Αφηρημένο

Εισαγωγή

Μη επεμβατική δοκιμή μετάλλαξης χρησιμοποιώντας κυκλοφορούν DNA του όγκου (ctDNA) είναι μια ελκυστική υπόθεση. Αυτό θα μπορούσε να επιτρέψει ασθενείς χωρίς διαθέσιμο δείγμα όγκου για να αποκτήσετε πρόσβαση σε περισσότερες επιλογές θεραπείας

Υλικά & amp.? Μέθοδοι

περιφερικού αίματος και να συνδυαστούν οι όγκοι αναλύθηκαν από 45 ασθενείς με ΜΜΚΠ. Ερευνήσαμε την επίδραση των προ-αναλυτικών μεταβλητών στην απόδοση DNA και /ή

KRAS

ανίχνευση μεταλλάξεων:. Δείγματος τύπου σωλήνα συλλογής, χρόνος επώασης, τα βήματα φυγοκέντρησης, είσοδος πλάσμα όγκο και την εκχύλιση του DNA κιτ

αποτελέσματα

χρόνος επώασης

2 ώρες και διπλή φυγοκέντρηση πλάσματος (2000 xg) μειωμένη συνολική απόδοση DNA με αποτέλεσμα μειωμένα επίπεδα του μολυσματικού γονιδιακού DNA (gDNA). Μειωμένη «μόλυνση» και την αυξημένη

KRAS

ανίχνευση μετάλλαξης παρατηρήθηκε χρησιμοποιώντας ελεύθερα κυττάρων DNA σωλήνες συλλογής αίματος (cfDNA BCT) (Streck), μετά από 72 ώρες μετά από μετάγγιση αίματος κλήρωση σε σύγκριση με σωλήνες EDTA. ο όγκος των εισροών του πλάσματος και χρήση διαφορετικών σετ εκχύλισης DNA επηρέασε απόδοση DNA.

Συμπέρασμα

Αυτή η μελέτη έδειξε ότι η επιτυχής ανάκτηση ctDNA για την ανίχνευση μεταλλάξεων σε NSCLC εξαρτάται από την προ-αναλυτικά βήματα. Ανάπτυξη τυποποιημένων μεθόδων για την ανίχνευση των

KRAS

μεταλλάξεις από δείγματα ctDNA συνιστάται για την ελαχιστοποίηση των επιπτώσεων της προ-αναλυτικά βήματα σχετικά με τα ποσοστά ανίχνευσης μετάλλαξης. Όπου η ταχεία επεξεργασία των δειγμάτων δεν είναι δυνατή η χρήση των cfDNA BCT σωλήνες θα ήταν επωφελής

Παράθεση:. Sherwood JL, Corcoran C, Μπράουν Η, Sharpe μ.Χ., Μουσίλοβα Μ, Kohlmann Α (2016) Βελτιστοποιημένη Προ-Αναλυτικές μέθοδοι βελτιώσει

KRAS

Μετάλλαξη ανίχνευση των κυκλοφορούντων όγκων DNA (ctDNA) από ασθενείς με μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC). PLoS ONE 11 (2): e0150197. doi: 10.1371 /journal.pone.0150197

Επιμέλεια: Javier Σ Castresana, Πανεπιστήμιο της Ναβάρα, Ισπανία

Ελήφθη: 24 Δεκεμβρίου 2015? Αποδεκτές: 10 του Φλεβάρη του 2016? Δημοσιεύθηκε: 26 Φλεβάρη 2016

Copyright: © 2016 Sherwood et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Όλη η δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. το έργο αυτό χρηματοδοτήθηκε από την AstraZeneca. Ο χρηματοδότης παρέχεται στήριξη με τη μορφή των μισθών για όλους τους συγγραφείς, αλλά δεν έχουν κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή ή την ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συντάκτες: JLS, CC, ΗΒ, AS, MM και ΑΚ είναι υπάλληλοι και κατέχουν μετοχές της AstraZeneca, του οποίου η εταιρεία που χρηματοδοτούνται αυτή τη μελέτη. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων να PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

Η ανάγκη για ακριβή ανίχνευση μετάλλαξης από μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC) καρκινικός ιστός έχει καθιερωθεί, μαζί με την ανάγκη για τον εντοπισμό πιθανών ανταποκρίθηκαν σε εξατομικευμένες φάρμακα όπως οι αναστολείς κινάσης τυροσίνης (ΤΚΙδ)? π.χ.

EGFR

TKIs, erlotinib, το gefitinib και το Τ790Μ κατευθύνεται ΤΚΙ osimertinib) [1]. Ωστόσο, αξιολογήθηκαν καρκινικός ιστός δεν είναι πάντα διαθέσιμη για τους ασθενείς με NSCLC [2]. Για παράδειγμα, στη μελέτη πρόσφατη Iressa τα μέτρα παρακολούθησης (IFUM), η κατάσταση μετάλλαξης του όγκου δεν ήταν σε θέση να καθορίζεται στο 19% των επιλέξιμων ασθενών [3]. Στο Ηνωμένο Βασίλειο μόνο το 71% των ασθενών με καρκίνο του πνεύμονα έχουν μια ιστολογική επιβεβαίωση της νόσου τους [4].

Λόγω της έλλειψης διαθεσιμότητα κατάλληλων δειγμάτων ιστού, που κυκλοφορεί το DNA του όγκου (ctDNA) γίνεται ολοένα και πιο σημαντική, καθώς αποτελεί εναλλακτική πηγή για την ανίχνευση της προσφυγής μεταλλάξεων [5]. θα υπάρξει μεγαλύτερη ζήτηση για δοκιμές βιοδεικτών σε δείγματα κυρίως στον καρκίνο του πνεύμονα, όπου πιο στοχευμένη φάρμακα βρίσκονται σε εξέλιξη [6], όπως οι αναστολείς ΜΕΚ 1/2? selumetinib [7], cobimetinib (GDC-0973, XL-518) και trametinib και η Τ790Μ κατευθύνεται EGFR TKIs, osimertinib (AZD9291) [8] και rociletinib (CO-1686) [9]. δοκιμή μετάλλαξης του πλάσματος προσφέρει επίσης μια ελάχιστα επεμβατική επιλογή για να χαρακτηρίσει μεταστατικό ή /και μηχανισμούς ανθεκτική νόσο όταν ο ιστός ή εκ νέου βιοψία ή μη διαθέσιμο.

