Αφηρημένο

Η στόχευση των ογκογόνων «οδηγός» κινασών με μικρά μόρια αναστολείς έχει αποδειχθεί ότι είναι μια πολύ αποτελεσματική θεραπευτική στρατηγική σε επιλεγμένα μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC) ασθενείς. Ωστόσο, επίκτητη αντοχή σε στοχευμένες θεραπείες πάντοτε προκύπτουν και είναι ένας σημαντικός περιορισμός για την φροντίδα του ασθενούς. πρωτεΐνες σύντηξης ROS1 είναι ένα περιγραφεί πρόσφατα τάξης των ογκογόνων οδηγού, και οι ασθενείς με NSCLC που εκφράζουν αυτές οι συγχωνεύσεις γενικά ανταποκρίνονται καλά στην ROS1-στοχευμένη θεραπεία. Σε αυτή τη μελέτη, επιδιώξαμε να καθορίσει μηχανισμούς επίκτητης αντίστασης στην αναστολή ROS1. Για να επιτευχθεί αυτό, αναλύσαμε δείγματα όγκων από έναν ασθενή που αρχικά ανταποκρίθηκαν στην crizotinib αναστολέα ROS1 αλλά τελικά εξελίχθηκε επίκτητης αντοχής. Επιπλέον, δημιουργείται ένα ROS1 αναστολή ανθεκτικό παράγωγο του αρχικώς ευαίσθητων NSCLC κυτταρική γραμμή HCC78. Προηγουμένως περιγράφηκε μηχανισμούς επίκτητης αντοχής στους αναστολείς της τυροσινικής κινάσης, συμπεριλαμβανομένων στόχος μετάλλαξη της κινάσης πεδίου, το κέρδος αριθμού αντιγράφων στόχο, επιθηλιακά-μεσεγχυματικά μετάβαση, και μετατροπή σε μικρές ιστολογία του καρκίνου του πνεύμονα βρέθηκε ότι δεν αποτελούν τη βάση αντίσταση στο δείγμα του ασθενούς ή ανθεκτική κυτταρική γραμμή. Ωστόσο, κάναμε παρατηρούμε ένα διακόπτη στον έλεγχο της ανάπτυξης και επιβίωσης μονοπατιών σηματοδότησης από ROS1 με το EGFR στην ανθεκτική κυτταρική γραμμή. Ως αποτέλεσμα αυτού του διακόπτη, ROS1 αναστολή ανθεκτικά κύτταρα HCC78 έγινε ευαίσθητοι στην αναστολή EGFR, μια επίδραση που ενισχύθηκε με την ταυτόχρονη αγωγή με έναν αναστολέα ROS1. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η συν-αναστολή της ROS1 και EGFR μπορεί να είναι μια αποτελεσματική στρατηγική για την καταπολέμηση της αντοχής σε στοχευμένη θεραπεία σε μερικούς ασθενείς με ΜΜΚΠ σύντηξης θετικά ROS1

Παράθεση:. Davies KD, Mahale S, Astling DP, Aisner DL , Le AT, Hinz ΤΚ, et al. (2013) Αντοχή σε ROS1 παρεμπόδιση που προκαλείται από EGFR μονοπάτι ενεργοποίησης σε μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα. PLoS ONE 8 (12): e82236. doi: 10.1371 /journal.pone.0082236

Επιμέλεια: Srikumar Π Chellappan, H. Lee Moffitt Cancer Center & amp? Research Institute, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 17, Ιουνίου του 2013? Αποδεκτές: 22 Οκτωβρίου του 2013? Δημοσιεύθηκε: 13 του Δεκεμβρίου του 2013

Copyright: © 2013 Davies et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από τη χρηματοδότηση της έρευνας από τον καρκίνο Λιγκ του Κολοράντο στο KD Davies, ο Boettcher Ίδρυμα Webb-Waring Βραβείο Ιατροβιολογικών Ερευνών στην Κ.Ο. Doebele, και το Πανεπιστήμιο της επιχορήγησης Κολοράντο καρκίνο του πνεύμονα σπορίων (P50CA058187) με τον Μ Βαρελλά-Γκαρσία και Κ.Ο. Doebele. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή ή την ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. D.L. Aisner έχει λάβει αμοιβές από την Abbott Μοριακής. Ρ.Α. Bunn νεώτερος έχει λάβει αμοιβές συμβούλων από την Pfizer, η Novartis, Genentech /Roche, η AstraZeneca, η Boehringer Ingelheim, Astellas, και GlaxoSmithKline. D.R. Camidge έχει λάβει συμβουλευτικές αμοιβές διοικητικού συμβουλίου από την Pfizer. Κ.Ο. Doebele έχει λάβει χρηματοδότηση της έρευνας, αμοιβές συμβούλων και συμβουλευτικών αμοιβών του σκάφους από την Pfizer, αμοιβές από την Abbott Molecular, αμοιβές συμβούλων και συμβουλευτικών αμοιβών του σκάφους από την Boehringer Ingelheim, η χρηματοδότηση της έρευνας από ImClone, και τη χρηματοδότηση της έρευνας από την Eli Lilly. Δεν υπάρχουν διπλώματα ευρεσιτεχνίας, τα προϊόντα για την ανάπτυξη ή την εμπορία προϊόντων που να δηλώνουν. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

Ο καρκίνος του πνεύμονα, εκ των οποίων περίπου το 80-85% μπορεί να χαρακτηριστεί ως μη-μικροκυτταρικό καρκίνος του πνεύμονα (NSCLC), είναι η κύρια αιτία θνησιμότητας σχετίζονται με τον καρκίνο στον κόσμο [1]. Πρόσφατα, έχει γίνει σαφές ότι NSCLC είναι μια ετερογενής νόσος που μπορεί να σε μεγάλο βαθμό υποδιαιρούνται βασίζεται σε γενετικές αλλαγές που δημιουργούν κυρίαρχη ογκογονίδια οδηγού [2]. καρκινικά κύτταρα NSCLC είναι συχνά «εθισμένος» σε αυτές τις ενεργοποιημένα ογκογονίδια, όπως ότι η αναστολή της δραστηριότητάς τους μπλοκ πολλαπλασιαστικών και προ-επιβίωσης κυτταρικής σηματοδότησης, οδηγώντας τελικά σε διακοπή αύξησης και /ή κυτταρικό θάνατο. Είναι σημαντικό ότι πολλές από τις ογκογόνο οδηγών ανακαλυφθεί μέχρι σήμερα έχουν ενεργοποιηθεί κινάσες που μπορούν να στοχευθούν από αναστολείς μικρού μορίου. Gefitinib και erlotinib θεραπεία των ασθενών με NSCLC υπόθαλψη

EGFR

ενεργοποίηση μεταλλάξεων και crizotinib θεραπεία των ασθενών με NSCLC υποθάλπουν την ενεργοποίηση

ALK

ανακατατάξεις είναι επιτυχημένα παραδείγματα της στρατηγικής αυτής [3], [4]. Η θεραπεία με αυτά τα φάρμακα κινάσης αναστολέα οδηγεί σε βελτιωμένη αποτελεσματικότητα και έχει πιο ανεκτό παρενέργειες σε σύγκριση με το πρότυπο χημειοθεραπείες σε ασθενείς οι οποίοι προ-έλεγχο για τα ενεργοποίηση γενετικές αλλοιώσεις [5], [6], [7].

