Αφηρημένο

Withaferin Α (WA), μια σημαντική βιοενεργών συστατικών του Ινδικού βότανο

Withania somnifera

, επάγει κυτταρικό θάνατο (απόπτωση /νέκρωση) σε πολλαπλούς τύπους των καρκινικών κυττάρων, αλλά ο μοριακός μηχανισμός βασίζεται η παρούσα κυτταροτοξικότητα παραμένει αόριστη. Αναφέρουμε εδώ ότι 2μΜ WA επαγόμενο κυτταρικό θάνατο επιλεκτικά σε ανδρογόνα αναίσθητη PC-3 και DU-145 αδενοκαρκινώματος του προστάτη κύτταρα, ενώ η τοξικότητα της ήταν λιγότερο σοβαρή στα κύτταρα αδενοκαρκινώματος LNCaP του προστάτη ανδρογόνου ευαίσθητο και φυσιολογικών ανθρώπινων ινοβλαστών (TIG-1 και KD ). WA σκοτώθηκαν επίσης PC-3 κύτταρα σε σφαιροειδή μέσο σχηματισμού. ανάλυση μικροσυστοιχιών DNA αποκάλυψε ότι WA αύξησε σημαντικά τα επίπεδα του mRNA του c-Fos και 11 πρωτεΐνες θερμικού σοκ (HSPs) σε PC-3 και DU-145, αλλά όχι σε LNCaP και TIG-1. Western ανάλυση αποκάλυψε αυξημένη έκφραση του c-Fos και μειωμένη έκφραση του αντι-αποπτωτική πρωτεΐνη c-FLIP (L). Έκφραση των HSPs όπως HSPA6 και Hsp70 ήταν εμφανώς αυξημένα? Ωστόσο, επειδή siRNA μεσολάβηση εξάντληση του HSF-1, μία HSP-προκαλώντας παράγοντα μεταγραφής, μειωμένη βιωσιμότητα PC-3 κυττάρου, είναι πιθανό ότι αυτά τα γονίδια θερμικού σοκ ενεπλάκησαν στην προστασία κατά του κυτταρικού θανάτου. Επιπλέον, WA επαγόμενη παραγωγή αντιδραστικών ειδών οξυγόνου (ROS) σε PC-3 και DU-145, αλλά όχι σε φυσιολογικούς ινοβλάστες. Ανοσοκυτταροχημεία και μικροσκοπία ανοσο-ηλεκτρονίου αποκάλυψε ότι WA αναστάτωσε την κυτταροσκελετού vimentin, πιθανώς επάγουν την παραγωγή ROS, c-Fos έκφρασης και γ-FLIP (L) καταστολή. Αυτές οι παρατηρήσεις υποδεικνύουν ότι πολλαπλά γεγονότα που ακολουθείται από διάσπαση του βιμεντίνης κυτταροσκελετού παίξει καθοριστικό ρόλο στην WA-μεσολαβούμενη κυτταρικού θανάτου

Παράθεση:. Nishikawa Υ, Okuzaki D, Fukushima Κ, Mukai S, Ohno S, Ozaki Y, et al. (2015) Withaferin Α επάγει τον κυτταρικό θάνατο επιλεκτικά σε ανδρογόνα-Ανεξάρτητη προστάτη καρκινικά κύτταρα αλλά όχι σε φυσιολογικά κύτταρα ινοβλαστών. PLoS ONE 10 (7): e0134137. doi: 10.1371 /journal.pone.0134137

Επιμέλεια: Hiroyasu Nakano, Toho Ιατρική Σχολή του Πανεπιστημίου, ΙΑΠΩΝΙΑ

Ελήφθη: 13, Φεβρουαρίου, 2015? Αποδεκτές: 6 Ιούλη του 2015? Δημοσιεύθηκε: 31 Ιουλίου 2015

Copyright: © 2015 Nishikawa et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. η εργασία αυτή χρηματοδοτήθηκε εν μέρει από επιχορηγήσεις-σε-βοήθειας για την Επιστημονική Έρευνα S (Νο 15101006), Επιστημονική Έρευνα Β (Νο 20370081 και 23370086) και διερευνητική έρευνα (Νο 21651085) με HN και Επιστημονικής Έρευνας C (Νο 22570185) στη Νέα Υόρκη από το Υπουργείο Παιδείας, Πολιτισμού, Αθλητισμού, Επιστημών και Τεχνολογίας της Ιαπωνίας (https://www.mext.go.jp/english /)

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Withaferin α (WA), μια σημαντική βιοενεργά συστατικά της Ayurvedic φάρμακα φυτό

βιθάνια

, προκαλεί κυτταρικό θάνατο σε πολλά κύτταρα όγκου [1-3]. Συγκεκριμένα, WA επάγει δοσο-εξαρτώμενο αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο που προκαλείται από την ανταπόκριση ξεδιπλωμένη πρωτεΐνη (UPR), η οποία ενεργοποιείται από συσσώρευση misfolded πρωτεϊνών στο ενδοπλασματικό δίκτυο (ER), και προκαλεί επίσης απόπτωση που διαμεσολαβείται από αντιδραστικά είδη οξυγόνου (ROS) σε νεφρικού καρκίνου (Caki) κύτταρα ανθρώπινου [4], [5]. WA εξασκεί ισχυρές αντιπολλαπλασιαστικά αποτελέσματα με την αναστολή της δραστικότητας συνοδού Hsp90, προκαλώντας έτσι την υποβάθμιση των πρωτεϊνών πελάτη Hsp90 σε παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές Panc-1, MIAPaCa2, και BxPC3? Αυτό το αποτέλεσμα αντιστρέφεται με τον αναστολέα πρωτεασώματος MG132 [6]. WA καταστέλλει την έκφραση του ανθρώπινου ιού θηλώματος Ε6 /Ε7 ογκογονίδια, αποκαθιστά δραστηριότητα μονοπάτι ρ53, και επάγει την απόπτωση σε κύτταρα του τραχήλου του καρκίνου CaSki [7]. WA προκαλεί διακοπή του κυτταρικού κύκλου σε G2 /M φάση σε καρκίνο προστάτη κυτταρικές γραμμές [8], και επάγει την απόπτωση σε ανθρώπινα κύτταρα μελανώματος με την παραγωγή ROS και κάτω ρύθμιση Bcl-2 [9].

