Αφηρημένο

παγκρεατικού πόρου αδενοκαρκινώματα περιέχει ένα υποσύνολο αποκλειστικά ογκογόνων καρκινικών βλαστικών κυττάρων (ΚΕΠ), τα οποία είναι ικανά για λόγους αποκατάστασης πληθυσμών των ολόκληρους πληθυσμούς ετερογενή καρκινικών κυττάρων και είναι ιδιαίτερα ανθεκτικά στη συνήθη χημειοθεραπεία. Εδώ έχουμε αποδείξει ότι η μετφορμίνη επιλεκτικά αφαιρεθεί παγκρέατος ΚΕΠ, όπως αποδεικνύεται από μειωμένη έκφραση των γονιδίων pluripotency που σχετίζονται και CSC που σχετίζονται με δείκτες επιφάνειας. Στη συνέχεια, η ικανότητα των ΚΕΠ μετφορμίνης επεξεργασμένου να κλωνικά επεκταθεί

in vitro

είχε μη αντιστρεπτά καταργήθηκε με την επαγωγή απόπτωσης. Αντίθετα, οι μη-ΚΕΠ προτίμηση απάντησε με την αναστολή του κυτταρικού κύκλου, αλλά δεν εξαλείφεται με αγωγή με μετφορμίνη. Μηχανιστικά, μετφορμίνη αυξημένη αντιδραστική παραγωγή ειδών οξυγόνου στο CSC και μειωμένο μιτοχονδριακό διαμεμβρανικό δυναμικό τους. Η επακόλουθη πρόκληση των θανατηφόρων ενεργειακή κρίση στις ΚΕΠ ήταν ανεξάρτητη της ΑΜΡΚ /mTOR. Τέλος, σε πρωτοπαθή καρκίνο του ιστού μοντέλα ξένου μοσχεύματος μετφορμίνη μείωσε αποτελεσματικά το φορτίο του όγκου και εμπόδισε την εξέλιξη της νόσου? αν συνδυαστεί με ένα στρώμα στόχευση λειανθούν αναστολέα για την ενίσχυση της διείσδυσης των ιστών, ενώ η γεμσιταμπίνη στην πραγματικότητα εμφανίστηκε περιττό

Παράθεση:. Lonardo E, Cioffi Μ, Sancho P, Sanchez-Ripoll Υ, Trabulo SM, Dorado J, et al . (2013) Η μετφορμίνη Στόχοι Το μεταβολικό αχίλλειο πτέρνα του Ανθρώπου καρκίνο του παγκρέατος βλαστικά κύτταρα. PLoS ONE 8 (10): e76518. doi: 10.1371 /journal.pone.0076518

Επιμέλεια: Anita Β Hjelmeland, Cleveland Clinic, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 3 του Μάη, 2013? Δεκτές: 1 Σεπτεμβρίου, 2013? Δημοσιεύθηκε: 18 Οκτωβρίου του 2013

Copyright: © 2013 Lonardo et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Η έρευνα υποστηρίχθηκε από την ΕΣΕ Σύνθετη Investigator Grant (Pa-CSC 233460), έβδομου προγράμματος-πλαισίου της Ευρωπαϊκής Κοινότητας (FP7 /2007-2013) στο πλαίσιο της συμφωνίας επιχορήγησης n ° 256974, το Subdirección General de Evaluación y Fomento de la Investigación, Fondo de Investigación Sanitaria ( PS09 /02129), και το Programa Nacional de Internacionalización de la I + D, Subprogramma: FCCI 2009 (PLE2009-0105? τόσο Ministerio Επιστημών e Innovación, Ισπανία). Ε.Ι. υποστηρίζεται από τη Roche μεταδιδακτορικής έρευνας του Προγράμματος. Μ.Ο. υποστηρίζεται από το La Caixa Predoctoral Προγράμματος Υποτροφιών. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

παγκρεατικό αδενοκαρκίνωμα του πόρου (PDAC) παραμένει μια από τις πιο καταστροφικές μορφές καρκίνου, και είναι η τέταρτη κύρια αιτία του καρκίνου που σχετίζονται με θανάτους στις βιομηχανικές χώρες με ποσοστό επιβίωσης 5 ετών μικρότερη από 5% [1]. Πολλοί παράγοντες κινδύνου όπως το κάπνισμα, η κατανάλωση αλκοόλ, και χρόνια παγκρεατίτιδα έχουν αναγνωριστεί ως πιθανοί παράγοντες κινδύνου για την ανάπτυξη του PDAC [2]. Επιδημιολογικές μελέτες δείχνουν επίσης ότι ο σακχαρώδης διαβήτης, ιδιαίτερα τύπου 2, συνδέεται με αυξημένο κίνδυνο για PDAC [3], [4]. Ως εκ τούτου, οι ερευνητές έχουν ξεκινήσει για την εξεύρεση μια υποθετική σχέση μεταξύ της χρήσης των αντιδιαβητικών φαρμάκων και μειωμένο κίνδυνο για την ανάπτυξη ή /και την εξέλιξη της PDAC. Εντυπωσιακά, σε μια αναδρομική ανάλυση, από του στόματος χορήγηση μετφορμίνης σε ασθενείς με σακχαρώδη διαβήτη τύπου II βρέθηκε να σχετίζεται με μειωμένο κίνδυνο για την ανάπτυξη PDAC [5], καθώς και καλύτερη έκβαση σε ασθενείς με εγκατεστημένη PDAC [6].

Η κύρια συστημική επίδραση της μετφορμίνης (Met) αντιπροσωπεύει μια μείωση στα επίπεδα της γλυκόζης στο αίμα μέσω της ελαττωμένης ηπατικής γλυκονεογένεσης και αυξημένη πρόσληψη γλυκόζης σε περιφερικούς ιστούς [7]. Μηχανιστικά, η μετφορμίνη ενεργοποιεί έμμεσα AMP-ενεργοποιημένη πρωτεϊνική κινάση (ΑΜΡΚ) σηματοδότησης [8] και στη συνέχεια αναστέλλει τη δράση του mTOR, η οποία είναι συχνά αυξημένη σε καρκινικά κύτταρα [9], συμπεριλαμβανομένων του καρκίνου του παγκρέατος βλαστοκύτταρα (ΚΕΠ) ως εξαιρετικά ογκογόνων υποπληθυσμό [10]. Αυτή η ανασταλτική δράση της μετφορμίνης επί ΑΜΡΚ αποτελέσματα /mTOR σηματοδότησης σε μειωμένη πρωτεϊνική σύνθεση και τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό [11], [12]. Επιπλέον, σε καθιερωμένες κυτταρικές σειρές PDAC μετφορμίνης είναι επίσης ικανή να αναστέλλει PDAC [13]. Περιέργως, μια άλλη πρόσφατη μελέτη έδειξε ότι η ΚΕΠ θα μπορούσε να στοχεύσει η μετφορμίνη μέσω επανέκφραση των miRNAs που εμπλέκονται στη διαφοροποίηση, αν και τα δεδομένα αυτά βασίζονται σε μη επικυρωμένα ΚΕΠ γραμμή που προέρχεται από καρκινικών κυττάρων [14].

