Αφηρημένο

Ο καρκίνος των ωοθηκών είναι μια από τις κύριες αιτίες θανάτου των γυναικών και η ανάπτυξη νέων θεραπευτικών προσεγγίσεων απαιτείται επειγόντως. Πυρηνικός παράγοντας-κΒ (NF-κΒ) είναι μόνιμα ενεργοποιημένη σε διάφορους τύπους καρκίνου, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου των ωοθηκών και είναι γνωστό ότι υποστηρίζει την επιβίωση των καρκινικών κυττάρων. Ωστόσο, μοριακοί μηχανισμοί της επίμονης ενεργοποίηση του ΝΡ-κΒ στον καρκίνο των ωοθηκών παραμένουν σε μεγάλο βαθμό άγνωστες. Αναφέρουμε εδώ ότι, εκτός από την προηγουμένως αναφερθείσα κανονική ενεργοποίηση, ο ΝΡ-κΒ ενεργοποιείται μέσω του μονοπατιού noncanonical σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών. Παρεμβολή RNA διαμεσολαβούμενη αποσιώπηση του NF-κΒ επαγωγής κινάση (ΝΙΚ), μια κεντρική ρυθμιστής της noncanonical οδού, μείωσε την NF-κΒ2 /P52 δραστηριότητα και την έκφραση του γονιδίου ΝΡ-κΒ-εξαρτώμενο ρεπόρτερ δέσμευσης καθώς και γονίδιο στόχος NF-κΒ DNA έκφραση. Αξίζει να σημειωθεί ότι, η κυτταρική ανάπτυξη εξαρτάται από την αγκύρωση και ανεξάρτητη από ήταν μειωμένη σε ΝΙΚ-εξαντλημένο κύτταρα. Η εξάντληση του ΝΙΚ κατέστειλε επίσης σχηματισμό όγκου στη δοκιμασία γυμνό ξενομοσχεύματος ποντικού. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η ΝΙΚ παίζει καθοριστικό ρόλο στην συστατική ενεργοποίηση ΝΡ-κΒ και την εξέλιξη του καρκίνου των ωοθηκών και κύτταρα υποδεικνύουν ότι ΝΙΚ αντιπροσωπεύει ένα ελκυστικό θεραπευτικό στόχο για τον καρκίνο των ωοθηκών

Παράθεση:. Uno M, Saitoh Υ, Mochida Κ, Tsuruyama Ε, Kiyono Τ, Imoto I, et al. (2014) NF-κΒ κινάση επαγωγής, μια Κεντρική Σηματοδότηση συστατικό του μη-Canonical Pathway του NF-κΒ, συμβάλλει στην εξέλιξη του καρκίνου των ωοθηκών. PLoS ONE 9 (2): e88347. doi: 10.1371 /journal.pone.0088347

Επιμέλεια: Javier Σ Castresana, Πανεπιστήμιο της Ναβάρα, Ισπανία

Ελήφθη: 30 του Αυγούστου 2013? Αποδεκτές: 12η του Ιανουαρίου 2014? Δημοσιεύθηκε: 12 Φεβρουαρίου, 2014

Copyright: © 2014 Uno et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε εν μέρει από μια επιχορήγηση-in-ενίσχυση για την Επιστημονική Έρευνα για τα καινοτόμα περιοχές από το Υπουργείο Παιδείας, Πολιτισμού, Αθλητισμού, Επιστημών και Τεχνολογίας της Ιαπωνίας να S.Yamaoka (22117004). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

επιθηλιακού καρκίνου των ωοθηκών είναι ένα από τα πιο θανατηφόρα γυναικολογική κακοήθειες και ποσοστό επιβίωσης της είναι πολύ χαμηλότερη από ό, τι άλλοι καρκίνοι που επηρεάζουν τις γυναίκες. Δεδομένου ότι ο καρκίνος των ωοθηκών παρουσιάζει αρχικά λεπτή και μη ειδικά συμπτώματα, οι περισσότεροι από τους ασθενείς που παρουσιάζουν προχωρημένη νόσο, έτσι ώστε επιθετική χειρουργική θεραπεία σε συνδυασμό με χημειοθεραπεία παραμένει το επίπεδο της περίθαλψης. Αν και προόδους στην χημειοθεραπεία βελτίωσε την επιβίωση των ασθενών με καρκίνο των ωοθηκών, συχνά δεν ανταποκρίνονται στην αρχική χημειοθεραπεία ή υποτροπή μετά την επίτευξη μιας ευνοϊκής απόκρισης [1]. Ως εκ τούτου, οι νέες θεραπευτικές προσεγγίσεις απαιτούνται επειγόντως για την επίτευξη καλύτερης αποτέλεσμα της θεραπείας.