WA συνδέεται άμεσα να βιμεντίνη με ομοιοπολική τροποποίηση ενός υπολείμματος κυστεΐνης (Cys328), προκαλώντας νημάτια βιμεντίνη να συσσωματώνονται και συνεντοπίζονται με F-ακτίνη και διαταράσσοντας τη βιμεντίνη κυτταροσκελετού [10], [11]. WA-επαγόμενη συσσωμάτωση βιμεντίνη συνοδεύεται από αλλαγές στο σχήμα του κυττάρου, μειωμένη κινητικότητα, και αυξημένα φωσφορυλίωση βιμεντίνη σε Ser38 [12]. Αυτές οι παρατηρήσεις υποδεικνύουν ότι WA θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν για τη στόχευση μεταστατικά κύτταρα όγκου [12], [13]. Παρά το γεγονός ότι αναστέλλει την WA επιθηλιακά-μεσεγχυματικά μετάβασης (ΕΜΤ) καταστέλλοντας λειτουργία βιμεντίνη [14], η επίδραση επί βιμεντίνη από μόνη της δεν μπορεί να εξηγήσει το σύνολο των WA μεσολάβηση υποκυτταρικά γεγονότων που οδηγούν σε κυτταρικό θάνατο. Πράγματι, WA επίσης συνδέει β-τουμπουλίνης, επάγοντας σοβαρή διαταραχή της φυσιολογικής μορφολογίας ατράκτου [15], και διαταράσσει επίσης την κυτταρική οργάνωση αρκετών άλλων ενδιάμεσων νηματίων (IF) δίκτυα, συμπεριλαμβανομένων περιφερίνη, πρωτεΐνη νευρονηματίου-τριπλή, και κερατίνη [12]. Ως εκ τούτου, για να κατανοήσουμε πλήρως το μοριακό μηχανισμό του WA-επαγόμενο κυτταρικό θάνατο, θα πρέπει να προσδιορίσει πρόσθετα μοριακούς στόχους του WA.

Το ογκογόνο παράγοντα μεταγραφής c-Fos ρυθμίζει την έκφραση των γονιδίων, σε συνδυασμό με Ιούνιο ή άλλες βασικές λευκίνη φερμουάρ πρωτεΐνες, ως συστατικό της πρωτεΐνης ενεργοποιητή 1 (ΑΡ-1) σύμπλοκο διμερούς. Αν και c-Fos ασκεί αντι-αποπτωτική λειτουργία, πρόσφατες εκθέσεις υποδεικνύουν ότι μπορεί επίσης να προωθήσει την απόπτωση [16], [17]. Ενεργοποιημένο c-Fos /ΑΡ-1 πριμοδοτεί κύτταρα PC-3 και LNCaP καρκίνου του προστάτη (PCA) για να υποστούν απόπτωση με άμεσα δεσμευτικές την περιοχή προαγωγού του αντι-αποπτωτικό γονίδιο c-FLIP (L), καταστέλλοντας έτσι τη μεταγραφή του [18]. Η απόπτωση απαιτεί επίσης την ενεργοποίηση του παράγοντα νέκρωσης όγκου (TNF)-σχετικές συνδέτη που επάγει απόπτωση (TRAIL) /Apo-2L? Αυτό TRAIL-επαγώμενη απόπτωση είναι ελάχιστα ανιχνεύσιμη σε φυσιολογικά κύτταρα [18]

Η παθογένεση των όγκων του προστάτη είναι αρχικά ανδρογόνο-εξαρτώμενη.? Ωστόσο, πολλοί ασθενείς να εξελιχθεί σε μεταστατικό ευνουχισμό ανθεκτικά (ανδρογόνο-ανεξάρτητων) PCa (mCRPC) [19]. Ανδρογόνο-ανεξάρτητα κύτταρα του προστάτη (π.χ., PC-3 και DU-145) εμφανίζουν χαρακτηριστικά στέλεχος-όπως, ενώ ανδρογόνων-κύτταρα που αποκρίνονται προστάτη (π.χ., LNCaP) δεν [20-22]. Αννεξίνη Α1, μια πρωτεΐνη φωσφολιπίδιο δέσμευσης και ρυθμιστής του γλυκοκορτικοειδή επάγουν [23]. NANOGP8, ένα retrogene κωδικοποιεί ένα NANOG1 πρωτεΐνη παρόμοια, παίζει επίσης ρόλο στη ρύθμιση βλαστικά κύτταρα που μοιάζουν προστάτη [24]. Side-πληθυσμός κυττάρων από ανθρώπινες κυτταρικές σειρές προστάτη και του ξενομοσχεύματος ιστοί υποβάλλονται σε πληρέστερη EMT και είναι πιο επιθετική από ό, τι ομόλογα κύτταρα χύμα πληθυσμού [25]. Έτσι, η EMT φαίνεται να συνδέεται στενά με την ανάπτυξη της mCRPC. Μέχρι σήμερα, δεν υπάρχουν φάρμακα που έχουν αναπτυχθεί που σκοτώνει αποτελεσματικά και ισχυρά mCRPCs αλλά όχι τα φυσιολογικά κύτταρα.

Σε αυτή τη μελέτη, επιδιώξαμε να διερευνήσει κατά πόσον WA μπορεί να σκοτώσει mCRPCs αλλά όχι τα φυσιολογικά κύτταρα, και αν ναι, να προσδιορίσει το ουσιώδες μοριακός στόχος του WA. Βρήκαμε ότι WA (2 μΜ) επιλεκτικά επαγόμενο κυτταρικό θάνατο σε ανδρογόνα ανεξάρτητο PC-3 και DU-145 κύτταρα PCa, αλλά όχι σε LNCaP ανδρογόνα αποκριτικά κύτταρα του προστάτη ή TIG-1 κανονικό ινοβλάστες. μικροσυστοιχιών DNA και δυτικές αναλύσεις αποκάλυψαν νέα μοριακοί στόχοι του WA που μπορούν να καθορίσουν τις διακριτές αποκρίσεις αυτών των κυτταρικών γραμμών σε WA. Επειδή WA σκότωσε PC-3 κύτταρα σε σφαιροειδή σχηματίζουν καλλιέργειες, προτείνουμε ότι WA μπορεί να χρησιμεύσει ως ένα εναρκτήριο μόριο για την ανάπτυξη φαρμάκων που επάγουν κυτταρικό θάνατο σε καρκινικά βλαστοκύτταρα (ΚΕΠ).

Αποτελέσματα

TIG-1 και LNCaP είναι λιγότερο ευαίσθητα σε WA από PC-3 και DU-145

Πρέπει πρώτα διαπίστωσε ότι WA που προκαλείται αποτελεσματικά τον κυτταρικό θάνατο σε PC-3 και DU-145, αλλά LNCaP ήταν λιγότερο ευαίσθητα στη θεραπεία WA (Σχήμα 1). Για να καθοριστεί εάν φυσιολογικών ανθρώπινων ινοβλαστών (TIG-1) παρουσιάζουν επίσης αντίσταση σε αλλαγμένη WA, συγκρίναμε την βιωσιμότητα του TIG-1 εκτίθενται σε 2 μΜ ή 4 μΜ WA στις βιωσιμότητες του LNCap, PC-3 και DU-145. Βιωσιμότητα του PC-3 και DU-145 μειώθηκε σημαντικά από 8 ώρες μετά από 4 μΜ θεραπεία WA (ροζ βέλη στο Σχήμα 1Α). Αντίθετα, η βιωσιμότητα του TIG-1 παρέμεινε υψηλό, σε ένα επίπεδο παρόμοιο με αυτό του LNCaP, μέχρι 8 ώρες μετά από 4 μΜ θεραπεία WA, όταν περισσότερο από το ήμισυ των PC-3 και DU-145 είχαν πεθάνει (πράσινα βέλη στο Σχήμα 1Α ). Κυτταρική βιωσιμότητα των DU-145 ήταν υψηλότερη από εκείνη των PC-3 σε 4, 8, και 24 ώρες.