Σε αντίθεση με το πλειοψηφία των διαφοροποιημένων κυττάρων εντός του όγκου, έχουν ΚΕΠ έχει αποδειχθεί ότι είναι εξαιρετικά ανθεκτικά στη χημειοθεραπεία [15]. Ως εκ τούτου, τα φάρμακα που στοχεύουν επιλεκτικά ΚΕΠ μπορεί να αντιπροσωπεύει μια πιο αποτελεσματική προσέγγιση για να ξεπεράσει την αντίσταση και /ή υποτροπής θεραπεία σε PDAC. Εδώ, τώρα παρέχουν πειστικές αποδείξεις ότι τα ΚΕΠ που προέρχεται από ένα διαφορετικό σύνολο των πρωτογενών ανθρώπινων PDACs είναι ιδιαίτερα ευάλωτα σε μεταβολικές επαναπρογραμματισμό από μετφορμίνη με αποτέλεσμα την μακροπρόθεσμη επιβίωση των προκλινικών μοντέλα ποντικών.

Αποτελέσματα

Έχουμε δείξει προηγουμένως ότι η πρωτογενής παγκρεατικά ΚΕΠ μπορεί να εμπλουτιστεί

in vitro

ως τρισδιάστατο σφαίρες ανεξάρτητη από προσκόλληση, τα οποία είναι εμπλουτισμένα για κύτταρα με τα βλαστικά κύτταρα που μοιάζουν με ιδιότητες [15]. Ένας συνολικός αριθμός των εννέα ξενομοσχευμάτων ανθρώπινου PDAC χρησιμοποιήθηκαν με A6L, 163, 185, 215, 247, 253, και 286 που περιγράφηκε προηγουμένως [16], [17], καθώς και 354 και JH029, τα οποία ελήφθησαν χρησιμοποιώντας την ίδια μεθοδολογία. Είναι σημαντικό, για

in vitro

πειράματα όλα τα κύτταρα πρόσφατα απομονώθηκαν από νωρίς ξενομοσχεύματα πέρασμα και καλλιεργούνται σε χαμηλά περάσματα ως προσκολλημένα κύτταρα ή αγκυροβόλιο ανεξάρτητα από σφαίρες. Οι σφαίρες εμπλουτισμένα σε CD133

+ κύτταρα (Σχ. S1A) και αρκετών άλλων δεικτών που έχουν συσχετιστεί με φαινότυπο CSC σε σύγκριση με προσκολλημένα κύτταρα [18].

μετφορμίνη μειώνει την έκφραση του ΚΕΠ δεικτών

Κατ ‘αρχάς, ιδρύσαμε την έκφραση του οργανικού κατιόντος μεταφορέα 1, 2 και 3 (OCT1-3) στην πρωτοβάθμια PDAC κύτταρα μας (Εικ. 1Α), τα οποία είναι ζωτικής σημασίας για την κυτταρική πρόσληψη της μετφορμίνης. Η μετφορμίνη χρησιμοποιείται σε συγκεντρώσεις που δεν είναι άμεσα τοξικές για πρωτογενή PDAC κύτταρα και μη μετασχηματισμένα κύτταρα του παγκρέατος (PSC, παγκρεατικά κύτταρα αστεροειδή? HDPE, ανθρώπινη πόρου του παγκρέατος επιθηλιακά κύτταρα) (Σχήμα 1 Β.), Που είναι σημαντικά χαμηλότερες σε σύγκριση με τις συγκεντρώσεις που χρησιμοποιούνται σε προηγούμενες μελέτες με PDAC κυτταρικές σειρές (10-30 mM) [14]. Στη συνέχεια βρήκαμε σημαντικές αλλαγές στα επίπεδα του mRNA των γονιδίων ΚΕΠ (CD133, Alk4, κομβικών, ακτιβίνη και Smad2) και γονιδίων πλειοδυναμία σχετιζόμενη (Nanog, Oct4 και Sox2) μετά από αγωγή με μετφορμίνη (σχήμα 1Γ?. Χρησιμοποιούνται εκκινητές παρατίθενται στον Πίνακα S1), οι οποίες επιβεβαιώθηκαν και στο επίπεδο πρωτεΐνης (Σχ. 1D). Εντυπωσιακά, η μετφορμίνη φάνηκε να εξαλειφθούν κατά προτίμηση ΚΕΠ ως CSC-δείκτη θετικών κυττάρων CD133, CD44, CXCR4 και SSEA-1 μειώθηκε, ενώ το επιθηλιακό maker διαφοροποίηση EpCAM αυξημένη (Εικ. 1 Ε).

(Α) Πρωτοβάθμια PDAC κύτταρα , αλλά όχι τα φυσιολογικά κύτταρα του παγκρέατος εκφράζουν οργανικό κατιόν μεταφορέα 1, 2, και 3 (n = 3). (Β) Ορισμός του θεραπευτικού εύρους για τη μετφορμίνη στην πρωτοβάθμια PDAC κύτταρα. Αριθμός κυττάρων που αναπτύσσονται παρουσία των ενδεικνυόμενων συγκεντρώσεων μετφορμίνης για 24 h (n = 6). ανάλυση (C) qPCR του ΚΕΠ που σχετίζονται με τα γονίδια σε σφαίρες σε επεξεργασία με 3 mM μετφορμίνης για 7 ημέρες. Τα δεδομένα είναι κανονικοποιημένα προς το γονίδιο οικοκυρική και παρουσιάζονται ως φορές μεταβολή στην έκφραση γονιδίου σε σχέση με κύτταρα μάρτυρες (n = 6). (D) Αντιπροσωπευτική κηλίδος Western που απεικονίζει μειωμένη έκφραση πρωτεΐνης Oct4 σε απόκριση στην αγωγή με μετφορμίνη (n = 3). (Ε) Αντιπροσωπευτική ανάλυση κυτταρομετρίας ροής για CSCs δείκτες σε σφαίρες θεραπεία για 7 ημέρες με 3 mM μετφορμίνης σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα σφαίρες (άνω πάνελ). Περίληψη των δεδομένων για PDAC-185, A6L, 215, 253, και 354 απεικονίζεται (κατώτερο πάνελ? N = 6)