ΝΡ-κΒ είναι ένας μεταγραφικός παράγοντας που εμπλέκονται σε διάφορες βιολογικές διεργασίες όπως ανοσοαπόκρισης, φλεγμονής, καρκίνου και του κυτταρικού θανάτου [2]. Σε κύτταρα θηλαστικών, ο ΝΡ-κΒ αποτελείται από ομο- και ετεροδιμερή από πέντε μέλη, NF-κB1 (ρ50 και ρ105 πρόδρομος του), NF-κΒ2 (P52 και πρόδρομος ρ 100 της), ΚεΙΑ (ρ65), RelB και c-Rel . Σε κύτταρα ηρεμίας, η δραστικότητα του ΝΡ-κΒ ρυθμίζεται αυστηρά από την αλληλεπίδρασή του με ανασταλτικές πρωτεΐνες ΙκΒ. Η ρ105 πρόδρομη πρωτεΐνη υφίσταται συστατική επεξεργασία από το κυψελοειδές πρωτεασώματος που εξαλείφει την περιοχή ΙκΒ-όπως η C-τερματικό για να δημιουργήσει ρ50. Αντιθέτως, η παραγωγή ρ52 απαιτεί ΙκΒ κινάσης (ΙΚΚ) επαγόμενη φωσφορυλίωση και πρωτεασώματος μεσολάβηση επεξεργασία ρ100. NF-κΒ σηματοδότηση διαμεσολαβείται από δύο οδούς που ονομάζεται κανονικό και noncanonical μονοπάτια. Η ενεργοποίηση της κανονικής οδού πυροδοτείται κυρίως από ερεθίσματα κυτοκίνης όπως παράγοντας νέκρωσης όγκων-α (TNFa) και ιντερλευκίνη-1β, που ακολουθείται από ενεργοποίηση του συμπλέγματος ΙΚΚ, η οποία αποτελείται από δύο πρωτεϊνικών κινασών ΙΚΚα και ΙΚΚβ και μιας ρυθμιστικής πρωτεΐνης ΝΡ-κΒ ουσιαστικό διαμορφωτή (ΝΕΜΟ ονομάζεται επίσης IKKγ). Ενεργοποιημένος ΙΚΚ-επαγόμενη φωσφορυλίωση της ΙκΒα οδηγεί σε polyubiquitination και πρωτεασωμική αποικοδόμηση της, ακολουθούμενη από μετατόπιση του ετεροδιμερούς ρ50-ΚεΙΑ στον πυρήνα και επαγωγή της έκφρασης του γονιδίου-στόχου. Η noncanonical μονοπατιού ΝΡ-κΒ ενεργοποιείται μέσω ιδίως μέλη της οικογένειας υποδοχέων TNF όπως υποδοχέα Β κυττάρου παράγοντας ενεργοποίησης (BAFF), CD40 και βήτα υποδοχέα λεμφοτοξίνης που συνδέονται προς τον υποδοχέα TNF-σχετιζόμενους παράγοντες (TRAF) 2 ή TRAF3. Noncanonical ενεργοποίηση του ΝΡ-κΒ έχει αναφερθεί να βασίζονται σε αυξημένη έκφραση του ΝΡ-κΒ επαγωγής κινάση (ΝΙΚ), η οποία επιτυγχάνεται με δύο τρόπους, είτε με δυσλειτουργία του K48 polyubiquitination του ΝΙΚ ή με ενισχυμένη έκφραση mRNA. Σε μη διεγερμένα κύτταρα, ΤΚΑΡ3 συνδέει ΝΙΚ σε ένα πολυ-υπομονάδα Ε3 ουμπικουιτίνης συγκρότημα λιγάση αποτελείται από TRAF2 και κυτταρικών αναστολέας της απόπτωσης 1 και 2 (cIAP1 και cIAP2), οδηγώντας σε Κ48 polyubiquitination και την υποβάθμιση του πρωτεασώματος της ΝΙΚ, διατηρώντας έτσι την έκφραση ΝΙΚ σε χαμηλή επίπεδο. Σε απόκριση προς διέγερση με κυτοκίνες όπως BAFF ή CD40 συνδετήρα, TRAF3 στρατολογείται με τον υποδοχέα και υποβάλλεται ουβικιτινίωση μεσολάβηση αποικοδόμηση του πρωτεασώματος. Αυτό έχει ως αποτέλεσμα τη σταθεροποίηση και τη συσσώρευση των νεοσυντιθέμενες ΝΙΚ, ενώ αυτά τα ερεθίσματα δεν αυξάνουν το

ΝΙΚ

επίπεδο του mRNA [3], [4]. Σε αιμοποιητικά κύτταρα καρκίνου όπως το πολλαπλό μυέλωμα και Τ-κυττάρων λευχαιμίας του ενήλικα, καθώς και καρκινικά κύτταρα πνεύμονα, είτε σταθεροποίηση της πρωτεΐνης ΝΙΚ μέσω μειωμένη αρνητική ρύθμιση από το TRAF3 /TRAF2 /CIAP σύμπλοκο ή παρεκκλίνουσα έκφραση του

ΝΙΚ

έχουν αναφερθεί mRNA [5], [6], [7], [8]. Σε κάθε περίπτωση, η συσσώρευση του ΝΙΚ ως αποτέλεσμα την ενεργοποίηση του συμπλόκου ΙΚΚ, η οποία με τη σειρά της φωσφορυλιώνει ρ100 οδηγεί στην επεξεργασία του για την ρ52 και πυρηνική μετατόπιση του ρ52 /RelB ετεροδιμερές. Σε αντίθεση με την ενεργοποίηση του κανονικού μονοπατιού, noncanonical ενεργοποίηση ΝΡ-κΒ δεν απαιτεί σύνδεση της NEMO με το σύμπλοκο ΙΚΚ και είναι σχετικά ανθεκτικές [9].

Προηγούμενες εκθέσεις έδειξαν συστατική ενεργοποίηση του NF-κΒ και της συνεισφορά στην εκδήλωση του κακοήθους φαινοτύπου σε διάφορους τύπους καρκίνου. ΝΡ-κΒ αποτελέσματα ενεργοποίηση σε αυξημένη έκφραση των γονιδίων που σχετίζονται με την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου, την επιβίωση και εισβολή των καρκινικών κυττάρων. Για παράδειγμα, η υπερέκφραση της κυκλίνης D1, ένα σημαντικός ρυθμιστής του κυτταρικού κύκλου, προάγει τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων, ενώ απορρυθμισμένη έκφραση του Β-κυτταρικού λεμφώματος-XL προστατεύει τα καρκινικά κύτταρα από την απόπτωση. Επιπλέον, μήτρα μεταλλοπεπτιδάση 9 (ΜΜΡ-9) και αγγειακού ενδοθηλιακού αυξητικού παράγοντα προάγει εισβολή όγκου και την αγγειογένεση [10]. Όσο για τον καρκίνο των ωοθηκών, η αναστολή της δραστικότητας ΙΚΚβ, είτε από ένα μικρό μόριο αναστολέα κινάσης ή με μεσολάβηση RNAi γονιδιακή σίγηση, αναφέρθηκε ότι καταστέλλουν τον πολλαπλασιασμό και την εισβολή των καρκινικών κυτταρικών γραμμών ωοθηκών [11]. Ο αποκλεισμός του ΝΡ-κΒ σηματοδότηση με έκφραση ενός κυρίαρχης αρνητικής μορφής ΙκΒα μεταβληθεί ογκογένεσης των καρκινικών κυτταρικών γραμμών ωοθηκών [12]. Επιπλέον, η συσσώρευση των πυρηνικών ΚεΙΑ σε όγκους των ωοθηκών αναφέρθηκε να συνδέσει με φτωχή πρόγνωση [13]. Παρόλα αυτά, οι μηχανισμοί που βρίσκονται πίσω το επίμονο ενεργοποίηση του ΝΡ-κΒ σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών έχουν παραμείνει σε μεγάλο βαθμό άγνωστος. Rattan et al. έδειξαν ότι η έκφραση του παράγοντα επιμήκυνσης μεταγραφής Α-σαν 7, ένας καταστολέας του ΚεΙΑ εξαρτώμενη μεταγραφή του γονιδίου, είναι συχνά κάτω-ρυθμίζονται σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών [14]. Έχουμε αναφερθεί πρόσφατα αυξημένη έκφραση του ΝΙΚ και τον ρόλο της στην ογκογόνο ιδιότητες λευχαιμίας ενηλίκων Τ-κυττάρων και κυττάρων καρκίνου του πνεύμονα, στα οποία

