Αφηρημένο

Καρκίνος βλαστικά κύτταρα (ΚΕΠ), συμπεριλαμβανομένων εκείνων του προχωρημένου καρκίνου του προστάτη, είναι μια προτεινόμενη λόγος για αντίσταση όγκου προς την συμβατική θεραπεία όγκων. Ως εκ τούτου, τα νέα θεραπευτικά μέσα χρειάζονται επειγόντως για τη στόχευση ΚΕΠ. Παρά την ελάχιστη κατανόηση των τρόπων δράσης τους, έχουν τα φυσικά προϊόντα και τα φυτικά θεραπείες έχουν συνήθως χρησιμοποιούνται για την πρόληψη και τη θεραπεία πολλών μορφών καρκίνου.

Berberis libanotica

Ehrenb (BLE) είναι ένα φυτό πλούσιο σε αλκαλοειδή τα οποία μπορεί να έχουν αντικαρκινική δράση και υψηλό δυναμικό για την εξάλειψη των ΚΕΠ. Ελέγξαμε την επίδραση της BLE επί κυττάρων καρκίνου του προστάτη και τα δεδομένα μας έδειξαν ότι το εκχύλισμα αυτό επάγεται σημαντική μείωση στην βιωσιμότητα των κυττάρων και ανέστειλαν τον πολλαπλασιασμό των ανθρώπινων καρκινικών κυτταρικών σειρών προστάτη (DU145, PC3 και 22Rv1) σε ένα δόση και το χρόνο-εξαρτώμενο τρόπο. BLE εκχύλισμα προκάλεσε διαταραχή του κυτταρικού κύκλου, που οδηγεί σε μια σύλληψη G0-G1. Επιπλέον, σημειώνεται το 50% κυτταρικό θάνατο, που χαρακτηρίζεται από την παραγωγή υψηλών επιπέδων αντιδραστικών οξειδωτικών ειδών (ROS). Η αναστολή της κυτταρικής μετανάστευσης και εισβολή επιτεύχθηκε επίσης με κατεργασία με BLE εκχύλισμα, υποδηλώνοντας ένα ρόλο στην αναστολή της μετάστασης. Είναι ενδιαφέρον, BLE εκχύλισμα είχε σημαντική επίδραση στο ΚΕΠ. Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε μία δοκιμασία 3D σφαίρα-σχηματισμού για τον εμπλουτισμό για ένα πληθυσμό καρκινικά βλαστικά /προγονικά κύτταρα. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν μια σημαντική μείωση στην ικανότητα σχηματισμού σφαίρας. Τρεις γύρους της θεραπείας με BLE εκχύλισμα ήταν αρκετή για να εξαλειφθεί η δυνατότητα αυτο-ανανέωση των ιδιαίτερα ανθεκτικά ΚΕΠ. Συμπερασματικά, τα αποτελέσματά μας δείχνουν ένα υψηλό θεραπευτικό δυναμικό της BLE εκχύλισμα ως προς τη στόχευση του καρκίνου του προστάτη και ΚΕΠ της

Παράθεση:. El-Merahbi R, Liu ΥΝ, Eid Α, Νταούντ G, Hosry L, Monzer A, et al. (2014)

Berberis libanotica

Ehrenb Απόσπασμα δείχνει αντι-νεοπλασματικές ιδιότητες για τον Καρκίνο του Προστάτη βλαστικά /προγονικά κύτταρα. PLoS ONE 9 (11): e112453. doi: 10.1371 /journal.pone.0112453

Επιμέλεια: Maria Cristina Vinci, Centro Cardiologico Monzino, Ιταλία

Ελήφθη: 23 Ιούλη, 2014? Αποδεκτές: 8 Οκτώβρη 2014? Δημοσιεύθηκε: 7, Νοεμβρίου 2014

Copyright: © 2014 El-Merahbi et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Η συγγραφείς επιβεβαιώνουν ότι όλα τα δεδομένα που διέπουν τα ευρήματα είναι πλήρως διαθέσιμα χωρίς περιορισμούς. Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. Η έρευνα υποστηρίχθηκε από τη χρηματοδότηση από την Ιατρική Πρακτική Plan-MPP (AUB-FM) και του Λιβάνου Εθνικό Συμβούλιο Επιστημονικών Ερευνών (CNRS) . Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος του προστάτη (PC) είναι η πιο συχνά διαγιγνώσκεται μη δερματική κακοήθεια και η τρίτη πιο κοινή αιτία θνησιμότητας από καρκίνο στον πληθυσμό της Δυτικής αρσενικό [1], [2]. Πρωτοβάθμια PC είναι ανδρογόνο-εξαρτώμενη στη φύση και συνήθως αντιμετωπίζεται με θεραπεία στέρησης ανδρογόνων (ADT). Πιο συχνά, όμως, ορμονική θεραπεία οδηγεί σε υποτροπή μέσα σε λίγα χρόνια και PC εξελίσσεται τελικά σε ένα ανδρογόνο ανεξάρτητο κράτος ή μια ανθεκτική λεγόμενο ευνουχισμού PC (CRPC). CRPC είναι επιθετικά μεταστατικά και θανατηφόρα μορφή PC και σήμερα, δεν υπάρχει καμία γνωστή αποτελεσματική θεραπεία για την

Ο καρκίνος του προστάτη βλαστικά κύτταρα (ΚΕΠ) ιδιότητες μετοχή με φυσιολογικά βλαστικά κύτταρα που έχουν την τάση να εκφράζουν υψηλά επίπεδα.: αφυδρογονάση αλδεΰδης (ΑΙ_ϋΗ) – ​​ένα ένζυμο αποτοξίνωση – [3], αντίσταση σε πολλαπλά φάρμακα (MDR) αντλίες εκροής και μεταφορείς ABC [4] – [6]. Αυτές οι αμυντικές στρατηγικές καθιστούν συμβατική θεραπεία αναποτελεσματική, λόγω της παρουσίας του γρήγορου πολλαπλασιασμού κυττάρων στον όγκο του όγκου και μεγάλο δυναμικό για διαφυλάσσει τον υποθετικό καρκινικά βλαστικά /προγονικά κύτταρα [7]. Επιπλέον, έχει αναφερθεί ότι η ΚΕΠ του προστάτη δεν εκφράζουν υποδοχείς ανδρογόνων (AR) [8], [9] και να μην μπορεί να ανταποκριθεί σε ADT ως ώριμα κύτταρα του όγκου να κάνει. Μετά ADT, καρκινικά βλαστικά κύτταρα μπορεί συχνά καταφέρνουν να συμπληρώσουν εκ νέου τη μάζα του όγκου με ανδρογόνο-ανεξάρτητα PC, το οποίο είναι ένα επιθετικά μεταστατικά και θανατηφόρα μορφή του PC.