Η

μετφορμίνη μειώνει επιλεκτικά in vitro και in vivo ογκογονικότητα

Εξετάσαμε επόμενο τα λειτουργικά αποτελέσματα της μετφορμίνης για την ικανότητα αυτο-ανανέωσης των ΚΕΠ. Η δοκιμασία σχηματισμού σφαίρα παρουσίασαν μεγάλη μείωση στο μέγεθος των σχηματίζονται σφαίρες με μετφορμίνη (Σχήμα 2Α & amp?. S1B) μέσω αναστολής της επέκτασης των απογόνων των ΚΕΠ, τα οποία αντιπροσωπεύουν το μεγαλύτερο μέρος των κυττάρων των σχηματίζονται σφαίρες. Ακόμη πιο σημαντικό, βρήκαμε ότι η μετφορμίνη μείωσε σημαντικά τον αριθμό των πράγματι σχηματίζονται σφαίρες με την ίδια αποτελεσματικότητα σε 3 και 10 mM (Σχ. 2Β). Προκειμένου να εξεταστεί η μακροπρόθεσμη επίδραση της θεραπείας με μετφορμίνη στην ικανότητα αυτο-ανανέωσης των κυττάρων που δεν δείχνουν σημαντική διαφορά κατά τη διάρκεια του σχηματισμού σφαίρας πρώτο πέρασμα (Panc-185 και Panc-215), δευτερογενή και τριτογενή τομέα κινήθηκαν χωρίς περαιτέρω μετφορμίνη θεραπεία. Σχηματισμός σφαιρών στο δεύτερο και τρίτο διόδους δραστικά παρεμποδίζεται υποδηλώνοντας ότι η αγωγή με μετφορμίνη είχε μη αντιστρεπτά εξαλειφθεί η πλειονότητα των ΚΕΠ με αναστολή ή κατάργηση των αυτο-ανανέωσης χωρητικότητά τους (Σχ. 2C). Σταθερά, προ-θεραπεία με μετφορμίνη οδήγησε στο σχηματισμό λιγότερων και μικρότερες αποικίες σε σύγκριση με τον έλεγχο (σχ. 2D). Το χρυσό πρότυπο για τη δραστηριότητα CSC αντιπροσωπεύει

in vivo

ογκογονικότητας. Η συχνότητα των ογκογόνων κυττάρων που προέρχονται από PDAC-354, 215, και A6L σφαίρες ήταν τακτικά πολύ υψηλή με τιμές κάτω από 1:500 και έγινε έντονα rarified με αγωγή με μετφορμίνη (Σχ. 2Ε). Τέλος, βρήκαμε ότι η μετφορμίνη προεπεξεργασία των παγκρεατικών ΚΕΠ συνέχεια ανάγεται μεταναστευτικά (Εικ. S2A) τους και επεμβατική ικανότητα (Σχ. 2F).

(Α) μετφορμίνη μειώνει το μέγεθος των σφαιρών. Αντιπροσωπευτικές εικόνες των σφαιρών που ελήφθη μετά από θεραπεία με μετφορμίνη για 7 ημέρες. Η ποσοτικοποίηση του μεγέθους σφαίρας (n≥6). ικανότητα σχηματισμού (Β) Σφαίρα παρουσία ή απουσία μετφορμίνης για 7 ημέρες (n≥6). (C) ικανότητα αυτο-ανανέωσης των βλαστικών κυττάρων του καρκίνου που απομονώθηκαν από όγκους ανταποκρίνεται καλά από την άποψη της πρώτης σφαίρας πέρασμα ικανότητα σχηματισμού. Τα κύτταρα συνεχώς πέρασμα ως δευτερογενή και τριτογενή σφαίρες που έλαβαν θεραπεία με μετφορμίνη ή όχημα μόνο κατά τη διάρκεια του σχηματισμού σφαίρα πρώτης γενιάς (n = 6). (D) σχηματισμός αποικίας για PDAC-185, A6L, 215, 253, και 354 αποδεικνύεται από 0,05% κρυσταλλικό ιώδες μετά από 21 ημέρες (η = 3). (Ε) Rarefication του

in vivo

ογκογόνων καρκινικών βλαστικών κυττάρων σε σφαίρες που έλαβαν θεραπεία με μετφορμίνη σε σύγκριση με το όχημα. (F) Εισβολή των κυττάρων σφαίρας προερχόμενων μετά από 24 ώρες θεραπείας με μετφορμίνη ή ελέγχου (n = 3).

Η

μετφορμίνη εξαλείφει ειδικά του παγκρέατος ΚΕΠ

διπλασιασμού του πληθυσμού των προσκολλημένων κυττάρων ήταν μειώνεται σημαντικά από τη μετφορμίνη με ισχυρά intertumoral παραλλαγή (Σχ. 3Α). Σταθερά, η έκφραση Κί67 ελαττώθηκε υποδηλώνοντας αναστολή του κυτταρικού πολλαπλασιασμού (Σχ. 3Β), γεγονός που επιβεβαιώθηκε με μειωμένη έκφραση του mRNA στο cyclinD1 (Εικ. 3C) και στο επίπεδο πρωτεΐνης (Εικ. S2B). Στη συνέχεια, αναλύσαμε το προφίλ κυτταρικού κύκλου των προσκολλημένων κυττάρων έναντι ΚΕΠ με κυτταρομετρία ροής. Είναι ενδιαφέρον ότι, τα στοιχεία έδειξαν ότι η λειτουργική επίδραση της μετφορμίνης επί πρόοδο του κυτταρικού κύκλου ήταν πολύ περισσότερο περιθωριακή για κύτταρα σφαίρα προερχόμενα υποδηλώνοντας διακριτό μηχανισμό που ευθύνεται για την επακόλουθη απώλεια τους κατά τη διάρκεια εκτεταμένων θεραπείας (Εικ. 3D). Πράγματι, ενώ η μετφορμίνη δεν μετέβαλε σημαντικά το ρυθμό των αποπτωτικών προσκολλημένων κυττάρων όπως αποδεικνύεται με χρώση Αηηβχίην /ϋΑΡΙ (1.23 ± 0.37 φορές μεταβολής), είχε ως αποτέλεσμα μια ισχυρή επαγωγή της απόπτωσης σε κύτταρα σφαίρα προερχόμενα (2.95 ± 1.10 φορές αλλαγή? Ρ & lt ? 0,01) (Εικ 3Ε).. Τα στοιχεία αυτά είναι σύμφωνα με προνομιακό εξάλειψη των ΚΕΠ με μετφορμίνη, ενώ τα αποτελέσματά της για διαφοροποιημένη απογόνους είναι ως επί το πλείστον σχετίζονται με την αναστολή του πολλαπλασιασμού.