ΝΙΚ

το mRNA εκφράζονται ανώμαλα [7], [8]. Στην παρούσα μελέτη, αποδεικνύουν σημαντικούς ρόλους για ΝΙΚ στον πολλαπλασιασμό

in vitro

και ογκογονικότητα των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών.

Υλικά και Μέθοδοι

Δήλωση Ηθικής

Πειράματα που χρησιμοποιούν πρωτογενή δείγματα καρκίνου των ωοθηκών εγκρίθηκαν από την επιτροπή δεοντολογίας του Τόκιο Ιατρική και Οδοντιατρική του Πανεπιστημίου και γραπτές πληροφορημένες συγκαταθέσεις ελήφθησαν από όλους τους ασθενείς. Όλα τα πειράματα σε ζώα πραγματοποιήθηκαν με την έγκριση της Επιτροπής των ζώων Μελέτη του Τόκιο Ιατρική και Οδοντιατρική του Πανεπιστημίου (Άδεια Νο 0120286A) και ήταν σύμφωνα με όλες τις σχετικές κατευθυντήριες γραμμές και τους νόμους.

καλλιέργειας κυττάρων και τα πρωτογενή δείγματα

Τέσσερις ανθρώπινες καρκινικές κυτταρικές σειρές των ωοθηκών, RMG-Ι, RMUG-S, RMUG-L και ΝΕΠ ελήφθησαν από την ιαπωνική συλλογή της έρευνας Bioresources Τράπεζας κυττάρων (Tokyo, Japan) και 2 καρκινικές κυτταρικές γραμμές ωοθηκών, OMC-3 και JHOC- 5, ήταν από το RIKEN κυττάρων Τράπεζα της Ιαπωνίας (Tsukuba, Ιαπωνία) [15]. RMG-Ι, RMUG-S, RMUG-L και OMC-3 καλλιεργήθηκαν σε μέσο F-12 Ham συμπληρωμένο με 10% FBS. JHOC-5 καλλιεργήθηκε σε 1:01 μίγμα από Dulbecco τροποποιημένο μέσο Eagle (ϋΜΕΜ) και Ham F 12, που περιέχει 0.1 mM μη-απαραίτητα αμινοξέα συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου βοός (FBS). ΝΕΠ καλλιεργήθηκε σε Ελάχιστο Απαραίτητο Μέσο Eagle που περιέχει 20% FBS. Όλα τα άλλα κυτταρικές γραμμές καρκίνου ωοθηκών περιγράφεται αλλού [16], [17], [18]. Ανθρώπινα εμβρυϊκά κυτταρικές σειρές νεφρού, ΗΕΚ293 και ΗΕΚ293Τ καλλιεργήθηκαν σε ϋΜΕΜ που περιέχει 10% FBS. HOSE1C είναι μια αθανατοποιημένη ανθρώπινη κυτταρική γραμμή ωοθηκών επιφάνεια επιθηλιακά κύτταρα που έχουν καταρτισθεί από πρωτογενή ανθρώπινα επιφανειακό επιθήλιο των ωοθηκών (ΣΩΛΗΝΑ) μετά τη μόλυνση με ρετροϊούς που εκφράζουν μεταλλαγμένο Cdk4, cyclinD1 και ανθρώπινης τελομεράσης ανάστροφης μεταγραφάσης [19]. κύτταρα HOSE1C καλλιεργήθηκαν σε 1:01 μίγμα DMEM και του Ham F12 συμπληρωμένο με 10% FBS. Όλα τα μέσα που χρησιμοποιήθηκαν ήταν συμπληρωμένο με 100 U /mL πενικιλλίνης G και 100 μg /mL θειικής στρεπτομυκίνης. Πρωτογενή δείγματα καρκίνου των ωοθηκών ελήφθησαν από 12 ασθενείς σε συνδεδεμένες νοσοκομείο του Τόκιο Ιατρική και Οδοντιατρική του Πανεπιστημίου. Η διάμεση ηλικία των ασθενών ήταν 56,5 έτη κυμαίνονται από 27 έως 80 ετών. Από τις 12 καρκίνους των ωοθηκών, 5 ήταν ιστολογικά ορώδες καρκίνωμα, 4 ήταν σαφείς καρκίνωμα, 2 ήταν ενδομητριοειδές καρκίνωμα και 1 ήταν yalk σάκο του όγκου.

