Αφηρημένο

Ιστορικό

Η ρεσβερατρόλη, μια φυσική ένωση phytopolyphenol, έχει προσελκύσει εκτεταμένο ενδιαφέρον για τις πρόσφατες χρόνια λόγω των ποικίλων φαρμακολογικών χαρακτηριστικών του. Παρά το γεγονός ότι η ρεσβερατρόλη έχει χημειοπροληπτική ιδιότητες εναντίον αρκετών μορφών καρκίνου, οι μοριακοί μηχανισμοί με τους οποίους αυτό αναστέλλει την ανάπτυξη των κυττάρων και επάγει την απόπτωση δεν έχουν ακόμη κατανοηθεί πλήρως. Η παρούσα μελέτη διεξήχθη για να εξετάσει κατά πόσον μονοπατιού PI3K /AKT /FOXO διαμεσολαβεί τις βιολογικές επιδράσεις της ρεσβερατρόλης.

Μεθοδολογία /Κύρια Ευρήματα

Η ρεσβερατρόλη αναστέλλει τη φωσφορυλίωση της PI3K, ΑΚΤ και mTOR. Η ρεσβερατρόλη, αναστολείς ΡΙ3Κ (LY294002 και βορτμαννίνη) και αναστολέα της ΑΚΤ μόνος ελαφρώς επαγόμενη απόπτωση σε κύτταρα LNCaP. Αυτοί οι αναστολείς ενισχυθεί περαιτέρω το δυναμικό επαγωγής απόπτωσης της ρεσβερατρόλης. Η υπερέκφραση του άγριου τύπου ΡΤΕΝ ελαφρώς επαγόμενη απόπτωση. Άγρια ΡΤΕΝ τύπου και ΡΤΕΝ-G129E ενισχυμένη ρεσβερατρόλη απόπτωση, ενώ ΡΤΕΝ-G129R είχε καμία επίδραση στην προ-απόπτωσης της ρεσβερατρόλης. Επιπλέον, το δυναμικό επαγωγής απόπτωσης της ρεσβερατρόλης ενισχύθηκε με κυρίαρχο αρνητικό ΑΚΤ, και αναστέλλεται από άγριου τύπου ΑΚΤ και συστατικώς δραστική ΑΚΤ. Η ρεσβερατρόλη έχει καμία επίδραση στην έκφραση του FKHR, FKHRL1 και AFX γονίδια. Η αναστολή της φωσφορυλίωσης FOXO με ρεσβερατρόλη οδήγησε στην πυρηνική μετατόπιση της δέσμευσης του DNA και μεταγραφική δραστηριότητα. Η αναστολή της ΡΙ3Κ /ΑΚΤ οδού μεταγραφική δραστικότητα που επάγεται FOXO καταλήγοντας σε επαγωγή Bim, TRAIL, ρ27

/KIP1, DR4 και DR5, και η αναστολή της κυκλίνης D1. Ομοίως, η ρεσβερατρόλη που προκαλείται FOXO μεταγραφική δραστηριότητα ενισχύθηκε περαιτέρω κατά την ενεργοποίηση της PI3K μονοπατιού /AKT ήταν αποκλεισμένη. Υπερ-έκφραση του ανεπάρκεια φωσφορυλίωσης των πρωτεϊνών μεταλλακτών FOXO (FOXO1-ΤΜ, FOXO3a-ΤΜ και FOXO4-TM) που επάγεται FOXO μεταγραφική δραστηριότητα, η οποία ενισχύεται περαιτέρω από ρεσβερατρόλη. Αναστολή παραγόντων μεταγραφής FOXO από shRNA μπλοκάρει ρεσβερατρόλη επαγόμενη προς τα πάνω ρύθμιση του Bim, TRAIL, DR4, DR5, ρ27

/KIP1 και απόπτωση, και αναστολή της κυκλίνης D1 με ρεσβερατρόλη.