(Α) Αριθμός κύτταρα που αναπτύσσονται με την παρουσία των ενδεικνυόμενων συγκεντρώσεων της μετφορμίνης για 24 ώρες. (N = 3). (Β) Ποσοτικοποίηση για Κί67 και DAPI στα προσκολλημένα κύτταρα μετά από 7 d θεραπείας με μετφορμίνη ή ελέγχου (n = 3). ανάλυση (C) qPCR για CyclinD1 στην προσκολλημένη και σφαίρα που προέρχονται από κύτταρα μετά από 7 ημέρες θεραπείας με μετφορμίνη ή τον έλεγχο. Τα δεδομένα είναι κανονικοποιημένα προς το γονίδιο οικοκυρική και παρουσιάζονται ως φορές μεταβολή στην έκφραση γονιδίου σε σχέση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα (n = 6). ανάλυση (D) του κυτταρικού κύκλου καθορίστηκε με χρώση ιωδιούχου προπιδίου σε προσκολλημένα κύτταρα και σφαίρες μετά από 7 d θεραπείας με μετφορμίνη ή ελέγχου (n = 3). ανάλυση (Ε) Κυτταρομετρίας αποπτωτικών κυττάρων με διπλή χρώση για αννεξίνη V /ϋΑΡΙ μετά τη θεραπεία με μετφορμίνη ή ελέγχου για προσκολλημένα κύτταρα έναντι σφαίρα προερχόμενα (n = 3).

Η

Μηχανισμός δράσης

η μετφορμίνη ομοιόμορφα μειωμένο επίπεδο ATP τόσο σε προσκολλημένα κύτταρα και σφαίρες σε όλη την ομάδα των όγκων διερευνήθηκε συμπεριλαμβανομένων καθυστερημένη ανταπόκριση (Σχ. 4Α). Σταθερά, η μετφορμίνη προκάλεσε μια εξαρτώμενη από το χρόνο αύξηση του pAMPK σε ΚΕΠ (Σχ. 4Β, άνω φωτογραφία) χωρίς εμφανή διαφορά σε μη CSC (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Επιπλέον, παρατηρήσαμε μια παρόμοια καθαρή μείωση σε p70S6K, υποδηλώνοντας μια αποτελεσματική αποκλεισμός του mTOR μονοπάτι (Σχ. 4Β, κάτω πάνελ). Καθώς η οδός mTOR είναι ένα κεντρικό ρυθμιστή της αυτοφαγία, αναλύσαμε εάν η μετφορμίνη μπορεί να προκαλέσουν χαρακτηριστικό σήμα κατατεθέν της αυτοφαγία στα ΚΕΠ έναντι μη-ΚΕΠ, αλλά τα αποτελέσματά μας δεν υποστηρίζουν την ιδέα ότι η επιλεκτική εξάλειψη των ΚΕΠ με μετφορμίνη μπορεί να εξορθολογιστεί από αλλαγές στην αυτοφαγία (Εικ. S3A /Β). Για την παροχή περαιτέρω αποδείξεις ότι ΑΜΡΚ μονοπάτι /mTOR δεν μεσολαβεί τα δηλητηριώδη αποτελέσματα της μετφορμίνης επί ΚΕΠ, ερευνήσαμε αν τα αποτελέσματα της μετφορμίνης μιμούνται την άμεση ενεργοποιητή ΑΜΡΚ A769662 ή /και τη ραπαμυκίνη αναστολέα mTOR (Rapa). Εντυπωσιακά, ούτε σχηματισμός σφαίρα (Εικ. 4C) ούτε το σχηματισμό αποικιών (Σχ. 4D) ανεστάλη σημαντικά από τους δύο αναστολείς, ουσιαστικά αποκλείοντας ΑΜΡΚ /mTOR ως κινητήριο μηχανισμό για τη μετφορμίνη στη στόχευση του παγκρέατος ΚΕΠ.

( Α) Τα επίπεδα Κινητή ΑΤΡ σε προσκολλημένα κύτταρα και σφαίρες μετά από 7 d θεραπείας με μετφορμίνη ή ελέγχου (n = 3). (Β)

Άνω πάνελ

: ανάλυση Western blot της pAMPK, ΑΜΡΚ, και GAPDH σε τομείς που έλαβαν θεραπεία με μετφορμίνη ή τον έλεγχο.

Κάτω πάνελ

: ανάλυση στυπώματος Western των pAMPK, pp70S6K, και GAPDH σε προσκολλημένα κύτταρα και σφαίρες αγωγή με μετφορμίνη ή ελέγχου για 7 ημέρες (η = 3). (Γ) Συνολική επίδραση της μετφορμίνης (3 mM), η αναστολή του mTOR (ραπαμυκίνη? 100 ng /ml), και η ενεργοποίηση κατεύθυνση της ΑΜΡΚ (A769662? 10 μΜ) επί του σχηματισμού σφαίρας και (n = 6). (D) για το σχηματισμό αποικιών PDAC-215, 253, και 354 κύτταρα (η = 3). (Ε) Σύνολο και μιτοχονδριακή παραγωγή (Mito) ROS μετά από 8 ώρες του ελέγχου ή θεραπεία με μετφορμίνη. (F) μιτοχονδριακού διαμεμβρανικό δυναμικό μετά από 8 ώρες του ελέγχου ή της θεραπείας με μετφορμίνη.

Η

Στη συνέχεια, υποθέσαμε ότι η ιδιαίτερη ευαισθησία των ΚΕΠ στη μετφορμίνη μπορεί να οφείλονται σε αντι-οξειδωτικές ιδιότητες με μετφορμίνη [19]. Πράγματι, η θεραπεία με μετφορμίνη αύξησε σημαντικά μιτοχονδριακή παραγωγή αντιδραστικών ειδών οξυγόνου (ROS) σε ΚΕΠ που προέρχονται από όλων των χρησιμοποιούμενων όγκων, αλλά αυτές οι αλλαγές ήταν πιο έντονη σε ταχεία ανταπόκριση (PDAC-253 και 354) σε σύγκριση με τα καθυστερημένα ανταποκρίθηκαν PDAC-215 και 286 (όπου επιδράσεις μετφορμίνη δεν είναι ανιχνεύσιμες σε σχηματισμό σφαίρα πρώτης γενιάς) (Σχ. 4Ε). Είναι ενδιαφέρον, συνεπή δεδομένα ελήφθησαν για μιτοχονδριακή διαμεμβρανικό δυναμικό, το οποίο ήταν περισσότερο ευδιάκριτα μειωμένη σε ταχεία ανταπόκριση (Σχ. 4F). Χρησιμοποιώντας τον ανιχνευτή μιτοχονδριακού TMRE, δείχνουμε ότι σε αυτούς τους όγκους μετφορμίνη μειωμένη μιτοχονδριακή διαμεμβρανικό δυναμικό τους (που χρησιμοποιείται ως γενικός δείκτης της μιτοχονδριακής τοξικότητας και της επαγωγής της απόπτωσης), ενώ παρέμεινε αμετάβλητος ή μόνο ελαφρώς μειωμένη σε καθυστερημένη ανταπόκριση. Αυτή η άμεση επίδραση στα μιτοχόνδρια μπορούν επίσης να εξηγήσει τη διαφορά ευαισθησίας μεταξύ των μη-ΚΕΠ και ΚΕΠ καθώς η τελευταία φαίνεται να είναι περισσότερο εξαρτημένοι από τα μιτοχόνδρια τους για την παραγωγή ενέργειας, ενώ οι μη-ΚΕΠ βασίζονται κυρίως πηγές μιτοχόνδρια-ανεξάρτητη, όπως αερόβια γλυκόλυση (φαινόμενο Warburg) [20]. Επιπλέον, επιβεβαιώσαμε επίσης ότι η επίδραση της μετφορμίνης επί μιτοχόνδρια ήταν ανεξάρτητη της ΑΜΡΚ /mTOR, διότι ούτε η άμεση AMP ενεργοποιητή A769662 ούτε ο αναστολέας mTOR ραπαμυκίνη ήταν ικανά να μιμούνται τις επιδράσεις της μετφορμίνης (Εικ. S4A /Β).