Η κλινική χρησιμότητα της ανίχνευσης των ΤΚΙ ευαισθητοποίηση

EGFR

μεταλλάξεις στο ctDNA έχει αποδειχθεί κατά τη θεραπεία ασθενών με gefitinib [3] σε NSCLC και με erlotinib σε καρκίνο του παχέος εντέρου (CRC) [10]. Έλεγχος για

KRAS

μεταλλάξεις στο CRC και τον καρκίνο του παγκρέατος, χρησιμοποιώντας ctDNA έχει επίσης διερευνηθεί μαζί με

BRAF

σε δείγματα μελανώματος [11-14]. ctDNA είναι τυπικά υποβαθμισμένη σε ένα μήκος 166 ζεύγη βάσεων, πιθανότατα λόγω των νουκλεολυτική διεργασίες που συμβαίνουν κατά τη διάρκεια της απόπτωσης [15,16]. Υπάρχουν κάποια στοιχεία που να υποδηλώνουν την ctDNA ενώ σε κυκλοφορία έχει ένα χρόνο ημίσειας ζωής από 16 λεπτά [17] και περίπου 2 ώρες [18,19], αλλά με σημαντικές διαφορές μεταξύ των περιπτώσεων. Αυτό είναι πιθανό να οφείλεται στην επιβαρύνει δραστικότητα νουκλεάσης αίμα που υποβαθμίζει τα θραύσματα [20] σε διαστήματα 10 ζευγών βάσεων [18] και το ήπαρ καθαρίζει επίσης θραύσματα από την κυκλοφορία [21]. Ανίχνευση μεταλλάξεων σε ctDNA είναι δύσκολη λόγω της χαμηλής ποσότητας των μεταλλαγμένων αλληλομόρφων σε ένα φόντο από άγριου τύπου DNA. Είναι παρούσα σε πολύ χαμηλά επίπεδα (& lt? 1%) [22] και μπορεί να ποικίλει από ασθενή σε ασθενή εξαιτίας των πολύπλοκων βιολογικών διαδικασιών όπως η γονιδιακή ενίσχυση που παρατηρείται με

EGFR

[23]. Ευαίσθητες μέθοδοι είναι επιτακτική ανάγκη να δώσει αξιόπιστα αποτελέσματα. Προ-αναλυτική μεταβλητές όπως η συλλογή περιφερικού αίματος, την επεξεργασία, την αποστολή και τις μεθόδους αποθήκευσης μπορεί να επηρεάσει τα ποσοστά ανίχνευσης.

ιστό του όγκου Επί του παρόντος παραμένει η συνιστώμενη χρυσό πρότυπο τύπο δείγματος οφείλεται στο σχετικά χαμηλό ποσοστό ανίχνευσης σε ctDNA σε σύγκριση με όγκο ιστού [3,24]. Ανίχνευση ctDNA κυμαίνεται από 62% έως 65,7% ευαισθησία για

EGFR

μεταλλάξεις σε NSCLC [3,25] και από 25% σε 41% ευαισθησία για

KRAS

μεταλλάξεις στο CRC [26,27 ].

Μία από τις μεγαλύτερες προκλήσεις στην ανίχνευση της προσφυγής μεταλλάξεων σε ctDNA είναι η αστάθεια των λευκών κυττάρων του αίματος μετά τη συλλογή. Τα λευκά αιμοσφαίρια καταρρεύσει κλήρωση των υστέρων αίμα, οδηγώντας σε αύξηση gDNA (γονιδιωματικό DNA) [28,29]. Η αυξημένη αφθονία της κανονικής παρευρισκομένων gDNA αραιώνει τον όγκο που προέρχεται ctDNA καθιστώντας πιο δύσκολη την ανίχνευση μεταλλάξεων προσφυγής [30] και απαιτεί να χρησιμοποιηθούν τεχνικές πιο ευαίσθητα από αυτά που χρησιμοποιούνται για την ανίχνευση μεταλλάξεων σε δείγματα ιστών. Προηγούμενες μελέτες έχουν διερευνήσει τη χρήση των μεθόδων βελτίωσης, αλλά σε περιορισμένο αριθμό δειγμάτων [30-32]. Τρέχουσες συστάσεις για την αξιολόγηση ctDNA περιλαμβάνουν: το πλάσμα και όχι δείγματα ορού, η χρήση του EDTA ή σωλήνες συλλογής του DNA των κυττάρων-free με επεξεργασία μέσα σε 4 ώρες, διπλή φυγοκέντρηση και όχι περισσότερες από τρεις κύκλους ψύξης απόψυξης των δειγμάτων πλάσματος [31]

Ο σκοπός αυτής της μελέτης ήταν να διερευνηθεί διάφορες μεθόδους για τη βελτίωση της ανίχνευσης μετάλλαξης σε ctDNA από ένα πρότυπο 10 mL κλήρωση αίμα του ασθενούς. Ερευνήσαμε ειδικά τη χρήση διαφορετικών σωλήνων συλλογής αίματος. Χρησιμοποιώντας πλάσματος από 45 ασθενείς με NSCLC που ταιριάζουν με τμήματα του όγκου που αξιολόγησε επίσης τις επιπτώσεις στην απόδοση του DNA και /ή

KRAS

ανίχνευση υπό τις ακόλουθες προϋποθέσεις: 1) ο χρόνος επώασης σε θερμοκρασία δωματίου πριν από την απομόνωση του πλάσματος? 2) μονά ή διπλά φυγοκέντρηση? 3) Ο όγκος των εισροών του πλάσματος και 4) σετ εξαγωγή διαφόρων DNA.

Υλικά και Μέθοδοι

Δήλωση Ηθικής

έγκριση της επιτροπής δεοντολογίας δεν ήταν απαιτείται στην περίπτωση του συγκεκριμένου έργου, όπως τα δείγματα συλλέχθηκαν στο εμπόριο από την Μάντσεστερ Κέντρο Ερευνών Καρκίνου (mCRC) Βιοτράπεζα, το Ηνωμένο Βασίλειο ή Asterand Bioscience Royston, Ηνωμένο Βασίλειο, που έχουν την έγκριση γενικής ηθικής: https://www.asterandbio.com/company/ethics/. Πλήρης γραπτή συγκατάθεση λήφθηκε για όλα τα δείγματα που χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη

Η MCRC Βιοτράπεζα έχει αδειοδοτηθεί από την (αριθμός άδειας: 30004) Ανθρώπινα ιστών Αρχή. Και έχει ηθικά εγκριθεί ως τράπεζα της έρευνας ιστού από το Νότιο Μάντσεστερ Η Επιτροπή Ερευνητικής Δεοντολογίας (Κωδ: 07 /H1003 /161 + 5). Μια σειρά από τυποποιημένα έντυπα ενημέρωσης των ασθενών και έντυπα συγκατάθεσης ασθενούς έχουν αναπτυχθεί και εγκριθεί και εν επιγνώσει συναίνεση του ασθενούς θα είναι πάντα να λαμβάνεται πριν από τη λήψη των δειγμάτων των ασθενών. Η Βιοτράπεζα κατέχει αυτό που είναι γνωστό ως έγκριση γενικής ηθικής

Αυτό παρέχει έγκριση σε όσους χρησιμοποιούν δείγματα από το MCRC Βιοτράπεζα, έτσι οι ερευνητές δεν χρειάζεται να αποκτήσουν το δικό τους ηθικούς έγκριση σχετικών σχεδίων χρησιμοποιώντας δείγματα Βιοτράπεζα:. Http: //www.mcrc.manchester.ac.uk/Biobank/Ethics-and-Licensing.

