Αφηρημένο

Fos που σχετίζονται με το αντιγόνο 2 (FRA-2 /FOSL2) ανήκει στην οικογένεια μεταγραφικού παράγοντα AP-1. Αν και FOSL2 έχει δειχθεί ότι εμπλέκεται σε διάφορες φυσιολογικές και παθολογικές διαδικασίες, πολύ λίγα είναι γνωστά σχετικά με τις οδούς σηματοδότησης που ρυθμίζουν την έκφραση FOSL2 και τους μηχανισμούς λειτουργίας FOSL2. Εδώ, δείχνουμε ότι η έκφραση FOSL2 ρυθμίζεται από ΤΟΡ-β1 και ότι FOSL2 απαιτείται για τον ΤΟΡ-β1 επαγόμενη μετανάστευση. Έχουμε αποδείξει ότι FOSL2 αλληλεπιδρά με Smad3

in vitro

και

in vivo

και έτσι ρυθμίζει προς ΤΟΡ-β1 επαγόμενη αποκρίσεις σηματοδότησης. Μηχανιστικά, FOSL2 προωθεί P300 σύνδεση με Smad3 και την ακετυλίωση της Smad3 με P300. Επιπλέον, δείχνουμε ότι η έκφραση του FOSL2 συσχετίζεται με ενεργοποιημένα έκφραση Smad3 σε κλινικές μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC) δείγματα. Συνοψίζοντας, η παρούσα μελέτη δείχνει ότι FOSL2 διευκολύνει TGF-β1 που προκαλείται από τη μετανάστευση από την αλληλεπίδραση με Smad3 στον NSCLC και προτείνει FOSL2 ως πιθανό θεραπευτικό στόχο για NSCLC

Παράθεση:. Wang J, Sun D, ​​Wang Υ, ren F, Pang S, Wang D, et al. (2014) FOSL2 Ρυθμίζει Θετικά TGF-β1 σηματοδότηση σε μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα. PLoS ONE 9 (11): e112150. doi: 10.1371 /journal.pone.0112150

Συντάκτης: Jeremy J W. Chen, Ινστιτούτο Βιοϊατρικών Επιστημών, Ταϊβάν

Ελήφθη: 4 του Ιούνη 2014? Αποδεκτές: 13, Οκτωβρίου 2014? Δημοσιεύθηκε: 6 Νοεμβρίου, 2014

Copyright: © 2014 Wang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Η συγγραφείς επιβεβαιώνουν ότι όλα τα δεδομένα που διέπουν τα ευρήματα είναι πλήρως διαθέσιμα χωρίς περιορισμούς. Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του χαρτιού

Χρηματοδότηση: Το έργο χρηματοδοτήθηκε από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (81172818? 81172215).. Ο χρηματοδότης δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ο ΤΟΡ-β οδού ελέγχει διαφόρων βιολογικών διεργασιών, συμπεριλαμβανομένου του πολλαπλασιασμού των κυττάρων, της διαφοροποίησης, της απόπτωσης, και της μετανάστευσης [1]. Μετά την ενεργοποίηση των ετερομερών τύπου II και τα σύμπλοκα υποδοχέα κινάσης τύπου Ι σερίνης-θρεονίνης κατά τη δέσμευση συνδέτη ΤΟΡ-β, ενδοκυτταρικής σηματοδότησης αρχίζει με φωσφορυλίωση του υποδοχέα ενεργοποιημένου Smad πρωτεΐνες (R-Smads) [2]. Ως μεταγραφικοί παράγοντες της οδού ΤΟΡ-β, φωσφορυλιωμένα Smad2 /3 σχηματίζει ένα σύμπλοκο με Smad4 και στη συνέχεια μετατοπίζεται στον πυρήνα για να ρυθμίζουν τη μεταγραφή του ΤΟΡ-β γονίδια στόχους οδού [3]. Οι κυτταρικές αποκρίσεις στην σηματοδότηση ΤΟΡ-β επηρεαστεί περαιτέρω από την αλληλεπίδραση των πρωτεϊνών Smad με συμπαράγοντες (συνενεργοποιητές ή συγκαταστολείς) για να ρυθμίζει την μεταγραφική δραστικότητα [4].