Η μετφορμίνη πάγκους PDAC εξέλιξη in vivo

Κατ ‘αρχάς, μελετήσαμε τα αποτελέσματα της μετφορμίνης

in vivo

χρησιμοποιώντας μια σύντομη θεραπεία με μετφορμίνη 7 ημερών από PDAC-185. Κατά τη διάρκεια της μετέπειτα παρακολούθησης 40 ημερών παρατηρήσαμε μια σημαντική μείωση στην ανάπτυξη του όγκου και πλήρη ύφεση σε 3 από 8 όγκους για μετφορμίνη αγωγή ποντικούς, σε αντίθεση με καμία διαγραφή στην ομάδα ελέγχου (Εικ. S5). Συνεπής δεδομένα ελήφθησαν για τα άλλα PDACs με μονοθεραπεία μετφορμίνης είναι ιδιαίτερα αποτελεσματική στην επαγωγή υποχώρησης της νόσου (Εικ. 5Α-F). Αρκετές σημαντικές παρατηρήσεις έγιναν κατά τη διάρκεια αυτών των μελετών. Κατ ‘αρχάς, δεν το ακαθάριστο τοξικότητα παρατηρήθηκε κατά τη διάρκεια παρατεταμένης θεραπείας με μετφορμίνη, όπως το σωματικό βάρος παρέμεινε αμετάβλητη (Εικ. 5Α, δεξιά πλευρά). Δεύτερον, οι όγκοι υποτροπίασαν αργά, αλλά τακτικά μετά την απόσυρση της μετφορμίνης κατά την ημέρα 100 (Εικ. 5Α, το αριστερό πάνελ). Τρίτον, ενώ η προσθήκη της γεμσιταβίνης

in vitro

έδειξε αθροιστική δράση στον πληθυσμό CSC (Εικ. 5C), καμία πρόσθετη επίδραση θα μπορούσε να σημειωθεί

in vivo

για τη μετφορμίνη συν γεμσιταβίνη (Εικ. 5D)

(Α)

Αριστερό πάνελ

:. PDAC-215 ιστός εμφυτεύθηκε και θεραπεία διατέθηκε μετά την αρχική υιοθέτηση του όγκου επαληθεύθηκε. Τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε αγωγή είτε με γεμσιταβίνη (Gem) ή μετφορμίνη (Met). Η μετφορμίνη διακόπηκε για D100 για να δοκιμάσουν τις δυνατότητες των υπόλοιπων βλαβών για την κίνηση υποτροπή της νόσου. Μετά από τεκμηριωμένη υποτροπή της νόσου, η θεραπεία με μετφορμίνη χορηγείται εκ νέου.

δεξί πάνελ

: σωματικό βάρος κατά τη διάρκεια της θεραπείας. (Β)

Αριστερό πάνελ

: Η ιστολογική ανάλυση: αιματοξυλίνη & amp? Ηωσίνη (Η & amp? Ε), CyclinD1 και Caspase3.

δεξί πάνελ

: Περιεχόμενο για τα κύτταρα CD44 +. (Γ) Αποτελέσματα της

in vitro

θεραπεία, όπως αναφέρεται στην ικανότητα σχηματισμού σφαίρας. (D) PDAC-A6L ιστού εμφυτεύθηκαν σε ποντικούς και θεραπεία όπως υποδεικνύεται. (Ε) Περιεχόμενο για CD44 + κύτταρα (

πάνω πίνακα

) και ικανότητα σχηματισμού σφαίρας (

κάτω πίνακα

). (F) ιστολογική ανάλυση:. H & amp? Ε και cytokeratin19 (CK19? N = 6)

Η

Αυτά τα στοιχεία μας ώθησε να υποθέτουν ότι η γεμσιταβίνη δεν ήταν κατάλληλα παραδοθεί στον ιστό PDAC [21] και /ή το στρώμα προστάτεψε τα ΚΕΠ από τα επιβλαβή αποτελέσματα της μετφορμίνης με την προώθηση βλαστική ικανότητα τους και στη συνέχεια την αντίσταση [22]. Ως εκ τούτου, προσθέσαμε την smoothened αναστολέα SIBI-C1 ως παράγοντας στρώμα /αστεροειδή κύτταρα-στόχευση με το συνδυασμό γεμκιταβίνης και μετφορμίνης. Δεδομένου ότι έχουμε δείξει στο παρελθόν ότι ο συνδυασμός γεμσιταβίνης συν λειαίνονται αναστολέας δεν εμποδίζει την υποτροπή [10] και γκεμσιταμπίνης σήμερα αποτελεί τυπική θεραπεία για PDAC, ελέγξαμε μόνο αυτό το συνδυασμό. Εκτός από την ενίσχυση παράδοσης ιστό της γεμσιταβίνης, [21], ο τριπλός συνδυασμός είχε επίσης ως αποτέλεσμα το διπλασιασμό της συγκέντρωσης μετφορμίνης ιστού (23.1 ± 0.82 έναντι 10.8 ± 1.9 mg /g). Στη συνέχεια παρατηρήθηκε αναπαραγώγιμη παλινδρόμησης της νόσου (Εικ. 6A-C) και, ακόμη πιο σημαντικό, αυτός ο συνδυασμός ήταν επίσης αποτελεσματική σε όγκους δειχθεί προηγουμένως να είναι ανθεκτικά σε mTOR αναστολής (Σχ. 6D) [23].