Όλες οι διαδικασίες πραγματοποιούνται σύμφωνα με τη δήλωση του Ελσίνκι (1964, τροποποιήθηκε το 1975, 1983, 1989, 1996 και 2000 ) του Παγκόσμιου Ιατρικού Συλλόγου και όλα τα δείγματα ασθενών που υποβλήθηκαν για ανάλυση έγιναν τόσο με την πλήρη συγκατάθεση των ασθενών.

Όλα τα κλινικά δεδομένα και τα δείγματα ελήφθησαν ανώνυμα.

ασθενείς

Δύο συλλογές δειγμάτων NSCLC που αποτελείται από σταθεροποιημένο με φορμαλίνη εμπεδωθεί με παραφίνη (FFPE) ιστού και συμφωνημένα πλάσματος χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη (Σχήμα 1). Για την αξιολόγηση των διαφόρων μεθόδων σταθεροποίησης του πλάσματος, μια συλλογή από συμφωνημένα πλάσματος και FFPE ιστούς σταθμίζονται με τους Καυκάσιους ασθενείς με αδενοκαρκίνωμα και με ιστορικό καπνίσματος χρησιμοποιήθηκε (n = 20? MCRC Βιοτράπεζα συνεργάζεται NHS Trusts). Συμφωνήθηκε πλάσμα και FFPE ιστούς χρησιμοποιήθηκαν για τη σύγκριση διαφορετικών όγκων του πλάσματος (n = 15? Asterand Bioscience, Royston, Ηνωμένο Βασίλειο) και τη σύγκριση κιτ εκχύλισης διαφορετικό DNA στο πλάσμα (n = 10? Asterand Bioscience)

διάγραμμα που δείχνει την. πειραματική ροή εργασιών για τις διάφορες ομάδες του δείγματος. Πίνακας Α Σύγκριση Streck τηλέφωνα Δωρεάν (BCT) και σωλήνες EDTA εκτός από μονόκλινα και δίκλινα φυγοκέντρηση για απόδοση του DNA και την ανίχνευση μετάλλαξης. B. Σύγκριση των διαφορετικών όγκων πλάσματος και κιτ εκχύλισης ctDNA σχετικά με την απόδοση του DNA και την ανίχνευση μετάλλαξης.

Η

συλλογή αίματος, την απομόνωση και την αποθήκευση του πλάσματος

Για την αξιολόγηση των διαφόρων μεθόδων σταθεροποίησης του πλάσματος, 10 mL περιφερικού αίματος συλλέχθηκαν σε ένα σωλήνα EDTA συλλογής αίματος (Vacutainer K2EDTA) (Becton, Dickinson, Οξφόρδη, Ηνωμένο Βασίλειο) και 10 ml σε ένα κελί-Free DNA ™ BCT (cfDNA BCT) (Streck, Omaha, ΝΕ) για 20 ασθενείς, σύμφωνα με τις οδηγίες χρήσης (αναστρέφοντας 10 φορές). Κάθε τόμος 10 κ.εκ. στη συνέχεια χωρίστηκε σε κλάσματα 2 χ 5 mL και στη συνέχεια επωάστηκαν σε θερμοκρασία δωματίου για 2 ώρες είτε ή 72 ώρες. Το πλάσμα στη συνέχεια απομονώνεται από το δείγμα αίματος με την εκτέλεση μιας 2000 χ g φυγοκέντρηση για 10 λεπτά και προσεκτική απομάκρυνση του πλάσματος. Το απομακρύνεται το πλάσμα στη συνέχεια φυγοκεντρήθηκε πάλι στα 2000 χ g για 10 λεπτά πριν από την απομάκρυνση του υπερκείμενου του πλάσματος για την εκχύλιση ctDNA. Για 5 από τους 20 ασθενείς ένα επιπλέον 10 mL κλήρωση αίμα συλλέχθηκε σε ένα σωλήνα EDTA και χωρίζεται σε 2 χ 5 ml όγκους. Το αίμα στη συνέχεια επωάστηκε σε θερμοκρασία δωματίου για 2 ώρες είτε ή 72 ώρες πριν από μια μοναχική περιστροφής φυγοκεντρωτή στα 2000 χ g για να απομονωθεί το πλάσμα (Σχ 1Α). Για μακροχρόνια αποθήκευση, όλο το πλάσμα αποθηκεύτηκε στους -80 ° C σε κλάσματα του 1 mL πριν από την εκχύλιση του DNA.

Για τη σύγκριση των διαφορετικών όγκων πλάσματος και διαφορετικά κιτ εκχύλισης DNA, συλλέχθηκε αίμα σε σωλήνες EDTA και φυγοκεντρήθηκαν μια φορά για 10 λεπτά σε 1,300 χ g. Πλάσμα συλλέχθηκε σε κλάσματα του 1 mL και αποθηκεύτηκε στους -80 ° C εντός 1 ώρας από τη συλλογή του αίματος. Κλάσματα από τον ίδιο ασθενή αποψύχθηκαν σε πάγο και ομαδοποιήθηκαν ανά ασθενή για να δημιουργήσει & gt? 6 mL συνολικά. Συνενωμένο πλάσμα κατόπιν αναμίχθηκε επιμελώς και διανεμήθηκε σε 1, 2 και 3 ml όγκους για την μελέτη σύγκρισης του όγκου του πλάσματος (n = 15), και δείγματα 3 Χ 2 mL για τη μελέτη εκχύλισης DNA σύγκριση kit (n = 10) (Σχήμα 1Β) . Όλα τα δείγματα πλάσματος στη συνέχεια καταψύχθηκαν στους -80 ° C.

Όλες οι συλλογές ιστού εκτελούνται συγχρόνως αν και αυτά που συλλέγονται από Asterand Bioscience διεξήχθησαν υπό τους περιορισμούς της διαθεσιμότητας τέτοιων συμφωνημένα σύνολα δειγμάτων, ως εκ τούτου ορισμένες παράμετροι συλλογή δεν ήταν ιδανικές για cfDNA π.χ. συλλογή με ένα βήμα φυγοκέντρισης όπως παραπάνω.