Παρά την αρχική αποτελεσματικότητα του gefitinib, erlotinib, και crizotinib σε επιλεγμένους ασθενείς με NSCLC, η επίκτητη αντοχή προκύπτει πάντα, συνήθως σε λιγότερο από ένα έτος. Στο κυτταρικό επίπεδο, αυτή η αντίσταση συμβαίνει με διάφορους μηχανισμούς. Η πρώτη από αυτές είναι η μετάλλαξη της περιοχής κινάσης στόχου που μειώνει την ικανότητα του φαρμάκου να αναστέλλει την κινάση. Για παράδειγμα, η μετάλλαξη Τ790Μ, ονομάζεται μετάλλαξη «φύλακα», μειώνει την ικανότητα των αναστολέων EGFR να outcompete σύνδεση με EGFR ΑΤΡ [8]. Αυτή η μετάλλαξη (μαζί με άλλα πολύ λιγότερο συχνές μεταλλάξεις σχετιζόμενες με την αντοχή) βρίσκεται σε μοντέλα κυτταρική γραμμή της αντίστασης και σε περίπου 50% των ασθενών που αναπτύσσουν επίκτητη ανθεκτικότητα στη θεραπεία με αναστολείς του EGFR [9], [10], [11]. Η ανάλογη θέση ρυθμιστή για ALK, L1196, ομοίως βρέθηκε να μεταλλαχθεί σε ALK σύντηξης-θετικό καρκίνο του πνεύμονα κατά το χρόνο της αντίστασης σε crizotinib και σε μοντέλα ανθεκτική κυτταρική γραμμή, όπως και οι διάφορες άλλες αμινοξέα για τα οποία μετάλλαξη μειώνει επίσης την ικανότητα του το φάρμακο για την αναστολή της κινάσης [12], [13], [14], [15], [16]. Ο δεύτερος μηχανισμός ανθεκτικότητας είναι η ενίσχυση της κινάσης στόχου. Στη θεωρία, η αύξηση του ποσού της κινάσης που εκφράζεται από το κύτταρο μπορεί να μειώσει την ικανότητα του φαρμάκου για τον κορεσμό του στόχου. Ενίσχυση του

ALK

συντήξεις έχει καταδειχθεί σε ανθεκτικά κύτταρα και ασθενείς που έχουν αναπτύξει αντοχή [13], [14], [16]. Επιπλέον, η ενίσχυση του

EGFR

έχει συσχετιστεί με αντίσταση στο

EGFR

μεταλλαγμένο καρκίνο του πνεύμονα, αν και στην πλειονότητα των περιπτώσεων το ενισχυμένο αλλήλιο φιλοξενεί το Τ790Μ μετάλλαξη [17], [18]. Ένα άλλο σημαντικό μηχανισμός αντοχής είναι η ενεργοποίηση εναλλακτικών συστατικών σηματοδότησης. Σε αυτήν την περίπτωση, οι πρωτεΐνες οι οποίες είναι προς τα κάτω από ή ότι η λειτουργία παράλληλα με το κινάση-στόχο ενεργοποιούνται και να ανατρέψει την εξάρτηση από την κινάση-στόχο για την τόνωση αποκλειστικά πολλαπλασιαστικών και προ-επιβίωσης σηματοδότησης. ΜΕΤ, ΡΙ3Κ, BRAF, IGF-1 R, FGFR1, ΜΕΚ, και η ενεργοποίηση ERK1 /2 έχουν όλες παρατηρηθεί σε EGFR αναστολέας ανθεκτικά

EGFR

μεταλλαγμένο ασθένεια ή /και κυτταρική σειρά μοντέλων [18], [19] , [20], [21], [22], [23], [24]. Η ενεργοποίηση ή ενίσχυση του EGFR, KRAS, και ΚΙΤ έχουν παρομοίως παρατηρηθεί σε crizotinib ανθεκτικά

ALK

αναδιατάσσεται ασθενών και κυτταρικές γραμμές [14], [15], [16], [25]. Επιπλέον, μια πρόσφατη μελέτη έδειξε ότι η έκθεση σε κοινούς παράγοντες ανάπτυξης είναι επαρκής για να επάγει αντίσταση σε στοχευμένες θεραπείες σε καρκινικές κυτταρικές σειρές από μία ποικιλία γενετικά υπόβαθρα, και το αποτέλεσμα αυτό συσχετίζεται με μία διάσωση από τα ναρκωτικά που προκαλείται ΑΚΤ και ERK αδρανοποίηση [26]. Τέλος, οι ιστολογικές και μορφολογικές αλλαγές αποδειχθεί ότι συσχετίζονται με αντίσταση. Συγκεκριμένα, η μετατροπή σε μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα ιστολογία του καρκίνου και επιθηλιακά-μεσεγχυματικά μετάβαση (ΕΜΤ) έχουν παρατηρηθεί σε

EGFR

μεταλλαγμένο ασθενών και κυτταρικές γραμμές ανθεκτικές σε αναστολείς EGFR [11], [18]. Οι μηχανιστικές βάσεις πίσω από αυτές τις αλλαγές δεν είναι πλήρως κατανοητοί.