Fos-συναφές αντιγόνο 2 (FRA-2 /FOSL2) ανήκει στην οικογένεια παράγοντα μεταγραφής ΑΡ-1, που περιλαμβάνει τις διάφορες ισομορφές της Fos και Jun [5]. Οι διάφορες ΦΩΣ πρωτεΐνες παίζουν βασικούς ρόλους σε διακριτές ανάπτυξης, της φυσιολογίας, και παθολογικές διαδικασίες [6], αλλά αυτά τα επιμέρους ρόλοι και οι μηχανισμοί που εμπλέκονται δεν είναι ακόμη σαφείς. FOSL2 ασκεί μια συγκεκριμένη λειτουργία στο οστό ανάπτυξη [7] και φαίνεται να έχει επιλεκτική φυσιολογικούς και παθολογικούς ρόλους σε διάφορες διεργασίες, συμπεριλαμβανομένων φωτοπεριοδικό ρύθμιση [8], τον καρκίνο [9], και η ίνωση [10]. Αρκετές προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι FOSL2 παίζει ένα ρόλο κλειδί στη ρύθμιση της οδού ΤΟΡ-β. Για παράδειγμα, FOSL2 υπερεκφράζεται σε συστηματική σκλήρυνση (SSC) και δρα ως μία νέα κατάντη μεσολαβητής της ινωτικών κυτοκίνης ΤΟΡ-β [11]. Σε καρδιακή ινοβλάστες, FOSL2 ως μεταγραφικός ρυθμιστής μπορεί να προκαλέσει ΤΟΡ-β έκφραση [10]. Επιπλέον, FOSL2 είναι απαραίτητη για 4 (LOXL4) εκφράσεις οξειδάση-όπως ΤΟΡ-β επαγόμενη λυσυλ στην ρύθμιση της εξωκυττάριας μήτρας (ECM) σύνθεση και την αναδιαμόρφωση [12]. Ωστόσο, είναι άγνωστο αν FOSL2 ρυθμίζει ΤΟΡ-β οδού στην καρκινογένεση.

Η παρούσα μελέτη ξεκίνησε για να εξετασθεί ο ρόλος της FOSL2 σε ΤΟΡ-β-επαγόμενη μετανάστευση. Η έκφραση του FOSL2 αυξήθηκε μετά από αγωγή ΤΟΡ-β και απαιτήθηκε για τον ΤΟΡ-β1 επαγόμενη μετανάστευση. FOSL2 Επίσης, αποδείχθηκε ότι συνδέονται με Smad3 να διαμορφώνει TGF-β επαγόμενη απαντήσεις σηματοδότησης.

Υλικά και Μέθοδοι

Δήλωση Ηθικής

πληροφορίες και τα δείγματα των ασθενών ελήφθησαν με τη γραπτή ενημέρωσε συγκατάθεση. Κάθε ασθενής σε αυτή τη μελέτη έδωσαν γραπτή συγκατάθεση για τη δημοσίευση αυτών των στοιχείων υπόθεση. Η έρευνα είχε εγκριθεί από την επιτροπή δεοντολογίας του Χαρμπίν Ιατρικό Πανεπιστήμιο Αντικαρκινικό Νοσοκομείο.

Γραμμές κύτταρο, κύτταρο Πολιτισμού, και διαμόλυνση

Το ανθρώπινο πνεύμονα αδενοκαρκίνωμα κυτταρικής σειράς Α549 και ανθρώπινων εμβρυϊκών κυττάρων νεφρού 293Τ αγοράστηκε από την American Type Culture Collection (ATCC) και διατηρήθηκαν σε DMEM συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου βοός (FBS) (Invitrogen) που περιέχει 100 μονάδες /ml πενικιλλίνη και 100 μονάδες /ml στρεπτομυκίνη (Sigma) στους 37 ° C με 5% CO

2. Για την επαγωγή της ΕΜΤ, τα κύτταρα Α549 καλλιεργήθηκαν σε 10% FBS για 24 ώρες και στη συνέχεια διατηρείται για 72 ώρες σε μέσο χωρίς ορό με την παρουσία 2 ng /ml ΤΟΡ-β1 (R &? D Systems). Α549 κύτταρα επιμολύνθηκαν χρησιμοποιώντας X-tremeGENE (Roche Applied Science), και τα κύτταρα ΗΕΚ293Τ επιμολύνθηκαν χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη 2000 (Invitrogen) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Ένα μικρό παρεμβαλλόμενο RNA (siRNA) που στοχεύουν ανθρώπινη FOSL2 διαμολύνθηκε σε κύτταρα για 24 ώρες χρησιμοποιώντας Αντιδραστήριο Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen).

Πλασμίδια και Αντισώματα

Μγο-tagged Smad3, FLAG-tagged FOSL2, και ΗΑ-tagged p300 κατασκευάστηκαν με κλασσικές υποκλωνοποίησης. Πλήρους μήκους Smad3 υποκλωνοποιήθηκε εντός πλαισίου με τον φορέα pGEX4T-1 για να ληφθεί πρωτεΐνες σύντηξης GST. Το πλασμίδιο ρεπόρτερ 3TP-lux ελήφθη από τον Δρ Joan Massague του Sloan- Kettering Institute, New York, NY. Αντισώματα αγοράστηκαν ως εξής: αντι-FOSL2, αντι-FLAG, αντι-Μγο, αντι-ΗΑ και αντι-GAPDH από τη Sigma? αντι-p300, αντι-Smad3, και αντι-GST από Santa Cruz? αντι-ακετυλιωμένης λυσίνης από τη Cell Signaling Technology? αντι-ρ-Smad3 από Abcam? Alexa Fluor 488 γάιδαρο IgG αντι-ποντικού και Alexa Fluor 546 γάιδαρο IgG αντι-κουνελιού από την Invitrogen. siRNAs για FOSL2 και του αρνητικού ελέγχου ελήφθησαν από Dharmacon.