Προετοιμασία των κυτταρικών εκχυλισμάτων

Για την παρασκευή των χονδρικών κυτταρικά εκχυλίσματα, τα κύτταρα συλλέχθηκαν και λύθηκαν σε ρυθμιστικό RIPA [20 mM τρις ​​(υδροξυμεθυλ) αμινομεθάνιο-ΗΟΙ (ρΗ 7,5), 137 mM NaCl, 1% Nonidet Ρ-40 (ΝΡ-40), 0,5% δεοξυχολικό, 0.1% SDS] . Για την εκχύλιση των κυτταροπλασματικών και πυρηνικών πρωτεϊνών, τα κύτταρα κατ ‘αρχάς σε λύση σε υποτονικό ρυθμιστικό διάλυμα [20 mM 4- (2-υδροξυαιθυλο) -1-πιπεραζινοαιθανοσουλφονικό οξύ (HEPES) (ρΗ 7,8), 0,15 mM αιθυλενοδιαμινοτετραοξικό οξύ (EDTA), 0.15 mM ethyleneglycoltetracetic οξύ , 10 mM KCl] και επωάζεται σε πάγο για 10 λεπτά. ΝΡ-40 προστέθηκαν σε μια τελική συγκέντρωση 1%, και τα κυτταρικά εναιωρήματα φυγοκεντρήθηκαν στα 14.000 rpm για 5 λεπτά. Τα υπερκείμενα χρησιμοποιήθηκαν ως κυτταροπλασματικά εκχυλίσματα. Τα σφαιρίδια πλύθηκαν τρεις φορές με ισοτονικό ρυθμιστικό [20 mM HEPES (ρΗ 7.8), 100 mM NaCl, 0.1 mM EDTA και 25% γλυκερόλη] και επαναιωρούνται σε ρυθμιστικό διάλυμα πυρηνικής εκχύλισης [20 mM HEPES (ρΗ 7.8), 400 mM NaCl, 0,1 mM EDTA, 25% γλυκερόλη και 1 mM διθειοθρεϊτόλη (DTT)]. Μετά από 30 λεπτά επώασης στους 4 ° C με συνεχή ανάδευση, το εναιώρημα φυγοκεντρήθηκε στις 14.000 rpm για 2 λεπτά. Τα υπερκείμενα ανακτώνται και χρησιμοποιούνται ως πυρηνικά εκχυλίσματα. Οι RIPA, υποτονικό και πυρηνικών ρυθμιστικά εκχύλιση συμπληρώθηκαν με 1 μg /mL απροτινίνη, 1 μg /mL λευπεπτίνη, 0,57 mM φαινυλομεθανοσουλφονυλοφθορίδιο, 100 μΜ βαναδικό νάτριο, και 20 mM β-γλυκεροφωσφορικό. Η συγκέντρωση πρωτεΐνης προσδιορίστηκε με τη δοκιμασία Bradford.

δοκιμασία μετατόπισης ηλεκτροφορητικής κινητικότητας (EMSA)

Πέντε μg πυρηνικών εκχυλισμάτων επωάστηκαν για 2 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου σε ρυθμιστικό διάλυμα δέσμευσης [10 mM HEPES ( ρΗ 7,8), 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 2.5% γλυκερόλη και 0.5 μg πολυ (dI-dC)] με 0,5 ng του

32Ρ-σημασμένο ΝΡ-κΒ-ειδικό ανιχνευτή που προέρχεται από την H -2Kb υποκινητή ή

32Ρ-σημασμένο Oct-1 ανιχνευτή [20], [21]. Για προσδιορισμούς υπερ-shift, πυρηνικά εκχυλίσματα προεπωάστηκαν με ειδικά αντισώματα ή αντιορός για 1 ώρα επί πάγου πριν από την επώαση με τον σημασμένο ανιχνευτή. Τα ακόλουθα αντισώματα ή αντιορός χρησιμοποιήθηκαν για την προεπώαση: αντίσωμα προς ρ50 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA, # sc-7178 Χ), καθαρισμένη IgG κουνελιού (Cedarlane Laboratories, Hornby, Canada) και ορό αντι-P52 ( Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής, 06-413). Προ-άνοσος ορός, αντι-ΚεΙΑ και αντι-RelB αντιοροί ευγενώς από τους Drs. N.R. Ρύζι (NCI, ΜΑ) και Α Ισραήλ (Institut Pasteur, Παρίσι). Για δοκιμασία ανταγωνιστικής πρόσδεσης, πυρηνικές πρωτεΐνες επωάστηκαν με 100-πλάσια μοριακή περίσσεια κρύου ολιγονουκλεοτιδίου πριν την προσθήκη του επισημασμένου ανιχνευτή. Τα σύμπλοκα πρωτεΐνης-ΟΝΑ διαχωρίστηκαν σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου που περιείχε 2,5% γλυκερίνη ακολουθούμενη από αυτοραδιογραφία.

δραστικότητα ΝΡ-κΒ δέσμευσης DNA

Η πρόσδεση του ρ52 ή RelB να αλληλουχία δέσμευσης του ΝΡ-κΒ ποσοτικοποιήθηκε με Transam ™ ΝΡ-κΒ Οικογένεια Kit (Active Motif, Carlsbad, CA, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Εν συντομία, 5 μg πυρηνικών εκχυλισμάτων προστέθηκαν σε πλάκα 96 φρεατίων προ-επικαλυμμένες με το ολιγονουκλεοτίδιο που περιέχει αλληλουχία συναίνεσης ΝΡ-κΒ. Η ενεργοποιημένη ρ52 ή RelB παρούσες στα πρόσδεση σε αυτό το νουκλεοτίδιο εκχυλίσματα ανιχνεύθηκε με δευτερεύοντα αντισώματα συζευγμένα σε HRP.