ROS1

είναι μια κινάση της τυροσίνης του υποδοχέα που συνδέεται στενά με την

ALK

, και, όπως

ALK

, έχουν υποβληθεί γονιδιωματική αναδιάταξη που δημιουργεί πρωτεΐνες σύντηξης σε NSCLC και άλλων καρκίνων [27]. Είναι καλά τεκμηριωμένο ότι αυτές οι πρωτεΐνες σύντηξης δρουν ως ογκογόνο οδηγούς και ότι η αναστολή ROS1 είναι αντι-πολλαπλασιαστική σε κύτταρα που εκφράζουν ROS1 συντήξεις [28]. Επιπλέον, crizotinib, η οποία έχει δράση έναντι ROS1, αποδεικνύει την αποτελεσματικότητα σε

ROS1

NSCLC ασθενείς σύντηξης-θετική σε μία δοκιμή φάσης Ι [29]. Έτσι, λαμβάνοντας υπόψη την επιτυχία της crizotinib στο

ALK

σύντηξης-θετικό NSCLC, φαίνεται ότι ROS1 στοχευμένη θεραπεία θα μπορεί σύντομα να είναι το πρότυπο φροντίδας για αυτόν τον πληθυσμό ασθενών. Ωστόσο, με βάση τις εμπειρίες με άλλους αναστολείς κινάσης στον καρκίνο του πνεύμονα, είναι πλήρως αναμένεται ότι θα συμβεί επίκτητη αντοχή στην αναστολή ROS1, και αυτό τελικά θα περιορίσει τις επιλογές θεραπείας για αυτούς τους ασθενείς. Προς υποστήριξη αυτού, μια πρόσφατη μελέτη ανέφερε μια κλινική περίπτωση ενός

ROS1

αναδιάταξη θετικών ασθενών που ανέπτυξαν αντίσταση σε crizotinib μετά από μια αρχική απάντηση [30]. Ο ασθενής βρέθηκε να έχει υποστεί μετάλλαξη στο

ROS1

περιοχή κινάσης που παρενέβαινε με φάρμακο δέσμευσης [30]. Σε αυτή τη μελέτη, επιδιώξαμε να καθορίσει μηχανισμούς αντοχής στην αναστολή ROS1. Αυτό επιτεύχθηκε χρησιμοποιώντας κλινικά δείγματα από έναν ασθενή που έγιναν ανθεκτικά σε crizotinib και ROS1 αναστολή ανθεκτικό παράγωγο του

ROS1

αναδιατάσσονται NSCLC κυτταρική σειρά HCC78.

Αποτελέσματα

έχουν αναφερθεί στο παρελθόν την αναγνώριση ενός ασθενούς NSCLC οι οποίοι εξέφρασαν την

sdc4-ROS1

σύντηξης και την επιτυχή αντιμετώπιση αυτού του ασθενούς με crizotinib [28]. Ο ασθενής εμφάνισε 57% συρρίκνωση του όγκου μετά από δύο κύκλους θεραπείας 28 ημερών. Ωστόσο, παρά τη συνεχή θεραπεία, την απόδειξη της εξέλιξης της νόσου ανακαλύφθηκε περίπου 18 εβδομάδες μετά την έναρξη της θεραπείας. Κατά το χρόνο αυτό, ελήφθη μια βιοψία δι ‘εκτομής του όγκου προχωρούν. Στοχευμένη αλληλούχιση ανθεκτικών αυτού του δείγματος βιοψίας αποκάλυψε ότι, παρόμοια με τη βιοψία προεπεξεργασία, ολόκληρη η

ROS1

τομέα κινάσης ήταν άγριου τύπου (WT), που σημαίνει ότι

ROS1

μετάλλαξη πεδίου κινάσης ήταν όχι ο μηχανισμός της αντίστασης (Πίνακας 1). Ανάλυση στιγμιότυπο ανέφερε επίσης WT κατάσταση των κοινώς μεταλλαγμένων υπολειμμάτων σε διάφορα άλλα γνωστά ογκογονίδια (συμπεριλαμβανομένων των

EGFR

,

KRAS

, και

BRAF

) τόσο στην προ-επεξεργασίας και μετά ανθεκτικότητας στο δείγματα (Πίνακας 1). Στη συνέχεια εξετάστηκε αριθμός αντιγράφων κέρδος του

ROS1

γονίδιο σύντηξης ως δυνητικός μηχανισμός αντίστασης. Αυτό επιτεύχθηκε με τη χρήση φθορισμού

σε in situ υβριδισμού

(FISH) με ανιχνευτές τόσο στα 5 ‘και 3’ περιοχές του γονιδίου. Η μέση ενιαία «σήμα 3 (εκπρόσωπος του γονιδίου σύντηξης) αριθμός ανά κύτταρο όγκου ήταν 1,7 στο δείγμα προ-επεξεργασίας και 1.82 στο δείγμα μετά αντοχή, μια μη σημαντική διαφορά (Σχήμα 1Α). Αυτό το εύρημα πρότεινε ότι η αύξηση του αριθμού αντιγράφων δεν ήταν ο μηχανισμός αντίστασης στη όγκου αυτού του ασθενούς. Το δείγμα μετά την αντίσταση αποκάλυψε μια απώλεια στο ενιαίο σήμα 5 ‘? Ωστόσο, αυτό δεν αναμένεται να είναι λειτουργικά σημαντική (Σχήμα 1Α). Επαληθεύσαμε ότι το γονίδιο σύντηξης εκφράζεται κατά το χρόνο της αντίστασης, και ότι η αναλογία της μακράς (

sdc4

εξόνιο 2 συγχωνευμένο με

ROS1

εξόνιο 32 (SD2? R32)) σε σύντομες (

sdc4

εξόνιο 2 συγχωνευμένο με

ROS1

εξόνιο 34 (SD2? R34)) παραλλαγές ήταν παρόμοια με το δείγμα προ-επεξεργασίας (Εικόνα 1Β). εξέταση μορφολογική του δείγματος που λαμβάνονται σε αντίσταση αποδεικνύεται παχουλό επιθηλιοειδή κύτταρα με μεγάλο λόγο πυρήνα προς κυτόπλασμα, εξέχοντα πυρήνια, και ηωσινοφιλική κυτταρόπλασμα, παρόμοια με τη βιοψία προεπεξεργασίας (Σχήμα 1 C). Αυτά τα ευρήματα υποδεικνύουν ότι δεν είχε επέλθει μικρή μετατροπή των κυττάρων. Τέλος, δεν μορφολογική ένδειξη του EMT όπως κυτταρικά υψηλός και λεπτός, παρατηρήθηκε, και η βιοψία που λαμβάνονται σε αντίσταση αποδεικνύεται αρνητική ανοσοϊστοχημική χρώση για βιμεντίνη, ένα δείκτη ΕΜΤ (Σχήμα S1). Η έλλειψη στοιχείων για τις εν λόγω κοινούς μηχανισμούς αντίστασης ήταν ενδεικτικά της προς τα πάνω ρύθμιση εναλλακτική σηματοδότησης ως υποκείμενο μηχανισμό της αντίστασης στην crizotinib σε αυτόν τον ασθενή.