Ένα ευρύ φάσμα των στρατηγικών έχουν χρησιμοποιηθεί για την ανακάλυψη νέων φάρμακα που θα μπορούσαν να φέρουν ευεργετικά αποτελέσματα για τους ασθενείς με καρκίνο. Μια στοχευμένη θεραπεία απαιτείται επειγόντως για την εξάλειψη όχι μόνο το μεγαλύτερο μέρος του καρκίνου, αλλά και την πισίνα CSC βρίσκονται εντός του όγκου. Προηγούμενη εργασία στο εργαστήριο μας έχει αποδείξει την ικανότητά να εμπλουτίσει πληθυσμό PC στελέχους /προγονικά κύτταρα με ανάπτυξή τους σε 3D συνθήκες καλλιέργειας σφαίρες σχηματισμού, δηλαδή ονομάζεται prostaspheres [10], [11]. Αρκετές μελέτες έχουν δείξει πρόσφατα ότι ένας αριθμός βιοδραστικών ενώσεων των τροφίμων μπορεί να έχει επίδραση αντι-CSC. Για παράδειγμα, έχει αναφερθεί πρόσφατα ότι φοινικέλαιου εκχυλίζεται γ-τοκοτριενόλη [12], πολυσακχαρίτη-P (PSP), ένα ενεργό συστατικό που εξάγεται από το μανιτάρι Τουρκία ουρά [13], και genistein, ένα σημαντικό ισοφλαβόνης συστατικό της σόγιας και προϊόντα σόγιας [14], εμφανίζουν ισχυρή ανασταλτική δράση στην ικανότητα σχηματισμού protosphere και ογκογονικότητα των κυττάρων PC. Οι ουσίες αυτές έχουν αποδειχθεί για να στοχεύσετε ΚΕΠ προστάτη

in vitro

, και να καταστείλει το σχηματισμό όγκων

in vivo

. Τα ευρήματα αυτά τονίζουν την πιθανή χρήση των φυτικών βιοδραστικών ενώσεων για την παραγωγή θεραπευτικών παραγόντων που στοχεύουν CSC, είτε για την πρόληψη ή τη θεραπεία του υπολογιστή.

Berberis libanotica

, ειδικά τις ρίζες της, έχει που χρησιμοποιούνται σε παραδοσιακά φυτικά Λιβάνου θεραπείες για ρευματικές και νευραλγικό ασθένειες [15], [16].

Β. vulgaris

και

Β. STATA

είναι τα δύο πιο μελετημένο είδος του

Berberis

[17] – [20]. Αλκαλοειδή αποτελούν την κύρια κατηγορία ενώσεων που αναφέρθηκε ότι υπάρχουν στο

Berberis

είδη και αντιπροσωπεύουν ένα πολύ ευρύ φάσμα των δευτερογενών μεταβολιτών με σημαντικές βιολογικές δραστηριότητες [21], [22]. Διάφορα φυτικά αλκαλοειδή έκθεμα

in vitro και in vivo

αντι-πολλαπλασιαστική και αντι-μεταστατικά αποτελέσματα επί διαφόρων τύπων καρκίνου. Αλκαλοειδή, όπως camptothecin [23] και βινβλαστίνη [24], έχουν ήδη αναπτυχθεί επιτυχώς σε αντικαρκινικά φάρμακα. Βερβερίνη, μια σημαντική αλκαλοειδές που χαρακτηρίζουν

Berberis

είδη, έχει εντατικά διερευνηθεί για φαρμακολογικές ιδιότητες. Έχει δειχθεί ότι αναστέλλει την μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων μελανώματος [25], και η ανάπτυξη των όγκων καρκίνωμα πλακωδών ανθρώπινης γλώσσας σε ένα μοντέλο ποντικού ξενομοσχεύματος [26], την ενίσχυση παράγοντα νέκρωσης όγκων που σχετίζονται με συνδέτη που επάγει απόπτωση στον καρκίνο του μαστού [27], και ασκούν μία κυτταροτοξική δράση εναντίον πολλών κυτταρικών γραμμών [25], [28], [29]. Μέχρι σήμερα, οι βιολογικές και φυτοχημικές ιδιότητες του

Β. libanotica

εκχυλίσματα έχουν ερευνηθεί μόνον σε δύο δημοσιεύσεις αναφέρουν την αναστολή της βιωσιμότητας λευχαιμίας Τ-κυττάρων ενηλίκων μέσω κλάσμα αιθανόλης [30], και την αναστολή των βασικών ενζύμων που συνδέονται με τη νόσο του Alzheimer [15]. Ωστόσο, λίγα είναι γνωστά σχετικά με την επίδραση των BLE εκχυλίσματος στον υπολογιστή και τον πολλαπλασιασμό και τη βιωσιμότητα των ΚΕΠ. Ως εκ τούτου, ο σκοπός της παρούσας μελέτης είναι να διερευνηθεί η θεραπευτική αποτελεσματικότητα του

Β. libanotica

εκχύλισμα ρίζας (μέσω εκχύλισης αμμωνία-διχλωρομεθάνιο) στην αναστολή του πολλαπλασιασμού και μειώνοντας την βιωσιμότητα των ανθρώπινων κυτταρικών σειρών PC αναπτύχθηκαν σε ένα συμβατικό μοντέλο 2D μονοστιβάδας. Επιπλέον, η μελέτη αυτή θα επικεντρωθεί σε προχωρημένο δοκιμασία (δοκιμασία σχηματισμού σφαίρας) να διερευνήσει την επίδραση της BLE εκχύλισμα ως προς τη στόχευση έναν εμπλουτισμένο πληθυσμό των ΚΕΠ του προστάτη.

Υλικά και Μέθοδοι

Cell Culture

καρκινικές κυτταρικές σειρές ανθρώπινου προστάτη, PC3, DU145, και 22Rv1 ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (Manassas, VA), και εστάλησαν σε μας σαν δώρο από τον Dr. Kathleen Kelly στα εθνικά Ινστιτούτα Υγείας ( Bethesda, MD). Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε RPMI-1640 AQ (Sigma, USA) συμπληρωμένο με 10% FBS (Sigma, USA), 1% πενικιλλίνη-στρεπτομυκίνη (Sigma, USA) και 1% μη απαραίτητα αμινοξέα (Sigma, USA) και επωάστηκαν στους 37 ° C σε υγροποιημένο επωαστή (95% αέρα, 5% CO

2). Τα κύτταρα συλλέχθηκαν με θρυψίνη-ΕϋΤΑ στους 37 ° C (Sigma, USA). Τα κύτταρα κατακρημνίστηκαν, αιωρούνται εκ νέου και να μεταφερθούν σε νέες-75 cm

φιαλών καλλιέργειας 2 ιστού για τη συντήρηση, ή σπέρνεται για τα πειράματα σε συγκέντρωση 1 × 10

4 κύτταρα /cm

2 για PC3 και Du145 και 1,5 × 10

4 κύτταρα /cm

2 για την κυτταρική γραμμή 22Rv1.