Εξαγωγή DNA από

πλάσμα

Για σύγκριση της σταθεροποίησης του αίματος και του όγκου του πλάσματος η QIAamp δανείζεται Nucleic Acid Kit (Qiagen, Hilden, Germany) χρησιμοποιήθηκε. Επιπλέον, μια σύγκριση τριών κιτ εκχύλισης DNA πραγματοποιήθηκε σε ίσους όγκους πλάσματος (2 ml το καθένα) (Σχήμα 1Β). Τα ακόλουθα σετ χρησιμοποιήθηκαν: ΡΜΕ ελεύθερο κυκλοφορούντων DNA Extraction Kit πρωτόκολλο (Analytik Jena, Jena, Germany) για 2-5 εκχυλίσεις mL χρησιμοποιώντας διάλυμα λύσης σύστημα GS /βιβλιοδεσίας διάλυμα VL και DSP Virus /παθογόνων Midi Kit εκτελείται σε QIAsymphony (Qiagen) και η QIAamp δανείζεται Nucleic Acid Kit (QIAGEN). εκχυλίσεις QIAsymphony πραγματοποιήθηκαν στο εργαστήριο εφαρμογές Qiagen (Hilden). Όλα τα δείγματα πλάσματος υποβλήθηκαν σε επεξεργασία σύμφωνα με τα πρωτόκολλα των κατασκευαστών, με εξαίρεση του κιτ ΡΜΕ όπου μία αρχική επώαση 20 λεπτών αντί των 10 λεπτών εκτελέστηκε και τα βήματα φυγοκέντρηση πλάσματος διεξήχθησαν σε 3750 χ g vs 4500 χ g. Όλα DNA εκλούεται σε 80 μί εντός του εύρους που καθορίζεται από το κιτ.

εξαγωγή DNA από FFPE ιστούς

Το DNA που εξάγεται από 2 x 5 μm φρεσκοκομμένου τμήματα ιστών FFPE σύμφωνα με τον κατασκευαστή πρωτόκολλο με τη χρήση του QIAamp DNA FFPE Kit Tissue (Qiagen) και εκλούεται σε 100 μι του ρυθμιστικού διαλύματος.

DNA ποσοτικοποίηση

Όλοι εκλούεται DNA αναμίχθηκε επιμελώς (στροβιλίζεται) πριν από την μέτρηση με ποσοτική PCR (qPCR ), η οποία πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του ΑΒΙ TaqMan® RNase P αντιδραστηρίων ανίχνευσης Kit και TaqMan® Οικουμενική PCR Master Mix (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) σε ένα όργανο Quantstudio Dx (Life Technologies, CA. USA). Οι αντιδράσεις παρασκευάστηκαν χρησιμοποιώντας 10 μι Master Mix, 1 μι Μίγμα Δοκιμασίας, 5 μι του DNA και 4 μλ νερό χωρίς νουκλεάση (Qiagen, Hilden, Germany). συνθήκες κύκλων ήταν 95 ° C για 10 λεπτά και στη συνέχεια 94 ° C για 15 δευτερόλεπτα και 60 ° C για 1 λεπτό εναλλάσσονται 40χ. Μία σειρά από 10 διαδοχικές αραιώσεις Γονιδιωματικό DNA ανθρώπου (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany) από 100 ng /μL έως 0.195 ng /μL χρησιμοποιήθηκε εις διπλούν για να παραχθεί η πρότυπη καμπύλη. Το μέγεθος αμπλικονίου του προσδιορισμού RNase P ήταν 87 ζεύγη βάσεων, η οποία είναι κατάλληλη για χρήση σε ctDNA.

KRAS

δοκιμές

KRAS

κατάσταση μετάλλαξης χαρακτηρίστηκε από FFPE ιστούς που προέρχονται από DNA χρησιμοποιώντας το

TheraScreen KRAS

κιτ RGQ PCR (Qiagen) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Το TheraScreen κιτ απασχολεί ενίσχυση πυρίμαχα σύστημα μετάλλαξη (ΟΠΛΑ) τεχνολογία PCR σε συνδυασμό με την τεχνολογία ανίχνευσης Scorpions [33]. Η κατάσταση μετάλλαξης ενός δεδομένου δείγματος καθορίζεται από τη σύγκριση της συγκεκριμένης

KRAS

δοκιμασία μετάλλαξης κατά μία δοκιμασία ελέγχου

KRAS

εξώνιο 4 για να δημιουργήσει μια αλλαγή στον κύκλο Όριο (ΔΟΙ). Η ΔCt είναι η λαμβάνεται με την αφαίρεση του CT ελέγχου από την CT δοκιμή μετάλλαξης. Η ΔCt στη συνέχεια σε σύγκριση με τα επικυρωμένα κόψει κριτήρια για τη ΔΟΙ, προκειμένου να αποδείξουν την ιδιότητα μετάλλαξης.

KRAS

ανίχνευση μετάλλαξης διεξήχθη με τον ίδιο τρόπο σε δείγματα ctDNA από ασθενείς με

KRAS

μεταλλάξεις που ανιχνεύονται με την αντίστοιχη FFPE DNA που προέρχονται από ιστούς. Δείγματα υποβάλλονται σε επεξεργασία με διαφορετικές μεθόδους προ-αναλυτική προσδιορίστηκαν με τον ίδιο RotorGeneQ (RGQ) τρέξιμο. Τα δείγματα πλάσματος αξιολογήθηκαν μόνο για το γνωστό

KRAS

μετάλλαξη όπως ελήφθη στην συμφωνημένα ιστό.

Η στατιστική ανάλυση

Η στατιστική ανάλυση πραγματοποιήθηκε με τη χρήση σε συνδυασμό Φοιτητών

t

-test στο Microsoft Excel όπου p & lt? 0,05 θεωρήθηκε σημαντική. ανάλυση γραμμικής παλινδρόμησης και τον υπολογισμό του R

2 εκτελέστηκαν σε GraphPad Prism (Έκδοση 6.01) και ρ-τιμές υπολογίστηκαν με βάση απόκλιση από το μηδέν. Γραφήματα παρήχθησαν σε GraphPad Prism.