(Α) Προ-επεξεργασία και μετα-αντίσταση ανάλυση των δειγμάτων ασθενών με BREAK- εκτός δοκιμασία FISH για

ROS1

. Κόκκινο ανιχνευτές είναι στην 5 ‘περιοχή του ROS1 και πράσινο ανιχνευτές στο 3’ περιοχή. Οι τιμές αντιπροσωπεύουν τον μέσο αριθμό των σημάτων ανά κύτταρο. Το ενιαίο «σήμα 3 (τιμές υπογραμμισμένη) είναι ενδεικτική της

ROS1

αριθμού αντιγράφων του γονιδίου σύντηξης. (Β) RT-PCR, χρησιμοποιώντας εκκινητές για

sdc4

και

ROS1

που καλύπτουν το σημείο σύντηξης, που διεξήχθη σε προ-επεξεργασίας και δείγματα όγκων μετα-αντίσταση. SD2? R32 είναι το «μακρύ» παραλλαγή (σύντηξη του

sdc4

εξόνιο 2 έως

ROS1

εξόνιο 32) και SD2? R34 είναι η «μικρή» παραλλαγή (σύντηξη του

sdc4

εξόνιο 2 έως

ROS1

εξόνιο 34). (C) με αιματοξυλίνη και ηωσίνη χρώση των προ-επεξεργασίας και μετά την αντοχή των δειγμάτων των ασθενών.

Η

Για να δημιουργήσετε ένα μοντέλο κυτταρική γραμμή της αντίστασης στην αναστολή ROS1, είμαστε σε χρόνια θεραπεία η

SLC34A2-ROS1

εκφράζει NSCLC HCC78 κυτταρική σειρά με αυξανόμενες συγκεντρώσεις του αναστολέα TAE684 ROS1. Αυτή η μέθοδος έχει χρησιμοποιηθεί προηγουμένως για τη δημιουργία ανθεκτικών μοντέλων για δύο αναστολείς EGFR σε

EGFR

της μεταλλαγμένα κύτταρα και crizotinib σε

ALK

αναδιατάχθηκαν κύτταρα, και οι μηχανισμοί που παρατηρούνται σε αυτά τα μοντέλα έχουν συσχετισθεί με ό, τι παρατηρείται σε ασθενείς [13], [15], [19]. Επιλέξαμε να χρησιμοποιήσουμε TAE684 (μη-κλινικές ένωση) πάνω crizotinib (ένα φάρμακο με την κλινική δραστικότητα έναντι ROS1) επειδή crizotinib έχει μια σχετικά υψηλή IC

50 HCC78 κύτταρα και μόνο ένα πολύ στενό παράθυρο εξόδους μεταξύ του IC

50 και εκτός στόχου δραστηριότητες του φαρμάκου [28], [31]. Με άλλα λόγια, με τη χρήση TAE684 για να κάνει τα κύτταρα ανθεκτικά σε ROS1 αναστολή αντί crizotinib, ήμασταν σε θέση να εξασφαλίσει μια πιο πλήρη αναστολή της πρωτεΐνης σύντηξης ROS1 σε δόσεις που δεν παρουσιάζουν εκτός στόχου αντι-πολλαπλασιαστικά αποτελέσματα. Μετά από περίπου 4 μήνες καλλιέργεια σε αυξανόμενες συγκεντρώσεις, το παράγωγο ανθεκτική της γραμμής HCC78, το οποίο ονομάζεται HCC78-TR, ήταν σε θέση να πολλαπλασιάζονται κανονικά σε 500 ηΜ TAE684. Οι αρχικές προσπάθειες για την αύξηση της δόσης σε καλλιέργεια ήταν ανεπιτυχείς περαιτέρω, έτσι 500 ηΜ θεωρήθηκε ένα μέγιστο και τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν συνεχώς σε αυτή τη συγκέντρωση του φαρμάκου. Όταν η ευαισθησία αυτών των κυττάρων να TAE684 αναλύθηκε σε δοκιμασίες πολλαπλασιασμού, προσδιορίστηκε ότι το IC

50 TAE684 ήταν μεγαλύτερη από 1 μΜ (Σχήμα 2Α). Αυτό είναι παρόμοιο με άλλες κυτταρικές σειρές NSCLC που δεν περιέχουν ALK ή συντήξεις ROS1 (H322 και HCC4006), υποδηλώνοντας ότι οι αντι-πολλαπλασιαστικά αποτελέσματα σε αυτό το εύρος είναι πιθανόν να οφείλεται σε εκτός στόχου δραστηριότητες. κύτταρα HCC78-TR ήταν επίσης λιγότερο ευαίσθητα σε crizotinib, και πάλι, το επίπεδο της ευαισθησίας ήταν πιο παρόμοια με κύτταρα που δεν εκφράζουν ALK ή συντήξεις ROS1 (Σχήμα 2Β). Ωστόσο, η απευαισθητοποίηση ήταν ειδική για αναστολή ROS1, καθώς τα κύτταρα HCC78-TR διατήρησαν την ευαισθησία τους στη πεμετρεξίδη, ένα FDA εγκεκριμένο χημειοθεραπεία για μη πλακώδους καρκίνου του πνεύμονα (Σχήμα 2C). Η αντίσταση στην αναστολή ROS1 δεν εξηρτάτο από τη συνεχή καλλιέργεια σε παρουσία 500 ηΜ TAE684, επειδή τα κύτταρα που ελήφθησαν από φάρμακο, παρέμειναν ανθεκτικοί για έως 6 μήνες και 47 διόδους (Σχήμα S2).

Cells υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με TAE684 (Α), crizotinib (Β), ή πεμετρεξίδη (C) ως single-παράγοντες για 3 ημέρες και στη συνέχεια αναλύθηκαν με δοκιμασία MTS. Οι τιμές αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± SEM (n = 3-7). Υπολογίζεται IC

50 τιμές για TAE684: γονική HCC78 = 0.14 μΜ, HCC78-TR = 1,09 μΜ, H322 = 1.42 μΜ, και HCC4006 = 1.15 μΜ. Υπολογίζεται IC

50 τιμές για crizotinib: γονική HCC78 = 0.79 μΜ, HCC78-TR = 1.95 μΜ, H322 = 4.13 μΜ, και HCC4006 = 3.03 μΜ. Υπολογίζεται IC

50 τιμές για πεμετρεξίδη: γονική HCC78 = 11 nM και HCC78-TR = 14 nM. κύτταρα HCC78-TR ήταν σημαντικά λιγότερο ευαίσθητα από τα γονικά κύτταρα HCC78 να TAE684 (p & lt? 0.000005) και crizotinib (p & lt? 0.05), αλλά όχι την πεμετρεξίδη (p & gt? 0,05). όπως καθορίζεται από ζεύγη έλεγχος τ

Η

αλληλουχίας του γονικού HCC78 και κύτταρα HCC78-TR έδειξε ότι η περιοχή της κινάσης του

ROS1

ήταν WT για τις δύο γραμμές, γεγονός που υποδηλώνει ότι

ROS1

μετάλλαξη δεν ήταν υπεύθυνος για την αντίσταση στην αναστολή ROS1 (Τραπέζι 1).