BLE Εξόρυξη

Οι ρίζες του

Berberis libanotica

Ehrenb συλλέχθηκαν σε Σεπτεμβρίου 2011 στην περιοχή Cedars στη Βόρειο Λίβανο (υψόμετρο 1400-1700 μ? προσέγγιση θέση GPS: N 34 ° 14’41 «? E 36 ° 2’15»). Δεν υπάρχουν ειδικά δικαιώματα ήταν απαραίτητα για αυτές τις θέσεις /δραστηριότητες που δεν περιλαμβάνουν απειλούμενα ή προστατευόμενα είδη. Το εργοστάσιο ταυτίστηκε με Pr. Γ Tohmé (CNRS, Λίβανος). Το δείγμα κουπόνι (Κωδικός αριθμός BLCS12) κατατέθηκε στην ερμπαρίου της Σχολής Θετικών Επιστημών ΙΙ, Πανεπιστήμιο του Λιβάνου, Βηρυτός, Λίβανος.

Οι ρίζες των φυτών ήταν σκιά-αποξηραμένα και σε σκόνη, χρησιμοποιώντας ένα ηλεκτρικό μίξερ. Το εκχύλισμα αμμωνία-διχλωρομεθάνιο παρασκευάστηκε ως εξής: 10 g σκόνης φυτού υγραίνεται για 2 ώρες με NH

διάλυμα 4OH ακολουθούμενο από την προσθήκη διχλωρομεθανίου (100 ml). Το μίγμα εμβαπτιστεί για 24 ώρες υπό μαγνητική ανάδευση, που ακολουθείται από διήθηση. Η οργανική φάση συμπυκνώθηκε στους 40 ° C υπό ελαττωμένη πίεση και κρυο-ξηραίνονται. Τα λαμβανόμενα εκχυλίσματα φυλάσσονται σε δροσερό μέρος σε σκοτεινά δοχεία. Το περιστροφικό εξατμιστήρα που χρησιμοποιήθηκε ήταν το ΙΚΑ RV 10 BASIC και η λυοφιλιωποιητή ήταν Lyovac GT4.

ΜΤΤ /κυτταροτοξικότητας Δοκιμασία

μετρήθηκαν αντι-πολλαπλασιαστικές και κυτταροτοξικές επιδράσεις της BLE

in vitro

μέσω ΜΤΤ ([3- (4, 5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ) -2, 5-διφαινυλτετραζόλιο βρωμίδιο]) δοκιμασίες. DU145 και PC3 κύτταρα σπάρθηκαν σε 100 μΙ πλήρους μέσου σε πλάκες καλλιέργειας των 96 φρεατίων σε πυκνότητα 7500 κύτταρα /φρεάτιο και 22Rv1 κύτταρα σε πυκνότητα 13250 κυττάρων ανά φρεάτιο. Τα κύτταρα επωάστηκαν όλη τη νύκτα στον επωαστήρα και στη συνέχεια κατεργάζεται εις τριπλούν με διάφορες συγκεντρώσεις εκχυλίσματος αραιωμένο σε 100 μΙ πλήρους μέσου για 24, 48 και 72 ώρες. Στην περίπτωση του καθαριστή ROS Ν-ακετυλο-L-κυστεΐνη (NAC? Sigma), τα κύτταρα DU145 προκατεργάστηκαν με 5 mM NAC για 30 λεπτά και τα κύτταρα στη συνέχεια κατεργάστηκαν με 30 μg /ml του BLE εκχυλίσματος για 24 και 48 ώρες όπως παραπάνω . Για κάθε χρονικό σημείο, 20 μΐ από 5 mg /ml – σε 1 χ φωσφορικό ρυθμιστικό διάλυμα (PBS) αντιδραστήριο -MTT προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο και επωάζονται στους 37 ° C για 4 ώρες. Τέλος, 100 μΐ διαλύματος διαλυτοποίησης προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο για να διαλυθούν οι κρύσταλλοι φορμαζάνης. Η μειωμένη οπτική πυκνότητα ΜΤΤ (OD) μετρήθηκε σε μήκος κύματος 595 nm χρησιμοποιώντας έναν αναγνώστη ELISA (Multiskan Ex). Το ποσοστό της κυτταρικής βιωσιμότητας παρουσιάστηκε ως λόγος OD μεταξύ των επεξεργασμένων και μη επεξεργασμένων κυττάρων στις δεικνυόμενες συγκεντρώσεις.

αποκλεισμό trypan blue Μέθοδος

Τα υπερκείμενα που περιέχουν τα νεκρά κύτταρα συλλέχθηκαν και επισυνάπτονται ζωντανά κύτταρα συλλέχθηκαν με θρυψίνη EDTA και προστέθηκε στο υπερκείμενο. Το σφαιρίδιο κυττάρου επανα-αιωρήθηκε σε 100 μΙ μέσου και 50 μΐ κυτταρικού εναιωρήματος αναμίχθηκαν με 50 μΙ κυανού τρυπανίου και στη συνέχεια να ζήσει /νεκρά κύτταρα μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας αιμοκυτόμετρο.

Κύκλου Κυττάρου Ανάλυση με κυτταρομετρία ροής

DU145 και τα κύτταρα PC3 σπάρθηκαν εις διπλούν σε πλάκες των 6-φρεατίων σε πυκνότητα 1 × 10

5 κύτταρα /φρεάτιο και επωάστηκαν για 24 ώρες πριν από την φαρμακευτική θεραπεία για 24, 48 ή 72 ώρες. Τα κύτταρα στη συνέχεια συλλέγονται, πλένονται δύο φορές με PBS, φυγοκεντρήθηκαν στις 1500 rpm για 5 λεπτά στους 4 ° C, επανα-εναιωρήθηκαν σε 1 ml ψυχρού PBS, σταθεροποιήθηκαν σε 4 mL ψυχρού απόλυτης αιθανόλης και στη συνέχεια αποθηκεύεται στους -20 ° C ° μέχρι χρώση και ανάλυση. Σταθερή κύτταρα μετά υποβλήθηκαν σε αγωγή για 1 ώρα με 200 μg /ml άνευ ϋΝάσης RNase Α, βάφονται με 1 mg /ml ιωδιούχου προπιδίου (ΡΙ) (Sigma, USA) και επωάστηκαν για 10 λεπτά στο σκοτάδι σε ένα σωλήνα ροής (BD flacon ). Ο φθορισμός του ΡΙ, ένα μέτρο της περιεκτικότητας του DNA σε έναν πληθυσμό κυττάρων, έγινε χρησιμοποιώντας κυτταρομετρία ροής (FACScan, Becton Dickinson). Ένα σύνολο 10.000 περιφραγμένο γεγονότων αποκτήθηκαν με σκοπό να εκτιμηθούν οι αναλογίες των κυττάρων σε διαφορετικά στάδια του κυτταρικού κύκλου. Ανάλυση της κατανομής κύκλου κυττάρου διεξήχθη χρησιμοποιώντας FlowJo Λογισμικού.