Συμπέρασμα /Σημασία

Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι οι παράγοντες μεταγραφής FOXO μεσολαβούν αντι-πολλαπλασιαστική και προ-αποπτωτικά αποτελέσματα της ρεσβερατρόλης, εν μέρει λόγω της ενεργοποίησης της εξωγενούς οδού της απόπτωσης

Παράθεση:. Chen Q, Ganapathy S, Singh KP, Shankar S, Srivastava RK (2010) ρεσβερατρόλη προκαλεί διακοπή της ανάπτυξης και την απόπτωση μέσω της ενεργοποίησης των Παράγοντες FOXO μεταγραφής στα κύτταρα του καρκίνου του προστάτη. PLoS ONE 5 (12): e15288. doi: 10.1371 /journal.pone.0015288

Επιμέλεια: Irina Λεμπέντεβα, Enzo ζωή Βιοεπιστημών, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 1 του Σεπτέμβρη του 2010? Αποδεκτές: 4 Νοεμβρίου, 2010? Δημοσιεύθηκε: 14 Δεκέμβρη του 2010

Copyright: © 2010 Chen et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Το έργο υποστηρίχθηκε από μια επιχορήγηση (NIH R01CA114469 να RKS) από τα Εθνικά Ινστιτούτα Υγείας (www.nih.gov). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ο καρκίνος του προστάτη, μια από τις πιο κοινές νεοπλάσματα στον δυτικό κόσμο, προκύπτει μέσω της προοδευτικής ανάπτυξης ενός ή περισσοτέρων προ νεοπλασματικές αλλοιώσεις σε αδενοκαρκίνωμα, και στη συνέχεια σε μεταστατική νόσο [1]. Οι πρόσφατες εξελίξεις έχουν εντοπίσει βασικές γενετικές αλλαγές που μπορεί να ξεκινήσει καρκινογένεση του προστάτη, και να ενισχύσει την πιθανότητα της εξέλιξης του καρκίνου. Ο καρκίνος του προστάτη κύτταρα είναι μόνο μετρίως ανταποκρίνονται ή ακόμη και αδιάφορα στην κυτταροτοξική δράση των χημειοθεραπευτικών παραγόντων ή ακτινοθεραπεία. Αυξημένες συγκεντρώσεις κυτταροτοξικών φαρμάκων και υψηλότερες δόσεις ακτινοβολίας αποτυγχάνουν να βελτιώσουν την απόκριση στη θεραπεία και οδηγεί σε αντίσταση στην απόπτωση σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη. Έτσι, είναι επιτακτικό να προσδιοριστούν αντικαρκινικοί παράγοντες που είναι μη τοξικά και άκρως αποτελεσματική στην επαγωγή της απόπτωσης κατά προτίμηση σε κύτταρα όγκου.

Επιδημιολογικά δεδομένα υποστηρίζουν την ιδέα ότι φυσικώς ενυπάρχουσες ενώσεις στη διατροφή του ανθρώπου μπορεί να στερείται τοξικότητας και έχουν μακρά διαρκή ευεργετικές επιδράσεις στην υγεία του ανθρώπου. Η ρεσβερατρόλη έχει αποδειχθεί ότι εμφανίζουν αρκετά δυνητικά χημειοπροστατευτικής δραστηριότητες σε μοντέλα κυττάρου και ζώου [2], [3], [4], [5], [6], [7], [8], [9], περιλαμβανομένης της αναστολής της ΡΙ3Κ /ΑΚΤ οδού [2], [6], [8], [10]. Έχουμε αποδείξει προσφάτως ότι resveratol ενισχύει το θεραπευτικό δυναμικό του TRAIL με προς τα πάνω ρύθμιση υποδοχέων θανάτου (TRAIL /DR4 και TRAIL-R2 /DR5) και επίσης εμπλέκεται μιτοχονδριακής μονοπάτι της απόπτωσης [2], [3]. Εξάλειψη ή μετάλλαξη του PTEN υπήρξε η κύρια αιτία για το μόνιμα ενεργό ΑΚΤ οδηγεί σε καρκινογένεση προστάτη στους ανθρώπους [11], [12]. Έτσι, η ρεσβερατρόλη μπορεί να είναι δυνητικά υποψήφιες για στόχευση κυττάρων με διαγραφή PTEN ή αδρανοποίηση και αυξημένη δραστηριότητα της ΑΚΤ σε προκαρκινικές προστατικό ιστό.