Αποτελέσματα

Η ποσοτικοποίηση του DNA μετά από διαφορετική επεξεργασία του πλάσματος βήματα

Για να καταλάβουμε αν οι μέθοδοι επεξεργασίας πλάσματος μπορεί να επηρεάσει τα επίπεδα των μολυσματικών παρούσας gDNA , συλλέξαμε το αίμα από 20 ασθενείς με NSCLC και επεξεργασία του πλάσματος κάτω από διάφορες συνθήκες (Σχήμα 1Α και Σχήμα 2). σωλήνες συλλογής EDTA και μεγαλύτερο χρόνο επώασης ήταν σημαντικά (p & lt? 0,01) σχετίζεται με αυξημένη απόδοση DNA, μέση τιμή ± SD: σωλήνα EDTA /2 ώρες επώασης (2,49 ± 1,60 ng /μL) σε σχέση με σωλήνα EDTA /72 ώρες επώασης (15.12 ± 16,44 ng /μL) (σχήμα 2Α). Μια χαμηλή αλλά σημαντική (ρ & lt? 0,01) αύξηση στην απόδοση DNA παρατηρήθηκε επίσης με σωλήνες συλλογής αίματος ελεύθερα κυττάρων DNA (cfDNA BCT) στις 72 ώρες (3.31 ± 1.82 ng /μL) σε σύγκριση με cfDNA BCT /2 hr (2,39 ± 1,42 ng /μL) (Εικόνα 2Β). Δεν υπήρχε σημαντική διαφορά στη συνολική απόδοση του DNA που παρατηρήθηκε όταν το πλάσμα υποβλήθηκε σε επεξεργασία εντός 2 ωρών χρησιμοποιώντας είτε τον τύπο σωλήνα (Σχ 2C). Η απόδοση του DNA από το πλάσμα επεξεργασία μετά από 72 ώρες, χρησιμοποιώντας cfDNA BCT σωλήνες ήταν σημαντικά (p & lt? 0,01) χαμηλότερη από το πλάσμα επεξεργασία χρησιμοποιώντας σωλήνες EDTA (Σχήμα 2D) «

Ολόκληρο αίμα συλλέχθηκε από 20 ασθενείς με NSCLC και επεξεργασία με χρήση. διάφορους τύπους σωλήνων, οι χρόνοι επώασης και τα βήματα φυγοκέντρησης ένα υποσύνολο αυτών των ασθενών (n = 5) είχαν ολικού αίματος σε επεξεργασία για να αξιολογήσει ένα μόνο εναντίον διπλό βήμα φυγοκέντρησης DNA μετρήθηκε με τη χρήση του ΑΒΙ TaqMan® RNase P Detection Reagent Kit A:.. αίμα συλλέχθηκαν με χρήση σωλήνα συλλογής EDTA αίματος (EDTA) και υποβάλλονται σε επεξεργασία μετά από 2 ώρες ή 72 ώρες Β:. αίμα συλλέχθηκε χρησιμοποιώντας σωλήνα κύτταρο ελεύθερο DNA συλλογής αίματος (cfDNA BCT) και υποβάλλονται σε επεξεργασία μετά από 2 ώρες ή 72 ώρες C:. αίμα συλλέχθηκε χρησιμοποιώντας σωλήνες και EDTA ή cfDNA BCT επεξεργασία μετά από 2 ώρες D:. Αίμα συλλέχθηκε χρησιμοποιώντας σωλήνες EDTA ή cfDNA BCT και επεξεργασία μετά από 72 ώρες E:. το αίμα συλλέγεται σε σωλήνες EDTA μετά από 2 ώρες επώασης και επεξεργασία χρησιμοποιώντας είτε μονή ή διπλή φυγοκέντρηση ΣΤ.: Αίμα συλλέχθηκε σε σωλήνες EDTA μετά από επώαση 72 hr και επεξεργασία χρησιμοποιώντας είτε μονή ή διπλή φυγοκέντρηση. Τα αποτελέσματα εμφανίζονται για κάθε ασθενή. Η στατιστική ανάλυση πραγματοποιήθηκε με τη χρήση t-test σε αντιστοίχιση του Student όπου? ** P & lt?. 0.01

Η

Ένα υποσύνολο αυτών των δειγμάτων των ασθενών (n = 5) αξιολογήθηκε περαιτέρω για την επιρροή της μονής ή διπλής βαθμίδας φυγοκέντρησης στις αποδόσεις DNA (Σχήμα 2Ε και 2F). Όταν υποβάλλονται σε επεξεργασία εντός 2 ωρών, φυγοκέντρηση των δειγμάτων πλάσματος δύο φορές δεν έχουν σημαντική επίδραση στην απόδοση του DNA σε σύγκριση με ενιαία περιστροφή (Σχήμα 2Ε). Ωστόσο, όταν υποβάλλονται σε επεξεργασία μετά από 72 ώρες, ένα διπλό βήμα φυγοκέντρησης οδήγησε σε μειωμένη μέση απόδοση DNA (19,35 ± 24,3 ng /μL) σε σύγκριση με το ενιαίο επεξεργασίας φυγοκέντρηση (35.47 ± 32,1 ng /μL). Μια μείωση στην απόδοση παρατηρήθηκε σε 4 από τα 5 δείγματα που αναλύθηκαν (Σχήμα 2F), ωστόσο αυτό δεν ήταν στατιστικά σημαντική (p = 0,058). Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα αποτελέσματα καταδεικνύουν ότι τα επίπεδα των αποδόσεων DNA μπορεί να ποικίλει ανάλογα με τη μέθοδο με την οποία το πλάσμα υποβάλλεται σε επεξεργασία με μη-βέλτιστες μεθόδους.

KRAS

ανίχνευση μετάλλαξης ακόλουθα διαφορετικά στάδια επεξεργασίας πλάσματος

η εφαρμογή των διαφόρων μεθόδων επεξεργασίας πλάσματος ερευνήθηκε επίσης για

KRAS

ανίχνευση μεταλλάξεων σε 20 δείγματα ασθενών (Σχήμα 1Α). Πριν από την εκτέλεση

KRAS

ανίχνευση μεταλλάξεων σε οποιοδήποτε προερχόμενο από πλάσμα DNA, το αντίστοιχο συμφωνημένα FFPE ιστού σαρώθηκε χρησιμοποιώντας το

TheraScreen KRAS

RGQ PCR kit για τον εντοπισμό ασθενών με μετάλλαξη θετικό όγκους (n = 10 /20? δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Σε αυτή την ομάδα, το 50% (n = 5) είχαν

KRAS

μεταλλάξεις που εντοπίζονται στην συμφωνημένα πλάσμα υποβάλλονται σε επεξεργασία σε σωληνάρια συλλογής cfDNA BCT εντός 2 ωρών και 40% (n = 4) σε 72 ώρες. Ωστόσο, το ποσοστό αυτό μειώθηκε ανίχνευσης σε σύγκριση με ένα θεωρούνται μη-βέλτιστη μέθοδο, π.χ. σωληνάρια συλλογής EDTA μετά 2 ώρες, 40% (n = 4) μεταλλάξεων ανιχνεύτηκαν πτώση στο 20% (n = 2) μετά από 72 ώρες (Πίνακας 1) στα ίδια δείγματα. Οι επιμέρους τιμές (CT), συνολικό ενισχυόμενο KRAS DNA (έλεγχος KRAS) και οι τιμές ΔCt για όλα τα δείγματα 10 πλάσματος εμφανίζεται στο S1 πίνακα. Θα πρέπει να σημειωθεί ότι

KRAS

κατάσταση μετάλλαξης ιδρύθηκε χρησιμοποιώντας το TheraScreen Qiagen

KRAS

RGQ PCR εγχειρίδιο, ΔΟΙ αποκοπεί τιμές κυμαίνονται 6,6 – 8 για τις μεταλλάξεις που ανιχνεύονται. Λόγω του μικρού αριθμού των δειγμάτων με

KRAS

μεταλλάξεις που ήταν ανιχνεύσιμα σε ctDNA, δεν είναι δυνατόν να επισυνάψετε στατιστική σημαντικότητα.