Γαλακτική δεϋδρογενάση (LDH) Δοκιμασία

Η κυτταροτοξικότητα της BLE εκχυλίσματος στην κυτταρική γραμμή DU145 προσδιορίστηκε με μέτρηση της δραστικότητας του γαλακτικής αφυδρογονάσης (LDH ) που απελευθερώνεται από το κυτοσόλιο των κατεστραμμένων κυττάρων χρησιμοποιώντας ένα κυτταροτοξικότητας Detection Kit PLUS (LDH) (Roche Diagnostics GmbH). Η δοκιμασία διεξήχθη σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Εν συντομία, μέσο υπερκείμενα από έλεγχο και τα επεξεργασμένα κύτταρα συλλέχθηκαν και προστέθηκαν ίσος όγκος του μείγματος της αντίδρασης. Τα μίγματα αντίδρασης επωάστηκαν για 20 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου στο σκοτάδι. Μετά την επώαση, η απορρόφηση προσδιορίστηκε στα 490 nm χρησιμοποιώντας αναγνώστη πλάκας ELISA. Το ποσοστό της κυτταροτοξικότητας υπολογίστηκε ως:. (Exp.value – αυθόρμητη απελευθέρωση ελέγχου) ÷ (απελευθέρωση max.control – αυθόρμητη απελευθέρωση ελέγχου) × 100

ανίχνευσης ROS από καιΝΒΤ Δοκιμασία

DU145 κύτταρα καλλιεργήθηκαν εις τριπλούν σε μία πλάκα 96 φρεατίων σε πυκνότητα 1 × 10

4 κύτταρα /cm

2 και στη συνέχεια επωάστηκαν για 24 ώρες πριν από τη θεραπεία BLE εκχυλισμάτων για 24, 48 ή 72 ώρες. Σε κάθε κατάσταση, η παραγωγή ROS αξιολογήθηκε με δοκιμασία νιτροτετραζολίου (ΝΒΤ? Sigma). Τα μέσα καλλιέργειας αναρροφήθηκαν και τα κύτταρα επωάστηκαν σε PBS που περιέχει 1 mg /ml ΝΒΤ σε 37 ° C στο σκοτάδι για 60 λεπτά. NBT μειώθηκε κατά ROS σε ένα σκούρο μπλε-αδιάλυτη μορφή του ΝΒΤ ονομάζεται φορμαζάνης που θα μπορούσε να γίνει ορατή. Για να ποσοτικοποιηθεί η φορμαζάνης προϊόν, το ενδοκυτταρικό φορμαζάνης διαλύθηκε σε ΚΟΗ 2 Μ και DMSO 5 Μ διάλυμα, και η απορρόφηση προσδιορίστηκε στα 630 nm χρησιμοποιώντας αναγνώστη πλάκας ELISA.

Προσδιορισμός απόπτωσης

απόπτωση προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας την κατάτμηση κυτταρικού DNA ELISA (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany) για την ανίχνευση των θραυσμάτων DNA BrdU-επισημασμένου σε υπερκείμενα καλλιέργειας και τα κυτταρολύματα. Η δοκιμασία που χρησιμοποιείται σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή και όπως περιγράφεται προηγουμένως [31]. Τα κύτταρα επωάστηκαν με 30 μg /ml του εκχυλίσματος BLE για 48 ώρες υπό την παρουσία ή απουσία 5 πιΜ Ν-ακετυλο-L-κυστεΐνης που προστέθηκε 30 λεπτά πριν BLE θεραπεία. Η απόπτωση στα μη επεξεργασμένα κύτταρα ελέγχου ρυθμίστηκε σε 100% και τα αποτελέσματα χαράσσονται ως επί τοις εκατό του μάρτυρα.

πληγών επούλωσης

δοκιμασία

Για την επούλωση των πληγών, ή δοκιμασία μηδέν, τα κύτταρα σπάρθηκαν σε έξι -Καλά πλάκα με τους ίδιους αριθμούς, και επωάζονται μέχρι να φτάσουν 80-90% συρροή. Τα κύτταρα μετά υποβλήθηκαν σε αγωγή με 10 μg /ml μιτομυκίνη C (Sigma) για 2 ώρες, προκειμένου να εμποδίσει τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό. Ένα αποστειρωμένο άκρο 200 μΐ χρησιμοποιήθηκε για πληγές μηδέν το ίδιο πλάτος σε κάθε μονοστιβάδα, οι πλάκες στη συνέχεια πλύθηκαν δύο φορές με PBS για να απομακρυνθούν τα αποκολλημένα κύτταρα, και τα υπόλοιπα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε πλήρες μέσο με ή χωρίς θεραπεία. Φωτογραφίες εν συνεχεία μεταφέρθηκαν σε 0, 12, 30, και 48 ώρες. Η απόσταση που διανύεται από τα κύτταρα εντός του πληγωμένης περιοχής απαριθμούνται το κλείσιμο των πληγών. Το πείραμα επαναλήφθηκε τρεις φορές με διπλές μετρήσεις σε κάθε πείραμα.