Ανοσοκαθίζηση και στύπωμα Western Ανάλυση

Στις 24 ώρες μετά την επιμόλυνση, λύματα κυττάρων συλλέχθηκαν χρησιμοποιώντας ρυθμιστικό διάλυμα λύσης (50 mM Tris, ρΗ 8,0, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 50 mM NaF, και 0.1% ΝΡ-40) και επωάστηκαν με πρωτεΐνη Α ή G σφαιρίδια Sepharose και τα κατάλληλα αντισώματα για 2 ώρες στους 4 ° C. Μετά από εκτεταμένη πλύσεις, οι ανοσοκατακρημνίστηκαν πρωτεΐνες έβρασαν σε ρυθμιστικό δείγματος πρωτεΐνης για 5 λεπτά και στη συνέχεια διαχωρίστηκαν με SDS-PAGE, μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες PVDF (Millipore), και ανιχνεύθηκαν με κηλίδωση Western ανάλυση.

GST pull-down Δοκιμασία

GST και πρωτεϊνών σύντηξης GST-Smad3 εκφράστηκαν σε κύτταρα BL21 και καθαρίζεται σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (GE Healthcare Life Science). FLAG-tagged FOSL2 κατασκευάσματα εκφράστηκαν σε κύτταρα ΗΕΚ 293Τ. λύματα πρωτεΐνη ολόκληρου κυττάρου συλλέχθηκαν μετά από 48 ώρες χρησιμοποιώντας ρυθμιστικό λύσης κυττάρου, προκαταρκτική διαύγαση χρησιμοποιώντας γλουταθειόνη σφαιρίδια Sepharose, και στη συνέχεια επωάστηκαν είτε με GST-Smad3 ή GST ελέγχου για 2 ώρες στους 4 ° C. Τα σφαιρίδια πλύθηκαν πέντε φορές με ρυθμιστικό διάλυμα GST-δέσμευσης, εκλούσθηκε σε 40 μΐ 2 χ ρυθμιστικό διάλυμα δείγματος SDS, και στη συνέχεια ανιχνεύεται με ανοσοστύπωμα.

Μεταγραφή Δοκιμασία Reporter

Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ή χωρίς 2 ng /ml ΤΟΡ-β1 σε 20 ώρες μετά την επιμόλυνση. Τα κύτταρα στη συνέχεια συλλέχθηκαν και αναλύθηκαν με το σύστημα προσδιορισμού Reporter διπλής λουσιφεράσης (Promega). Όλες οι δοκιμασίες πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν, και όλες οι τιμές κανονικοποιούνται για την αποτελεσματικότητα της επιμόλυνσης κατά

Renilla

δραστηριότητες της λουσιφεράσης.

Real-time RT-PCR (qRT-PCR)

Σύνολο RNAs ελήφθησαν χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο ΤΚΙζοΙ (Invitrogen). Η αντίστροφη μεταγραφή του RNA πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το σύστημα IMPROM-II ΟΠΙΣΘΟΠΟΡΕΙΑ μεταγραφής (Promega) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Ποσοτική ανάστροφης μεταγραφάσης (qRT) -PCR εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας ένα ΑΒΙ PRISM 7500 Sequence Detector System (Applied Biosystems) με το γονίδιο-ειδικούς εκκινητές για ρ21 και ΡΑΙ-1.

ανοσοφθορισμού

Α549 κύτταρα καλλιεργείται σε ένα 6-φρεατίων και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με ΤΟΡ-β1 (2 ng /ml). Τα κύτταρα στη συνέχεια σταθεροποιήθηκαν με 4% παραφορμαλδεΰδη, περατά με 0,1% Triton Χ-100, και επωάστηκαν με πρωτεύοντα αντισώματα εναντίον FOSL2 ή Smad3 για 1 ώρα στους 37 ° C. Τα κύτταρα στη συνέχεια επωάστηκαν με Alexa Fluor 488 ή Alexa Fluor 546 αντισώματα για 30 λεπτά στους 37 ° C. Οι εικόνες φθορισμού συλλήφθηκαν χρησιμοποιώντας ένα συνεστιακό λέιζερ σάρωσης μικροσκόπιο.

Η ανοσοϊστοχημεία

δείγματα ιστών εγκλείστηκαν σε παραφίνη. Οι τομές αποπαραφινώθηκαν σε ξυλόλιο και επανυδατώθηκαν σε μια κλίση αιθανόλης. Μετά ανάκτηση αντιγόνου, οι τομές υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 3% Η

2O

2 για 10 λεπτά, ακολουθούμενο από 5% αλβουμίνη βόειου ορού (BSA) για 30 λεπτά. Οι τομές στη συνέχεια επωάστηκαν με πρωτεύοντα αντισώματα. Η οπτικοποίηση της δέσμευσης αντισώματος διεξήχθη χρησιμοποιώντας χρώση DAB. Οι πυρήνες βάφτηκαν με αιματοξυλίνη. Τα αποτελέσματα ανοσοχρώση εκτιμήθηκαν ανεξάρτητα από δύο παθολόγους.