σηματοδότησης ΡΙ3Κ διαδραματίζει κεντρικό ρόλο στην ενδοκυττάρια μονοπάτια μεταγωγής σήματος που εμπλέκονται στον κυτταρικό μετασχηματισμό, την ανάπτυξη των κυττάρων, και ογκογένεση. Η απενεργοποίηση του ΑΚΤ καταλήγει σε αποφωσφορυλίωση και ενεργοποίηση των παραγόντων μεταγραφής FOXO, αναφέρθηκε ότι διαμεσολαβούν διακοπή του κυτταρικού κύκλου, την επιδιόρθωση του DNA, και η απόπτωση [13], [14]. Αυτοί οι παράγοντες μεταγραφής, ανήκουν στην «O ‘υποομάδα /forkhead οικογένειας μεταγραφή παράγοντα φτερωτό-έλικα, αποτελείται κυρίως από τέσσερα μέλη FOXO1, FOXO3a, FOXO4 και FOXO6 [15]. πρωτεΐνες FOXO είναι εξελικτικά συντηρημένες μεταγραφικών παραγόντων που εμπλέκονται σε διάφορες βασικές κυτταρικές λειτουργίες, λειτουργώντας ως καταληκτικό σημείο για την μεταγραφική προγράμματα που εμπλέκονται στην απόπτωση, αντίδραση στο στρες και τη μακροζωία [16], [17], [18], [19], [20]. Κατάργηση της λειτουργίας FOXO συχνά παρατηρείται στον καρκίνο του ανθρώπου [17], [21], ως εκ τούτου, οι μηχανισμοί ρύθμισης των πρωτεϊνών FOXO λαμβάνουν όλο και μεγαλύτερη προσοχή στην έρευνα για τον καρκίνο. Οι πρωτεΐνες FOXO ενσωματωθούν ρυθμιστικά εισόδους από μια ποικιλία από οδούς σηματοδότησης ανάντη, το σημαντικότερο σε απόκριση σε παράγοντα ανάπτυξης και το άγχος σηματοδότηση [17], [21]. Πρόσφατα, οι παράγοντες FOXO καθιερωθεί ως καταστολείς όγκων, προάγοντας την μεταγραφή των προ-αποπτωτικών μορίων όπως FasL και Bim όταν η οδός ΡΙ3Κ /ΑΚΤ ρυθμίζεται προς τα κάτω λόγω της θρεπτικής ή ασιτία ορού και κυτταρικό στρες [22] [23], [24, ]. Τρίκλινο μοντέλα νοκ-άουτ το ποντίκι αποδειχθεί τις ιδιότητες καταστολής του όγκου των FOXOs, όπως ποντίκια ταυτόχρονα στερούνται τα βασικά μέλη της FOXO υποοικογένεια των θηλαστικών, FOXO1, FOXO3a και FOXO4, είναι επιρρεπείς στην ανάπτυξη αιμαγγειώματα και λεμφοϋπερπλαστικές νόσους [25]. Αντίθετα, το άτομο ή σε συνδυασμό αδρανοποίηση των FOXO1, FOXO3a ή FOXO4 οδήγησε σε λιγότερο σοβαρό φαινότυπο, υποστηρίζοντας την ιδέα των λειτουργικών απολύσεων αυτών των παραγόντων FOXO [25]. Επιπλέον, η αναγκαστική έκφραση FOXO έχει αποδειχθεί ότι αναστέλλουν την ογκογένεση σε μοντέλα ξενομοσχεύματος σε γυμνά ποντίκια [26], [27], [28], [29], [30], [31], [32]. Ως εκ τούτου, η επανενεργοποίηση του FOXO με βάση όγκου ιδιότητες καταπιεστής του θεωρείται ως μια πολύ ελκυστική στρατηγική για την καταπολέμηση του καρκίνου. Δεδομένου ότι οι πρωτεΐνες FOXO έχουν αναφερθεί να είναι κρίσιμη μεσολαβητές απόπτωσης που προκαλείται από αντικαρκινικά φάρμακα, θα διατυπωθεί η άποψη ότι η έκφραση FOXO ή μεταγραφική δραστηριότητα θα μπορούσε να είναι σημαντικό γεγονός στη διαμεσολάβηση τις επιπτώσεις της ρεσβερατρόλης.