Σφαίρα Δοκιμασία Σχηματισμού

Σε αυτή τη μελέτη, οι τρεις κυτταρικές σειρές, PC3, DU145 και 22Rv-1, ήταν σε θέση να σχηματίσει σφαιροειδή σε μη προσκολλημένα καλλιέργειας, γεγονός που υποδηλώνει την παρουσία του καρκίνου βλαστικών κυττάρων που ομοιάζουν εντός αυτών των κυτταρικών σειρών. Μετά την καταμέτρηση του αιώρημα μονών κυττάρων από κυτταρικές σειρές καρκίνου του προστάτη, μια συγκέντρωση 1000 κύτταρα /φρεάτιο αιωρήθηκε σε κρύο Matrigel ™ /χωρίς ορό RPMI-1640 (1:01) σε ένα συνολικό όγκο 50 μΙ. Τα κύτταρα σπάρθηκαν ομοιόμορφα σε ένα κυκλικό τρόπο γύρω από το κάτω χείλος ενός καλά σε ένα πλακίδιο των 24 φρεάτων και αφέθηκε να στερεοποιηθεί σε επωαστήρα στους 37 ° C για 45 λεπτά, πριν από 0,5 ml πλήρους RPMI-1640 -2% FBS μέσο ( με ή χωρίς επεξεργασία) προστέθηκε ήπια στο μέσο της κάθε φρεάτιο. Σφαίρες αναπληρώνονται με ζεστό μέσα ενημέρωσης όπως και στην αρχική σπορά (με ή χωρίς θεραπεία) κάθε δύο με τρεις ημέρες. Σφαίρες μετρήθηκαν μετά από 13 ημέρες. Για να διαδώσει σφαίρες, το μέσο αναρροφήθηκε και Matrigel ™ υπέστη πέψη με 0.5 ml διαλύματος Dispase (Invitrogen, Carlsbad, CA, 1 mg /ml, διαλυμένο σε RPMI-1640 μέσο ατελής) για 60 λεπτά στους 37 ° C. Σφαίρες συλλέχθηκαν, επωάστηκαν σε 1 ml ζεστό Trypsin- EDTA στους 37 ° C για 5 λεπτά, και στη συνέχεια διαβιβάζεται μέσω σύριγγας διαμετρήματος 27 5 φορές. Τα κύτταρα μετρήθηκαν με ένα αιμοκυτταρόμετρο και την εκ νέου seeded.

Transwell Invasion Δοκιμασία

Για την δοκιμασία εισβολής, 2.5 × 10

5 κύτταρα σπάρθηκαν σε ένα μέσο χωρίς ορό με ή χωρίς θεραπεία στον άνω θάλαμο πάνω στο Matrigel ™ επίσης επίστρωση μεμβράνης (ένθετο 24-φρεατίων? μέγεθος πόρων, 8 μm? Falcon), και ένα μέσο συμπληρωμένο με ορό χρησιμοποιήθηκε ως χημειο-προσελκυστικό στον κατώτερο θάλαμο. Κάθε φρεάτιο φρεσκοεπιστρωμένη με 100 μΐ Matrigel ™ (BD Bioscience) σε αραίωση 1:10 σε ψυχρό PBS και στη συνέχεια ξηραίνεται στον αέρα όλη τη νύχτα πριν από την έναρξη της δοκιμασίας εισβολή. Τα κύτταρα αφέθηκαν να μεταναστεύσουν μέσω της μεμβράνης επικαλυμμένη με Matrigel ™ στους 37 ° C σε επωαστήρα 5% CO2 για 24 και 48 ώρες. Μη μεταναστευτικά κύτταρα στον άνω θάλαμο στη συνέχεια απαλά ξύνεται με ένα applicator βαμβάκι-tip. Εισβάλλοντα κύτταρα στην κάτω επιφάνεια της μεμβράνης μονιμοποιήθηκαν και χρωματίστηκαν με αιματοξυλίνη και ηωσίνη. Μετά τη χρώση, ο συνολικός αριθμός των κυττάρων που εισβάλλουν μετρήθηκε κάτω από το μικροσκόπιο φωτός (× 10 στόχος) από 6 διαδοχικά πεδία για κάθε φρεάτιο.

εκχύλιση RNA και ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR (qRT-PCR)

Ολικό RNA εξήχθη από κύτταρα, επεξεργασμένο ή μη επεξεργασμένο με 30 μg /ml του εκχυλίσματος BLE για 48 ώρες, χρησιμοποιώντας το RNeasy Micro Kit (Qiagen) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. cDNA παράχθηκε από το ολικό RNA χρησιμοποιώντας το σύστημα Super Script III First Strand Synthesis για RT-PCR (Invitrogen), και PCR εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας Platinum Taq πολυμεράσης (Invitrogen). Για την ποσοτική RT-PCR, το στάδιο ενίσχυσης έγινε χρησιμοποιώντας το SYBR πράσινο μάστερ μιξ PCR (Applied Biosystems, Bedford, ΜΑ). Ολες οι αντιδράσεις έτρεξαν εις διπλούν με τη χρήση των ειδικών εκκινητών που αναφέρονται παρακάτω και όλες οι τιμές ομαλοποιήθηκαν προς το σπίτι κρατώντας γονίδιο GAPDH. Οι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν ήταν: GAPDH-F: 5 ‘ACCTGGCTAGCGAAAAGCAA3’? GAPDH-R: 5’CCACTTTGTCAAGCTCATTTCCT3 ‘? Sox2-F: 5’AACCCCAAGATGCACAACTC3 ‘? Sox2-R: 5’GCTTAGCCTCGTCGATGAAC3 ‘? Oct4-F: 5’AGAACATGTGTAAGCTGCGG3 ‘? Oct4-R: 5’GTTGCCTCTCACTCGGTTC3 ‘? Nanog-F: 5’ACCTCAGCTACAAACAGGTGAA3 ‘? Nanog-R: 5’AAAGGCTGGGGTAGGTAGGT3 ‘? CD44-F: 5’TTTGCATTGCAGTCAACAGTC3 ‘? CD44-R: 5’GTTACACCCCAATCTTCATGTCCAC3 ‘? CD166-F: 5’TGGCAATATCACATGGTACAGG3 ‘? CD166-R:. 5’AGCCTTGGTTGTCTTGTACTC3 «

Δεδομένα

Ανάλυση

Η στατιστική ανάλυση έγινε με τη χρήση του Microsoft Excel 2013. Η σημασία των στοιχείων που αναλύθηκαν με τη χρήση t-test του Student, και οι διαφορές μεταξύ των δύο σημαίνει με p & lt? 0,05 (*) και p & lt?. .01 (#) θεωρήθηκαν σημαντικές και πολύ σημαντικά, αντιστοίχως

Αποτελέσματα

BLE εκχύλισμα ανέστειλε τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων PC σε μια δόση και χρόνο-εξαρτώμενο τρόπο

πρώτος στόχος μας ήταν να διερευνηθεί η

in vitro

επιπτώσεις της BLE εκχυλίσματος στην ανάπτυξη των κυττάρων PC και τη βιωσιμότητα. Χρησιμοποιώντας δοκιμασίες ΜΤΤ (Εικ. 1Α), η δραστηριότητα του πολλαπλασιασμού των κυττάρων PC γραμμών Du145, PC3 και 22Rv-1 βρέθηκε να συσχετίζεται αντιστρόφως με τη συγκέντρωση εκχύλισμα στο μέσο καλλιέργειας. Μετά από 72 ώρες θεραπείας, η ανασταλτική δράση άρχισε σε χαμηλές συγκεντρώσεις και αναστέλλει σημαντικά τον πολλαπλασιασμό κατά 50% όταν τα κύτταρα PC αναπτύχθηκαν σε μέσα που παρέχονται με 30 μg /ml του BLE εκχυλίσματος. Ωστόσο, σε υψηλή συγκέντρωση εκχύλισμα (100 μg /ml), περίπου το 75% του αντι-πολλαπλασιαστικού αποτελέσματος επιτεύχθηκε σημαντικά. Αυτά τα αποτελέσματα ήταν συμβατά με αλλαγές συρροή σε καλλιέργεια (Σχήμα S1) και επαληθεύεται από trypan blue ανιχνεύσεις αποκλεισμού (Εικ. 1Β). Σε υψηλές συγκεντρώσεις (60 και 100 μg /ml), αυξημένη παρατηρήθηκαν κυτταροτοξικότητα και θάνατο κυττάρου.

