εικόνες ελήφθησαν με τη χρήση ενός στόχου 20Χ (Olympus BX51, Ιαπωνία) σε ένα μικροσκόπιο επιφθορισμού. Επιπλέον, προσδιορίστηκαν οι δραστηριότητες πρωτεασώματος ξενομοσχευμάτων όγκου. Εν συντομία, ξενομοσχεύματα όγκου homogenerized σε ρυθμιστικό δοκιμασίας δραστικότητας πρωτεοσώματος χρησιμοποιώντας το Σύστημα FastPrep (ΜΡ-24 FastPrep, USA), μετά από φυγοκέντρηση στους 4 ° C για 30 λεπτά. Τα υπερκείμενα στη συνέχεια χρησιμοποιούνται για δοκιμασία των δραστηριοτήτων πρωτεασώματος χρησιμοποιώντας τη μέθοδο όπως περιγράφεται παραπάνω για την ανάλυση των κυτταρικών δραστηριοτήτων πρωτεασώματος.

κηλίδωση Western ανάλυση

Western δοκιμασία κηλίδωσης διεξήχθη όπως περιγράφηκε προηγουμένως [33, 34] . Εν συντομία, μία μικρή ποσότητα πρωτεΐνης (100 μg) δείγμα φορτώθηκε σε 12% SDS γέλη, διαχωρίστηκε ηλεκτροφορητικά και μεταφέρθηκαν σε μια μεμβράνη νιτροκυτταρίνης (Bio-Rad). Αφού η μεμβράνη επωάστηκε με 10 mM TBS με 20% Tween 20 και 5% αφυδατωμένο αποβουτυρωμένο γάλα για να εμποδίσει μη ειδική πρωτεΐνη δεσμεύσεως, η μεμβράνη επωάστηκε με πρωτεύοντα αντισώματα όλη τη νύχτα στους 4 ° C. Τα πρωτογενή αντισώματα (όλα από την Cell Signaling Technology) που χρησιμοποιήθηκαν ήταν πολυκλωνικό αντίσωμα κουνελιού έναντι ανθρώπινου ΙκΒ-α (# 4812, 1: 400), Βαχ (# 2772, 1: 400), πρωτεοσώματος β1 υπομονάδα (PSMB6) (# 13267, 1 : 500), β-ακτίνη (# 4967, 1: 400) και ποντικού μονοκλωνικού αντισώματος κατά της ανθρώπινης ρ27 Kip1 (# 3688, 1: 400) ή ουβικιτίνη (# 3936, 1: 1000). Μετά TBS πλύσεις, τα στυπώματα στη συνέχεια επωάστηκαν με δευτερογενές αντίσωμα για 2 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου σε μία αραίωση 1: 1000 και έπειτα ορατή χρησιμοποιώντας χημειοφωταύγεια (Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA). Τα δευτερεύοντα αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν ήταν HRP-συνδεδεμένη IgG αίγας αντι-κουνελιού (# 7074) και HRP-συνδεδεμένη αλόγου αντι-ποντικού IgG (# 7076), και οι δύο από την Cell Signaling Technology.

Η υπερέκφραση του πρωτεασώματος β1 υπομονάδα σε PC-3 κύτταρα με επιμόλυνση πλασμιδίου

κύτταρα με υπερέκφραση του πρωτεασώματος β1 υπομονάδας ελήφθησαν με επιμόλυνση με πλασμίδιο pcDNA3.1 που κωδικοποιεί πλήρους μήκους ανθρώπινου cDNA PSMB6 όπως περιγράφηκε προηγουμένως [34]. Για πλασμίδιο διαμόλυνση, 5 × 10