(Α, Β) Η βιωσιμότητα των κυττάρων μετρήθηκε στις 4, 8, και 24 ώρες μετά από 2 μΜ ( Α) ή 4 μΜ (Β) θεραπεία WA. NT, μη επεξεργασμένα. Πράσινο και μπλε βέλη δείχνουν γραμμές για την επιβίωση των κυττάρων, ενώ το ροζ και κόκκινα βέλη δείχνουν μπαρ για κύτταρα που έχασαν τη ζωή τους κάτω από τις ίδιες συνθήκες. Κίτρινα βέλη δείχνουν τα δείγματα που χρησιμοποιούνται για την ανάλυση μικροσυστοιχιών DNA. Οι ράβδοι αντιπροσωπεύουν μέσο ± SEM για τρία ανεξάρτητα πειράματα. Μωβ βέλη δείχνουν σημαντικές μειώσεις στις κυτταρικές βιωσιμότητες (*,

P

& lt? 0,05? **,

P

& lt? 0,01).

Η

Μετά τη θεραπεία με 2 μΜ WA, βιωσιμότητα των PC-3 μειώθηκε σε 4, 8, και 24 ώρες, ενώ DU-145 έγινε inviable μόνο στις 24 ώρες (κόκκινα βέλη στο Σχήμα 1Β). Αντίθετα, TIG-1 και LNCaP παρέμειναν βιώσιμα στις 24 ώρες (μπλε βέλη στο Σχήμα 1Β). Η επώαση αυτών των κυττάρων για μεγαλύτερα χρονικά διαστήματα έδειξε ότι TIG-1 παρέμειναν βιώσιμα ακόμη και στις 96 ώρες, ενώ LNCaP έγινε inviable σε 72 h (S1A και S1c Σχήμα), γεγονός που υποδηλώνει ότι 2μΜ θεραπεία WA δεν επάγει το θάνατο του TIG-1, αλλά το θάνατος του LNCaP καθυστέρησε μόνο. Μια άλλη κανονική γραμμή ανθρώπινων ινοβλαστών (KD) έδειξε επίσης αντίσταση σε 2 θεραπεία μΜ WA (S1B σχήμα). Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι TIG-1 και LNCaP κύτταρα είναι περισσότερο ανθεκτικά σε WA από PC-3 και DU-145 κύτταρα.

Up-ρύθμιση του c-Fos μετά τη θεραπεία WA συσχετίζεται με την κυτταρική βιωσιμότητα

Για την αναγνώριση των γονιδίων που ήταν πάνω ή προς τα κάτω-ρυθμίζονται σε αυτές τις κυτταρικές σειρές μετά από θεραπεία WA, εξετάσαμε τις transcriptomes της TIG-1, LNCaP, PC-3, και DU-145 χρησιμοποιώντας Agilent SurePrint G3 Ανθρωπίνων μικροσυστοιχίες. Εξετάσαμε τα επίπεδα mRNA για PC-3 και TIG-1 σε 4 ώρες και 24 ώρες, αντίστοιχα, μετά από 2 μΜ θεραπεία WA, και για LNCaP και DU-145 στις 4 ώρες και 8 ώρες, αντίστοιχα, μετά από 4 θεραπεία μΜ WA (κίτρινο βέλη στο Σχήμα 1Α και 1Β). Πτυχές αλλαγές στην έκφραση γονιδίων προσδιορίστηκαν με σύγκριση εντάσεις σήματος υβριδοποίησης μεταξύ των δειγμάτων που έλαβαν θεραπεία με WA και εκείνους που έλαβαν θεραπεία με διμεθυλοσουλφοξείδιο (διαλύτης). S1 Ο πίνακας δείχνει μια λίστα των διαφορικά εκφρασμένων γονιδίων, που διοργανώνονται κατά φθίνουσα σειρά φορές αλλαγή στο PC-3? όλα τα γονίδια που παρατίθενται ήταν επίσης πάνω ρυθμισμένα κατά περισσότερο από 4-φορές σε DU-145. ΝΕΦΕΛΟΓΡΑΜΜΑΤΑ δείχνουν ότι τα επίπεδα του mRNA της ανάλυσης των γονιδίων ήταν αρκετά υψηλή (πρώτες ένταση του σήματος & gt? 10). Για να επιτρέψει φυσιολογικά σημαντική συγκρίσεις (S2 Εικ)

Επειδή η υπερέκφραση του c-Fos επάγει απόπτωση σε κύτταρα ανθρώπινου καρκινώματος του παχέος [ ,,,0],17], εστιάσαμε στα γονίδια c-Fos και FosB, η οποία ήταν εμφανώς πάνω ρυθμισμένα σε PC-3 και DU-145, αλλά ήταν ασθενώς πάνω ρυθμισμένα σε TIG-1 και ακόμη λιγότερο σε LNCaP (S1 πίνακα? ροζ και τιρκουάζ βέλη στο S2 σχήμα). Στο PC-3, αυτές οι πρωτεΐνες ήταν σημαντικά πάνω ρυθμισμένα σε 4 ώρες μετά από 4 θεραπεία μΜ WA, ακολουθούμενη από μία βαθμιαία αύξηση στη συνέχεια (Σχήμα 2Α). Σε DU-145, c-Fos ήταν εμφανώς up-ρυθμίζονται σε 4 ώρες, αλλά η έκφρασή της μειώνεται σταδιακά μετά? ένα παρόμοιο μοτίβο παρατηρήθηκε σε TIG-1, αν και η προς τα πάνω ρύθμιση ήταν λιγότερο εμφανή από ό, τι DU-145 (Σχήμα 2Α). Σε LNCaP, το επίπεδο c-Fos ήταν πολύ χαμηλή, και ήταν ανιχνεύσιμη μόνο σε 24 ώρες. Αξίζει να σημειωθεί ότι, η βαθμολογική διάταξη της βιωσιμότητας των κυττάρων (βλέπε Σχήμα 1Α) ήταν ταυτόσημη με τη σειρά του επιπέδου έκφρασης c-Fos σε 8 ώρες μετά από 4 μΜ θεραπεία WA (LNCaP & gt? TIG-1 & gt? DU-145 & gt? PC-3 ). Επιπλέον, μετά από 2 θεραπεία μΜ WA, ένα παρόμοιο μοτίβο c-Fos ανοδική ρύθμιση παρατηρήθηκε τόσο σε PC-3 και DU-145? Ωστόσο, πολύ λίγα έκφραση c-Fos παρατηρήθηκε σε TIG-1 και LNCaP (Σχήμα 2Β)? Έτσι, WA-επαγόμενη έκφραση c-Fos συσχετίστηκε με τη βιωσιμότητα των κυττάρων. Αντίθετα, Fos Β και FosB2 δεν ήταν σημαντικά πάνω ρυθμισμένα, και τα επίπεδα έκφρασής τους δεν συσχετίστηκαν με βιωσιμότητα των κυττάρων (Σχήμα 2Α).