Οι στόχοι της μελέτης μας ήταν να εξεταστεί η επιδράσεις PI3K /AKT οδό για τη ρύθμιση των παραγόντων μεταγραφής FOXO και το γονίδιο-στόχο τα προϊόντα τους, και να εκτιμήσει κατά πόσον μονοπατιού PI3K /AKT /FOXO ρυθμίζει αντι-πολλαπλασιαστικές επιδράσεις της ρεσβερατρόλης σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη. Τα στοιχεία μας έδειξαν ότι η αναστολή της ΡΙ3Κ μονοπατιού /ΑΚΤ ενισχυμένη FOXO δέσμευσης DNA και μεταγραφική δραστικότητα, με αποτέλεσμα τη ρύθμιση των γονιδιακών προϊόντων της (TRAIL, DR4, DR5, Bim, ρ27

/KIP1 και κυκλίνη D1). Αναστολή της PI3K /AKT οδό ή υπερέκφραση FKHR, FKHRL1 και AFX ενισχυμένη FOXO μεταγραφική δραστηριότητα ρεσβερατρόλη που προκαλείται. Σε αντίθεση, η αναστολή της FKHR, FKHRL1 ή AFX μπλοκαριστεί ρεσβερατρόλη επαγόμενη έκφραση του TRAIL, DR4, DR5, Bim και ρ27, και ανέστειλε την έκφραση της κυκλίνης D1. Αυτά τα στοιχεία υποδηλώνουν ότι η ρεσβερατρόλη προκαλεί απόπτωση και διακοπή της ανάπτυξης μέσω της ενεργοποίησης των μεταγραφικών παραγόντων FOXO, και η αναστολή των PI3K οδού /AKT ενεργοποιεί παράγοντες μεταγραφής FOXO και ενισχύει περαιτέρω αντιπολλαπλασιαστική και προ-απόπτωσης της ρεσβερατρόλης.

Αποτελέσματα

αναστολή της ΡΙ3Κ μονοπατιού /ΑΚΤ ενισχύει ρεσβερατρόλη απόπτωση σε καρκινικά κύτταρα του προστάτη

Εξετάσαμε πρώτα τα αποτελέσματα της φαρμακολογικής αναστολής της ΑΚΤ με LY294002, βορτμαννίνη ή αναστολέα ΑΚΤ σε ρεσβερατρόλη απόπτωση σε κύτταρα LNCaP (Σχ. 1Α). Η ρεσβερατρόλη επήγαγε απόπτωση σε κύτταρα LNCaP. Ομοίως, LY294002, Wortmannin ή ΑΚΤ αναστολέα ελαφρώς αλλά σημαντικά απόπτωση. Η προεπεξεργασία των LNCaP κυττάρων με LY294002, βορτμαννίνη ή αναστολέα της ΑΚΤ σημαντικά ενισχυμένη ρεσβερατρόλη απόπτωση στις 48 ώρες. Αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι η αναστολή της δραστηριότητας /ΑΚΤ ΡΙ3Κ με φαρμακολογική προσέγγιση ενισχυμένη ρεσβερατρόλη απόπτωση.

(Α), κύτταρα LNCaP προκατεργάστηκαν με LY294002 (1 μΜ), βορτμαννίνη (1 μΜ) ή αναστολέα ΑΚΤ (100 ηΜ) για 2 ώρες, ακολουθούμενη από επεξεργασία με ρεσβερατρόλη (20 μΜ) για 48 ώρες. Στο τέλος της περιόδου επώασης, τα κύτταρα συλλέχθηκαν και η απόπτωση μετρήθηκε με δοκιμασία TUNEL. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν μέση τιμή ± SE. *, # Και ** = σημαντικά διαφορετική από την αντίστοιχη του ελέγχου (P , $ και ** = σημαντικά διαφορετικό από τον έλεγχο, η P & lt? 0,05. (D), η φωσφορυλίωση ανεπαρκών μεταλλακτών από FOXO ενισχύσει FOXO μεταγραφική δραστικότητα ρεσβερατρόλη που προκαλείται. LNCaP κύτταρα επιμολύνθηκαν παροδικά με κενό φορέα ή κατασκευάσματα που κωδικοποιούν FOXO1-ΤΜ, FOXO3a-ΤΜ, ή FOXO4-ΤΜ μαζί με 6Χ DBE-λουσιφεράσης και ρΡΙ_-ΤΚ πλασμίδια για 24 ώρες. Μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα πλύθηκαν, υποβλήθηκε σε επεξεργασία με ρεσβερατρόλη (20 μΜ) για 24 ώρες, και συλλέχθηκαν για προσδιορισμούς λουσιφεράσης πυγολαμπίδας /Renilla χρησιμοποιώντας το Dual-Luciferase Assay System Reporter (Promega). μετρήσεις λουσιφεράσης ομαλοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας το