5 κύτταρα σπάρθηκαν σε κάθε φρεάτιο μιας έξι φρεατίων μέχρις ότου τα κύτταρα έφθασαν περίπου 80% συρροή μετά καλλιεργήθηκαν για 24 ώρες. 2,5 μg pcDNA3.1 πλασμιδιακό DNA που κωδικοποιεί PSMB6 ή πλασμιδίου pcDNA3.1 DNA χωρίς PSMB6 (ως αρνητικός έλεγχος) αραιώθηκε σε 250 μΙ μέσου χωρίς ορό και έπειτα επωάστηκαν για 20 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου με ένα μίγμα από 10 μι Lipofectamine 2000 (Invitrogen ) και 400 μΙ μέσου χωρίς ορό. Το προκύπτον σύνθετο μίγμα στη συνέχεια προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο της πλάκας καλλιέργειας κυττάρων. Μετά από 6 ώρες επώαση, το σύμπλοκο μέσο αντικαταστάθηκε με φρέσκο ​​ελάχιστο βασικό μέσο συμπληρωμένο με 10% (ν /ν) FBS και αφέθηκαν να μεγαλώσουν την διάρκεια της νύχτας. Στη συνέχεια, G418 (Merck) προστέθηκε στο μέσον για να επιτευχθεί τελική συγκέντρωση ίση με την ελάχιστη θανατηφόρο δόση (400 μg /mL). Τα κύτταρα αφέθηκαν να αναπτυχθούν και πέρασμα με την παρουσία του G418 για πάνω από 2 εβδομάδες. Έκφραση των υπομονάδων του πρωτεασώματος β1 στα επιμολυσμένα κύτταρα ελέγχθηκε χρησιμοποιώντας δοκιμασία Western blotting και συγκρίθηκε με εκείνη των κυττάρων άγριου τύπου και τα κύτταρα αρνητικού ελέγχου. Η κυτταροτοξικότητα του fangchinoline σε κύτταρα με υπερέκφραση του πρωτεασώματος β1 υπομονάδα στη συνέχεια ελέγχθηκε χρησιμοποιώντας ΜΤΤ δοκιμασία όπως περιγράφεται παραπάνω και συγκρίθηκε με εκείνη των κυττάρων άγριου τύπου και τα κύτταρα αρνητικού ελέγχου.

εξόντωση πρωτεασώματος β1 υπομονάδας σε PC-3 κύτταρα με siRNA διαμόλυνση

Επικυρώθηκε siRNAs για PSMB6 (Sigma-Aldrich) διαμολύνθηκαν σε κύτταρα PC-3 με τη χρήση Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Κωδικοποιημένα αρνητικό siRNAs ελέγχου (Sigma-Aldrich) χρησιμοποιήθηκαν ως αρνητικός μάρτυρας. επίπεδα έκφρασης του PSMB6 (πρωτεασώματος β1 υπομονάδα) σε ευρεία κύτταρα τύπου, PSMB6 knockdown κύτταρα (κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με τα siRNA για PSMB6), κύτταρα αρνητικού ελέγχου (κύτταρα επιμολυσμένα με τα ανακατωμένα αρνητικό έλεγχο siRNAs) ελέγχθηκαν με τη χρήση Western δοκιμασία κηλίδωσης. Για να ελέγξετε την επιρροή του πρωτεασώματος β1 υπομονάδα νοκ ντάουν για κυτταροτοξικότητα της fangchinoline, τα κύτταρα επιμολυσμένα με τα siRNA για PSMB6 ή ομελέτα αρνητικά τα siRNA ελέγχου για 24 ώρες. Στη συνέχεια, τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων σε πυκνότητα 5 χ 103 κύτταρα /φρεάτιο και τα αποτελέσματα της fangcinoline στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων ελέγχθηκαν χρησιμοποιώντας ΜΤΤ δοκιμασία όπως περιγράφεται ανωτέρω. Επιπλέον, τα αποτελέσματα της fangchinoline στους δείκτες της απόπτωσης και αυτοφαγία σε κύτταρα με φυσιολογική ή knockdown του β1 υπομονάδος ελέγχθηκαν χρησιμοποιώντας δοκιμασία Western blotting όπως περιγράφεται παραπάνω. Εν συντομία, μετά από επιμολυσμένα με τα siRNA για PSMB6 ή κωδικοποιημένο αρνητικός siRNAs ελέγχου για 24 ώρες, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με fangchinoline στους 40 μΜ για 24 ώρες. Στη συνέχεια, τα κύτταρα συλλέχθηκαν για δοκιμασία Western blotting. Τα πρωτογενή αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν ήταν αντι-κασπάση κουνέλι 3 αντίσωμα (1: 1000, Cell Signaling Technology, Cat # 9662), αντι-ΡΑΚΡ αντίσωμα κουνελιού (1: 1000, Cell Signaling Technology, Cat # 9542) και αντίσωμα αντι-LC3B κουνελιού ( 1: 1000, Cell Signaling Technology, Cat # 2775). Το δευτερεύον αντίσωμα που χρησιμοποιήθηκε ήταν IgG αντι-κουνελιού HRP-συνδεδεμένη κατσίκας (1: 1000, Cell Signaling Technology, Cat # 7074).