Ασθενείς

δείγματα καρκίνου του πνεύμονα (n = 57) συλλέχθηκαν από ασθενείς με ΜΜΚΠ στο Χαρμπίν Ιατρικό Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο του καρκίνου από το 2009 έως το 2012. Οι ιστοί φυλάχθηκαν στους -80 ° C μέχρι τη χρήση. Όλα τα δείγματα ήταν από ασθενείς οι οποίοι δεν είχαν υποβληθεί σε προεγχειρητική ακτινοθεραπεία ή χημειοθεραπεία. Η παθολογική στάσης των 57 όγκων πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με τον όγκο-κόμβο-μετάσταση (TNM) σύστημα σταδιοποίησης.

Κυττάρου Μετανάστευση Δοκιμασία

δοκιμασίες Μετανάστευση πραγματοποιήθηκαν με 8-μm φίλτρα (BD Biosciences ). Κάθε καλά φορτώθηκε με περίπου 1 × 10

5 κύτταρα. Μετά από επώαση για 16 ώρες, τα κύτταρα που διέρχεται από το φίλτρο μέσα στα φρεάτια πυθμένα μονιμοποιήθηκαν σε φορμαλίνη και χρωματίζονται με κρυσταλλικό ιώδες. Τα κύτταρα σε 10 τυχαία επιλεγμένα πεδία (200 ×) από κάθε φρεάτιο μετρήθηκαν.

Στατιστικές Αναλύσεις

Όλες οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση του λογισμικού SPSS17.0. Άλλες στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση ενός Student t test. Η ανάλυση επιβίωσης Kaplan-Meier για την αξιολόγηση της συνολικής χρόνο επιβίωσης έγινε με τη δοκιμασία log-rank. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± SD από 3 ανεξάρτητες δοκιμασίες. Μια στατιστικά σημαντική διαφορά θεωρήθηκε όταν

P

& lt?. 0.05

Αποτελέσματα

FOSL2 απαιτείται για TGF-β1 που προκαλείται από τη μετανάστευση

Για να αρχίσει να διερευνήσει την πιθανότητα ότι η έκφραση FOSL2 ρυθμίζεται από TGF-β1, εμείς κατεργασμένα κύτταρα Α549 με ΤΟΡ-β1 κατά τη διάρκεια μιας χρονικής πορείας που εκτείνεται από 24 ώρες έως 72 ώρες και διεξάγεται ανάλυση κηλίδος western. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι τα επίπεδα FOSL2 αυξήθηκε σημαντικά σε απόκριση σε θεραπεία ΤΟΡ-β1 σε αυτή την κυτταρική σειρά (Εικόνα 1Α). Τα μέγιστα επίπεδα έκφρασης FOSL2 σε 72 ώρες ήταν περίπου 4 φορές εκείνες του ελέγχου βασικού επιπέδου (Σχήμα 1Α). Στη συνέχεια, ελέγξαμε εάν FOSL2 συμμετέχει στο ΤΟΡ-β1 επαγόμενη μετανάστευση. Για να διερευνηθεί αυτή η πιθανότητα, εμείς γκρέμισε έκφραση FOSL2 σε κύτταρα Α549, και μία ανάλυση στυπώματος western έδειξε ότι τα επίπεδα FOSL2 μειώθηκαν σημαντικά σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου (Εικόνα 1Β). Στη συνέχεια, εξετάσαμε την επίδραση της ρυθμιστικής FOSL2 στο μεταναστευτικό ικανότητα των κυττάρων Α549 χρησιμοποιώντας δοκιμασία μετανάστευσης Transwell. θεραπεία ΤΟΡ-β1 προωθείται δραματικά τη μετανάστευση των κυττάρων Α549, ενώ χτυπήσει κάτω FOSL2 καταργηθεί κυτταρική μετανάστευση παρουσία του ΤΟΡ-β1 (Σχήμα 1 C). Επιπλέον, εξετάσαμε επίσης τις μορφολογικές μεταβολές των Α549 κυττάρων μετά από έκθεση σε TGF-β1. Σε περίπτωση απουσίας του ΤΟΡ-β1, τα κύτταρα διατηρούνται μια κλασική μορφολογία λιθόστρωτα επιθηλιακών και ανάπτυξη μοτίβο, αλλά τα κύτταρα υιοθέτησε μια περισσότερο μοιάζουν με ινοβλάστες μορφολογία και μειωμένη κυττάρου-κυττάρου επαφή τους μετά από διέγερση TGF-β1? Ωστόσο, η επίδραση αυτή αναστέλλεται από εξάντληση FOSL2 (Σχήμα 1 D).