Renilla

λουσιφεράσης έλεγχος επιμόλυνσης. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν τον μέσο όρο ± S.D. * Και ** = σημαντικά διαφορετικό από τον έλεγχο, η P & lt?. 0.05

Η

Εξετάσαμε δίπλα τα αποτελέσματα της AKT σχετικά με ρεσβερατρόλη που προκαλείται δραστηριότητα FOXO στα κύτταρα LNCaP (Σχήμα 3Β.). Η δραστηριότητα ΑΚΤ διεπόταν από άγριου τύπου ΑΚΤ (WT-ΑΚΤ), ουσιαστικά δραστική ΑΚΤ (CA-ΑΚΤ) και κυρίαρχο αρνητικό ΑΚΤ (DN-ΑΚΤ). LNCaP κύτταρα επιμολύνθηκαν παροδικά με κενό φορέα, WT-ΑΚΤ, CA-ΑΚΤ ή DN-ΑΚΤ και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με ή χωρίς ρεσβερατρόλη (20 μΜ). Η επιμόλυνση των κυττάρων LNCaP με κενό φορέα, WT-ΑΚΤ, ή CA-ΑΚΤ είχε καμία επίδραση στην FOXO μεταγραφική δραστηριότητα. Συγκριτικά, η επιμόλυνση των κυττάρων με DN-ΑΚΤ επάγεται σημαντική FOXO μεταγραφική δραστηριότητα. Η ρεσβερατρόλη επαγόμενη FOXO μεταγραφική δραστικότητα σε κύτταρα επιμολυσμένα με άδειο φορέα. Η υπερέκφραση του WT-AKT ή CA-ΑΚΤ στα κύτταρα LNCaP ανέστειλε FOXO μεταγραφική δραστηριότητα ρεσβερατρόλη που προκαλείται. Είναι ενδιαφέρον ότι, η υπερέκφραση του DN-ΑΚΤ ενισχυμένη FOXO μεταγραφική δραστικότητα ρεσβερατρόλη που προκαλείται. Συνολικά, αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι η αναστολή της δράσης της ΑΚΤ με γενετική προσέγγιση ενισχύει FOXO μεταγραφική δραστικότητα ρεσβερατρόλη που προκαλείται σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη.

Δεδομένου ότι τα κύτταρα LNCaP εκφράζουν μεταλλαγμένο ΡΤΕΝ με αποτέλεσμα συστατική ενεργοποίηση της ΑΚΤ, επιδιώξαμε να εξετάσει το ρόλο του ΡΤΕΝ επί FOXO μεταγραφική δραστικότητα ρεσβερατρόλη που προκαλείται (Εικ. 3C). LNCaP κύτταρα επιμολύνθηκαν με άδειο φορέα ή πλασμίδιο που εκφράζει άγριου τύπου ΡΤΕΝ, ΡΤΕΝ-G129E, ή ΡΤΕΝ-G129R και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με ή χωρίς ρεσβερατρόλη. PTEN-WT ελαφρά επαγόμενη FOXO μεταγραφική δραστηριότητα. Η ρεσβερατρόλη επαγόμενη FOXO μεταγραφική δραστικότητα σε κύτταρα LNCaP επιμολυσμένα με άδειο φορέα. Επιμόλυνση των LNCaP κυττάρων με άγριου τύπου PTEN ή PTEN-G129E ενισχυθεί σημαντικά FOXO μεταγραφική δραστηριότητα ρεσβερατρόλη που προκαλείται. Συγκριτικά, η υπερέκφραση του ΡΤΕΝ-G129R σε κύτταρα LNCaP είχε FOXO μεταγραφική δραστικότητα παρόμοια με εκείνη του LNCaP κενά κύτταρα επεξεργασμένα ρεσβερατρόλης /φορέα. Αυτά τα δεδομένα προτείνουν ότι η αναστολή της δραστικότητας ΑΚΤ από υπερέκφραση του ΡΤΕΝ ενισχύει FOXO μεταγραφική δραστηριότητα.