EGFR

,

KRAS

, και

BRAF

βρέθηκαν επίσης να είναι WT στις δύο κυτταρικές σειρές (Πίνακας 1). ανάλυση FISH έδειξαν ότι τα κύτταρα HCC78-TR έχασε 1 αντίγραφο του

ROS1

γονιδίου σύντηξης σε σύγκριση με την γονική γραμμή (1 αντίγραφο έναντι 2 αντίγραφα, αντίστοιχα), γεγονός που υποδηλώνει ότι αριθμός αντιγράφων κέρδος του γονιδίου σύντηξης ήταν όχι ο μηχανισμός της ανθεκτικότητας (Σχήμα 3Α). Ως αποτέλεσμα της γονιδιωματικής απώλεια 1 αντίγραφο του γονιδίου σύντηξης, λιγότερο

SLC34A2-ROS1

mRNA εκφράστηκε στα κύτταρα HCC78-TR (Σχήμα S3). Αν και η σημασία της μειωμένης έκφρασης του γονιδίου σύντηξης είναι ασαφής, αναγκαστική έκφραση μιας ενεργοποιημένης πρωτεΐνης σύντηξης ROS1 (sdc4-ROS1) στα κύτταρα HCC78-TR δεν τους εκ νέου ευαισθητοποιηθούν TAE684 (Σχήμα S4). Περίπου το 40% των κυττάρων HCC78-TR εμφανίζεται μια αύξηση στον αριθμό των αντιγράφων του 5 ‘περιοχή του

ROS1

(από 2 έως 4 αντίγραφα αντίγραφα), αν και αυτό δεν αναμένεται να είναι λειτουργικά σημαντικές καθώς η 5 ‘περιοχή δεν παρουσιάζει δραστικότητα κινάσης (Σχήμα 3Α). Επιπλέον, η μορφολογία των κυττάρων HCC78-TR δεν διέφερε οπτικά από εκείνη της γονικής γραμμής HCC78, υποδεικνύοντας ότι η μετατροπή σε ένα μικρό πνεύμονα μορφολογία καρκίνος δεν συνέβη (Σχήμα 3Β). Με την ποσοτικοποίηση mRNA,

Cdh1

επίπεδα ήταν παρόμοια μεταξύ των δύο κυτταρικές σειρές και

VIM

επίπεδα μειώθηκαν 3 φορές στη γραμμή HCC78-TR (Σχήμα S5). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι ΕΜΤ δεν ήταν ο μηχανισμός της αντίστασης. Τέλος, δεν παρατηρήσαμε σημαντικές αυξήσεις στην έκφραση του mRNA οποιασδήποτε από τις ΑΤΡ-σύνδεσης γονίδια της οικογένειας μεταφορέα κασέτας στα κύτταρα HCC78-TR, υποδηλώνοντας ότι η ενισχυμένη εκροής φαρμάκου πιθανότατα δεν αντιπροσωπεύουν την αντίσταση να ROS1 αναστολή (Πίνακας S1).

(Α) Γονική HCC78 και HCC78-TR κύτταρα αναλύθηκαν με τη δοκιμασία FISH διάλειμμα-εκτός για

ROS1

. Κόκκινο ανιχνευτές είναι στην 5 ‘περιοχή του ROS1 και πράσινο ανιχνευτές στο 3’ περιοχή. Οι τιμές αντιπροσωπεύουν τον αριθμό των σημάτων ανά κύτταρο. Το ενιαίο «σήμα 3 (τιμές υπογραμμισμένη) είναι ενδεικτική της

ROS1

αριθμού αντιγράφων του γονιδίου σύντηξης. Στη γραμμή HCC78-TR, δύο πληθυσμοί υπήρχαν που διέφεραν ανάλογα με τον αριθμό των 5 ‘σήματα που ανιχνεύονται. (Β) Εκπρόσωπος φωτεινές εικόνες τομέα της γονικής HCC78 και κύτταρα HCC78-TR.

Η

Στη συνέχεια ρώτησε αν η αντοχή στην αναστολή ROS1 μπορεί να οφείλεται σε αλλαγές στην κατάντη κυτταρική σηματοδότηση. Η γονική HCC78 και τα κύτταρα HCC78-TR υποβλήθηκαν σε αγωγή με μία δόση εύρους των TAE684 για 4 ώρες και στη συνέχεια τα κυτταρολύματα αναλύθηκαν με στύπωμα Western. Παρόμοια με ό, τι έχουμε ήδη αναφερθεί, θεραπεία TAE684 μειωμένη ROS1 αυτοφωσφορυλίωση και φωσφορυλίωση ενεργοποίηση του SHP-2, ΑΚΤ, και ERK1 /2 στα γονικά κύτταρα HCC78 (Σχήμα 4Α) [28]. Όπως προβλέπεται από την γονιδιωματική απώλεια αριθμός αντιγράφων του

ROS1

γονίδιο σύντηξης και της μειωμένης έκφρασης του mRNA, τα κύτταρα HCC78-TR εκφράζεται λιγότερο της πρωτεΐνης σύντηξης από την γονική γραμμή και ROS1 αυτοφωσφορυλίωση δεν μπορούσε να ανιχνευθεί. Η μείωση της ποσότητας της πρωτεΐνης σύντηξης ROS1 συσχετίζεται με μία μείωση στην βασική φωσφορυλίωση της SHP-2. Ωστόσο, παρά την απώλεια πρωτεΐνης σύντηξης, τα βασικά επίπεδα της φωσφορυλιώνεται ERK1 /2 ήταν παρόμοια με την γονική γραμμή και τα βασικά επίπεδα της φωσφορυλιωμένης ΑΚΤ ήταν μεγαλύτερη σε σχέση με την πατρική γραμμή. Σημαντικά, η θεραπεία TAE684 δεν οδήγησε σε de-φωσφορυλίωση του ERK1 ή ΑΚΤ /2 στα ανθεκτικά κύτταρα. Παρόμοια αποτελέσματα παρατηρήθηκαν με τη θεραπεία crizotinib (Σχήμα 4Β).

Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με TAE684 (Α) ή crizotinib (Β) για 4 ώρες. Τα υλικά λύσεως των κυττάρων στη συνέχεια αναλύθηκαν με κηλίδα Western, χρησιμοποιώντας τα υποδεικνυόμενα αντισώματα.