( Α) PDAC-185 ιστού εμφυτεύτηκε σε ποντικούς και αντιμετωπίζονται ως ενδείκνυται, συμπεριλαμβανομένης της λειανθούν αναστολέα SIBI-C1. (Β) Περιεχόμενο για EpCAM + και CD133 + κύτταρα, αντίστοιχα, (

πάνω πίνακα

) και ικανότητα σχηματισμού σφαίρας (

κάτω πίνακα

). (Γ) Η ιστολογική ανάλυση: αιματοξυλίνη & amp? Ηωσίνη (Η & amp? Ε) και cytokeratin19 (CK19). ανθεκτικά (D) αναστολέας mTOR ιστού PDAC-253 εμφυτεύονται σε ποντίκια και αντιμετωπίζονται ως υποδεικνύεται (n = 6).

Η

Συζήτηση

Εδώ έχουμε αποδείξει ότι οι ετερογενείς πληθυσμούς των καρκινικών κυττάρων έτρεφε σε πρωτογενείς ανθρώπινους ιστούς PDAC διαφέρουν ως προς την ανταπόκρισή τους στη μετφορμίνη ανάλογα με το επίπεδο τους βλαστική ικανότητα. Ενώ το μεγαλύτερο μέρος των πιο διαφοροποιημένων κυττάρων καρκίνου αντιδρά στην αγωγή με μετφορμίνη με διακοπή του κυτταρικού κύκλου, ένα υποσύνολο των κυττάρων με διακριτά βλαστική ικανότητα χαρακτηριστικά, δηλαδή ΚΕΠ υποβλήθηκαν πράγματι ταχύ θάνατο αποπτωτικών λόγω ενεργειακή κρίση. Αν και η πιο εμφανής επίπτωση για θεραπεία με μετφορμίνη σε πρωτοβάθμια σφαίρες ήταν μια σημαντική μείωση του μεγέθους του τομέα συνάδει με μειωμένο συντελεστή πολλαπλασιασμού των πιο διαφοροποιημένα κύτταρα έτρεφε σε αυτούς τους τομείς, οι επόμενες σειριακό πέρασμα των σφαιρών αποκάλυψε ξεκάθαρα σχεδόν πλήρης και μη αναστρέψιμη απώλεια της κλωνογονικού ικανότητα πολλαπλασιασμού, παρά το γεγονός ότι η θεραπεία με μετφορμίνη διεκόπη ήδη μετά την πρώτη δίοδο. Αυτά τα δεδομένα καταδεικνύουν ότι η μετφορμίνη εξαντλήσει σχεδόν το κλάσμα CSC, αλλά είναι επίσης συνεπής με την έννοια ότι η μη-CSC δεν ανασύσταση του παγκρέατος πισίνα CSC μετά τον τερματισμό της θεραπείας με μετφορμίνη. Συνέπεια, η μεταμόσχευση των προεπεξεργασμένων κυττάρων σε ανοσοκατεσταλμένα ποντίκια αποκάλυψε ότι η ογκογονικότητα των κυττάρων πράγματι μειωθεί δραστικά από μικρής διάρκειας έκθεση στη μετφορμίνη. Το πιο σημαντικό, ωστόσο,

in vivo

θεραπεία της εγκατεστημένης πρωτογενών ανθρώπινων καρκίνων απάντησε έντονα στη μετφορμίνη με υποχώρηση της νόσου και την επακόλουθη σταθερή νόσο.

Η εντοπίστηκαν μηχανισμός δράσης για τη μετφορμίνη σε ΚΕΠ έχει παραμείνει σε μεγάλο βαθμό άγνωστο . Οι περισσότερες έρευνες χύμα καρκινικά κύτταρα υποστηρίζουν ένα απλοποιημένο μοντέλο εργασίας στην οποία μετφορμίνη εξασκεί αντικαρκινική επιδράσεις από έμμεσα ενεργοποιώντας AMPK ακολουθούμενη από επακόλουθη καταστολή του mTOR [8]. Απευθείας στόχευση mTOR με rapalogs έχει επίσης θεωρηθεί ως στόχο για την ανάπτυξη αντικαρκινικών φαρμάκων. Ενώ αυτό ήταν αποτελεσματικό σε ασθενείς με διάφορους καρκίνους [24], προκλινικές μελέτες σε PDAC δεν υποδηλώνουν συγκεκριμένη υψηλό ποσοστό απόκρισης (23%) [23]. Είναι σημαντικό ότι, ένα από τα μη ευαίσθητα όγκων σε αυτή τη μελέτη ήταν PDAC-215, τα οποία ήμασταν σε θέση να δοκιμάσει επίσης στην παρούσα μελέτη με τη χρήση μετφορμίνης. ΚΕΠ που προέρχονται από αυτόν τον όγκο παρουσίασαν ισχυρή αναστολή του σχηματισμού δευτερογενούς τομέα

in vitro

και αποτελεσματική υποχώρηση του όγκου

in vivo

. Από την άλλη πλευρά, η άμεση ενεργοποίηση του mTOR με A769662 ή η αναστολή της mTOR με ραπαμυκίνη δεν μιμούνται τις ισχυρές επιδράσεις που πετύχαμε με μετφορμίνη υποδεικνύοντας ότι τα αποτελέσματα της θεραπείας της μετφορμίνης σε παγκρεατικά ΚΕΠ είναι ανεξάρτητες από μεταβολές του άξονα ΑΜΡΚ /mTOR.

τα ανθρώπινα κύτταρα PDAC γνωστή για την εγγενή ανοχή τους στη διατροφή λιμού, που τους επιτρέπει να επιβιώνουν κάτω από ένα μικροπεριβάλλον του όγκου υποαγγειακές (λιτότητας). Πρόκειται για μια αναδυόμενη παράδειγμα ότι τα φυσιολογικά βλαστικά κύτταρα χαρακτηρίζονται από επικρατούσα αερόβια γλυκόλυση και κατέστειλε μιτοχονδριακή οξείδωση με συνέχεια κάτω μιτοχονδριακή παραγωγή ATP και την απελευθέρωση ROS [25]. Τα δεδομένα μας είναι σύμφωνες με την ιδέα ότι η παγκρεατική ΚΕΠ φέρει πράγματι ένα ιδιαίτερα μιτοχονδριακό εξαρτώμενη μεταβολικό προφίλ, το οποίο είναι σε πλήρη αντίθεση με την κανονική βλαστικά κύτταρα, αλλά τα διακρίνει και από τις χύδην καρκινικά κύτταρα. Έχει προηγουμένως δειχθεί ότι η μετφορμίνη αργά συσσωρευμένη 1000 φορές εντός μιτοχονδρίων και απευθείας αναστέλλει το σύμπλοκο 1 (αφυδρογονάση NADH), το οποίο μετατοπίζεται τέσσερα πρωτόνια από μιτοχονδριακή μήτρα στον χώρο intermembrane, παράγοντας έτσι μία διαβάθμιση πρωτονίων. Η αλυσίδα μεταφοράς ηλεκτρονίων και την οξειδωτική φωσφορυλίωση συνδέονται με αυτήν την βαθμίδα πρωτονίου κατά μήκος της εσωτερικής μιτοχονδριακής μεμβράνης, και η αναστολή τους φαίνεται να είναι ιδιαίτερα θανατηφόρος για ΚΕΠ [26]. Ως εκ τούτου, φάρμακα όπως η μετφορμίνη που στοχεύουν την οξειδωτική μιτοχονδριακή μεταβολισμό αντιπροσωπεύουν ισχυρά θεραπευτικά εργαλεία για την επίθεση στην πισίνα CSC.