επόμενο εξετάστηκε αν η ρεσβερατρόλη προκαλεί μεταγραφική ενεργοποίηση του FOXO παρουσία ή απουσία FOXO1-ΤΜ, FOXO3a-ΤΜ, ή FOXO4- TM (φωσφορυλίωση ανεπάρκεια τριπλή μετάλλαξη) (Σχ. 3D). LNCaP κύτταρα επιμολύνθηκαν με κατασκεύασμα ανταποκριτού p6xDBE-λουσιφεράσης με την παρουσία ή απουσία πλασμιδίων που εκφράζουν FOXO1-ΤΜ, FOXO3a-ΤΜ, ή FOXO4-ΤΜ. Μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ρεσβερατρόλη για 24 ώρες, και η δραστικότητα λουσιφεράσης μετρήθηκε. Η επιμόλυνση των κυττάρων με πλασμίδια που εκφράζουν FOXO1-ΤΜ, FOXO3a-ΤΜ, ή FOXO4-ΤΜ επαγόμενη FOXO μεταγραφική δραστικότητα σε σύγκριση με τον κενό φορέα (έλεγχος). δραστηριότητα FOXO μεταγραφική ρεσβερατρόλη που προκαλείται ενισχύθηκε περαιτέρω με την παρουσία ανεπάρκεια φωσφορυλίωσης μεταλλάξεις του FOXO1, FOXO3a και FOXO4. Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι η ενεργοποίηση της μεταγραφής FOXO παραγόντων ενισχύει περαιτέρω FOXO μεταγραφική δραστικότητα ρεσβερατρόλη που προκαλείται.

Αναστολή της ΡΙ3Κ μονοπατιού /ΑΚΤ ρυθμίζει Bim, ρ27

/Kip1, κυκλίνη D1, TRAIL, TRAIL-R1 /DR4 και TRAIL-R2 /DR5

στη συνέχεια εξετάσαμε την επίδραση της αναστολής της PI3K οδού /AKT σχετικά με την έκφραση της Bim, p27

/Kip1, κυκλίνη D1, TRAIL, TRAIL-R1 /DR4 και TRAIL-R2 /DR5. Αυτά τα γονίδια είναι άμεσοι στόχοι του μεταγραφικού παράγοντα FOXO. LNCaP κύτταρα προκατεργάστηκαν με LY-294002 ή αναστολέα της ΑΚΤ IV ακολουθούμενη από επεξεργασία με ρεσβερατρόλη για 24 ώρες, και η έκφραση του Bim, ρ27, κυκλίνη D1, TRAIL, DR4 και DR5 μετρήθηκε με κηλίδωση Western (Εικ. 4). LY-294002 και ΑΚΤ IV αναστολέα προκάλεσε την έκφραση του Bim, ρ27

/Kip1, TRAIL, DR4 και DR5, και ανέστειλε την έκφραση της κυκλίνης D1. Θεραπεία του κυττάρου με ρεσβερατρόλη ενισχυθεί περαιτέρω τις επιπτώσεις της LY-294002 ή ΑΚΤ IV αναστολέα για την έκφραση του Bim, TRAIL, DR4 και DR5. Ωστόσο, ο συνδυασμός της LY-294002 ή ΑΚΤ αναστολέα IV με ρεσβερατρόλη είχε καμία περαιτέρω επίδραση στην έκφραση του p27

/KIP1 και κυκλίνης D1. Αυτά τα δεδομένα προτείνουν ότι η αναστολή της ΡΙ3Κ μονοπατιού /ΑΚΤ μπορεί να ρυθμίζει την έκφραση του Bim, ρ27

/Kip1, κυκλίνη D1, TRAIL, DR4 και DR5, οι οποίες είναι μεταγραφική στόχοι FOXO. Resverarol μπορεί επίσης να ρυθμίζουν την έκφραση αυτών των FOXO μεταγραφικής στόχους.

LNCaP κύτταρα προκατεργάστηκαν με LY294002 (10 μΜ) ή αναστολέα ΑΚΤ (ΑΚΤ-Ι, 1 μΜ) για 2 ώρες και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με ή χωρίς ρεσβερατρόλη (20 μΜ) για 48 ώρες. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν για να μετρηθεί η έκφραση του Bim, p27

/KIP1, κυκλίνη D1, TRAIL, DR4 και DR5 με ανάλυση κηλίδας theWestern. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης.