Η

Η μείωση της ποσότητας του εκφρασμένη πρωτεΐνη σύντηξης ROS1, η επιμονή των βασικών ΑΚΤ και την ενεργοποίηση ERK1 /2, και της έλλειψης αναστολή της ΑΚΤ και ERK1 /2 από τους αναστολείς ROS1 πρότεινε ότι μια εναλλακτική οδό σηματοδότησης είχε ενεργοποιηθεί στα κύτταρα HCC78-TR. Σε μια προσπάθεια να προσδιοριστούν τα συστατικά ρυθμίζεται προς τα πάνω οδού, εκτελέσαμε δύο πειράματα συστοιχίας φωσφο-πρωτεΐνης: μία που εξετάστηκαν κινάσες τυροσίνης υποδοχέα (RTKs) και ένα που αναλύθηκαν κατάντη κινάσες (μεταξύ άλλων πρωτεϊνών). Όπως έχουμε παρατηρήσει στο παρελθόν, η γονική γραμμή HCC78 εξέφρασε φωσφορυλιωμένη EGFR και ΚΟΑ όταν εξετάζεται με τη σειρά φωσφο-RTK (Σχήμα 5Α) [28]. Η γραμμή HCC78-TR που εκφράζεται ακόμη φωσφορυλιωμένου EGFR, αλλά φωσφο-ΜΕΤ ήταν σημαντικά μειωμένη (Σχήμα 5Α). Δεν παρατηρήθηκαν άλλες σημαντικά φωσφορυλιώθηκε κινάσες τυροσίνης υποδοχέα. Όπως είχε προβλεφθεί από την ανάλυση κηλίδος western, ΑΚΤ φωσφο-S473 αυξήθηκε στα κύτταρα HCC78-TR σε σύγκριση με τα γονικά κύτταρα, όπως ήταν αρκετές θέσεις φωσφορυλίωσης επί ρ53 (Σχήμα 5Α). Αυτές ήταν οι μόνες διαφορές που παρατηρήθηκαν με συστοιχία φωσφο-πρωτεΐνης.

(Α) Phospho-RTK (επάνω) και φωσφο-κινάση (κάτω) σειρά αναλύσεων που εκτελούνται σε μη κατεργασμένα γονικών HCC78 και κυττάρων HCC78-TR. Οι πρωτεΐνες που παρουσιάζουν ενδιαφέρον επισημασμένο. Unlabeled κηλίδες στις γωνίες των δύο συνόλων των πινάκων είναι ο θετικός έλεγχος. (Β) Η γονική HCC78 και κύτταρα HCC78-TR υποβλήθηκαν σε αγωγή με TAE684, gefitinib, ή ένα συνδυασμό και των δύο για 4 ώρες. Τα υλικά λύσεως των κυττάρων στη συνέχεια αναλύθηκαν με κηλίδα Western, χρησιμοποιώντας τα υποδεικνυόμενα αντισώματα. κύτταρα (C) Η γονική HCC78 (Ρ) και HCC78-TR (Τ) αφέθηκαν χωρίς θεραπεία, θεραπεία με 1 μΜ gefitinib για 4 ώρες, ή σε επεξεργασία με 100 ng /ml EGF επί 10 λεπτά. Τα υλικά λύσεως των κυττάρων στη συνέχεια αναλύθηκαν με κηλίδα Western, χρησιμοποιώντας τα υποδεικνυόμενα αντισώματα.

Η

Έχουμε αποδείξει προηγουμένως ότι η σηματοδότηση EGFR είναι μερικώς δραστηριοποιείται στην γονική γραμμή HCC78, ως ένα ισχυρό αντι-πολλαπλασιαστική επίδραση του TAE684 μπορούσε να επιτευχθούν μόνο με συν-θεραπεία με τον αναστολέα gefitinib EGFR [28]. Λόγω των παρατηρήσεων ότι EGFR ήταν το μόνο σημαντικά φωσφορυλιωμένο RTK στη γραμμή HCC78-TR, και ότι ΑΚΤ, η οποία συνήθως ενεργοποιείται κατάντη του EGFR, ήταν πιο βαριά φωσφορυλιωμένο στη γραμμή HCC78-TR, υποθέσαμε ότι ίσως EGFR σηματοδότησης είχε περαιτέρω ασχολούνται με τα ανθεκτικά κύτταρα. Για να ελεγχθεί αυτή η υπόθεση, υποβάλλαμε σε αγωγή γονικών HCC78 και κυττάρων HCC78-TR με 200 ηΜ TAE684, 1 μΜ gefitinib, ή ένα συνδυασμό και των δύο για 4 ώρες. Και πάλι, φωσφο-ΑΚΤ και φωσφο-ERK1 /2 ήταν ευαίσθητα στην TAE684 μεταχείρισης στην γονική γραμμή, αλλά όχι η γραμμή HCC78-TR (Σχήμα 5Β). Ωστόσο, η κατάσταση αντιστράφηκε όταν αυτές οι γραμμές υποβλήθηκαν σε αγωγή με gefitinib, με προς τα κάτω σηματοδότηση είναι ευαίσθητη στη γραμμή HCC78-TR αλλά όχι την γονική γραμμή (Σχήμα 5Β). Παρόμοια αποτελέσματα παρατηρήθηκαν με τη χημικά διακριτών αναστολείς EGFR erlotinib, λαπατινίμπη, και afatinib, γεγονός που υποδηλώνει ότι τα αποτελέσματα οφείλονταν σε on-στόχο αναστολής EGFR (Εικόνα S6). Έτσι, WT EGFR είχε γίνει η κυρίαρχη κινητήρια δύναμη της ανάπτυξης και επιβίωσης σηματοδότηση μονοπατιών στα κύτταρα HCC78-TR. Αυτή η αλλαγή στην κυτταρική σηματοδότηση συσχετίζεται με μια μέτρια αύξηση στα ολικά επίπεδα EGFR σε κύτταρα HCC78-TR σε σύγκριση με τα γονικά κύτταρα HCC78 (Σχήμα 5C). Η αυτοφωσφορυλίωση του EGFR, όπως προσδιορίζεται με κηλίδα western χρησιμοποιώντας ένα κοκτέιλ από τοπο-ειδικών αντισωμάτων φωσφορυλίωση, ήταν σχετικά χαμηλός σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές. Ωστόσο, κατά τη διέγερση με το EGFR συνδέτη EGF, αυτοφωσφορυλίωση αυξήθηκε και ήταν υψηλότερη στα κύτταρα HCC78-TR (Σχήμα 5C). mRNA ποσοτικοποίηση αποκάλυψε ότι οι περισσότεροι συνδετήρες EGFR δεν ήταν σημαντικά περισσότερο εκφράζεται στα κύτταρα HCC78-TR, με εξαίρεση το NRG1 οποία εμφανίζεται μια 4-πλάσια αύξηση στα επίπεδα mRNA (Σχήμα S7).