Μετά την επώαση των κυτταρικών σειρών καρκίνου του προστάτη τρία (DU145, PC3 και 22Rv-1) για 24, 48 και 72 h με ή χωρίς επεξεργασία με BLE εκχύλισμα, τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων προσδιορίστηκε. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως ένα ποσοστό της μελέτησαν ομάδα σε σύγκριση με τον έλεγχο της. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν μέσο όρο πέντε ανεξάρτητα πειράματα. Τα δεδομένα αναφέρονται ως μέση τιμή ± SD (* P & lt? 0,05? # P & lt? 0,01).

Η

BLE εκχύλισμα σε κυτταρικό επίπεδο τοξικότητας σε κυτταρική σειρά DU145

BLE ήταν κυτταροτοξική και προκάλεσε σημαντικές κυτταρικού θανάτου στην κυτταρική σειρά DU145 σε μια δόση και το χρόνο εξαρτώμενο τρόπο (Εικ. 2). Το κυτταροτοξικό δυναμικό της BLE εκχύλισμα προσδιορίστηκε με βάση τη μέτρηση του ενδοκυτταρικού ενζύμου LDH, το οποίο είναι ένα σταθερό κυτοσολικό ένζυμο απελευθερώνεται εντός του μέσου κυτταρικής καλλιέργειας κατόπιν βλάβη της πλασματικής μεμβράνης. Ένα 30% κυτταροτοξική δράση επιτεύχθηκε σημαντικά στις 48 ώρες με 100 μg /ml και σε 72 ώρες με 60 μg /ml. Ωστόσο, το μέγιστο ποσοστό των νεκρών κυττάρων ήταν περίπου 50% μετά από 72 ώρες της θεραπείας στη συγκέντρωση των 100 μg /ml του εκχυλίσματος BLE.

Ο κυτταρικός θάνατος προσδιορίσθηκε με γαλακτικής αφυδρογονάσης (LDH) δοκιμασία σε επεξεργασία με ή χωρίς υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις BLE εκχυλίσματος για 24, 48 και 72 ώρες. Ο κυτταρικός θάνατος υπολογίστηκε ως το ποσοστό της απελευθέρωσης LDH σύμφωνα με έναν προηγουμένως αναφερθέντα τύπο. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν μέσο όρο τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. Τα δεδομένα αναφέρονται ως μέση τιμή ± SD (* P & lt? 0,05? # P & lt? 0,01).

Η

BLE προ-οξειδωτική προκαλούμενη δραστηριότητα DU145 κυτταρικό θάνατο

Η ενδοκυτταρική αντιδραστικά είδη οξυγόνου (ROS ) η παραγωγή μετρήθηκε χρησιμοποιώντας νιτροτετραζολίου (ΝΒΤ). Η ένταση της βαφής είναι αντιστρόφως propotional στην παρουσία των ROS. Τα αποτελέσματα από το Σχήμα 3 δείχνουν μια δόση και το χρόνο-εξαρτώμενη μείωση του ΝΒΤ. αναγωγή ΝΒΤ άρχισε στις 24 ώρες με 100 μg /ml, ενώ το μέγιστο ποσοστό της μείωσης ΝΒΤ ήταν μετά από 72 ώρες της θεραπείας με 100 μg /ml του BLE εκχυλίσματος. Είναι ενδιαφέρον ότι, υπό την παρουσία ενός καθαριστή ROS (Ν-ακετυλο-L-κυστεΐνη, NAC), BLE απέτυχε να επηρεάσει τη βιωσιμότητα των κυττάρων στις 24 ώρες και 48 ώρες. Επιπλέον, BLE προκαλούμενη κυτταρική κατάτμηση του DNA, ενδεικτική της απόπτωσης και κυτταρικού θανάτου, δεν παρατηρήθηκε παρουσία NAC (Εικ. S2). Αυτό υποδηλώνει ότι η BLE εκχύλισμα επάγει τον κυτταρικό θάνατο με την επαγωγή της παραγωγής ROS.

παραγωγή ROS μετρήθηκε με νιτροτετραζολίου (ΝΒΤ) μείωση στην κυτταρική γραμμή DU145 με ή χωρίς αγωγή με υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις BLE εκχυλίσματος για 24, 48 και 72 ώρες. αναγωγή ΝΒΤ υπολογίστηκε ως το ποσοστό του ελέγχου της ίδιας ομάδας. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν μέσο όρο τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. Τα δεδομένα αναφέρονται ως μέση τιμή ± SD (* P & lt? 0,05? # P & lt? 0,01).

Η

BLE εκχυλίσματα κυττάρων που επάγεται από τη σύλληψη του κύκλου στο G0-G1 φάση

Σε μια προσπάθεια να κατανοήσουν πώς το BLE εκχύλισμα είναι σε θέση να μειώσει τον αριθμό των κυττάρων και να αναστέλλουν τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, επιδιώξαμε να αναλύσουμε τον κυτταρικό κύκλο. Εξετάσαμε την κυτταρική διανομή περιεχομένου DNA με κυτταρομετρία ροής μετά από 24, 48 και 72 ώρες της θεραπείας. Η ανάλυση κυτταρικού κύκλου αποκάλυψαν ότι η διανομή του περιεχομένου του DNA μεταβάλλεται σε BLE επεξεργασμένου PC3 (Πίνακας 1) και DU145 (Πίνακας 2) κύτταρα. Όπως συνοψίζεται στον Πίνακα 1, BLE κατεργασία των κυττάρων PC3 με είτε 10 μg /ml ή 30 μg /ml προκάλεσε αύξηση, εντός 24 h, στον αριθμό των κυττάρων στην φάση G1 του κυτταρικού κύκλου, το οποίο αποδεικνύει την G1 σύλληψης. Στις 48 h και 72 h μετά τη θεραπεία, ο πληθυσμός G1 αυξήθηκε από λιγότερο από 50% στον έλεγχο σε περισσότερο από 60% σε κύτταρα PC3 που έλαβαν θεραπεία με BLE εκχύλισμα σε 10 μg /ml ή 30 μg /ml. Είναι ενδιαφέρον ότι, αυτό συνδέθηκε με μια συνακόλουθη μείωση του ποσοστού των κυττάρων φάσης S και τη συσσώρευση των κυττάρων φάσης προ-G1 (G0). Το ίδιο προφίλ παρατηρήθηκε όταν τα κύτταρα DU145 υποβλήθηκαν στην ίδια επεξεργασία και ανάλυση (Πίνακας 2). Αυτά τα στοιχεία υποδηλώνουν ότι η BLE αποτελέσματα της θεραπείας σε μια διαταραχή του κυτταρικού κύκλου.