(Α, Β) ανάλυση στυπώματος Western για την ανίχνευση c-Fos (Fos Β) σε TIG-1, LNCaP, DU-145, και PC-3 κύτταρα σε 4, 8, και 24 ώρες μετά την αγωγή με 4 μΜ (Α) ή 2 μΜ (Β) WA. NT, μη επεξεργασμένα. (Γ) ανάλυση κηλίδας Western για την ανίχνευση c-Fos, PARP, FLIP και GAPDH σε PC-3 κύτταρα σε 12 ώρες μετά από 4 θεραπεία μΜ WA παρουσία (+) ή απουσία (-) τριών διαφορετικών siRNAs (Χ-Ζ) από ΟηΟεηε. (D) Βιωσιμότητα των PC-3 κυττάρων μετά κατεργασία siFos. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσο ± SEM τριών ανεξάρτητων πειραμάτων? ροζ βέλη δείχνουν μια στατιστικά σημαντική μείωση του αριθμού των κυττάρων μετά από αγωγή siFos (**

P

& lt? 0,01). (Ε) Πληθυσμός των αποπτωτικών, νεκρωτική, και τα ζωντανά κύτταρα ευδιάκριτα βάφονται με Annexin V-EnzoGold, 7-AAD-κόκκινο, και GFP. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσο ± SEM τριών ανεξάρτητων πειραμάτων? κόκκινο, μπλε και πράσινα βέλη δείχνουν στατιστικά σημαντικές αλλαγές (**,

P

& lt? 0,01). (F) ανάλυση Western blot του c-Fos, PARP, FLIP, και GAPDH σε DU-145 σε 12 ώρες μετά από 4 θεραπεία μΜ WA παρουσία (+) ή απουσία (-) του siRNAs? siFos ή siGL2 (siControl). (G) Βιωσιμότητα DU-145 κύτταρα μετά από εξωγενή υπερέκφραση του pcDNA3-FLIP ή φορέα μόνο υπό την παρουσία DMSO (διαλύτης) ή 4 μΜ WA.

Η

siRNA μεσολάβηση knockdown του c-Fos ( siFos) διασώζει τον κυτταρικό θάνατο σε PC-3 [18]. Ως εκ τούτου, ερευνήσαμε το είδος κυτταρικού θανάτου (δηλαδή, απόπτωση ή νέκρωση) διασώζεται από siFos. Για αυτά τα πειράματα, χρησιμοποιήσαμε siFos_Z (Σχήμα 2C). Πρώτον, επιβεβαιώθηκε το PC-3 ότι η βιωσιμότητα μειώθηκε σημαντικά σε 48 ώρες και 72 ώρες μετά τη θεραπεία WA (Σχήμα 2D). Ανάλυση FACS (S3 Εικ) αποκάλυψε ότι το ποσοστό νέκρωσης ήταν χαμηλότερη σε siFos-επεξεργασμένα κύτταρα παρά σε κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με siGL2 (αρνητικός έλεγχος) 8 ώρες μετά την αγωγή με είτε μόνο του DMSO ή WA (2 μΜ ή 4 μΜ), υποδηλώνοντας ότι η υπερέκφραση του c-Fos επάγεται από WA παίζει ένα ρόλο στην επαγωγή νεκρωτικό κυτταρικό θάνατο (κόκκινα βέλη στο Σχ 2Ε-i). Αντιθέτως, υπό τις ίδιες συνθήκες, η βιωσιμότητα μειώθηκε (μπλε βέλη στο Σχ 2Ε-ΙΙ) και το ποσοστό των αποπτωτικών κυττάρων αυξήθηκε (πράσινα βέλη στο σχήμα 2Ε-ΙΙΙ και 2Ε-IV). Έτσι, η υπερέκφραση του c-Fos συσχετίζεται με WA-επαγόμενο κυτταρικό θάνατο σε PC-3. Παραμένει φευγαλέα αν c-Fos εμπλέκεται στον προσδιορισμό της βιωσιμότητας των κυττάρων ή απλώς μετατρέπει την λειτουργία κυτταρικού θανάτου από απόπτωση σε νέκρωση χωρίς να επηρεάζει την επαγωγή του κυτταρικού θανάτου. Εμείς δεν θα μπορούσε να εξετάσει αυτό το DU-145, διότι τόσο siGL2 και siFos προκάλεσε κυτταρικό θάνατο σε παρόμοιο επίπεδο.

c-Fos ασκεί προαποπτωτικής λειτουργία του στα κύτταρα PC-3 και LNCaP εν μέρει από την καταστολή της έκφρασης του c FLIP (L), η οποία θα αναφερθούμε στη συνέχεια ως «FLIP» [18]. Το επίπεδο FLIP μειώθηκε μετά από αγωγή WA σε όλα τα κύτταρα που δοκιμάστηκαν (Σχήμα 2Β)? η μείωση του FLIP ήταν ιδιαίτερα αξιοσημείωτο σε DU-145, ιδιαίτερα σε 24 ώρες μετά από 2 μΜ θεραπεία WA (Σχήμα 2Β, λωρίδα 16), σε σχέση με τις μειώσεις σε TIG-1, LNCaP, και PC-3 (Εικόνα 2Β, λωρίδες 4 , 8, και 12). Αυτή η παρατήρηση υποδηλώνει ότι WA μεσολάβηση κυττάρων θάνατος επέρχεται εν μέρει λόγω της μειωμένης έκφρασης του FLIP. ανάλυση κηλίδας Western έδειξε ότι το επίπεδο του FLIP δεν μειώθηκε με κατεργασία siFos_Z σε PC-3 (Σχήμα 2C, λωρίδα 6), ενώ siFos_X ή θεραπεία siFos_Y μειωθεί ελαφρώς το επίπεδο FLIP (Σχ 2C, λωρίδες 4 και 5). Σε DU-145, το επίπεδο FLIP ομοίως μειώνεται με κατεργασία με siControl ή siFos_Z (Σχήμα 2F, λωρίδες 3 και 4). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η ρύθμιση του επιπέδου c-Fos είναι κατά κάποιον τρόπο σχετίζονται με, αλλά δεν επηρεάζει άμεσα το μειωμένο επίπεδο FLIP. Παρ ‘όλα αυτά, η εξωγενής έκφραση του FLIP σε DU-145 διασώζονται WA-επαγόμενο κυτταρικό θάνατο (Εικόνα 2G). Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι WA προκάλεσε δύο ανεξάρτητα γεγονότα, δηλαδή, μια αύξηση στο επίπεδο c-Fos και μείωση του επιπέδου FLIP, να επάγει κυτταρικό θάνατο.