Η

Αναστολή της έκφρασης FOXO με shRNA αναστέλλει τις αντιπολλαπλασιαστικές επιδράσεις της ρεσβερατρόλης και μπλοκάρει κασπάσης-3 δραστικότητα ρεσβερατρόλη επαγόμενη απόπτωση και

Εάν η ρεσβερατρόλη επάγει την απόπτωση μέσω της ενεργοποίησης του μεταγραφικού παράγοντα FOXO, η αναστολή των πρωτεϊνών FOXO πρέπει να δεσμεύσουν τις αντι-πολλαπλασιαστικές επιδράσεις της ρεσβερατρόλης. LNCaP κύτταρα επιμολύνθηκαν με shRNA εκφράζουν FKHR, FKHRL1 ή AFX και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με ρεσβερατρόλη (Εικ. 5). Η ρεσβερατρόλη επήγαγε απόπτωση σε LNCaP /FKHR κωδικοποιημένα, LNCaP /FKHRL1 κωδικοποιημένα και LNCaP /AFX κωδικοποιημένα κυττάρων με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο (εικ. 5Α). Αναστολή της FKHR, FKHRL1 ή AFX με shRNA μπλοκάρει αντι-πολλαπλασιαστικά αποτελέσματα της ρεσβερατρόλης. Αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι η ρεσβερατρόλη αναστέλλει τη βιωσιμότητα των κυττάρων μέσω της ρύθμισης των παραγόντων μεταγραφής FOXO.

(Α), η αναστολή του παράγοντα μεταγραφής FOXO από shRNA μπλοκ αντι-πολλαπλασιαστικά αποτελέσματα της ρεσβερατρόλης. LNCaP κύτταρα επιμολύνθηκαν παροδικά με πλασμίδια που εκφράζουν FKHR shRNA, FKHRL1 shRNA, AFX shRNA ή αντίστοιχων κωδικοποιημένο ελέγχου και θεραπείας με ρεσβερατρόλη (20 μΜ) για 48 ώρες και μετρήθηκε η βιωσιμότητα των κυττάρων. (Β), η αναστολή των παραγόντων μεταγραφής FOXO ή ROS (αντιδραστικά είδη οξυγόνου) από την NAC μπλοκ ρεσβερατρόλη απόπτωση. LNCaP κύτταρα επιμολύνθηκαν με ένα μίγμα πλασμιδίων που εκφράζουν FKHR shRNA, FKHRL1 shRNA συν AFX shRNA ή ομελέτα ελέγχου. Μετά τη διαμόλυνση, το μέσο καλλιέργειας αλλάχθηκε και τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε προεπεξεργασία με NAC για 2 ώρες, και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με ρεσβερατρόλη (20 μΜ) για 48 ώρες. Στο τέλος της περιόδου επώασης, η απόπτωση μετρήθηκε με δοκιμασία TUNEL. (C), η αναστολή των παραγόντων μεταγραφής FOXO ή ROS από την NAC μπλοκ ρεσβερατρόλη επαγόμενη δραστικότητα κασπάσης-3. LNCaP κύτταρα επιμολύνθηκαν με ένα μίγμα πλασμιδίων που εκφράζουν FKHR shRNA, FKHRL1 shRNA συν AFX shRNA ή ομελέτα ελέγχου. Μετά τη διαμόλυνση, το μέσο καλλιέργειας αλλάχθηκε και τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε προεπεξεργασία με NAC για 2 ώρες, και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με ρεσβερατρόλη (20 μΜ) για 48 ώρες. Στο τέλος της περιόδου επώασης, η δραστικότητα κασπάσης-3 μετρήθηκε σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

Η

επόμενο επεδίωξε να εξετάσει κατά πόσον η αναστολή της κασπάσης-3 δραστικότητα ρεσβερατρόλη που προκαλείται από επίδραση έκφραση FOXO και την απόπτωση (Σχ . 5Β και C). Η ρεσβερατρόλη επαγόμενη δραστικότητα της κασπάσης-3 και απόπτωσης σε LNCaP /κωδικοποιημένα κύτταρα. Προεπεξεργασία των LNCaP /κωδικοποιημένα κυττάρων με NAC παρεμπόδισε δραστικότητα ρεσβερατρόλη επαγόμενη κασπάσης-3 και την απόπτωση. Η αναστολή της έκφρασης FOXO με shRNA ανέστειλαν ρεσβερατρόλη επαγόμενη δραστικότητα της κασπάσης-3 και την απόπτωση. Είναι ενδιαφέρον, προεπεξεργασία των LNCaP /κυττάρων FOXO shRNA με NAC μπλοκάρει δράση της ρεσβερατρόλης που προκαλείται κασπάσης-3 και την απόπτωση. Αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι η επαγόμενη από ρεσβερατρόλη δραστικότητα της κασπάσης-3 και απόπτωση μέσω παραγωγή ROS, και η αναστολή της FOXO (FKHR, FKHRL1 και AFX) αναστέλλει κασπάσης-3 δραστικότητα και την απόπτωση.