Λόγω του διακόπτη τον έλεγχο της ανάπτυξης και επιβίωσης μονοπατιών σηματοδότησης από ROS1 προς EGFR σε κύτταρα HCC78-TR, υποθέσαμε ότι ο πολλαπλασιασμός αυτών των κυττάρων θα ήταν ευαίσθητα στην αναστολή EGFR. Για να ελέγξει την υπόθεση αυτή, θα αντιμετωπίζονται τόσο γονική HCC78 και HCC78-TR κύτταρα με gefitinib ως μονοθεραπεία σε δοκιμασίες πολλαπλασιασμού. Όπως έχουμε ήδη αναφερθεί, gefitinib σε συγκεντρώσεις έως 5 μΜ δεν επηρέασε τον πολλαπλασιασμό των γονικών κυττάρων HCC78 (Σχήμα 6Α) [28]. Ωστόσο, το φάρμακο ανέστειλε μετρίως τον πολλαπλασιασμό HCC78-TR κύτταρα (Σχήμα 6Α). Παρόμοια αποτελέσματα παρατηρήθηκαν με erlotinib (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Στη συνέχεια Υποθέσαμε ότι, δεδομένου ότι τα κύτταρα HCC78-TR ακόμη εκφράζεται κάποια, αν μειωμένα επίπεδα της πρωτεΐνης σύντηξης ROS1, μια πλήρης αντι-πολλαπλασιαστική δράση που προκαλείται από gefitinib θα απαιτούσε συν-αναστολή της ROS1. Για να ελεγχθεί αυτή η υπόθεση, έχουμε κατεργασμένα κύτταρα HCC78-TR με ένα δοσολογικό εύρος από gefitinib σε συνδυασμό με 500 ηΜ TAE684 (η συγκέντρωση του φαρμάκου που αυτά τα κύτταρα ήταν συνεχώς καλλιεργήθηκαν in). Η προσθήκη 500 ηΜ TAE684 δεν είχε αντι-πολλαπλασιαστική δράση από μόνη της? Ωστόσο, ευαισθητοποιημένα περαιτέρω τα κύτταρα προς θεραπεία gefitinib (Σχήμα 6Β). Υπό αυτές τις συνθήκες, τα κύτταρα HCC78-TR δεν ήταν τόσο ευαίσθητο όπως η κυτταρική γραμμή HCC827 NSCLC η οποία οδηγείται από E746_A750del EGFR. Αυτό αναμένεται επειδή ενεργοποίηση μεταλλάξεων στο EGFR ενισχύσει συγγένειά του για αναστολείς κινάσης EGFR [32]. Ωστόσο, τα κύτταρα HCC78-TR ήταν το ίδιο ή περισσότερο ευαίσθητη από τις WT EGFR εκφράζουν γραμμές NSCLC Η358 και H322, αντίστοιχα (Σχήμα 6Β). Αυτές οι δύο κυτταρικές γραμμές έχουν αναφερθεί ότι είναι εξαιρετικά ευαίσθητα στο gefitinib σε σύγκριση με άλλες WT EGFR εκφράζουν γραμμές NSCLC [33]. Είναι σημαντικό ότι, στα κύτταρα HCC78-TR, σημαντική αντι-πολλαπλασιαστική δράση παρατηρήθηκε σε κλινικά σχετικές δόσεις της gefitinib (~ 1 μΜ), όταν συνδυάζεται με αναστολή ROS1 [34].

(Α) Γονική HCC78 και HCC78- κύτταρα TR υποβλήθηκαν σε θεραπεία με gefitinib ως μονοθεραπεία για 3 ημέρες και στη συνέχεια αναλύθηκαν με δοκιμασία MTS. (Β) Η γονική HCC78 και κύτταρα HCC78-TR συν-θεραπεία με 500 ηΜ TAE684 και gefitinib, και HCC827, H322, και τα κύτταρα Η358 υποβλήθηκαν σε αγωγή με gefitinib μονοθεραπεία για 3 ημέρες και στη συνέχεια αναλύθηκαν με δοκιμασία MTS. Υπολογίζεται IC

50 τιμές: γονική HCC78 (κάτω του 50% με μονοθεραπεία TAE684), HCC78-TR = 0.86 μΜ, HCC827 = 0.04 μΜ, H322 = & gt? 5 μΜ, και H358 = 1,0 μΜ. Όλες οι τιμές αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± SEM (n = 4).

Η

Ως απόδειξη της ιδέας ότι η ενεργοποίηση του EGFR μπορεί να απο-ευαισθητοποίηση των κυττάρων σύντηξης με γνώμονα ROS1 σε αναστολή ROS1, εξετάσαμε την επίδραση της ενεργοποίηση του υποδοχέα που επάγεται με συνδέτη επί ευαισθησία. Για να επιτευχθεί αυτό, πραγματοποιήσαμε προσδιορισμούς πολλαπλασιασμού εξέταση ευαισθησίας στην TAE684 απουσία ή παρουσία του EGFR προσδέματος EGF. Βρήκαμε ότι η προσθήκη του EGF κατά την έναρξη της δοκιμασίας απευαισθητοποιούνται σημαντικά τα γονικά κύτταρα HCC78 στην αναστολή του ROS1 (Σχήμα 7Α). Σε αντίθεση, ο EGF δεν είχε καμία επίδραση επί της ευαισθησίας των κυττάρων HCC78-TR, η οποία αναμενόταν λόγω της ήδη μέγιστη αναισθησία αυτής της γραμμής (

cf

Σχήμα 2Α). Μηχανιστικά, η απευαισθητοποίηση στα γονικά κύτταρα HCC78 συσχετίζεται με μια διάσωση από EGF από την TAE684 επαγόμενη de-φωσφορυλίωση των ΑΚΤ και ERK1 /2 (Σχήμα 7Β).