Η έκφραση των γονιδίων HSP ρυθμίζεται προς τα πάνω μετά WA θεραπεία

Στη συνέχεια, έχουμε παρατηρήσει ότι τα γονίδια 11 πρωτεΐνη θερμικού σοκ (HSP) (

HSPA6

,

DNAJA4

,

HMOX1

,

HSPA1B

,

HSPA1L

,

HSPA1A

,

DNAJB1

,

DNAJB4

,

HSPH1

, και

SERPINH1

) ήταν μεταξύ των 45 πιο πάνω ρυθμισμένα γονίδια σε PC-3 (S1 πίνακα). HSPs είναι μοριακές chaperones που υπόκεινται σε ταχεία και ισχυρή επαγωγή από το στρες. Στο PC-3 και DU-145, HSPA6 ήταν απότομα τα πάνω ρυθμισμένη 4 ώρες μετά τη θεραπεία WA, ενώ σε TIG-1 και LNCaP, το επίπεδο της πρωτεΐνης HSPA6 ήταν πολύ χαμηλή (Σχήμα 3Α). Αντίθετα, τα επίπεδα έκφρασης του DNAJA4 (Hsp40 στη συνέχεια) και HSPA1B (HSP70 εφεξής) παρουσίασαν παρόμοια σταδιακές αυξήσεις σε αυτά τα κύτταρα (Σχήμα 3Α).

(Α) ανάλυση κηλίδας Western για την ανίχνευση HSPA6, Hsp40, HSPA70, EGR -1, PAR-4, και GAPDH (μάρτυρας φόρτωσης) σε TIG-1, LNCaP, DU-145, και PC-3 κύτταρα σε 0, 4, 8 και 24 ώρες μετά από 4 θεραπεία μΜ WA. Βέλος δείχνει τη ζώνη για τους καλόπιστους EGR-1. (Β) Επίδραση των siHSPA6 έκφραση στην κυτταρική ανάπτυξη PC-3. (I) Σχηματική για αυτό το πείραμα. (Ii) ανάλυση κηλίδος Western για να επιβεβαιωθεί η knockdown του HSPA6 πρωτεΐνης με siHSPA6, σε σχέση με κύτταρα που υπέστησαν αγωγή με siGL2 (αρνητικός έλεγχος). (Iii) Επίδραση siHSPA6 και siGL2 στην ανάπτυξη PC-3 κυττάρων, με ή χωρίς θεραπεία WA. Arrow τονίζει τη μείωση της ανάπτυξης των κυττάρων PC-3. (C) Επίδραση της siHSF-1 έκφραση στην κυτταρική ανάπτυξη PC-3. (I) Σχηματικά για αυτό το πείραμα. (Ii) ανάλυση κηλίδος Western για να επιβεβαιωθεί η knockdown του HSP πρωτεΐνης με siHSF-1, σε σχέση με κύτταρα που υπέστησαν αγωγή με siGL2 (αρνητικός έλεγχος), και να καθοριστεί αν HSF-1 knockdown επηρεάζονται τα επίπεδα HSP πρωτεΐνης με ανίχνευση HSPA6, Hsp40, HSPA70, και GAPDH σε PC-3 κύτταρα. (Iii) Επίδραση του siHSF-1 και siGL2 στην ανάπτυξη PC-3 κυττάρων, με ή χωρίς θεραπεία WA. Arrow τονίζει τη μείωση της ανάπτυξης των κυττάρων PC-3. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσο ± SEM τριών ανεξάρτητων πειραμάτων? ροζ, πράσινο και μπλε βέλη δείχνουν σημαντικές μειώσεις στο κελί βιωσιμότητες (*,

P

& lt? 0,05? **,

P

& lt? 0,01).

Η

Για να μειωθεί το επίπεδο της πρωτεΐνης στο HSPA6 WA-επεξεργασμένα κύτταρα, πραγματοποιήσαμε siRNA μεσολάβηση knockdown σε PC-3 (Εικόνα 3Β-i). Επιβεβαιώσαμε την επιτυχή νοκ ντάουν με κηλίδωση Western (Σχήμα 3Β-ΙΙ). Ωστόσο, παρατηρήσαμε μικρή αλλαγή στην βιωσιμότητα των κυττάρων σε siHSPA6-κατεργασμένα κύτταρα σε σχέση με τα κύτταρα σε επεξεργασία με ένα RNA αρνητικού ελέγχου (siGL2) (κόκκινα βέλη στο Σχ 3Β-ΙΙΙ), υποδηλώνοντας ότι η υπερέκφραση του HSPA6 δεν είναι η αιτία του κυτταρικού θανάτου μετά WA θεραπεία.

επόμενο εκτελείται siRNA μεσολάβηση knockdown του παράγοντα πρωτεΐνη θερμικού σοκ 1 (HSF1), το σημαντικό παράγοντα μεταγραφής που εμπλέκονται στην προς τα πάνω ρύθμιση των γονιδίων HSF [26], χρησιμοποιώντας ένα παρόμοιο πειραματικό σχεδιασμό (Σχ 3C-i). Western ανάλυση επιβεβαίωσε ότι HSF1 knockdown χρησιμοποιώντας siHSF1 μειωμένη έκφραση αμφοτέρων HSF1 και HSPA6 (Σχήμα 3C-ΙΙ). Αντίθετα, τα επίπεδα της Hsp40 και HSP70 ήταν αναλλοίωτη (Σχήμα 3C-ΙΙ), πιθανώς λόγω των υψηλών επιπέδων βασικής γραμμής των ενδογενών Hsp40 και HSP70 (βλέπε σχήμα 3Α). Παρ ‘όλα αυτά, η θεραπεία της PC-3 κυττάρων με siHSF1 αυξημένο κυτταρικό θάνατο (πράσινο και μπλε βέλη στο Σχ 3C-III), αν και η αύξηση αυτή δεν ήταν εμφανή. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι άγνωστες πρωτεΐνες up-ρυθμίζεται από HSF1 προστατεύουν κύτταρα PC-3 κατά τον κυτταρικό θάνατο.

Τέσσερα της απόκρισης πρώιμης ανάπτυξης γονίδια (EGR) ήταν κατατάσσεται μεταξύ των κορυφαίων 40 WA-που προκαλείται από γονίδια (S1 πίνακα) . Τα επίπεδα του EGR-1 και EGR-3 παρέμεινε σταθερή μετά από αγωγή WA (S3 Εικ)? Ως εκ τούτου, εμείς αγνοείται αυτών των πρωτεϊνών στις επόμενες αναλύσεις. Σε αντίθεση με μια προηγούμενη αναφορά [27], την απόπτωση του προστάτη απάντηση-4 (PAR-4) δεν ήταν ρυθμισμένη μετά τη θεραπεία WA είτε στο mRNA (πράσινο αιχμές βελών στο S1 σχήμα) ή το επίπεδο της πρωτεΐνης (S3 Εικ). Ως εκ τούτου, αυτά τα γονίδια δεν μπορούν να συμμετέχουν στον καθορισμό της βιωσιμότητας των κυττάρων (βλέπε Εικόνα 1).