Η ικανότητα της μετφορμίνης για την εξάλειψη επιλεκτικά ΚΕΠ είναι σε πλήρη αντίθεση με τις επιδράσεις της γεμσιταβίνης, ένα χημειοθεραπευτικό φάρμακο που σκοτώνει τα καρκινικά κύτταρα χύμα, αλλά όχι καρκινικά βλαστικά κύτταρα [15]. Με βάση τις ξεχωριστές τους ιδιότητες, η μετφορμίνη θα πρέπει να συνεργούν με γεμσιταβίνη να μειώσει τόσο μη-ΚΕΠ και ΚΕΠ στο μικτό πληθυσμό. Πράγματι, φάνηκε μόλις πρόσφατα σε τέσσερα γενετικά διαφορετικούς τύπους κυτταρικών σειρών καρκίνου του μαστού ότι η μετφορμίνη επιλεκτικά σκοτώνει ΚΕΠ και ότι ο συνδυασμός μετφορμίνης και η τυπική δοξορουβικίνη χημειοθεραπευτικό παράγοντα σκότωσε και τα δύο ΚΕΠ και μη ΚΕΠ

in vitro

ως καθώς και μείωση της μάζας του όγκου και παρατεταμένη ύφεση πιο αποτελεσματικά

in vivo

ό, τι είτε φάρμακο μόνο [27]. Ενώ θα μπορούσαμε να επιβεβαιωθεί αυτή η υπόθεση για PDAC

in vitro

, μας

in vivo

μελέτες θεραπείας δείχνουν ότι η γεμσιταμπίνη είναι πραγματικά περιττό όσο μετφορμίνη συνεχίζεται σε όλη τη μελέτη. Ενώ τα δεδομένα αυτά σίγουρα απαιτούν περαιτέρω επικύρωση φαίνεται λογικό να υποθέσουμε ότι η μετφορμίνη ως μονοθεραπεία θα μπορούσε να αποτελέσει μια νέα θεραπευτική επιλογή για τους ασθενείς που είναι πολύ εύθραυστη για να ανέχονται τις παρενέργειες της γεμσιταβίνης χημειοθεραπευτικού παράγοντα [28].

Δυστυχώς, όμως , όλα ελέγχονται οι όγκοι τελικά εξελίχθηκε υπό θεραπεία με μετφορμίνη. Απομένει να καθοριστεί αν ΚΕΠ εκτίθενται σε μακροχρόνια θεραπεία με μετφορμίνη ενεργοποιήσετε μεταβολικές φαινότυπο τους τα καθιστά ανθεκτικά στις επιδράσεις της μετφορμίνης για μιτοχόνδρια (επίκτητη αντοχή) ή αν μια προϋπάρχουσα υποπληθυσμό ΚΕΠ είναι πραγματικά ανθεκτικό σε μετφορμίνη και τελικά γίνεται ο κλώνος κυρίαρχο (κληρονομική αντίσταση). Αυτό το ζήτημα πρέπει να αντιμετωπιστεί σε μελλοντικές μελέτες συγκρίνοντας ΚΕΠ που απομονώθηκαν από όγκους που υποχώρησαν υπό αγωγή με μετφορμίνη και ΚΕΠ που απομονώθηκαν από όγκους που τελικά προχώρησε κάτω από τις ίδιες συνθήκες. Εκτεταμένες χαρακτηρισμό των ανθεκτικών κλώνων πρέπει να παρέχουν ζωτικής σημασίας πληροφορίες για το κατά πόσον αυτό είναι στην πραγματικότητα θα μπορούσε να προσφερθεί να προληφθούν ή τη δεύτερη θεραπευτικές επιλογές γραμμής.

Είναι σημαντικό, ωστόσο, η προσθήκη ενός στρώματος στόχευση λειανθούν αναστολέα εμφανίζεται υποχρεωτικά να επιτευχθεί ισχυρότερη και πλέον διαρκή ποσοστά ανταπόκρισης. Η πιο πιθανή εξήγηση θα μπορούσε να είναι δύο φορές. Ένας παράγοντας που συνέβαλε στην αποτυχία των συστηματικών θεραπειών μπορεί να είναι η πλούσια περιεκτικότητα σε στρωματικό όγκο που είναι το χαρακτηριστικό της PDAC. Το στρώμα αντιπροσωπεύει το μεγαλύτερο μέρος της μάζας του όγκου, και αποτελείται από μια δυναμική ποικιλία συστατικών εξωκυτταρικής μήτρας και μη νεοπλασματικά κύτταρα, συμπεριλαμβανομένων ινοβλαστική, αγγειακή, και κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος. Πρόσφατες έρευνες αποκάλυψαν ότι το στρώμα υποστηρίζει ΚΕΠ, [18], [22], [29] προωθεί εισβολής και της μετάστασης, καθώς και ταυτόχρονα χρησιμεύει ως ένα φυσικό εμπόδιο για την παράδοση των ναρκωτικών [21]. Ως εκ τούτου, σκαντζόχοιρος αναστολή της οδού, εκτός από την παροχή καλύτερης πρόσβασης των συστημικά χορηγούμενου φαρμάκου, μπορεί επίσης να καταργήσει την θέση CSC τα καθιστά πιο ευαίσθητα στις επιδράσεις της θεραπείας της μετφορμίνης και /ή γεμσιταβίνη. Μέλλον πιο εκτεταμένες μελέτες θα πρέπει να δείξει εάν η ανάπτυξη αντοχής μπορούν να προληφθούν αποτελεσματικά με αυτή την στρατηγική θεραπείας.