(Α) κύτταρα Α549 επωάστηκαν με ΤΟΡ-β1 (2 ng /ml) για τους υποδεικνυόμενους χρόνους, και τα κύτταρα συλλέχθηκαν για western blot ανάλυση. GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. επίπεδα (Β) FOSL2 εξετάστηκαν από western αποτύπωση σε FOSL2-siRNA και τα κύτταρα sicontrol Α549. GAPDH προσδιορίσθηκε επίσης ως έλεγχος φόρτωσης. (Γ) μετανάστευση των κυττάρων μετρήθηκε χρησιμοποιώντας δοκιμασίες Transwell σε sicontrol και κύτταρα Α549 siFOSL2 με ή χωρίς ΤΟΡ-β1 (2 ng /ml) θεραπεία. Τα κύτταρα που μεταναστεύουν προς την κάτω επιφάνεια των φίλτρων Transwell φωτογραφήθηκαν (επάνω) και μετρήθηκαν (κάτω). (D) siControl και siFOSL2 κύτταρα Α549 επωάστηκαν με ή χωρίς 2 ng /ml ΤΟΡ-β1 για 72 ώρες. μικροσκοπία αντίθεσης φάσης παρουσιάζει τις μορφολογικές αλλαγές των κυττάρων.

Η

FOSL2 αλληλεπιδρά με Smad3

Επειδή Smad2 /3 πρωτεΐνες είναι οι μεταγραφικές δράστες της σηματοδότησης TGF-β1, εξετάσαμε αν η αναστολή της ΤΟΡ-β1 επαγόμενη μετανάστευση από εξάντληση FOSL2 διαμεσολαβήθηκε από την αλληλεπίδραση με αυτά τα Smads. Για να ελεγχθεί αν υπάρχει μια αλληλεπίδραση μεταξύ FOSL2 και Smad3 in vivo, χρησιμοποιήσαμε κυτταρολύματα από κύτταρα 293Τ επιμολυσμένα με πλασμίδια έκφρασης για Flag-tagged FOSL2 και με Myc Smad3 και διαπίστωσε ότι FOSL2 μπορούσε να συν-καθιζάνει με Smad3 (Σχήμα 2Α) , ενώ μια αλληλεπίδραση μεταξύ FOSL2 και Smad2 δεν παρατηρήθηκε (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα). Στη συνέχεια προσδιορίζεται κατά πόσον ενδογενή FOSL2 και Smad3 αλληλεπιδρούν επίσης. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2Β, η ενδογενής FOSL2 συνδέονται με Smad3 σε κύτταρα Α549, και η αλληλεπίδραση ήταν ιδιαίτερα εμφανής με την παρουσία του ΤΟΡ-β1. Επιπλέον, FOSL2 συνεντοπίζεται με Smad3 με την παρουσία του ΤΟΡ-β1 (Σχήμα 2C). Για να προσδιορίσετε αν FOSL2 αλληλεπιδρά άμεσα με Smad3, πραγματοποιήσαμε GST προσδιορισμοί pull-down. Ισοδύναμες ποσότητες της GST-Smad3 ή πρωτεΐνη GST μόνη επωάστηκαν με Flag-tagged FOSL2. FOSL2 αλληλεπιδράσει άμεσα με Smad3, αλλά καμία αλληλεπίδραση της Smad3 ήταν εμφανής με την πρωτεΐνη GST (Σχήμα 2D).

(Α) FOSL2 αλληλεπιδρά με Smad3 in vivo. FLAG-FOSL2 και Myc-Smad3 συν-επιμολύνθηκαν σε κύτταρα ΗΕΚ293Τ. Τα κυτταρολύματα συλλέχθηκαν και IP διεξήχθη με ένα αντίσωμα αντι-Μγο. FOSL2 και Smad3 ανιχνεύθηκαν από τα ανοσοϊζήματα με κηλίδωση Western με τα υποδεικνυόμενα αντισώματα. (Β) Η συσχέτιση μεταξύ της ενδογενούς FOSL2 και Smad3 σε Α549 κύτταρα με TGF-β1 (2 ng /ml) της θεραπείας. Ανοσοκαταβύθιση διεξήχθη χρησιμοποιώντας ένα αντίσωμα αντι-IgG ή αντι-Smad3 αντίσωμα. (Γ) Υποκυτταρική colocalisation του FOSL2 και Smad3 σε κύτταρα Α549 με την παρουσία ΤΟΡ-β1 (2 ng /ml). Οι πυρήνες βάφτηκαν με DAPI. (D) Ισοδύναμες ποσότητες GST-Smad3 ή GST μόνη επωάστηκαν με κυτταρολύματα από κύτταρα ΗΕΚ 293Τ που υπερεκφράζουν Flag-FOSL2? 10% της εισόδου έτρεξε στο πήκτωμα σαν ένας έλεγχος. Η GST-Smad3 ανιχνεύθηκε με χρώση πηκτωμάτων με Coomassie Blue.

Η

FOSL2 διαμορφώνει αποκρίσεις σηματοδότησης ΤΟΡ-β1 επαγόμενη

Στη συνέχεια ερευνήσαμε την επίδραση της έκφρασης FOSL2 επί ΤΟΡ-β1- εξαρτώμενη μεταγραφική απαντήσεις χρησιμοποιώντας τον δημοσιογράφο 3TP-Lux. Συν-έκφραση του FOSL2 σταδιακά οδήγησε σε ανοδική ρύθμιση του Smad3 επαγόμενη δραστικότητα ανταποκριτή (Σχήμα 3Α). Αντίθετα, η δραστηριότητα ανταποκριτή μειώθηκε σε κύτταρα Α549 επιμολύνονται με FOSL2 siRNA (siFOSL2) σε σχέση με τα κύτταρα ελέγχου που επιμολύνθηκαν με μπερδεμένο siRNA (Εικόνα 3Β), επιβεβαιώνοντας ότι η ενδογενής FOSL2 ρυθμίζει δραστικότητα Smad3.