WA επάγει την απόκριση στο στρες ξεκινά στο ER και μιτοχόνδρια των καρκινικών κυττάρων του προστάτη

WA επάγει απόπτωση που διαμεσολαβείται από ER στρες στα κύτταρα ανθρώπινου νεφρικού καρκινώματος [4] και

Xenopus laevis

A6 νεφρού επιθηλιακά κύτταρα [28]. Γονιδιακή Οντολογία ανάλυση των δεδομένων των μικροσυστοιχιών DNA (S5 σχήμα) χρησιμοποιώντας το σύστημα NextBio επιβεβαίωσε ότι οι κορυφαίες ομάδες εμπλουτισμένο γονίδιο που περιέχεται ER σχετίζονται με το άγχος UPR γονίδια (ID, GO: 0006986? S4 σχήμα). Για να καθοριστεί εάν ER στρες προκλήθηκε σε διαφορετικούς βαθμούς σε TIG-1 και PC-3 μετά την αγωγή WA, εκτελέσαμε ανάλυση Western στις 2, 4, και 8 ώρες μετά από 4 μΜ θεραπεία WA. Στο PC-3, η επαγωγή της έκφρασης CHOP και ενεργοποίηση της κασπάσης 3 και PARP διάσπαση παρατηρήθηκαν, το οποίο προτείνει ότι η απόκριση ER στρες μέσω ενεργοποίησης του CHOP είναι σημαντική (Σχήμα 4). Ωστόσο, siRNA μεσολάβηση knockdown του CHOP υποδηλώνουν ότι CHOP δεν παίζει ρόλο στην ενεργοποίηση της κασπάσης 3 (S6 Εικ). Αντίθετα, η φωσφορυλίωση του eIF2α στο ser51 ήταν αναποτελεσματική, πιθανώς λόγω της χαμηλής ενεργοποίηση PERK? κατά συνέπεια, καθοδικά συμβάντα όπως κασπάσης 3 ενεργοποίηση και διάσπαση PARP ήταν μόλις ανιχνεύσιμα σε TIG-1 (από τα αριστερά πάνελ στο σχήμα 4). Αυτό αδύναμη απάντηση στο ER στρες μπορεί να εξηγήσει γιατί TIG-1 είναι ανθεκτικό σε θεραπεία WA (βλέπε Σχήμα 1Β). Σε LNCaP, κασπάσης 3 ενεργοποίηση και διάσπαση PARP δεν παρατηρήθηκαν σε 8 h? Έτσι, σε αυτή την κυτταρική σειρά η απόκριση στρες ER ενεργοποιήθηκε σε μία ενδιάμεση μεταξύ εκείνων σε TIG-1 και PC-3 επίπεδο? η αντίσταση του LNCaP να WA μπορεί να οφείλεται σε αυτήν την καθυστέρηση σε καθοδικά συμβάντα. Ωστόσο, αν και το επίπεδο CHOP προκλήθηκε μετά τη θεραπεία WA σε DU-145, λίγο διάσπαση ενεργοποίησης και PARP κασπάσης 3 παρατηρείται (δεξιότερο πάνελ στο σχήμα 4). Έτσι, αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο των DU-145 μπορεί να οφείλεται κυρίως στην αυξημένη έκφραση c-Fos και μειωμένη έκφραση FLIP παρά την απόκριση ER στρες (βλέπε Σχήμα 3).

(Α) ανάλυση κηλίδας Western για την ανίχνευση IRE -1α, PERK, pS51-eIF2α, CHOP, κασπάσης 3, PARP, ΣΣΕ, και GAPDH (έλεγχος φόρτωσης) σε TIG-1, LNCaP, DU-145 και PC-3 κύτταρα σε 4, 8 και 24 ώρες μετά από 4 θεραπείας μΜ WA. ΝΤ: μη επεξεργασμένο. (Β) Σχηματική αναπαράσταση των αναλυθέντων πρωτεϊνών στο αποπτωτικό μονοπάτι που επάγεται από ER στρες. (C) Οι τυπικές εικόνες φθορισμού από TIG-1 (i), LNCaP (ii), PC-3 (III), και DU-145 (iv) τα οποία κατεργάστηκαν με 4 μΜ WA για 24 ώρες και στη συνέχεια κατεργάζεται με αντιδραστήρια ανίχνευσης ROS με τη χρήση του Image-ζωντανά Πράσινη ROS Detection Kit. συγχωνεύονται εικόνες εμφανίζονται κυτταροπλασματικών σήματα ROS (πράσινο) και τα σήματα πυρηνικού DNA βάφονται με Hoechst33342 (μπλε). Πράσινη γραμμή, 100 μm. Μαύρη γραμμή, 10 μm.

Η

Ashwagandha

εκχύλισμα των φύλλων που περιέχουν WA προκαλεί τον καρκίνο του μαστού τα κύτταρα να παράγουν ROS, η οποία είναι μια αντίδραση στο στρες που ξεκίνησε σε μιτοχόνδρια [29]. Εξετάσαμε εάν η θεραπεία με WA επάγει επίσης παραγωγή ROS σε κύτταρα καρκίνου προστάτη και φυσιολογικών ινοβλαστών με μια μέθοδο ανιχνευτή φθορισμού. Εμείς επιβεβαίωσε την πρώτη ανίχνευση των ROS σηματοδοτεί όταν τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε θεραπεία με

τ

-βουτυλο υδροϋπεροξείδιο (ΤΒΗΡ), ένας επαγωγέας της παραγωγής ROS. Όλα τα κύτταρα που δοκιμάστηκαν παρουσίασαν κυτταροπλασματική σήματα (πράσινο) που προέρχεται από την παραγωγή ROS (S7A σχήμα). Κατά την επεξεργασία με 4 μΜ WA για 24 ώρες, μόνο ένα χαμηλό επίπεδο κυτταροπλασματικής ROS ανιχνεύθηκε σε TIG-1 (Σχήμα 4Β-i) και KD (S7B σχήμα), η οποία είναι παρόμοια με τη διαπίστωση της προηγούμενης έκθεσης ότι TIG-3 παράγουν μικρό ROS μετά τη θεραπεία WA [29]. Αντίθετα, ισχυρά σήματα ROS ανιχνεύθηκαν σε LNCaP, PC-3, και DU-145 (Σχήμα 4C-ΙΙ, -III, και-IV). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι TIG-1 και KD, σε αντίθεση με LNCaP, PC-3, και DU-145, δεν παράγουν ROS μετά από τη θεραπεία WA, η οποία μπορεί να εξηγήσει γιατί TIG-1 και KD είναι ανθεκτικά σε WA.