ανοσοαποτύπωσης

ολόκληρου κυττάρου (30 μγρ), κυτταροπλασματική (30 μg) και της πυρηνικής (10 μg) κυτταρολύματα αναλύθηκαν με SDS-PAGE και αναλύθηκαν με ανοσοστύπωση. Χρησιμοποιήθηκαν τα ακόλουθα αντισώματα: anti-NF-P52 κΒ2 (C-5) (Santa Cruz Biotechnology, # sc-7386) για την ανίχνευση του ρ52 και του προδρόμου ρ100 του? αντι-ΝΙΚ (Cell Signaling, Danvers, ΜΑ, ΗΠΑ, # 4994)? αντι-RelB (C-19) (Santa Cruz Biotechnology, # sc-226)? αντι-φωσφο-P100 (Ser866 /870) (Cell Signaling, # 4810)? αντι-φωσφο-ΙκΒα (Ser32 /36) (5a5) (Cell Signaling, # 5205)? αντι-ΙκΒα (C-21) (Santa Cruz Biotechnology, # sc-371)? αντι-φωσφο-ΙΚΚα (Ser180) /ΙΚΚβ (Ser181) (Cell Signaling, # 2681), αντι-ΙΚΚα (H-744, Santa Cruz Biotechnology, # sc-7218), αντι-ΙΚΚα /β (H-470, Σάντα Cruz Biotechnology, # sc-7607), αντι-TRAF2 (C90-481) (BD Biosciences, San Jose, CA, USA, 558.890)? αντι-TRAF3 (Η-122) (Santa Cruz Biotechnology, SC-1828)? αντι-cIAP1 (R &? συστήματα D, Minneapolis, MN, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής, AF8181)? αντι-λαμίνη A /C (4C11) (Cell σηματοδότηση, # 4774)? αντι-α-τουμπουλίνης (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής, T9026). Για την ανίχνευση της ενδογενούς πρωτεΐνης ΝΙΚ, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 0,1% DMSO ή 20 μΜ MG132 (Peptide Institute, Osaka, Japan) επί 6 ώρες και κυτταροπλασματικά εκχυλίσματα υποβλήθηκαν σε ανάλυση ανοσοστυπώματος.

σε πραγματικό χρόνο αντίστροφη μεταγραφή -PCR (RT-PCR) ανάλυση

σε πραγματικό χρόνο ανάλυση RT-PCR διεξήχθη ουσιαστικά όπως περιγράφηκε προηγουμένως [7]. Εν συντομία, ολικό RNA εκχυλίστηκε από κυτταρικές σειρές και ιστούς καρκίνου των ωοθηκών χρησιμοποιώντας ISOGEN (Nippon Gene, Tokyo, Japan) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Τα επίπεδα mRNA της

ΝΙΚ

,

κυκλίνης D1

και

MMP-9

μετρήθηκαν με StepOnePlus σε πραγματικό χρόνο σύστημα RT-PCR (Applied Biosystems, Foster City, CA, ΗΠΑ). Εκατό ng του ολικού RNA υποβλήθηκε σε ποσοτική RT-PCR χρησιμοποιώντας TaqMan® One-Step RT-PCR Master Mix Αντιδραστήρια Kit (Applied Biosystems). Αντίστροφη μεταγραφή εκτελέστηκε στους 48 ° C για 30 λεπτά και Taq DNA πολυμεράση ενεργοποιήθηκε στους 95 ° C για 10 λεπτά, ακολουθούμενη από 45 κύκλους ενίσχυσης μετουσίωσης στους 95 ° C για 15 δευτερόλεπτα και ανασύνδεση και επέκταση στους 60 ° C για 1 λεπτό . Τα επίπεδα mRNA κανονικοποιήθηκαν στα 18S ριβοσωμικού RNA επίπεδα μετρήθηκαν με πραγματικού χρόνου RT-PCR χρησιμοποιώντας 100 pg ολικού RNA. Η έκφραση του miR-31 εξετάστηκε χρησιμοποιώντας TaqMan® Micro RNA Δοκιμασίες (Applied Biosystems) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Τα επίπεδα miR-31 ομαλοποιήθηκαν με τα επίπεδα έκφρασης RNU48.

λεντιϊοί

Οι φορείς λεντοϊών σε θέση να εκφράζουν shRNA στόχευσης

ΝΙΚ

(PCS-puro-Νίκη-1 και υπολογιστές -puro-Νίκη-2) έχουν περιγραφεί προηγουμένως [7]. Η αλληλουχία στόχευσης ειδική για

πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη

(GFP) 5′-ACCCGCGCCGAGGTGAAG-3 ‘εισήχθη αμέσως κατάντη του προαγωγέα Η1 του φορέα pSuperRetoro (Oligoengine, Seattle, WA, USA), δημιουργώντας PSR-GFPi . Η κασέτα έκφρασης shRNA μεταφέρθηκε στο φορέα λεντοϊού, PCS-puro-PRE, που φέρει το γονίδιο ανθεκτικότητας σε πουρομυκίνη εκφράζεται υπό τον έλεγχο του προαγωγού φωσφογλυκερικής κινάσης [7]. Το πλασμίδιο που προέκυψε ονομάστηκε PCS-puro-GFPi. Για την παραγωγή των φακοϊών ικανή να εκφράζει shRNA, κύτταρα ΗΕΚ293Τ συνεπιμολύνθηκαν με PCS-puro-GFPi (shCtl), PCS-puro-Νίκη-1 (shNIK-1) ή PCS-puro-Νίκη-2 (shNIK-2) μαζί με το κατασκεύασμα συσκευασίας pCMV-ΔR8.2 και pHCMV-VSV-G (είδος δώρα από τον Dr. ISY Chen) χρησιμοποιώντας Fugene6 (Promega, Madison, WI, USA). Τα υπερκείμενα καλλιέργειας συλλέχθηκαν και διηθήθηκαν 56 ώρες μετά την επιμόλυνση. κύτταρα RMG-Ι και JHOC-5 μολύνθηκαν με αυτούς τους φακοϊούς για 12 ώρες με την παρουσία 10 μg /mL polybrene. Μολυσμένα κύτταρα επιλέχθηκαν με την παρουσία 4 μg /mL πουρομυκίνη (Sigma-Aldrich) 24 ώρες μετά τη μόλυνση.