Η στατιστική ανάλυση

Φοιτητών

t

– δοκιμή εφαρμόστηκε για να αξιολογήσει τις διαφορές μεταξύ θεραπεία και έλεγχο ομάδες. Τα δεδομένα εκφράστηκαν ως μέση τιμή ± SEM και τα αποτελέσματα από τουλάχιστον 3 ανεξάρτητα πειράματα χρησιμοποιήθηκαν για στατιστική ανάλυση. Οι αστερίσκοι δείχνουν μία σημαντική διαφορά (P & lt? 0,05) σε σύγκριση με τον έλεγχο του ΟΗΕ που έλαβαν

Αποτελέσματα

συγγένειες βιβλιοδεσίας και άμεση ανασταλτικά αποτελέσματα της fangchinoline /tetrandrine για ανασυνδυασμένη πρωτεασώματος β1 υπομονάδα

Τόσο fangchinoline (σχήμα 1Γ) και tetrandrine (Σχήμα 1D) εμφάνισαν άμεση συγγένεια σύνδεσης με ανασυνδυασμένη ανθρώπινη υπομονάδα πρωτεασώματος β1. Όπως φαίνεται στο Σχ 1C, RU αυξάνεται με την αύξηση συγκέντρωσης fangchinoline, η οποία έδειξε ότι fangchinoline ήταν σε θέση να συνδέεται με πρωτεασώματος υπομονάδα β1 με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. Παρόμοια αποτελέσματα παρατηρήθηκαν για tetrandrine (Εικ 1D). Η ένωση (

k

α), διαχωρισμός (

k

δ) και διάστασης ισορροπίας (

K

D) σταθερές fangchinoline ή σύνδεση προς το πρωτεάσωμα β1 υπομονάδα tetrandrine φαίνονται στον πίνακα 1. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι fangchinoline και tetrandrine παρουσίασαν παρόμοια συγγένεια δέσμευσης με πρωτεασώματος υπομονάδα β1. Επιπλέον, τόσο fangchinoline και tetrandrine θα μπορούσε να αναστείλει άμεσα την ενζυμική δραστικότητα της ανασυνδυασμένης πρωτεασώματος β1 υπομονάδα

in vitro

. Όπως φαίνεται στο Σχ 1Ε, fangchinoline δοσοεξαρτώμενο ανέστειλε την δραστικότητα του ανασυνδυασμένου πρωτεασώματος β1 υπομονάδα. Παρόμοια αποτελέσματα παρατηρήθηκαν για tetrandrine (Εικ 1 F).

Η

Ο ανασταλτικός επιδράσεις της fangchinoline στον πολλαπλασιασμό και την κυτταρική πρωτεασώματος δραστηριότητες των καρκινικών κυττάρων

Όπως φαίνεται στο Σχ 2Α, fangchinoline μπορούσε δοσοεξαρτώμενο και χρονικά εξαρτώμενο μειώνουν τη βιωσιμότητα των PC-3 κύτταρα. Το IC

50 τιμές του fangchinoline στην αναστολή του πολλαπλασιασμού των κυττάρων PC-3 κύτταρα 27.53 ± 3.346 μΜ για 24 ώρες, 13.13 ± 1.579 μΜ για 48 ώρες, και 7,247 ± 0,3122 μΜ για 72 θεραπεία h, αντίστοιχα. Επιπλέον, όπως φαίνεται στο σχήμα 2Β, fangchinoline μπορούσε δοσοεξαρτώμενο αναστέλλουν την C-L δραστηριότητα των κυτταρικών πρωτεασώματος, η οποία διαμεσολαβείται από πρωτεασώματος β1 υπομονάδα. Η αναστολή στη δραστικότητα C-L ήταν σημαντική σε δόσεις 1 και 10 μΜ fangchinoline. Οι δραστηριότητες του πρωτεασώματος τύπου θρυψίνης (TL) και χυμοθρυψίνης (CT-L) δραστηριότητες, με τη μεσολάβηση β2 πρωτεασώματος και υπομονάδας β5, δεν επηρεάστηκαν σημαντικά από fangchinoline θεραπεία.