WA προκαλεί BAG3 μεσολάβηση αυτοφαγία στα κύτταρα PC-3

WA προκαλεί αυτοφαγία στα καρκινικά κύτταρα του μαστού, αλλά η λεπτομερής μηχανισμός παραμένει άπιαστο [30]. δεδομένων των μικροσυστοιχιών DNA μας (S1 πίνακα), έδειξε ότι το επίπεδο του mRNA των Bcl-2 που σχετίζονται με athanogene 3 (BAG3), ένα μέλος της οικογένειας BAG συν-συνοδός εμπλέκονται στην αυτοφαγία [31], είναι up-ρυθμίζεται μετά τη θεραπεία WA. Έτσι, ερευνήσαμε αν WA προκαλείται από αυτοφαγία στο PC-3 εκφράζοντας EGFP-tagged μικροσωληνίσκων που σχετίζεται με ελαφρά αλυσίδα πρωτεΐνης 3 (LC3), ένα δείκτη αυτοφαγία που χαρακτηρίζει ειδικά autophagosomal μεμβράνες [32]. Πράγματι, EGFP-LC3 puncta εμφανίστηκε μετά από 2 μΜ ή 4 μΜ θεραπεία WA (Σχήμα 5Α) με συχνότητα παρόμοια με εκείνη σε κύτταρα στερούνται ορού (Σχήμα 5Β).

Α) Παρατήρηση του EGFP και ΕΟΡΡ- LC3 σήματα με μικροσκοπία ανοσοφθορισμού. Bar, 10 μm. (Β) Μπαρ γραφικές παραστάσεις που δείχνουν το ποσοστό των κυττάρων που περιέχουν στικτή ΕΟΡΡ- LC3? βέλη δείχνουν ότι οι τιμές αυξάνονται σταδιακά υπό τις υποδεικνυόμενες συνθήκες. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσο ± SEM τριών ανεξάρτητων πειραμάτων? πράσινα βέλη δείχνουν στατιστικά σημαντικές αυξήσεις (**,

P

& lt? 0,01). (Γ) ανάλυση κηλίδας Western για την ανίχνευση LC-3 και GAPDH (μάρτυρας φόρτωσης) σε PC-3 υπό τις υποδεικνυόμενες συνθήκες. (D) γραφήματα ράβδου που δείχνει τη βιωσιμότητα των κυττάρων (%) υπό τις υποδεικνυόμενες συνθήκες. (Ε) ανάλυση κηλίδας Western για την ανίχνευση BAG3, LC-3, και GAPDH (μάρτυρας φόρτωσης) σε PC-3 κυττάρων παρουσία των υποδεικνυόμενων συνθηκών siBAG3 ή siGL2 (αρνητικός έλεγχος). γραφήματα (F) Bar που δείχνει τη βιωσιμότητα των κυττάρων (%) στις υποδεικνυόμενες συνθήκες. (D, F) Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσο ± SEM τριών ανεξάρτητων πειραμάτων? κόκκινα βέλη δείχνουν στατιστικά σημαντικές μειώσεις στην βιωσιμότητα των κυττάρων (**,

P

& lt? 0,01). (Α-Ρ) Τα δείγματα συλλέχθηκαν σε 4 ώρες μετά τη θεραπεία WA. προφίλ (G) Έκφραση των autophagy σχετίζονται πρωτεΐνες BAG3 και LC3 σε κύτταρα PC-3 σε 4, 8, και 24 ώρες μετά την αγωγή με 4 μΜ WA. NT:. Μη επεξεργασμένα

Η

Για να προσδιορίσετε αν WA-μεσολάβηση αυτοφαγία επηρεάζει τη βιωσιμότητα των κυττάρων, προσθέσαμε φαρμακολογικές αναστολείς της κατηγορίας ΙΙΙ φωσφατιδυλοϊνοσιτόλης 3-κινάσες, 3-μεθυλαδενίνη (3-ΜΑ) ή ουορτμανίνη, η οποία καταστέλλει κανονική αυτοφαγία, σε PC-3 κύτταρα σε παρουσία (+) ή απουσία (-) 4 θεραπεία μΜ WA. Western ανάλυση έδειξε ότι WA επαγόμενη έκφραση LC3 ανεξάρτητα από την παρουσία του 3-ΜΑ ή ουορτμαννίνης (Σχ 5C). Επιπλέον, ούτε ναρκωτικά κατέστειλε τη μείωση της κυτταρικής βιωσιμότητας (Σχήμα 5D).

Επειδή BAG3 ενεργοποιεί noncanonical αυτοφαγία προκαλείται από τους αναστολείς πρωτεασώματος όπως MG132 [33], ερευνήσαμε αν siRNA μεσολάβηση νοκ ντάουν της BAG3 θα επηρεάσει PC- 3 βιωσιμότητα των κυττάρων. siBAG3 κατέστειλε με επιτυχία έκφραση BAG3 σε σύγκριση με siGL2, αρνητικός έλεγχος (πάνω πίνακα του Σχήματος 5Ε). Όπως αναμενόταν, η έκφραση LC3 καταστάλθηκε από siBAG3 μετά είτε θεραπεία με DMSO, 2 μΜ MG132, 20 μΜ MG132, ή 4 μΜ WA (μεσαίο πάνελ της Εικ 5Ε). Επιπλέον, η βιωσιμότητα των κυττάρων μειώθηκε κατά siBAG3 μετά από αγωγή WA (Σχήμα 5F), πιθανώς λόγω της αναστολής της αντι-αποπτωτική δραστικότητα BAG3. Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι WA-επαγόμενη BAG3 μεσολαβεί noncanonical αυτοφαγία, η οποία προστατεύει κύτταρα PC-3 έναντι του κυτταρικού θανάτου.

ανάλυση κηλίδος Western κατέδειξε ότι η ένταση της ζώνης ~ 70 kDa του BAG3 (βέλος στην Εικ 5G) μειώθηκε σε TIG-1 στις 24 ώρες μετά τη θεραπεία WA (Σχήμα 5G, λωρίδα 4), ενώ το επίπεδο της ήταν ήδη υψηλή (λωρίδες 9 και 13) και αμετάβλητο μετά τη θεραπεία WA σε PC-3 (λωρίδες 10-12) και DU-145 (λωρίδες 14-16). Επιπλέον, η ζώνη ~ 62 kDa της BAG3 (ένα υποθετικό επεξεργασμένη μορφή της BAG3) ήταν εμφανώς αυξηθεί σε PC-3 και DU-145 (βέλος στο Σχήμα 5G)? παραμένει άπιαστο αν 62 kDa BAG3 είναι πιο δραστήρια από 70 kDa BAG3 ή είναι ανενεργός. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι το επίπεδο της πρωτεΐνης BAG3 είναι υψηλότερη σε PC-3 και DU-145 σε σχέση με TIG-1 και LNCaP. Παρ ‘όλα αυτά, το επίπεδο ήταν χαμηλό LC3 σε PC-3 και DU-145 (μεσαίο πάνελ στο Σχήμα 5G), γεγονός που υποδηλώνει ότι ένας ρυθμιστικός μηχανισμός που συνδέει δραστηριότητα BAG3 και παραγωγή LC3-ΙΙ μεταβλήθηκε σε αυτά τα κύτταρα. Μάλιστα, μια πρόσφατη έκθεση έδειξε ότι DU-145 δεν μπορεί να παράγει LC3-ΙΙ οφείλεται σε μια γενετική δυσλειτουργία της οδού αυτοφαγία [34]. Αντίθετα, η έκφραση LC3 ήταν υψηλή σε TIG-1 και LNCaP (μεσαίο πάνελ στο σχήμα 5G). Απομένει να αναλυθεί εάν αυτά τα αποτελέσματα προτείνουν ότι αυτά τα κύτταρα είναι κατά κάποιο τρόπο προστατεύονται από WA-επαγόμενο κυτταρικό θάνατο παρόμοιο με την προστασία των κυττάρων Caco-2 από τον κυτταρικό θάνατο που προκαλείται από την οξαλιπλατίνη [35].