Η

BLE εκχυλίσματος μείωσε σημαντικά τις μετανάστευση και την εισβολή των ικανοτήτων των DU145 κυττάρων

Στη συνέχεια, διερευνήθηκε η επίδραση του εκχυλίσματος BLE στην κυτταρική μετανάστευση και εισβολή ,, δύο φαινοτύπους που σχετίζονται με την εξέλιξη σε μετάσταση. Χρησιμοποιώντας μια δοκιμασία για επούλωση της πληγής, με την παρουσία του μιτομυκίνη C για την αναστολή της κυτταρικής διαίρεσης, BLE θεραπεία κατέστειλε σημαντικά την ικανότητα κυτταρικής μετανάστευσης των κυττάρων DU145 σε σύγκριση με τον έλεγχο, σύμφωνα με την οποία το τραύμα επουλώθηκε πλήρως μετά από 48 ώρες (Εικ. 4Α και Β) . Αυτά τα δεδομένα είναι συμβατά με την δοκιμασία εισβολή όπου κατά την επεξεργασία με 30 μg /ml του εκχυλίσματος BLE, την ικανότητα εισβολής, σε απόκριση προς FBS, μειώθηκε σημαντικά κατά περισσότερο από τρεις πτυχές σε σύγκριση με τον έλεγχο (Εικ. 4 Γ και Δ). Είναι ενδιαφέρον ότι, η θεραπεία BLE μείωσε σημαντικά την βασική εισβολή (χωρίς FBS) των κυττάρων σε σύγκριση με τον έλεγχο. Επιπλέον, και μετά από διόρθωση για την επίδραση επί του πολλαπλασιασμού /απόπτωσης, η επίδραση της BLE επί εισβολή παρέμειναν σημαντικές μεταξύ της θεραπείας και την ομάδα ελέγχου. Αυτό υποδηλώνει ότι BLE εκχύλισμα έχει υψηλή ανασταλτική επίδραση στην μετανάστευση PC κυττάρων και εισβολή.

(Α) το μηδέν, σε κύτταρα DU145, έγινε χρησιμοποιώντας ένα κίτρινο άκρη, και οι εικόνες λήφθηκαν σε Τ = 0 h, 12 ώρες, 30 ώρες και 48 ώρες με ή χωρίς θεραπεία, και ποσοτικοποίηση της διαμέτρου του κλεισίματος του τραύματος εκτιμήθηκε την πάροδο του χρόνου (Β). Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν μέσο όρο τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. Τα δεδομένα αναφέρονται ως μέση ± SD (* Ρ & lt? 0,05? # Ρ & lt? 0,01). (C): αντιπροσωπευτικών εικόνων του προσδιορισμού εισβολή trans-φρεατίων. κύτταρα DU145 σπάρθηκαν πάνω στο Matrigel ™ επίσης επίστρωση μεμβράνης στην κορυφή θάλαμο του trans-φρεατίων και είτε επεξεργασμένο ή όχι σε κατεργασία με 30 μg /ml του εκχυλίσματος BLE παρουσία ή απουσία FBS στον κάτω θάλαμο. Κύτταρα που εισέβαλαν στον κάτω θάλαμο μετά από 48 ώρες σταθεροποιήθηκαν με μεθανόλη, χρωματίστηκαν με Η &? Ε, μετρήθηκαν και παριστάνεται ως ένα ποσοστό των εισέβαλαν κυττάρων σε σύγκριση με τον έλεγχο (D). Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν μέσο όρο τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. Τα δεδομένα αναφέρονται ως μέση τιμή ± SD (* P & lt? 0,05? # P & lt? 0,01).

Η

BLE εκχύλισμα στοχευμένες έναν εμπλουτισμένο πληθυσμό PC αρχέγονων /προγονικών κυττάρων με τη χρήση 3D σφαίρες σχηματισμού

δοκιμασία

Η ικανότητα να διαμορφώσει και να διαδώσει τις σφαίρες σε μη προσκολλημένα πολιτισμός είναι ένα από τα χαρακτηριστικά των ΚΕΠ. Για να επιβεβαιωθεί ότι η θεραπεία μπορεί να αναστείλει BLE προστάτη ιδιότητες CSC, σχηματισμός prostaspheres από κυτταρικές σειρές PC μελετήθηκε με την παρουσία ή απουσία BLE εκχυλίσματος. Σε αυτή τη δοκιμασία, prostaspheres δημιουργήθηκαν με την ενσωμάτωση 1.000 μονά κύτταρα ανά φρεάτιο σε Matrigel ™ σε χαμηλή συγκέντρωση ορού (2% FBS). Μετά την καλλιέργεια των κυττάρων DU145 για 13 ημέρες, ένας μικρός αριθμός αυτών των κυττάρων ήταν σε θέση να σχηματίσουν σφαίρες όγκου σε μη επεξεργασμένα συνθήκες με μία μονάδα σχηματισμού σφαίρας (SFU) του 6,8%. Ωστόσο, η θεραπεία με 20 μg /ml ή 30 μg /ml του εκχυλίσματος BLE μείωσε σημαντικά τον αριθμό των prostaspheres κατά περισσότερο από 50% (Σχ. 5Α). Επιπλέον, δεν σφαίρες παρατηρήθηκαν σε φρεάτια σε επεξεργασία με BLE εκχύλισμα σε μια συγκέντρωση πάνω από 30 μg /ml. Είναι ενδιαφέρον ότι, το μέσο μέγεθος των BLE prostaspheres εκχυλίσματος επεξεργασμένου ήταν σημαντικά μικρότερος σε σύγκριση με τον έλεγχο (Σχήμα 5Β και Δ) και αυτό θα μπορούσε να εξηγηθεί από τη σημαντική μείωση του μέσου αριθμού των κυττάρων ανά prostasphere όπως φαίνεται στο σχήμα 5C.