Κανονισμός του Bim, TRAIL, DR4, DR5, p27

/Kip1 και κυκλίνης D1 από τα γονίδια FOXO (FKHR, FKHRL1 και AFX)

μεταγραφικών παραγόντων FOXO έχει αποδειχθεί ότι ρυθμίζει γονίδια που συνδέονται με τον κύκλο της απόπτωσης και κυττάρων [14], [34]. Δεδομένου ότι η ρεσβερατρόλη ρυθμίζεται η έκφραση της Bim, TRAIL, DR4, DR5, p27

/Kip1 και κυκλίνη D1, επιδιώξαμε να εξετάσει κατά πόσον αυτές οι επιδράσεις της ρεσβερατρόλης μεσολάβηση παραγόντων μεταγραφής FOXO που ανεστάλησαν από shRNA (Εικ. 6). Η ρεσβερατρόλη επήγαγε την έκφραση του Bim (ΒΙΜ

EL, Bim

L και ΒΙΜ

S), TRAIL, DR4, DR5 και ρ27

/Kip1, και ανέστειλε την έκφραση της κυκλίνης D1 σε LNCaP /περιπλεγμένο κύτταρα. Αναστολή της FKHR, FKHRL1 ή AFX από shRNA εξασθενημένο ρεσβερατρόλη που προκαλείται Bim, TRAIL, DR4, DR5 και ρ27

/έκφραση Kip1. Συγκριτικά, η αναστολή της FKHR, FKHRL1 ή AFX με shRNA εξασθενημένο ελαφρώς τις ανασταλτικές επιδράσεις της ρεσβερατρόλης επί της έκφρασης κυκλίνης D1. Αυτά τα στοιχεία υποδηλώνουν ότι η ρεσβερατρόλη μπορεί να ρυθμίσει την απόπτωση (Bim, TRAIL, DR4 και DR5) και γονίδια που συνδέονται με τον κύκλο των κυττάρων (p27

/Kip1, και κυκλίνη D1) μέσω μεταγραφικών παραγόντων FOXO. Είναι ενδιαφέρον ότι, η επαγωγή του TRAIL και των υποδοχέων του DR4 και DR5 με ρεσβερατρόλη θα έχει ως αποτέλεσμα την ενεργοποίηση του εξωγενούς οδού της απόπτωσης.

(Α), κύτταρα LNCaP μορφομετατράπηκαν με πλασμίδια που εκφράζουν FKHR shRNA ή ομελέτα ελέγχου. Μετά τη διαμόλυνση, το μέσο καλλιέργειας αλλάχθηκε και τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ρεσβερατρόλη (0-20 μΜ) για 48 ώρες. Στο τέλος της περιόδου επώασης, τα κύτταρα συλλέχθηκαν για να μετρηθεί η έκφραση του Bim, TRAIL, DR4, DR5, ρ27 και την κυκλίνη D1 με ανάλυση κηλίδος Western. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. (Β), κύτταρα LNCaP μορφομετατράπηκαν με πλασμίδια που εκφράζουν FKHRL1 shRNA ή ομελέτα ελέγχου. Μετά τη διαμόλυνση, το μέσο καλλιέργειας αλλάχθηκε και τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ρεσβερατρόλη (0-20 μΜ) για 48 ώρες. Στο τέλος της περιόδου επώασης, τα κύτταρα συλλέχθηκαν για να μετρηθεί η έκφραση του Bim, TRAIL, DR4, DR5, ρ27 και την κυκλίνη D1 με ανάλυση κηλίδος Western. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. (C), κύτταρα LNCaP μορφομετατράπηκαν με πλασμίδια που εκφράζουν AFX shRNA ή ομελέτα ελέγχου. Μετά τη διαμόλυνση, το μέσο καλλιέργειας αλλάχθηκε και τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ρεσβερατρόλη (0-20 μΜ) για 48 ώρες.