Γονική HCC78 και HCC78-TR κυττάρων (Α) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με TAE684 για 3 ημέρες, με ή χωρίς την προσθήκη 100 ng /ml EGF και στη συνέχεια αναλύθηκαν με δοκιμασία MTS. Οι τιμές αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± SEM (n = 3). Υπολογίζεται IC

50 τιμές για TAE684: γονική + όχημα = 0,18 μΜ, γονική + EGF = 0.57 μΜ, HCC78-TR + όχημα = 1.39 μΜ, και HCC78-TR + EGF = 1.45 μΜ. EGF απευαισθητοποιούνται σημαντικά γονική HCC78 αλλά όχι κύτταρα HCC78-TR για TAE684 όπως προσδιορίζεται με ζεύγη έλεγχος τ (ρ & lt? 0,05). (Β) γονικά κύτταρα HCC78 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με TAE684 για 4 ώρες, EGF για 10 λεπτά, ή ένα συνδυασμό και των δύο. Τα υλικά λύσεως των κυττάρων στη συνέχεια αναλύθηκαν με κηλίδα Western, χρησιμοποιώντας τα υποδεικνυόμενα αντισώματα. (C) CUTO-2 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με TAE684 για 4 ημέρες με ή χωρίς την προσθήκη 100 ng /ml EGF και στη συνέχεια αναλύθηκαν με δοκιμασία MTS. Οι τιμές αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± SEM (n = 3). Υπολογίζεται IC τιμές

50 για TAE684: + όχημα = 0.2 μΜ και + EGF = 0.81 μΜ. EGF απευαισθητοποιούνται σημαντικά CUTO-2 κύτταρα να TAE684 όπως προσδιορίζεται με ζεύγη έλεγχος τ (ρ & lt? 0,01). (D) κύτταρα CUTO-2 υποβλήθηκαν σε θεραπεία με TAE684 για 4 ώρες, EGF για 10 λεπτά, ή ένα συνδυασμό και των δύο. Τα υλικά λύσεως των κυττάρων στη συνέχεια αναλύθηκαν με κηλίδα Western, χρησιμοποιώντας τα υποδεικνυόμενα αντισώματα. Η φωσφορυλιωμένη ROS1 ζώνες ήταν κάτω από το όριο ανίχνευσης και επομένως δεν συμπεριλαμβάνονται.

Η

Μία κυτταρική γραμμή προήλθε από τη βιοψία που λήφθηκε από ανθεκτικά όγκου του ασθενούς. Δημιουργία αυτής της κυτταρικής γραμμής, που έχουμε ονομάζεται Κολοράντο Πανεπιστήμιο Θώρακος Ογκολογίας-2 (CUTO-2), πήρε περίπου ένα χρόνο στον πολιτισμό και έγινε εν τη απουσία ενός αναστολέα ROS1. Όταν τα κύτταρα έφθασαν επαρκή αριθμό διόδου (& gt? 35 περάσματα) και επαρκή ρυθμό ανάπτυξης για την πειραματική ανάλυση, εξετάσαμε την κατάσταση ROS1 γονιδιακή σύντηξη, η έκφραση της πρωτεΐνης σύντηξης ROS1, και ευαισθησία στην αναστολή ROS1. Τα κύτταρα CUTO-2 επαληθεύθηκαν να εξακολουθούν να εμφανίζουν αναδιάταξη του

ROS1

γονίδιο και εκφράζουν μια πρωτεΐνη σύντηξης ROS1 (Σχήμα S8A, Β). Σε προσδιορισμούς πολλαπλασιασμού, τα κύτταρα CUTO-2 έδειξαν μια παρόμοια ευαισθησία σε TAE684 και μια ελαφρώς αυξημένη ευαισθησία σε crizotinib σε σύγκριση με τα γονικά κύτταρα HCC78 (Σχήμα 7C και Σχήμα S8C). Είναι ενδιαφέρον ότι, όπως και τα γονικά κύτταρα HCC78, ευαισθησία στην αναστολή ROS1 θα μπορούσε να μειωθεί με την εφαρμογή EGF και αυτό συσχετίζεται με απευαισθητοποίηση διάσωση από TAE684 προκαλούμενη μείωση του φωσφορυλιωμένου ΑΚΤ και ERK1 /2 (Σχήμα 7 C και D).

Συζήτηση

επίκτητη αντοχή σε στοχευμένες θεραπείες είναι ένας σημαντικός περιορισμός για την θεραπεία των ασθενών με καρκίνο του πνεύμονα. Ωστόσο, μπορούν να αναπτυχθούν ορθολογική προσεγγίσεις για την καταπολέμηση της αντοχής φορά προσδιορίζονται οι μοριακών και κυτταρικών μηχανισμών που διέπουν. Σε αυτή τη μελέτη, διερευνήσαμε μηχανισμούς αντοχής σε αναστολή ROS1 στον NSCLC. Αυτό επιτεύχθηκε χρησιμοποιώντας δείγματα όγκου από έναν ασθενή ο οποίος έγινε NSCLC ανθεκτικά σε crizotinib και μία κυτταρική γραμμή NSCLC που κάναμε ανθεκτική στην αναστολή ROS1 με συνεχή καλλιέργεια στο TAE684 αναστολέα ROS1. Στην ιδανική περίπτωση, μελέτες που έγιναν για να εξετάσει μηχανισμούς ανθεκτικότητας αφορούν δείγμα τραπεζών από πολλούς ασθενείς και πολλαπλές διαφορετικές κυτταρικές σειρές. Ωστόσο, όπως

ROS1

ανακατατάξεις υπάρχουν μόνο στο 1-2% των ασθενών με NSCLC, είχαμε πρόσβαση σε έναν ασθενή ο οποίος έγινε ανθεκτική στη θεραπεία μόνο. Επίσης, πριν από παραγωγή μας της γραμμής CUTO-2, HCC78 ήταν το μόνο που δημοσιεύθηκε NSCLC κυτταρική γραμμή γνωστή ότι εκφράζει μια πρωτεΐνη σύντηξης ROS1. Παρά τους περιορισμούς αυτούς, τα ευρήματα από τη μελέτη αυτή έχει σημαντικές συνέπειες για

ROS1

αναδιάταξη-θετικούς ασθενείς οι οποίοι γίνονται ανθεκτικοί σε crizotinib θεραπεία. Πριν από την μελέτη μας, μόνο μία δημοσιευμένη αναφορά είχε εντοπίσει ένα μηχανισμό αντίστασης στην αναστολή ROS1. Στη μελέτη των Awad et al., Ένα

ROS1

αναδιάταξη θετικών ασθενών που αρχικά ανταποκρίθηκαν στην crizotinib αλλά έγινε ανθεκτικά βρέθηκε να έχουν αποκτήσει μια μετάλλαξη στο κωδικόνιο 2032 του

ROS1

γονίδιο σύντηξης (

CD74-ROS1

). Η μετάλλαξη αυτή αποδείχθηκε ότι αλληλεπιδρά με σύνδεση crizotinib στην τοποθεσία ROS1 σύνδεσης ΑΤΡ [30].