(Α) ΗΕΚ 293Τ κύτταρα επιμολύνθηκαν με τον ανταποκριτή p3TP-Lux πλασμίδιο που φιλοξενεί Smad3 εν απουσία και παρουσία FOSL2, όπως υποδεικνύεται. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν στις 36 ώρες μετά την επιμόλυνση και εξετάστηκαν για δραστικότητα λουσιφεράσης. Τα δεδομένα είναι τα μέσα ± s.d. (Β) κύτταρα Α549 επιμολύνονται με siFOSL2 και έλεγχος κωδικοποιημένα siRNA. Μετά από 24 ώρες, τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με p3TP-Lux και Smad3, όπως παραπεμφθεί. Η δράση φωτοφεράσης προσδιορίστηκε μετά από ένα περαιτέρω 24 ώρες. Τα δεδομένα είναι μέσα ± s.d. κύτταρα (C) Α549 επιμολύνονται με siFOSL2 και ελέγχου κωδικοποιημένο siRNA διεγέρθηκαν με 2 ng /ml ΤΟΡ-β1 επί 4 ώρες. Σύνολο mRNAs αναλύθηκαν με qRT-PCR χρησιμοποιώντας εκκινητές ειδικούς για ρ21 και ΡΑΙ-1. Τα δεδομένα είναι μέσα ± s.d. κύτταρα (D) Α549 επιμολύνονται με siFOSL2 και ελέγχου κωδικοποιημένο siRNA διεγέρθηκαν με 2 ng /ml ΤΟΡ-β1 επί 4 ώρες και στη συνέχεια συλλέχθηκαν για να παράγουν προϊόντα λύσης κυττάρου. Τα επίπεδα έκφρασης των υποδεικνυόμενων πρωτεϊνών εξετάστηκαν με κηλίδωση Western με τα κατάλληλα αντισώματα, όπως υποδεικνύεται.

Η

Στη συνέχεια αξιολογήθηκε το αποτέλεσμα της FOSL2 knockdown για την ενδογενή έκφραση του TGF-β1 /Smad3 γονιδίων στόχων. Σε κύτταρα Α549, θεραπεία ΤΟΡ-β1 διήγειρε την ταχεία έκφραση των ρ21 και ΡΑΙ-1 mRNA, και knockdown του FOSL2 εξασθενημένων σημαντικά αυτά τα αποτελέσματα (Σχήμα 3C). Σταθερά, TGF-β1 που προκαλείται από ρ21 και ΡΑΙ-1 έκφραση στο πρωτεϊνικό επίπεδο αναστάλθηκε σε Α549 κύτταρα μετά από εξάντληση FOSL2 (Σχήμα 3D).

FOSL2 προάγει σύνδεση προς Smad3 και την ακετυλίωση της Smad3 με P300

είναι γνωστό ότι η CBP /p300 συνεργάζεται με το συγκρότημα Smad να ρυθμίσει τη μεταγραφή του γονιδίου στόχου ΤΟΡ-β, η οποία σταθεροποιεί την μεταγραφική δραστηριότητα της Smad συμπλόκου και έτσι αυξάνει τη διάρκεια της σηματοδότησης ΤΟΡ-β. Για την περαιτέρω διερεύνηση του μηχανισμού της ρύθμισης των FOSL2 στη σηματοδότηση ΤΟΡ-β, εξετάσαμε αν FOSL2 επηρεάζει την ΤΟΡ-β1 που προκαλείται σχηματισμός του συμπλόκου /p300 Smad3. Η αλληλεπίδραση μεταξύ Smad3 και p300 προκλήθηκε με διέγερση TGF-β1, και αυτή η αλληλεπίδραση ήταν βαθιά αυξάνεται από την έκτοπη έκφραση της FOSL2 (Σχήμα 4Α). Σε αντίθεση, η αλληλεπίδραση Smad3 και p300 εξασθένησε από την knockdown του FOSL2 (Σχήμα 4Β). Επειδή Smad3 ακετυλίωση με p300 ρυθμίζει θετικά μεταγραφική δραστηριότητα της, μπορούμε συνεπώς, να εξετασθεί αν FOSL2 εμπλέκεται σε αυτή τη διαδικασία. Για να ελεγχθεί αυτή η πιθανότητα, κύτταρα 293Τ επιμολύνθηκαν με Myc-Smad3 μόνο του ή μαζί με p300 ή FOSL2. Όπως φαίνεται στην Εικόνα 4C, p300 επήγαγε την ακετυλίωση της Smad3, και FOSL2 υπερέκφραση βελτίωσε σημαντικά αυτό ακετυλίωση. Επιπλέον, η ενδογενής εξάντληση FOSL2 κατέστειλε την ακετυλίωση της Smad3 με p300 σε Α549 κύτταρα (Σχήμα 4D).