Η

Σύνολο ενισχυόμενο

KRAS

DNA (

KRAS

ελέγχου) ανίχνευσης σε όλα τα δείγματα έδειξε μια παρόμοια τάση που παρατηρήθηκε για την απόδοση του DNA (qPCR) στο Σχήμα 2 (S1 πίνακα). Μια μείωση στην CT αξία αποδείχθηκε μη-βέλτιστες μεθόδους που υποδεικνύει μεγαλύτερη μολύνουν συγκέντρωση DNA? μέση CT ± SD: EDTA επώασης σωλήνα /2 ώρες (29,0 ± 1,0), σωλήνα EDTA /επώασης 72 ώρες (25,5 ± 1,5), cfDNA BCT /επώασης 2 ώρες (29,4 ± 1,1), και cfDNA BCT /72 ώρες επώασης (28,5 ± 1,0) , αντίστοιχα (Πίνακας S1). Αυτά τα αποτελέσματα αποδεικνύουν ότι τόσο

KRAS

ανίχνευση μετάλλαξης και συνολικό ενισχυόμενο

KRAS

DNA μπορεί να επηρεαστεί ανάλογα με τη μέθοδο της επεξεργασίας πλάσματος που χρησιμοποιείται.

Η ποσοτικοποίηση του DNA ακόλουθες διαφορετικές πλάσμα εισόδου

Όπως ήταν αναμενόμενο, μια σημαντική αύξηση της απόδοσης DNA παρατηρήθηκε με αυξανόμενο όγκο δείγματος (ρ & lt? 0,01) από 15 ασθενείς (Σχήμα 3). Η αύξηση της απόδοσης θα αυξήσει τη συγκέντρωση και τους απόλυτους αριθμούς αντίγραφο ctDNA διαθέσιμα για ανάλυση καθιστώντας έτσι την ανίχνευση μετάλλαξης πιο πιθανό. Η μέση απόδοση του DNA από 3 mL πλάσματος ήταν 4,39 ± 4,55 ng /μL σε σύγκριση με 3,03 ± 3,24 ng /μL (2 mL πλάσματος) και 1,79 ± 1,81 ng /μL (1 mL πλάσματος). Από αυτούς τους 15 ασθενείς, 7 είχαν

KRAS

μεταλλάξεις στο αντίστοιχο συμφωνημένα ιστού Σε αυτή την ομάδα, ένας ασθενής (αριθμός 23) είχαν ανιχνεύσιμο

KRAS

μετάλλαξη στο πλάσμα και για τους τρεις τόμους τα υπόλοιπα δείγματα ασθενών έχοντας τιμές ΔCt εκτός των αποκοπεί κριτήρια για τη δοκιμή (S2 πίνακα). Αυτό μπορεί να οφείλεται σε αυτό το συγκεκριμένο συλλογή αντίστοιχα δείγματα πλάσματος που συντάσσεται σε συνήθεις σωλήνες EDTA, με ένα μόνο γύρισμα αντικατοπτρίζει το σύνηθες ποσοστό ανίχνευσης που προκύπτει σε μη-βέλτιστες μεθόδους [34]. Επιπλέον, αυτά τα συγκεκριμένα δείγματα προήλθαν κατά κύριο λόγο από το στάδιο Ι ή ΙΙ NSCLC (13/20), τα οποία θα μπορούσαν να περιέχουν χαμηλότερα επίπεδα ctDNA από τον όγκο [35]. Είναι ενδιαφέρον,

KRAS

μάρτυρα ενίσχυσης έδειξε μια παρόμοια τάση με την απόδοση του DNA (qPCR) στο Σχήμα 2. Κάτω μέσες τιμές CT για το

KRAS

ελέγχου παρατηρήθηκαν με αύξηση του όγκου του πλάσματος. Οι χαμηλότερες τιμές CT έδειξαν σημαντική αύξηση (ρ & lt? 0.001) σε

KRAS

ανίχνευση ελέγχου (μέση τιμή CT ± SD) για 3 mL πλάσματος (26,5 ± 1,7) σε σύγκριση με 2 mL πλάσματος (27,1 ± 1,8) και 1 mL πλάσματος (28,1 ± 1,7) δείγματα (S2 πίνακα). Αυτά τα δεδομένα καταδεικνύουν ότι ποικίλη ένταση εισόδου του πλάσματος μπορεί να επηρεάσει την απόδοση του DNA και το συνολικό ενισχυόμενο

KRAS

. Για

KRAS

ανίχνευσης μετάλλαξης, ωστόσο, ένα μεγαλύτερο κοόρτη ανιχνεύσιμων μεταλλαγμένου δειγμάτων απαιτείται για περαιτέρω ανάλυση.

Τρεις όγκοι πλάσματος (1 ml, 2 ml και 3 mL) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία από κάθε δείγματος σε μία ομάδα από 15 ασθενείς με NSCLC. DNA εκχυλίζεται με τη χρήση του QIAamp CNA Kit και μετρήθηκε με qPCR χρησιμοποιώντας το κιτ αντιδραστήριο ανίχνευσης ΑΒΙ TaqMan® RNase Ρ. Τα αποτελέσματα εμφανίζονται για κάθε ασθενή. Η στατιστική ανάλυση πραγματοποιήθηκε με τη χρήση t-test σε αντιστοίχιση του Student όπου? ** P & lt?. 0.01

Η

Αν και κανένα συμπέρασμα μπορεί να γίνει από ένα μόνο δείγμα, όλα τα δείγματα αυξήθηκε σε απόδοση DNA όπως αναμενόταν. Οι αυξημένοι αριθμοί του

KRAS

ενισχύσιμα αντίγραφα DNA που λαμβάνονται μέσω εκχύλισης από περισσότερα του πλάσματος, θα μπορούσαν να επηρεάσουν το ποσοστό ανίχνευσης σε αυτά τα δείγματα εάν περισσότερο ευαίσθητες μεθόδους, π.χ. ψηφιακή PCR χρησιμοποιήθηκαν.