(Α) Κυτταρική βιωσιμότητα (ΜΤΤ αποτέλεσμα δοκιμασίας) από PC-3 κύτταρα που κατεργάζονται με διάφορες συγκεντρώσεις fangchinoline για 24, 48 ή 72 ώρες. Τα δεδομένα ήταν στατιστικά αποτελέσματα τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. (Β) Κυτταρική δραστηριότητες πρωτεασώματος του PC-3 κύτταρα που κατεργάζονται με 0,1% DMSO ή fangchinoline σε διαφορετικές συγκεντρώσεις για 24 ώρες. (C) Cell βιωσιμότητας (αποτέλεσμα δοκιμασίας ΜΤΤ) των LNCaP κυττάρων σε επεξεργασία με διάφορες συγκεντρώσεις fangchinoline για 24, 48 ή 72 ώρες. (Δ) Κυτταρική δραστηριότητες πρωτεασώματος του PC-3 κύτταρα ελέγχου σε επεξεργασία με 0,1% DMSO (μάρτυρας διαλύτης) ή fangchinoline σε διαφορετικές συγκεντρώσεις για 24 ώρες. Τα δεδομένα ήταν στατιστικά αποτελέσματα τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. *

σ

& lt? 0,05 έναντι του ελέγχου διαλύτη. Carfilzomib χρησιμοποιήθηκε ως θετικός έλεγχος.

Η

Παρόμοια αποτελέσματα παρατηρήθηκαν σε ένα άλλο κυτταρική σειρά καρκίνου, LNCaP κύτταρα. Fangchinoline δοσο-εξαρτώμενο τρόπο και το χρόνο εξαρτώμενο από μειώνουν την βιωσιμότητα των LNCaP κυττάρων (Σχήμα 2C). Το IC

50 τιμές του fangchinoline στην αναστολή του κυτταρικού πολλαπλασιασμού των LNCaP κυττάρων ήταν 36.18 ± 6.33 μΜ για 24 ώρες, 11.59 ± 0.22 μΜ για 48 ώρες, και 12,73 ± 0,59 μΜ για 72 θεραπεία h, αντίστοιχα. Και, fangchinoline μπορούσε επίσης να αναστέλλουν σημαντικά την δραστηριότητα CL της κυτταρικής πρωτεασώματος, αλλά δεν επηρεάζουν τις δραστηριότητες της πρωτεασώματος TL και CT-L δραστηριοτήτων σε LNCaP κύτταρα (Σχήμα 2D).

Ο ανασταλτικός επιπτώσεις της fangchinoline στη δραστηριότητα CL καθαρού ανθρώπινο 20S πρωτεασώματος

Η καμπύλη υδρόλυση του β1-ειδικών φθοριογονικών πεπτιδικού υποστρώματος Z-Ile-AMC σε διαφορετικές συγκεντρώσεις από καθαρισμένο ανθρώπινο 20S πρωτεασώματος παρουσιάστηκε στο σχήμα 3Α. Το K

m και V

max του καθαρισμένου πρωτεασώματος υπολογίστηκε να είναι 244.2 μΜ και 9.749X10

-4 nmol /min, αντίστοιχα. Οι αντιπροσωπευτικές καμπύλες υδρόλυση εξαρτώμενη από το χρόνο του Ζ-LLE-AMC (75 μΜ) με πρωτεασώματος, με ή χωρίς παρουσία 500 μΜ fangchinoline δείχθηκε στο Σχ 3Β. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η υδρόλυση του υποστρώματος με πρωτεασώματος ήταν εν μέρει αναστέλλεται παρουσία του fangchinoline. Τα ανασταλτικά αποτελέσματα των fangchinoline σε διαφορετικές δόσεις φαίνεται στο Σχ 3C. Το K

i της fangchinoline υπολογίστηκαν να είναι 356,58 ± 30,63 μΜ.

(Α) υδρόλυση του β1-ειδική φθοριογονικών πεπτιδικού υποστρώματος Z-Ile-AMC σε διαφορετικές συγκεντρώσεις από καθαρισμένο ανθρώπινο 20S πρωτεασώματος. (Β) Ο χρόνος που εξαρτώνται από την υδρόλυση του υποστρώματος 75 μΜ Z-Ile-AMC με 20S πρωτεασώματος, με ή χωρίς την παρουσία 500 μΜ fangchinoline. (Γ) Ο ανασταλτικός επιδράσεις της fangchinoline σε διαφορετικές συγκεντρώσεις επί της δραστικότητας υδρόλυσης του 20S πρωτεασώματος. Τα δεδομένα ήταν στατιστικά αποτελέσματα τριών ανεξάρτητων πειραμάτων.

Η

Fangchinoline επαγόμενη διακοπή του κυτταρικού κύκλου και της απόπτωσης σε κύτταρα PC-3

Αντιπροσωπευτικά αποτελέσματα της ανάλυσης κυτταρικού κύκλου δείχθηκε στο Σχήμα 4Α και στατιστική ανάλυση αποτελέσματα φαίνονται στον πίνακα 1. Fangchinoline-επεξεργασμένα κύτταρα PC-3 φάνηκε να συσσωρεύονται κατά τη φάση G0 /G1 με ταυτόχρονη μείωση στο ποσοστό των κυττάρων στη φάση S. Και, επίσης fangchinoline δοσοεξαρτώμενο επαγόμενη απόπτωση σε κύτταρα PC-3. Αντιπροσωπευτικά αποτελέσματα της ανάλυσης απόπτωσης δείχθηκε στο Σχήμα 4Β και τα αποτελέσματα στατιστική ανάλυση φαίνονται στον Πίνακα 2.