ΝΡ-κΒ γονίδιο ρεπόρτερ δοκιμασία

κύτταρα

RMG-Ι και JHOC-5 ήταν μολύνθηκαν με φακοϊό φορείς που φέρουν είτε NF-κΒ-απόκρισης υποκινητή με γνώμονα Firefly

λουσιφεράσης

γονίδιο (CS-κΒ-R2.2) ή ο παράγοντας επιμήκυνσης (EF) -1α υποκινητή με γνώμονα

Renilla λουσιφεράσης

γονίδιο (pCERp) [8], [22]. Τα προκύπτοντα πισίνες κύτταρο στη συνέχεια μολύνθηκαν με φακοϊούς ικανό να εκφράζει κάθε shRNA. Μετά την επιλογή με 4 μg /mL πουρομυκίνη επί 3 ημέρες, τα κύτταρα συλλέχθηκαν και οι δραστηριότητες της λουσιφεράσης μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας σύστημα προσδιορισμού Dual-Luciferase Reporter (Promega). δραστηριότητα λουσιφεράσης NF-κΒ-εξαρτώμενη Firefly ομαλοποιήθηκε με εξαρτώμενα

Renilla

δραστηριότητα λουσιφεράσης EF-1α υποκινητή-οδηγείται.

κυτταρικού κύκλου ανάλυσης

Τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν σε 70% αιθανόλη και επωάστηκαν με 0.5 mg /mL RNase για 45 λεπτά και στη συνέχεια χρωματίζονται με 30 μg /mL ιωδιούχου προπιδίου για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Η περιεκτικότητα σε DNA των κυττάρων μετρήθηκε με τη χρήση του συστήματος FACS Calibur (BD Biosciences) και αναλύθηκαν CellQuest λογισμικού (BD Biosciences).

μαλακό άγαρ

δοκιμασία κυττάρων

RMG-Ι που εκφράζουν shCtl ή shNIK-1 ήταν σπάρθηκαν σε F-12 μέσο το οποίο περιέχει 0,33% άγαρ. Μετά από 4 εβδομάδες επώασης, οι αποικίες μεγαλύτερες από 60 μm σε διάμετρο μετρήθηκαν για να αξιολογηθεί αγκύρωση ανεξάρτητη ανάπτυξη των κυττάρων.

Μοντέλο ξενομοσχεύματος όγκου Mouse

BALB /cAJcl-ηυ /ηυ ποντίκια (CLEA Japan , Τόκιο, Ιαπωνία) διατηρήθηκαν κάτω από ειδικές άνευ παθογόνου κατάστασης στο Πειραματικό Κέντρο ζώων του Τόκιο Ιατρική και Οδοντιατρική του Πανεπιστημίου. κύτταρα RMG-Ι που εκφράζουν shCtl ή shNIK-1 αιωρήθηκαν σε μέσο ελεύθερο ορού. Αθυμικά ποντίκια (ηλικίας 5-6 εβδομάδων) εμβολιάσθηκαν υποδορίως στην postauricular περιοχή με 5 × 10

6 κύτταρα. Ο όγκος του όγκου καταγράφηκε κάθε εβδομάδα. Η μεγαλύτερη διαμήκης διάμετρος (μήκος) και το μεγαλύτερο εγκάρσιο διάμετρος (πλάτος) μετρήθηκαν με ένα παχύμετρο. Ο όγκος του όγκου υπολογίστηκε με τον ακόλουθο τύπο: όγκος όγκου = μήκος Χ πλάτος

2/2. Όλοι οι ποντικοί θυσιάστηκαν 3 εβδομάδες μετά τον εμβολιασμό και μετρήθηκε το βάρος του κάθε όγκου.

Στατιστικά

Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέση ± SD ή ως αντιπρόσωπος εικόνες τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα. Η στατιστική ανάλυση πραγματοποιήθηκε με τη χρήση t-test δύο ουρά Student. Για την ανάλυση του ασθενούς δείγματος και το μοντέλο ποντικού, σημαντικές διαφορές μεταξύ των ομάδων προσδιορίστηκαν με την Mann-Whitney U. Ένα

P

αξία των & lt? 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική

Αποτελέσματα

Noncanonical ενεργοποίηση του NF-κΒ στα καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών

Για να διερευνήσουν πώς NF. -κB ιδιοσυστατικά ενεργοποιείται σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών, μπορούμε κατ ‘αρχάς εξετάστηκε δραστικότητα δέσμευσης με EMSA ΝΡ-κΒ DNA. Ο καρκίνος των ωοθηκών κύτταρα έδειξαν σημαντικά αυξημένη δραστικότητα ΝΡ-κΒ δέσμευσης DNA σε σύγκριση με ΗΕΚ293 κύτταρα είναι γνωστό ότι έχουν μια βασική δραστικότητα ΝΡ-κΒ. HOSE1C, μία αθανατοποιημένη επιφάνεια των ωοθηκών επιθηλιακής κυτταρικής γραμμής έδειξαν μια δραστικότητα δέσμευσης του ΝΡ-κΒ στο χαμηλότερο ΗΕΚ293 κύτταρα και χρησιμοποιήθηκε ως μάρτυρας στις παρακάτω μελέτες (Σχήμα 1Α). Η σύνδεση με το ραδιο-σημασμένο ανιχνευτή ήταν αποτελεσματικά ανταγωνίστηκε με μια περίσσεια ποσότητα ψυχρού ανιχνευτή, δείχνοντας την εξειδίκευση της σύνδεσης (Σχήμα 1Β). Ακόμη και αν η επίμονη ενεργοποίηση του ΝΡ-κΒ έχει αναφερθεί στον καρκίνο των ωοθηκών, τα σύμπλοκα πρόσδεσης ΝΡ-κΒ-DNA που εμπλέκεται σε αυτά τα κύτταρα έχουν παραμείνει άγνωστες. δοκιμασίες υπερ-μετατόπιση αποκάλυψε ότι όχι μόνο NFKB1 /p50 και ΚεΙΑ, αλλά και NFKB2 /P52 και RelB συμμετείχαν στις NF-κΒ DNA-δεσμευτική συγκροτήματα στην RMG-Ι και JHOC-5 κύτταρα (Εικόνα 1Β). Immunoblottings έδειξαν αυτές οι σειρές εκφράζονται ειδικώς φωσφορυλιωμένες μορφές των ΙΚΚα, ΙΚΚβ και ΙκΒα (Σχήμα 1C). Η φωσφορυλίωση του ΙΚΚβ και ΙκΒα ήταν πιο έντονη σε JHOC-5 και ΝΕΠ κυττάρων ενώ ΙΚΚα ήταν κυρίως φωσφορυλιωμένο σε RMG-Ι και OMC-3 κύτταρα, υποδεικνύοντας προτιμησιακή ενεργοποίηση των κανονικών και noncanonical οδών σε κάθε κυτταρικές σειρές. Το γεγονός ότι η έκφραση του NFKB2 /P100 εξαρτάται σε μεγάλο βαθμό από την ενεργοποίηση του NF-κΒ μέσω της κανονικής οδού μπορεί να εξηγεί εν μέρει την άφθονη έκφραση του NFKB2 /P100 και φωσφορυλιωμένη μορφή της, καθώς και ρ52 σε JHOC-5 κύτταρα. Η φωσφορυλιωμένη μορφή της ρ100 ανιχνεύθηκε στα κυτταρικές γραμμές καρκίνου των ωοθηκών εκτός από την RMUG-S, αλλά όχι στον έλεγχο 293 ή κύτταρα HOSE1C. Η παρουσία ΚεΙΑ και RelB στον πυρήνα συσχετίζονται με τα αποτελέσματα της EMSA (Εικόνα 1D). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι τόσο η κανονική και /ή noncanoncal μονοπάτια NF-κΒ διαφορικά ενεργοποιούνται σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών.