εκχύλιση του DNA σύγκριση κιτ

Ίσοι όγκοι (2 ml) του πλάσματος από 10 ασθενείς υποβλήθηκαν σε εξαγωγή του DNA χρησιμοποιώντας τρεις διαφορετικές μεθόδους. Και οι τρεις μέθοδοι αποδειχθεί επιτυχής εξαγωγή του DNA (Σχήμα 4) με QIAamp Qiagen του Κυκλοφορούν νουκλεϊκών κιτ οξύ αποδίδοντας την υψηλότερη απόδοση του DNA, δηλαδή μέση τιμή ± SD (3,03 ± 2.19ng /μL) σε σύγκριση με PME Αναλυτική Ιένα ελεύθερων κυκλοφορούν πρωτόκολλο Kit DNA Extraction ( 0,83 ± 0.88ng /μι? p & lt? 0.001) και σε σύγκριση με το DSP Virus Qiagen του /παθογόνων Midi Kit πραγματοποιήθηκε σε QIAsymphony (0,53 ± 0.53ng /μι? p & lt? 0,01). Οι οδηγίες κιτ είναι απλό στη χρήση και κατάλληλο για τις μικρές και μεσαίου μεγέθους παρτίδα ενώ το QIAsymphony απαιτεί ειδική εκπαίδευση, αλλά είναι πιο κατάλληλο για υψηλής απόδοσης και συνεχή επεξεργασία.

Ίσοι όγκοι πλάσματος (2 mL) από ασθενείς με ΜΜΚΠ 10 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με τρεις διαφορετικές μεθόδους εκχύλισης DNA: QIAamp Κυκλοφορούν Nucleic Acid Kit (Qiagen CNA Kit)? PME ελεύθερη κυκλοφορία του DNA Extraction Kit (Analytik Ιένα) και το DSP Virus /παθογόνων Midi Kit πραγματοποιήθηκε σε QIAsymphony (QIAsymphony). DNA μετρήθηκε με qPCR χρησιμοποιώντας το κιτ αντιδραστήριο ανίχνευσης ΑΒΙ TaqMan® RNase Ρ. Τα αποτελέσματα εμφανίζονται για κάθε ασθενή. Η στατιστική ανάλυση πραγματοποιήθηκε με τη χρήση t-test σε αντιστοίχιση του Student όπου? ** P & lt? 0,01, *** p & lt? 0.001

Η

Συζήτηση

Εξατομικευμένη θεραπεία του καρκίνου συχνά βασίζεται σε εξέταση για μεταλλάξεις του DNA χρησιμοποιώντας μια διαγνωστική δοκιμασία σύντροφος για τον εντοπισμό των ασθενών που θα. περισσότερες πιθανότητες να απαντήσετε σε στοχευμένες θεραπείες. Επί του παρόντος, η πιο συχνά χρησιμοποιούμενη δείγματος για την ανίχνευση της προσφυγής αλλαγές μετάλλαξη του DNA είναι καρκινικό ιστό, συνήθως FFPE ιστούς. Ωστόσο, ένα δείγμα ιστού δεν είναι πάντα διαθέσιμη [3] είτε λόγω της εξάντλησης του διαγνωστικού μπλοκ για άλλες έρευνες μοριακής παθολογίας ή επειδή ο ασθενής δεν έχει ποτέ υποστεί βιοψία για άλλους κλινικούς λόγους. Όπου η διαθεσιμότητα ιστών είναι ένα θέμα προσεκτική επιλογή των εξαιρετικά παράλληλα διαγνωστικών πλατφόρμες όπως το Next Generation Sequencing (NGS) ή Matrix Υποβοηθούμενη εκρόφησης λέιζερ /ιονισμού Χρόνος πτήσης (MALDI-TOF), μπορεί να καθυστερήσει η εξάντληση του μπλοκ [36].

Υγρό βιοψίες (π.χ. πλάσμα) προσφέρουν μια εναλλακτική λύση, χρονική και λιγότερο επεμβατική επιλογή για την ακριβή δοκιμή μετάλλαξης. Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι η δοκιμή μετάλλαξης ctDNA έχει υψηλή ειδικότητα (& gt? 95%), αλλά η ευαισθησία είναι μικρότερη (60%) σε σύγκριση με ιστό [3,37]. Τα περισσότερα από τα τεκμηριωμένα στοιχεία στον NSCLC μέχρι σήμερα σχετίζεται με

EGFR

δοκιμές. Μερικές μελέτες έχουν διερευνήσει

KRAS

μεταλλάξεις από ctDNA σε ασθενείς με καρκίνο του παχέος εντέρου [12,26,34].

Τεχνολογίες και μέθοδοι που μπορούν να βελτιώσουν την απομόνωση των ctDNA και τη μείωση της μόλυνσης του DNA άγριου τύπου αναδυόμενες [31]: αποφεύγοντας σωλήνες ηπαρίνης [38], η χρήση πλάσματος αντί ορό [39] και την αποφυγή του παγώματος δειγμάτων [28]. Αυτές περιλαμβάνουν το βήμα αλλαγές στην επεξεργασία πλάσματος για τα βήματα παράδειγμα φυγοκέντρηση (ταχύτητα και τον αριθμό των περιστροφών) [40] και πιο εξελιγμένα βελτιώσεις, όπως ένα εξειδικευμένο σωλήνες συλλογής, σωλήνες δηλαδή των κυττάρων χωρίς DNA συλλογής αίματος που σταθεροποιούν τα λευκά κύτταρα του αίματος [30, 32]. Παρά το γεγονός ότι η πιθανή κλινική χρησιμότητα του

KRAS

ανίχνευσης μετάλλαξης από το πλάσμα έχει επίσης διερευνηθεί [41] στο NSCLC, η επίδραση αυτών των τροποποιήσεων επεξεργασία στο

KRAS

ανίχνευση μεταλλάξεων σε NSCLC δεν έχει ακόμη συγκεκριμένα διερευνώνται.

Ο στόχος αυτής της μελέτης ήταν να προσδιορίσει τη βέλτιστη προ-αναλυτικά στάδια επεξεργασίας για την απόκτηση ctDNA από το πλάσμα από ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα. Σε αυτή τη μελέτη μέτρησε την επίδραση αυτών των βημάτων στις αποδόσεις DNA και

KRAS

ποσοστά ανίχνευσης μετάλλαξης.

Ποσοτική PCR (qPCR) πιστεύεται ότι είναι η καταλληλότερη μέθοδος ποσοτικοποίησης του DNA, όπως το χαρακτηρίζει ενισχυόμενο μόρια DNA μόνο [28]. Η μέθοδος που χρησιμοποιείται χρησιμοποιείται μια μονάδα επέκτασης ζεύγος 87 βάσεων οι οποίες θα ενισχύσουν ctDNA που συνήθως υποβαθμίζεται σε 166 ζεύγη βάσεων (40). Θα πρέπει να σημειωθεί, ωστόσο, ότι η χρήση άλλων μεθόδων είναι κατάλληλη όταν χρησιμοποιείται ως μέρος ενός προηγουμένως επικυρωμένης μεθόδου.