(Α) κύτταρα ΗΕΚ293Τ συν-επιμολύνθηκαν με πλασμίδια έκφρασης για HA-p300 και FLAG-FOSL2, μαζί με Myc-Smad3 , όπως υποδεικνύεται, με ή χωρίς με ΤΟΡ-β1 (2 ng /ml) θεραπεία. Smad3 δεσμευμένο p300 ανοσοκαταβυθίστηκε με αντίσωμα αντι-Μγο και ανιχνεύθηκαν με κηλίδωση Western με ένα αντίσωμα αντι-ΗΑ. (Β) κύτταρα Α549 επιμολύνονται με siFOSL2. Μετά από 24 ώρες, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία, όπως αναφέρεται, με ΤΟΡ-β1 (2 ng /ml) θεραπεία. (C) κύτταρα ΗΕΚ293Τ διαμολύνθηκαν παροδικά με τα υποδεικνυόμενα πλασμίδια. Τα κύτταρα επωάστηκαν με την παρουσία του TSA (5 μΜ) για 20 ώρες. Κυτταρολύματα ανοσοκατακρημνίστηκαν (IP) με ένα αντίσωμα anti-myc, και ακετυλιωμένα Smad3 (Ac-Smad3) ανιχνεύθηκε με κηλίδωση Western με ένα αντι-ακετυλιωμένο αντίσωμα λυσίνης. (D) κύτταρα Α549 διαμολύνθηκαν παροδικά με τα υποδεικνυόμενα πλασμίδια. Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν όπως περιγράφεται στο σχ. 4C.

Η

Συσχέτιση FOSL2 και ενεργοποιείται η έκφραση Smad3 σε όγκους NSCLC

Για να διερευνηθεί περαιτέρω η κλινική σχέση μεταξύ FOSL2 και σηματοδότηση TGF-β1, η έκφραση της FOSL2 και π-Smad3 στην 57 δείγματα NSCLC εξετάστηκαν με ανοσοϊστοχημικές μεθόδους, και αξιολογήθηκαν συσχετίσεις των πρωτεϊνών. Από 57 περιπτώσεις, 35 ήταν παθολογική Στάδιο Ι, και 22 ήταν σε pStage III. Από τις 35 περιπτώσεις pStage Ι, 31 (88,6%) έδειξε μια χαμηλότερη έκφραση των πρωτεϊνών FOSL2 και ρ-Smad3? Ωστόσο, 18 από τις 22 περιπτώσεις (81,8%) σε pStage III έδειξε ένα υψηλότερο εκφράσεις αμφοτέρων των πρωτεϊνών (Σχήμα 5Α). Επιπλέον, η έκφραση FOSL2 συσχετίστηκε θετικά με χρώση ρ-Smad3 (Ρ & lt? 0.001) (Σχήμα 5Β). Οι καμπύλες επιβίωσης Kaplan-Meier έδειξε ότι οι ασθενείς με FOSL2 υψηλότερη έκφραση ήταν σε σημαντικά μεγαλύτερο κίνδυνο προγενέστερου θανάτου από εκείνους με FOSL2 χαμηλότερη έκφραση (P = 0.0059) (Σχήμα 5C). Συνεπώς, αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η έκφραση σε ιστό FOSL2 καρκίνο του πνεύμονα σχετίζεται με μετεγχειρητική υποτροπή και την επιβίωση των ασθενών με καρκίνο του πνεύμονα.

(Α) Ανοσοϊστοχημική ανάλυση FOSL2 και π-Smad3 σε 57 δείγματα NSCLC. (Β) έκφραση FOSL2 συσχετίζεται θετικά με ρ-Smad3 έκφραση σε δείγματα NSCLC. Ημιποσοτική βαθμολόγησης εκτελέστηκε (τεστ συσχέτισης Pearson? R = 0,858, p & lt? 0.001). Σημειώστε ότι ορισμένες από τις τελείες στα γραφήματα αντιπροσωπεύουν περισσότερα από ένα δείγματα (μερικά βαθμολογίες επικαλύπτονται). Καμπύλες επιβίωσης (C) κατά Kaplan-Meier για τους ασθενείς με NSCLC με FOSL2 υψηλότερη ή χαμηλότερη έκφραση. Η διαφορά στην μετεγχειρητική επιβίωση μεταξύ των ασθενών με NSCLC με FOSL2 υψηλότερη έκφραση και με FOSL2 χαμηλότερη έκφραση ήταν σημαντικά σημαντική (

P

= 0,0059 με τη δοκιμασία log-rank).