(Α) Αντιπροσωπευτική κυτταρομετρίας ροής αποτελέσματα ανάλυσης του ιστογράμματα DNA του PC-3 κύτταρα που κατεργάζονται με διάφορες συγκεντρώσεις για 24 fangchinoline h. Παρατηρήθηκε κελί σύλληψη του κύκλου σε φάση G0 /G1. (Β) Αντιπροσωπευτικά ροή αποτελέσματα ανάλυσης κυτταρομετρίας απόπτωσης σε κύτταρα PC-3 υποβάλλεται σε επεξεργασία με διάφορες συγκεντρώσεις fangchinoline για 24 ώρες. Έδειξε ήταν αντιπροσωπευτικά αποτελέσματα τριών ανεξάρτητων πειραμάτων.

Η

θεραπεία Fangchinoline ανέστειλε την ανάπτυξη των PC-3 ξενομοσχεύματα καρκίνου του προστάτη και απόπτωση που επάγεται

Όπως φαίνεται στο Σχήμα 5Α, fangchinoline θεραπεία στα 25 και 50 mg /kg θα μπορούσε δοσοεξαρτώμενο αναστέλλουν την ανάπτυξη των PC-3 ξενομοσχεύματα. Τα δεδομένα έδειξαν στο σχήμα 5Α ήταν σχετικός όγκος του όγκου (RTV), η οποία ορίζεται ως ο λόγος του όγκου του όγκου σε ένα υποδεικνυόμενο χρόνο και τον όγκο του όγκου κατά την έναρξη της φαρμακευτικής αγωγής. Τα δεδομένα του όγκου του όγκου (mm

3) της κάθε ομάδας έδειξαν στον Πίνακα S1. Και, τα αποτελέσματα της επισήμανσης TUNEL (Σχήμα 5Β) έδειξε ότι η απόπτωση προκλήθηκε σε PC-3 ξενομοσχεύματα ζώων που υπέστησαν αγωγή με fangchinoline.

(Α) καμπύλη ανάπτυξης όγκου σε γυμνούς ποντικούς που έλαβαν θεραπεία με τον έλεγχο του οχήματος, 25 mg /kg fangchinoline ή 50 mg /kg fangchinoline. (Β) απόπτωση (έδειξε με την επισήμανση TUNEL) που προκαλείται από fangchinoline σε ξενομοσχεύματα όγκου των ζώων που έλαβαν θεραπεία με fangchinoline. μπαρ κλίμακας = 10 μm. δραστηριότητες (Γ) πρωτεασώματος ξενομοσχευμάτων όγκου των ζώων που έλαβαν θεραπεία με μάρτυρα φορέα ή fangchinoline. *

P

& lt?. 0,05 vs. ομάδα ελέγχου

Η

αναστολή πρωτεασώματος σε ξενομοσχεύματα των ζώων που έλαβαν θεραπεία με fangchinoline

Όπως φαίνεται στο σχήμα 5C, τα αποτελέσματα της δραστηριότητας του πρωτεασώματος ποσοτικό προσδιορισμό των ξενομοσχευμάτων όγκου έδειξε ότι οι δραστηριότητες πρωτεασώματος ξενομοσχευμάτων ομάδων fangchinoline αγωγή μειώθηκαν σε σύγκριση με εκείνη του ελέγχου του οχήματος. Η μείωση της δραστηριότητας του πρωτεασώματος ήταν σημαντική σε 50 mg /kg ομάδα fangchinoline φάρμακο.

Fangchinoline επαγόμενη συσσώρευση ουβικουιτινωμένης πρωτεΐνες, καθώς και Ub-ΙκΒα, Ub-ρ27 και Ub-Βαχ

Proteasome η αναστολή θα μπορούσε να προκαλέσει συσσώρευση ουβικουιτινωμένης πρωτεϊνών. Όπως φαίνεται στο Σχ 6Α και το Σχ 6Β, fangchinoline επαγόμενη δοσο-εξαρτώμενη και χρονο-εξαρτώμενη συσσώρευση των ουμπικιτινομένων πρωτεϊνών σε κύτταρα.