(Α) Πέντε μικρογραμμάρια πυρηνικά εκχυλίσματα από τις υποδεικνυόμενες κυτταρικές σειρές υποβλήθηκαν σε EMSA χρησιμοποιώντας τα

32Ρ-σημασμένα ολιγονουκλεοτίδια που περιέχουν αλληλουχία πρόσδεσης ΝΡ-κΒ ή Oct-1-δεσμευτική αλληλουχία ως ανιχνευτές. (Β) Για τα δείγματα των πυρηνικών δοκιμασία ανταγωνισμού προεπωάστηκαν με 100-πλάσια μοριακή περίσσεια κρύου ολιγονουκλεοτιδίου πριν από την προσθήκη του επισημασμένου ανιχνευτή (αριστερό πάνελ). δέσμευσης DNA συστατικά ΝΡ-κΒ σε υποδεικνυόμενες κυτταρικές γραμμές προσδιορίστηκαν με υπερ-shift EMSA (δεξί πάνελ). Πυρηνικά εκχυλίσματα (5 μg) από τις υποδεικνυόμενες κυτταρικές σειρές προεπωάστηκαν για 30 λεπτά με καθαρισμένη IgG ποντικού, αντι-ρ50 ή αντισώματα αντι-c-Rel, προ-άνοσο (PI), αντι-ρ52, αντι-ΚεΙΑ ή αντι-RelB ορούς, και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε EMSA με το ΝΡ-κΒ-ειδικό ανιχνευτή. (Γ και Δ) Nuclear (10 μg), κυτταροπλασματική (30 μg) ή ολόκληρων κυττάρων (30 μg) εκχυλίσματα υποβλήθηκαν σε SDS-PAGE ακολουθούμενη από immunoblottings με τα υποδεικνυόμενα αντισώματα.

Η

ΝΙΚ παίζει ένα κεντρικό ρόλο στην συστατική ενεργοποίηση του NF-κΒ στο ωοθηκών καρκινικά κύτταρα

η αυξημένη έκφραση του NFKB2 /P52 μας ώθησε να εξετάσουμε την έκφραση ΝΙΚ στα καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών. ποσοτική ανάλυση RT-PCR αποκάλυψε ότι τα κύτταρα HOSE1C έλεγχος έδειξε μεγαλύτερο CT διαφορά από τα 28 ωοθηκών κυτταρικές γραμμές που εξετάστηκαν, μεταξύ των οποίων 17 κυτταρικών σειρών που εκφράζονται 4 έως 16 φορές πιο

ΝΙΚ

mRNA από κύτταρα HOSE1C ελέγχου (Σχήμα 2Α). Μια πρόσφατη έκθεση έδειξε ότι η απώλεια των microRNA miR-31 στόχευσης

ΝΙΚ

κρύβεται συστατική ενεργοποίηση του NF-κΒ σε ενήλικες κύτταρα Τ-κυττάρων λευχαιμίας [23]. Ως εκ τούτου, αξιολογήθηκαν miR-31 έκφραση σε ωοθηκικό καρκινικά κύτταρα με ποσοτική RT-PCR. Τέσσερις από τις 6 κυτταρικές σειρές καρκίνου είχαν λιγότερο από το 1/8 του miR-31 RNA στα κύτταρα HOSE1C αν συσχέτιση μεταξύ

ΝΙΚ

και miR-31 έκφρασης RNA δεν ήταν σημαντική (Σχήμα 2Β και 2Γ). Σημαντικά, ποσοτική ανάλυση RT-PCR ιστών καρκίνου των ωοθηκών αποκάλυψε μια μέση τιμή των 2,4-πλάσια αύξηση σε

ΝΙΚ

mRNA έκφραση σε σύγκριση με φυσιολογικούς ιστούς των ωοθηκών (Εικόνα 2D). Ωστόσο, miR-31 έκφραση σε ιστούς καρκίνου των ωοθηκών δεν διέφεραν σημαντικά από εκείνα σε φυσιολογικούς ιστούς ωοθηκών ούτε στατιστικά συσχετίζονται με

ΝΙΚ

έκφραση mRNA (Σχήμα 2Ε και 2F). Έτσι, ορισμένες περιπτώσεις

ΝΙΚ

συσσώρευση του mRNA δεν μπορεί να εξηγηθεί αποκλειστικά από μειωμένη miR-31 έκφρασης και προτείνουν προηγουμένως αποκάλυψε μηχανισμό (ες) του

ΝΙΚ

υπερέκφραση του mRNA.