Μπορεί να υποστηριχθεί ότι οι συγκεντρώσεις μετφορμίνη χρησιμοποιείται σε

in vitro

μελέτες μας, έστω και ήδη σημαντικά χαμηλότερες από αυτές που χρησιμοποιούνται σε προηγούμενες μελέτες, εξακολουθούν να είναι μη επιτεύξιμη

in vivo

και, ως εκ τούτου άσχετο από μια μηχανιστική άποψη. Ωστόσο, είναι σημαντικό να σημειωθεί ότι η μετφορμίνη συσσωρεύεται στους ιστούς και ιδιαίτερα στα μιτοχόνδρια σε συγκεντρώσεις αρκετές φορές υψηλότερες από εκείνες που μετρήθηκαν στο αίμα [26]. Αυτό ισχύει ιδιαίτερα για τα κύτταρα που είναι εξοπλισμένα με τις αντίστοιχες σχετικές μεταφορείς για πρόσληψη μετφορμίνη, δηλαδή OCT1-3. Όπως δείχνουμε εδώ, PDAC κύτταρα εκφράζουν και τις τρεις ισομορφές, αλλά εμφανίζουν ιδιαίτερα υψηλή έκφραση του OCT1. Αν και είναι δύσκολο να εκτιμηθούν οι αληθινή ενδοκυτταρικές συγκεντρώσεις μετφορμίνης σε PDAC κύτταρα λόγω της μαζικής περιεχόμενο στρώμα και νεκρωτικές περιοχές σε συγκομίζονται όγκους, ανάλυση μας της συγκέντρωσης μετφορμίνης αποκάλυψαν υψηλότερες συγκεντρώσεις μετφορμίνης στον ιστό PDAC (10,8 mg /g ιστού) από στο ήπαρ (8,9 mg /g) και ακόμα περισσότερο αν η μετφορμίνη χορηγήθηκε σε συνδυασμό με τον αναστολέα smoothened SIBI-C1 (23,1 mg /g). Ως εκ τούτου, μας μηχανιστική

in vitro

μελέτες είναι όντως πολύ σημαντικά για το

in vivo

ρύθμιση.

Η μετφορμίνη φέρει ένα εξαιρετικό προφίλ ασφάλειας, καθώς μόνο ηπατοκύτταρα, αλλά όχι άλλες μη μετασχηματισμένα κύτταρα (βλαστικά) εκφράζουν Οκτώβριο για την αποτελεσματική κυτταρική πρόσληψη της μετφορμίνης. Αρκετές κλινικές μελέτες (NCT01210911, NCT01167738 και NCT01488552) εξετάζουν επί του παρόντος μετφορμίνη σε τοπικά προχωρημένο και μεταστατικό PDAC. Αυτό θα παράσχει ενδεχομένως μια οριστική εκτίμηση των κλινικών επιπτώσεων της μετφορμίνης σε PDAC. Θα ήταν ιδιαίτερα ενδιαφέρον το αν οι ασθενείς επίσης θα προχωρήσουν τελικά κατά τη διάρκεια της θεραπείας με μετφορμίνη και εάν αυτό θα μπορούσε να αξιολογηθεί ή /και προβλέπεται από την ανάλυση των κυκλοφορούντων κυττάρων καρκίνου (στέλεχος). υποψήφιους απομόνωσή τους κατά τη διάρκεια της υποτροπής μπορεί να παρέχει σημαντικές μηχανιστικές γνώσεις σχετικά με την αιτία της υποτροπής.

Υλικά και Μέθοδοι

δείγματα όγκων

Μετά την έγγραφη συγκατάθεση είχε ληφθεί από τους ασθενείς, περίσσεια ιστών από εκτομή του παγκρέατος καρκινώματα ήταν ξενομοσχεύτηκε στο Johns Hopkins Ιατρικών Ιδρυμάτων (Ηθική έγκριση του διοικητικού συμβουλίου: JHMIRB: 05-04-14-02 «Μελέτη σκοπιμότητας για την εξατομικευμένη θεραπεία των ασθενών με προχωρημένο καρκίνο του παγκρέατος») και το Νοσοκομείο de Madrid – Centro Integral Oncológico Clara Campal (FHM.06.10 «Ίδρυση τράπεζας για τους όγκους και τους υγιείς ιστούς σε ασθενείς με καρκίνο»), αντίστοιχα, σύμφωνα με τις αναφερόμενες Institutional Review Board-εγκεκριμένα πρωτόκολλα [30]. Εν συντομία, η περίσσεια ιστούς όγκων που δεν απαιτούνται για την κλινική διάγνωση κατά τη διάρκεια της ρουτίνας εκτομές Whipple εκτελείται από χειρουργούς που δεν συμμετείχαν στην παρούσα μελέτη στη συνέχεια εμφυτεύτηκαν σε ανοσοκατεσταλμένα ποντίκια. Όλες οι πληροφορίες ασθενούς έγινε ανώνυμα από την αφαίρεση οποιασδήποτε πληροφορίας, η οποία προσδιορίζει, ή θα μπορούσε να οδηγήσει στην ταυτοποίηση του ασθενούς. Κανένας από τους ασθενείς είχαν υποβληθεί σε εισαγωγική ακτινοβολία ή χημειοθεραπεία πριν από την εκτομή του όγκου.

Πρωτογενή ανθρώπινα κύτταρα PDAC

Για in vitro μελέτες, θραύσματα ιστού κιμά, ενζυματικώς πέψη με κολλαγενάση (Stem Cell Technologies, Vancouver, British Κολομβία) για 90 λεπτά στους 37 ° C [10] και μετά από φυγοκέντρηση για 5 λεπτά στις 1200 rpm τα σφαιρίδια επαναιωρήθηκαν και καλλιεργήθηκαν σε RPMI, 10% FBS και 50units /ml πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη. Για ορισμένα πειράματα, η ανθρώπινη κυτταρική σειρά PDAC L3.6pl χρησιμοποιήθηκε όπως περιγράφεται προηγουμένως [15].

Καρκίνος βλαστικών κυττάρων-εμπλουτισμού καλλιέργεια

PDAC σφαίρες παρήχθησαν και επεκτάθηκαν σε DMEM-F12 ( Invitrogen, Karlsruhe, Germany) συμπληρωμένο με Β-27 (Gibco, Καρλσρούη, Γερμανία) και bFGF (PeproTech ΕΚ, Λονδίνο, Ηνωμένο Βασίλειο). 10

3 κύτταρα /ml σπάρθηκαν σε πλάκες εξαιρετικά χαμηλής προσκόλλησης (Corning BV, Schiphol-Rijk, The Netherlands) όπως περιγράφηκε προηγουμένως [31] Μετά από 7 d επώασης, σφαίρες τυπικά & gt?. 75 μm μεγάλο με ~ 97% CD133high. Για σειριακό πέρασμα, 7-ημερών σφαίρες συλλέχθηκαν χρησιμοποιώντας 40 μm σουρωτήρια κυττάρων, διασπώνται σε μεμονωμένα κύτταρα με θρυψίνη, και στη συνέχεια εκ νέου καλλιεργούνται για 7 ημέρες.