TIG-1 και PC-3 εμφανίζουν διαφορετικά πρότυπα του υποκυτταρικού βιμεντίνης εντοπισμού μετά τη θεραπεία WA

WA συνεργάτες με βιμεντίνη και προκαλεί ταχεία αναδιοργάνωση των βιμεντίνης ενδιάμεσα νημάτια (VIF) σε περιπυρηνικών αδρανών υλικών στο BJ-5ta ανθρώπινους ινοβλάστες [12]. Παρά το γεγονός ότι τα επίπεδα του mRNA της βιμεντίνης ήταν υψηλά και αναλλοίωτη μετά τη θεραπεία WA σε TIG-1, LNCaP, PC-3, και DU-145 (μαύρα βέλη στο Σχ S1), ανάλυση Western έδειξε ότι τα επίπεδα πρωτεΐνης βιμεντίνης ήταν αυξημένα μετά από αγωγή WA σε PC- 3 (Εικόνα 6Α). Αντίθετα, το επίπεδο vimentin ήταν ήδη υψηλό πριν από τη θεραπεία WA, και παρέμεινε σε υψηλά επίπεδα, στο DU-145 (Σχήμα 6Α). Σε TIG-1, το επίπεδο βιμεντίνη μειώθηκε, με προϊόντα διάσπασης του βιμεντίνης [10] εμφανής στις 24 ώρες (κεφαλές βέλους Σχήμα 6Α), ενώ δεν μπάντα βιμεντίνη ανιχνεύθηκε σε LNCaP (Σχήμα 6Α). Αυτές οι παρατηρήσεις συμφωνούν με το γεγονός ότι PC-3, αλλά όχι LNCaP, υπέστη τη ΕΜΤ να αποκτήσει έκφραση βιμεντίνη.

(Α) ανάλυση κηλίδας Western για την ανίχνευση βιμεντίνη και ακτίνη σε TIG-1, LNCaP, PC- 3, και DU-145 σε 4, 8, και 24 ώρες μετά την αγωγή με 2 μΜ ή 4 μΜ WA. ΝΤ: μη επεξεργασμένο. (Β) Οι τυπικές εικόνες TIG-1 (i) και PC-3 (ii) χρωματίστηκαν με αντι-βιμεντίνη αντίσωμα, φαλλοειδίνη (για F-ακτίνη), και Hoechst 33342 (για DNA) σε 2, 4, και 6 (h ) μετά τη θεραπεία WA. ΝΤ: μη επεξεργασμένο. Ροζ και κίτρινα βέλη υποδεικνύονται colocalized βιμεντίνη και F-ακτίνη αδρανών υλικών. συγχωνεύονται εικόνες που εμφανίζονται στην κάτω σειρά. Bar, 10 μm. (C) Ποσοστό όλων των παρατηρούμενων κυττάρων που περιέχουν τελείες συσσωματωμένης ή μη συσσωματωμένης βιμεντίνη δείχνονται για TIG-1 (i) και PC-3 (ii). Κύτταρα που φιλοξενούν πάνω από 10 αδρανών υλικών vimentin βαθμολογήθηκαν ως «συγκεντρωτική», ενώ τα κύτταρα με μη ομαδοποιημένες βιμεντίνη βαθμολογήθηκαν ως «μη-συγκεντρωτική». Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσο ± SEM τριών ανεξάρτητων πειραμάτων? αστερίσκοι υποδεικνύουν στατιστικώς σημαντικές αλλαγές στην βιωσιμότητα των κυττάρων (**,

P

& lt? 0,01? ***,

P

& lt? 0.001). (D) Jasplakinoloide (Jsp) δεν επηρέασε PC-3 βιωσιμότητα των κυττάρων. (I) Σχηματική του πειραματικού σχεδιασμού. (Ii) γραφικές παραστάσεις ράβδου που δείχνει τη βιωσιμότητα των κυττάρων (%) με την παρουσία (+) ή απουσία (-) 4 μΜ WA ή Jasp 8 ώρες μετά την προσθήκη του WA. ΝΤ: μη επεξεργασμένο. γραφικές παραστάσεις Bar αντιπροσωπεύουν μέσο ± SEM για τρία ανεξάρτητα πειράματα. Ροζ, μπλε και πράσινα βέλη δείχνουν στατιστικά σημαντικές μειώσεις στην βιωσιμότητα των κυττάρων (*,

P

& lt? 0,05? **,

P

& lt? 0,01).

Η

η ανοσοχρώση στις 2, 4, και 8 ώρες μετά από 4 θεραπεία μΜ WA προκαλείται συσσωμάτωση βιμεντίνη γύρω από την μεμβράνη πλάσματος σε TIG-1 (ροζ βέλη, Σχήμα 6Β-i). Αντίθετα, PC-3 επέδειξε μία ομογενή κατανομή του βιμεντίνης, χωρίς τέτοια συσσωματώματα (Σχήμα 6Β-i και 6Β-ΙΙ)? αυτό υποδηλώνει ότι vimentin εξέφρασε μετά την EMT στο PC-3 εξυπηρετεί μια διαφορετική λειτουργία από ό, τι στα μεσεγχυματικά κύτταρα. Αξίζει να σημειωθεί ότι, η κυτταροπλασματική όγκος του PC-3 ήταν μικρότερο από εκείνο της TIG-1. Το ποσοστό των κυττάρων που φιλοξενούν αυτά τα συσσωματώματα αυξήθηκε εμφανώς σε TIG-1 (Σχ 6C-i) σε σχέση με PC-3 (Σχήμα 6C-ΙΙ).

Immuno-ηλεκτρονική μικροσκοπία αποκάλυψε σήματα βιμεντίνη στο ΕΟ στο κυτταρόπλασμα σε η απουσία θεραπείας WA (S8A Σχήμα), επιβεβαιώνοντας την μεσεγχυματικής προέλευσης του TIG-1. Αξίζει να σημειωθεί ότι, πολλά σήματα βιμεντίνη μετατοπίζεται προς την περιφερειακή περιοχή του κυτταροπλάσματος κοντά στην μεμβράνη του πλάσματος, σε ένα σχέδιο που αντανακλά την παρουσία των προαναφερθέντων συσσωματωμάτων βιμεντίνη (βλέπε σχήμα 6Β-i), μετά από 4 ώρες από 4 μΜ θεραπεία WA (S8B Εικ) . Αντίθετα, μόνο αραιή σήματα βιμεντίνη παρατηρήθηκαν σε PC-3 με την απουσία της θεραπείας WA (S8C Εικ)?