Η

Συζήτηση

Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι FOSL2 πάνω ρύθμιση είναι απαραίτητη για TGF-β1 που προκαλείται από τη μετανάστευση. Η αναστολή της έκφρασης FOSL2 εμπόδισε ΤΟΡ-β1 επαγόμενη μετανάστευση και των συναφών μορφολογικές αλλαγές. Συλλογικά, αυτά τα αποτελέσματα προτείνουν ότι FOSL2 είναι ένα σημαντικό συστατικό ενός ρυθμιστικού δικτύου σε ΤΟΡ-β1 επαγόμενη μετανάστευση.

Smad3 είναι ένα βασικό αισθητήριο σήμα σε ΤΟΡ-β1 που προκαλείται μονοπατιών σηματοδότησης [13]. Σε μια προσπάθεια για την περαιτέρω διαλεύκανση της σχέσης μεταξύ FOSL2 και Smad3, προσδιορίσαμε FOSL2 ως συν-παράγοντας για Smad3. Πώς FOSL2 λειτουργίες σε κύτταρα δεν έχει χαρακτηριστεί μέχρι σήμερα [14]. Εμείς επικυρωθεί πρώτα τις φυσικές αλληλεπιδράσεις των FOSL2 με Smad3. Στο πυρήνα, Smad ολιγομερών προσλαμβάνουν τις μεταγραφικές συν-ενεργοποιητές p300 /CBP [15] – [17], τα οποία σχετίζονται δομικά με πρωτεΐνες ιστόνης ακετυλοτρανσφεράσης (ΗΑΤ) δραστηριότητα. Η ακετυλίωση είναι μια μετα-μεταφραστική τροποποίηση των πρωτεϊνών, με ιστόνες είναι το πιο γνωστό παράδειγμα [18]. Smad3 είναι μια άμεση στόχος των μεταγραφικών συν-ενεργοποιητές p300 /CBP, και αυτό ακετυλίωση διεγείρεται από ΤΟΡ-β [19]. Ωστόσο, δεν είναι σαφές εάν υπάρχουν και άλλες πρωτεΐνες που διευκολύνουν αυτή τη διαδικασία. Στην έκθεση αυτή, που αποδεικνύουν ότι FOSL2 προωθεί P300 σύνδεση με Smad3 και Smad3 ακετυλίωση από P300, γεγονός που υποδηλώνει ότι FOSL2 διαδραματίζει θετικό ρόλο στη ρύθμιση της σηματοδότησης TGF-β.

Η μετάσταση είναι μια εξαιρετικά πολύπλοκη διαδικασία που περιλαμβάνει τη διαφυγή του κυττάρων όγκου από τον πρωτογενή όγκο μάζα, τη μετανάστευση και εισβολή μέσω βασικές μεμβράνες και οι συνδετικοί ιστοί, την έναρξη του αγγειακού ή λεμφικού συστήματος, η επιβίωση στην κυκλοφορία, εξαγγείωση σε διαφορετικές θέσεις οργάνων (συμπεριλαμβανομένων προσκόλληση σε ενδοθηλιακά κύτταρα και diapaedesis μήκος του ενδοθηλίου), και πολλαπλασιασμός για να σχηματίσουν μια μακρινή μετάσταση [20] – [22]. Προηγούμενα αποτελέσματα έχουν δείξει ότι FOSL2 υπερέκφραση οδηγεί σε αυξημένη επιθετική πιθανότητα σε κύτταρα καρκίνου του μαστού, αλλά ο μηχανισμός δεν έχει διευκρινιστεί μέχρι σήμερα [23]. Δεδομένου ότι ο ΤΟΡ-β1 μπορεί να χρησιμοποιεί διάφορα προγράμματα για την προώθηση της μετάστασης του καρκίνου μέσω των αποτελεσμάτων της επί της μικροπεριβάλλον του όγκου, η ενισχυμένη επεμβατική ιδιότητες, και η αναστολή της λειτουργίας των ανοσοκυττάρων, τα ευρήματά μας αποκαλύπτουν επίσης ότι μπορούν να αυξήσουν FOSL2 επιθετική πιθανότητα μέσω της οδού του ΤΟΡ-β. Επιπλέον, κλινικά αποτελέσματα μας για μια συσχέτιση μεταξύ FOSL2 και ενεργοποιείται η έκφραση Smad3 σε όγκους NSCLC επιβεβαιώνουν περαιτέρω αυτό το συμπέρασμα. Τα ευρήματα αυτά υπογραμμίζουν τη συμβολή της FOSL2 σε μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα ογκογένεσης και να αυξήσει την πιθανότητα αναστολής της FOSL2 στη θεραπεία NSCLC.

Εν ολίγοις, έχουμε παρέχουν την πρώτη απόδειξη ότι FOSL2 διευκολύνει TGF-β1 που προκαλείται από τη μετανάστευση σε NSCLC κυττάρων μέσω της αλληλεπίδρασης με Smad3 και έτσι προωθεί την σύνδεση με Smad3 και Smad3 ακετυλίωση με P300 P300, γεγονότα που μπορεί να συμβάλει στην ανάπτυξη των NSCLC και να προτείνει FOSL2 ως πιθανό θεραπευτικό στόχο στον NSCLC.

Ευχαριστίες

το ερευνητικό έργο χρηματοδοτήθηκε από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (81172818? 81172215).