Κυκλοφορούν DNA υπάρχει με φυσικό τρόπο, αλλά είναι συχνά αυξημένα σε ασθενείς με καρκίνο [19]. Η ποσότητα του ctDNA σε ένα δείγμα ποικίλλει ανάλογα με τη ρύθμιση της νόσου και το στάδιο [35]. Η ανίχνευση των μεταλλάξεων από ctDNA εξαρτάται σε μεγάλο βαθμό από τη σταθερότητα του δείγματος. Υπήρξε μια εμφάνιση εναλλακτικών σωλήνες συλλογής αίματος που σταθεροποιούν τα κύτταρα του αίματος, π.χ. CellSave Συντηρητικό Σωλήνες (Cell Αναζήτηση, Νότια Ritan, NJ, USA) και cfDNA BCT (Streck). Στην παρούσα μελέτη επικεντρώθηκε στην εκτίμηση της cfDNA BCT σωλήνες, διότι αυτά ήταν το μόνο εμπορικά διαθέσιμο προϊόν που έχει σχεδιαστεί ειδικά για τη σταθεροποίηση του αίματος για την αξιολόγηση ctDNA. Το σταθεροποιητικό διάλυμα που περιέχεται στη cfDNA BCT σωλήνες δεν επηρεάζει κατάντη μοριακή ανάλυση με PCR [42], όπως παρατηρήσαμε επίσης σε αυτή τη μελέτη. Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι cfDNA BCT σωλήνες διατήρηση του αίματος που επιτρέπει την ανίχνευση των κυκλοφορούντων ελεύθερο DNA με τη χρήση πλάσματος από υγιείς δότες [30,32] ή πλάσματος εμπλουτίστηκε με καρκινικά κύτταρα [43]. Ωστόσο, για το καλύτερο της γνώσης μας, δεν υπάρχουν μελέτες που έχουν χρησιμοποιήσει αυτές τις σωλήνες για να αξιολογήσει απόδοση DNA και συγκεκριμένες μεταλλάξεις στο πλάσμα ασθενών με NSCLC.

Δείξαμε εδώ ότι κατά τη χρήση διαφορετικών μεθόδων επεξεργασίας, όπως ένα 72 ώρες επώαση πριν από την επεξεργασία, cfDNA BCT σωλήνες ήταν καλύτερα στη σταθεροποίηση της αίμα σε σύγκριση με σωλήνες συλλογής EDTA, όπως φαίνεται από τη μείωση των αποδόσεων του DNA. Ως εκ τούτου, όταν η άμεση επεξεργασία (& lt? 2 ώρες) του πλάσματος δεν είναι δυνατή, cfDNA BCT σωλήνες παρέχουν μια ανώτερη εναλλακτική λύση με το πρότυπο σωληνάρια συλλογής EDTA. Αυτό είναι ιδιαίτερα σημαντικό σε ένα κλινικό περιβάλλον όπου αίμα συλλέγεται αλλά δεν είναι σε θέση να υποβληθούν σε επεξεργασία αμέσως

Έχει αναφερθεί ότι η αρχική αργή φυγοκέντρηση (& lt? 1600 xg για 10 λεπτά). Που ακολουθείται από μια δεύτερη φυγοκέντρηση, σε υψηλή ταχύτητα (& lt? 16,000 xg για 10 λεπτά) είναι απαραίτητη για την απομόνωση ελεύθερο κυττάρων πλάσμα [40,44], όπως φαίνεται από τη μείωση της απόδοσης του DNA. Είναι σημαντικό, κλινικά εργαστήρια δεν έχουν πάντα τη δυνατότητα να εκτελέσει μια γρηγορότερη δεύτερη φυγοκέντρηση. Η μελέτη μας επιβεβαίωσε ότι η μόλυνση gDNA ήταν χαμηλότερη από το πλάσμα απομονώνεται με διπλή φυγοκέντρηση σε σύγκριση με ένα μόνο φυγοκέντρησης που υποστηρίζουν τις προηγούμενες παρατηρήσεις. Υπό τις συνθήκες αυτές, συνιστάται ότι μία δεύτερη φυγοκέντρηση στη χαμηλότερη ταχύτητα είναι πιο αποτελεσματική στην απομάκρυνση των κυττάρων από μία φυγοκέντρηση [45]. Επιπλέον, η αύξηση του όγκου του πλάσματος, αυξάνει την απόδοση του DNA και μείωσε το

KRAS

ελέγχου όπως αναμένεται [45].

Υπάρχουν μια σειρά από επιλογές εξαγωγής DNA που μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την ανάλυση ctDNA από πλάσμα ή ορό (S3 πίνακα). Επιλέξαμε να συγκρίνουμε τρεις μεθόδους, όλα έχουν σχεδιαστεί ειδικά για την εκχύλιση των κυκλοφορούντων DNA, η οποία επέτρεψε τη χρήση των 2 ml πλάσματος εισόδου. Έχουμε επιλέξει μια αυτοματοποιημένη μέθοδο (QIAsymphony), μία ευρέως χρησιμοποιούμενη μέθοδος (κιτ QIAamp ΚΥΠΕ) και ένα λιγότερο τεκμηριωμένη μέθοδο (Analytik Jena). Ενώ παρατηρήσαμε ότι οι μέθοδοι απέδωσε επαρκή DNA για τους μεταγενέστερους εφαρμογή, ωστόσο οι αποδόσεις διέφεραν σημαντικά μεταξύ τους προσδιορισμούς. Οι διάφορες αποδόσεις, όπως μετράται με qPCR μπορεί να έχει προκύψει από την απομόνωση των θραυσμάτων της κατανομής διαφορετικού μεγέθους λόγω του μεγέθους αποκλεισμό των νουκλεϊκών οξέων σε ένα δεδομένο σετ. Λόγω της διακύμανσης της απόδοσης των εμπορικών κιτ, μια επικυρωμένη μέθοδος θα πρέπει να χρησιμοποιείται κατά την ανάλυση κλινικών δειγμάτων. Ως εκ τούτου, θα πρέπει να δίνεται ιδιαίτερη προσοχή κατά την επιλογή ενός βέλτιστου μέθοδο εκχύλισης ctDNA.

Εν κατακλείδι, αν και μεμονωμένα κάποια βήματα βελτιστοποίησης είχε μια μέτρια επίδραση σε αυτή τη μελέτη, η συσσώρευση των πολλαπλών τροποποιήσεων θα οδηγήσει τελικά σε ποσοστά ανίχνευσης βελτιωμένη μετάλλαξης σε ctDNA. Ειδικότερα, η ενσωμάτωση των σωλήνων cfDNA BCT δείχθηκε να βελτιώσει την σταθεροποίηση του περιφερικού αίματος σε σύγκριση με σωλήνες EDTA μετά από επώαση 72 ωρών.