(Α) σχηματισμού σφαίρας Unit (SFU) παρουσιάζεται με ή χωρίς BLE θεραπεία (20, 30, 60 και 100 μg /ml). παράγονται σφαίρες αναφέρονται ως G1 (Generation 1) σφαίρες. SFU υπολογίζεται σύμφωνα με τον ακόλουθο τύπο: SFU = (αριθμός των σφαιρών μετρήθηκαν ÷ αριθμός των κυττάρων εισόδου) × 100. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν μέσο όρο τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. Τα δεδομένα αναφέρονται ως μέση ± SD (* Ρ & lt? 0,05? # Ρ & lt? 0,01). (Β) Εκπρόσωπος εικόνες της DU145 prostaspheres με ή χωρίς BLE θεραπεία. Εικόνες έγιναν ορατές από τον Carl Zeiss μικροσκόπιο σε μεγέθυνση 10x και αναλύθηκαν από τον Carl Zeiss Zen 2012 λογισμικό εικόνα. (Γ) Ποσοτικοποίηση της μέσης διαμέτρου των prostaspheres DU145 με ή χωρίς όρους θεραπείας. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν μέσο όρο τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. Τα δεδομένα αναφέρονται ως μέση ± SD (* Ρ & lt? 0,05? # Ρ & lt? 0,01). (D) Ποσοτικός προσδιορισμός του μέσου αριθμού των κυττάρων ανά DU145 prostasphere με ή χωρίς θεραπεία. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν μέσο όρο τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. Τα δεδομένα αναφέρονται ως μέση ± SD (* Ρ & lt? 0,05? # Ρ & lt? 0,01).

Η

δραστικότητα αυτο-ανανέωση θεωρείται ότι είναι ένα από τα σημαντικότερα χαρακτηριστικά του στελέχους /προγονικών κυττάρων. Έτσι, για να εξασφαλιστεί ότι το εκχύλισμα μας είναι σε θέση να στραφούν προς την αυτο-ανανέωση CSC πισίνα, σφαίρα δραστηριότητας σχηματισμός αξιολογήθηκε πάνω από πέντε γενιές. κύτταρα DU145 που ήταν σε θέση να σχηματίσουν σφαίρες στην πρώτη γενιά (G1) συλλέχθηκαν και αναπαράχθηκαν με διάσταση σφαίρες σε απλά κύτταρα και στη συνέχεια τον ίδιο αριθμό κυττάρων (1000 κύτταρα /φρεάτιο) επανα-seeded. Η δοκιμασία διεξήχθη μέχρι τις πέμπτης γενιάς (G5), μετά από πειραματικό σχεδιασμό που απεικονίζεται στο σχήμα 6Β. Η αγωγή με 20 μg /ml του BLE εκχυλισμάτων ήταν αρκετή για να μειώσει σημαντικά την ικανότητα σχηματισμού σφαίρα σε περίπου 50% όταν κατεργάζεται μία φορά και με συνέπεια πάνω από πέντε γενεές (Σχ. 6Α). Είναι ενδιαφέρον ότι, μετά από διαδοχικές επεξεργασία και διάδοση των κυττάρων που ήταν σε θέση να αντισταθούν και να επιβιώσει το πρώτο BLE θεραπεία στο G1, εξαιρετικά υποβιβαστεί SFUs παρήχθησαν στο G2, και δεν prostaspheres διαμορφώθηκαν στο G3. Αξίζει να σημειωθεί ότι τα κύτταρα που υποβλήθηκαν σε επεξεργασία μία φορά στο G1 ήταν σε θέση να ανακτήσει σχηματισμού σφαίρας ικανότητά τους κατά την περαιτέρω διάδοση των prostaspheres απουσία οποιασδήποτε θεραπείας (Εικ. 6Β). Αυτό υποδηλώνει ότι απαιτείται σειριακή επεξεργασία με BLE εκχύλισμα και είναι σε θέση να στοχεύσουν τα ιδιαίτερα ανθεκτικό ΚΕΠ, και ως εκ τούτου πυρόσβεσης ικανότητα αυτο-ανανέωσή τους. Αξίζει να σημειωθεί ότι, τα κύτταρα σε επεξεργασία με 30 μg /ml του BLE εκχυλίσματος έδειξαν σημαντική μείωση στα επίπεδα έκφρασης του Sox2, Oct4, Nanog, CD44 και CD166, όλοι οι δείκτες που είναι γνωστό ότι εκφράζεται σε βλαστικά κύτταρα του καρκίνου του προστάτη, σε σύγκριση με τον έλεγχο μη-κατεργασμένα κύτταρα (Εικ. S3).

(Α) SFU λαμβάνεται από σειριακά prostaspheres πάνω από πέντε γενιές εμφανίζεται κάτω από μη επεξεργασμένο συνθήκες (πάντα τον έλεγχο) και με 20 μg /ml του εκχυλίσματος BLE-αγωγή κατάσταση (θεραπεία μία φορά μετά διάδοσης του ελέγχου). (Β) του προστάτη CSC εμπλουτίστηκαν από την κυτταρική σειρά DU145 και αγωγή είτε με BLE εκχυλίσματα (20 μg /ml) ή μέσο (έλεγχος) (G1). Μετά από κάθε πολλαπλασιασμό, τα κύτταρα που είχαν αρχικά αγωγή με το εκχύλισμα BLE (20 μg /ml) ή μέσο (έλεγχος) σπάρθηκαν σε ξεχωριστά φρεάτια. Σφαίρες διαδόθηκαν για πέντε γενιές εις διπλούν της κάθε κατάστασης. SFU συνυπολογίζεται και ο μέσος όρος των δύο ανεξάρτητων πειραμάτων εκπροσωπείται. Τα δεδομένα αναφέρονται ως μέση τιμή ± SD (* P & lt? 0,05? # P & lt? 0,01).

Η

Συζήτηση και Συμπεράσματα

Ο γενικός στόχος της θεραπείας του καρκίνου είναι να στοχεύουν μόνο τα καρκινικά κύτταρα , ενώ αφήνουν βιώσιμα φυσιολογικά κύτταρα αλώβητη. Σε αυτή τη μελέτη,

Berberis libanotica

εκχύλισμα εμφάνισαν αντι-νεοπλασματικές επιδράσεις με τη μείωση της βιωσιμότητας και του πολλαπλασιασμού των κυτταρικών σειρών τρία PC σε ένα χρόνο- και δοσο-εξαρτώμενο τρόπο, σύμφωνα με την οποία η κυτταρική γραμμή 22RV-1 έδειξε μία υψηλότερη ευαισθησία για θεραπεία από ό, τι τα άλλα δύο κυτταρικές σειρές (PC3 και DU145). Μία συγκέντρωση 30 μg /ml του εκχυλίσματος BLE ήταν επιτυχής στην επίτευξη IC50, ενώ μία συγκέντρωση 60 μg /ml προκάλεσε μία αναστολή πολλαπλασιασμού 70% και ο κυτταρικός θάνατος επιτεύχθηκε σε 100 μg /ml.