( Α και D) ολικό RNA εκχυλίστηκε από τις υποδεικνυόμενες κυτταρικές σειρές ή ιστούς του καρκίνου των ωοθηκών και υποβλήθηκε σε πραγματικό χρόνο RT-PCR για την ποσοτικοποίηση

ΝΙΚ

έκφραση mRNA. (Α) Η ΔΟΙ προσδιορίζεται ως η διαφορά μεταξύ της τιμής Ct της

ΝΙΚ

mRNA και ότι αραιωμένου 18S rRNA. Ενιαία αστερίσκοι υποδηλώνουν σημαντική μείωση (

P

& lt? 0.05) στην τιμή ΔCt σε σύγκριση με τα κύτταρα HOSE1C. (Δ) Η

ΝΙΚ

επίπεδα mRNA ομαλοποιήθηκαν στο 18S RNA. Σχετική

Τα ΝΙΚ

επίπεδα mRNA δείχνεται με πλάσια αύξηση στο mRNA αφθονία σε σχέση με το μέσο όρο της κανονικής ωοθηκών (αυθαίρετα ορίζεται σε 1). (Β και Ε) Ολικό RNA που χρησιμοποιείται στο πάνελ Α και D υποβλήθηκε σε πραγματικό χρόνο RT-PCR για miR-31 ποσοτικοποίησης. (Β) Η ΔΟΙ προσδιορίζεται ως η διαφορά μεταξύ της τιμής Ct του miR-31 και του RNU48 εσωτερικού ελέγχου. Ενιαία αστερίσκοι υποδηλώνουν σημαντική αύξηση (

P

& lt? 0.05) στην τιμή ΔCt σε σύγκριση με τα κύτταρα HOSE1C. (Ε) Τα επίπεδα miR-31 ομαλοποιήθηκαν με τα αντίστοιχα επίπεδα RNU48. Τα σχετικά επίπεδα miR-31 φαίνεται από διπλάσια αύξηση της miR-31 αφθονία σε σχέση με το μέσο όρο της κανονικής ωοθηκών (αυθαίρετα ορίζεται σε 1). (C, F) Pearson συντελεστής συσχέτισης R

2 μεταξύ του mRNA ΝΙΚ και τα επίπεδα του miR-31 υπολογίστηκε. (G) Τριάντα μικρογραμμάρια προϊόντα λύσης υποβλήθηκαν σε SDS-PAGE ακολουθούμενη από immunoblottings με τα υποδεικνυόμενα αντισώματα. Για την ανίχνευση των ενδογενών ΝΙΚ, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με MG132 (20 μΜ) ή DMSO για 6 ώρες πριν από την παρασκευή των κυτταροπλασματικών εκχυλισμάτων. N.S., δεν είναι σημαντική.

Η

Η έκφραση της πρωτεΐνης ΝΙΚ ρυθμίζεται αυστηρά από polyubiquitination και την υποβάθμιση του πρωτεασώματος με τη μεσολάβηση και διατηρείται γενικά μη ανιχνεύσιμο από ανοσοαποτύπωση χωρίς να αναστέλλουν την ταχεία υποβάθμιση της. Η έκφραση του TRAF2, 3 και cIAP1 σε καρκινικές κυτταρικές σειρές των ωοθηκών που ρυθμίζουν αρνητικά την έκφραση ΝΙΚ παρέμεινε συγκρίσιμη με κύτταρα μάρτυρες (Σχήμα S1). Καθώς δεν μπορέσαμε να ανιχνεύσει την πρωτεΐνη ΝΙΚ με απλή ανοσοκηλίδωση ή ανοσοκαθίζησης-συζευγμένο ανοσοαποτύπωση χρησιμοποιώντας κυτταροπλασματικά προϊόντα λύσης από αυτές τις κυτταρικές, εμείς κατεργασμένα κύτταρα με έναν αναστολέα πρωτεασώματος MG132 πριν από την εκχύλιση των πρωτεϊνών. Η πρωτεΐνη ΝΙΚ ήταν εύκολα ανιχνεύσιμη στα καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών με την παρουσία MG132, αλλά όχι σε HOSE1C έλεγχο ούτε ΗΕΚ293 κύτταρα (Σχήμα 2G), υποδεικνύοντας αυξημένη παραγωγή της πρωτεΐνης ΝΙΚ στα καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών. Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι συλλογικά ΝΙΚ εκφράζεται μη φυσιολογικά στο pretranslational επίπεδο σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών.

Προηγούμενες εκθέσεις έδειξαν ότι η κακή πρόγνωση των ασθενών με καρκίνο των ωοθηκών συσχετίζεται με την υπερέκφραση του προ-ΜΜΡ-9 και η κυκλίνη D1 [24], [25], των οποίων η έκφραση είναι γνωστό ότι ρυθμίζονται από ΝΡ-κΒ. αναλύσεις Ποσοτική RT-PCR έδειξαν ότι το

ΜΜΡ-9

επιπέδων mRNA των περισσοτέρων από τις κυτταρικές σειρές καρκίνου των ωοθηκών ήταν υψηλότερη από εκείνη των κυττάρων HOSE1C ελέγχου. Η

MMP-9

επίπεδα mRNA σε κάθε κυτταρική σειρά δεν συσχετίζονται με το

ΝΙΚ

mRNA επίπεδα (Σχήμα 3Α). Επίπεδα

cyclinD1

mRNA σε όλες τις εξετασθείσες κυτταρικές γραμμές καρκίνου ωοθηκών υπερέβαινε εκείνη των κυττάρων ΗΕΚ293, ενώ τα κύτταρα HOSE1C εκφράζεται σε αφθονία

cyclinD1

mRNA οφείλεται στην αναγκαστική έκφραση αυτού του γονιδίου για αθανατοποίηση. Σε ιστούς καρκίνου των ωοθηκών,

MMP-9

mRNA έκφραση ήταν σημαντικά επάνω ρυθμισμένη και

Κυκλίνη D1

επίπεδα mRNA έτεινε να αυξηθεί στο ιστούς του καρκίνου των ωοθηκών, αν και αυτές έκφραση mRNA σε κάθε δείγμα δεν σχετίζεται με την

ΝΙΚ

έκφραση mRNA (Σχήμα 3Β).

Ολικό RNA που εξάγεται από τα υποδεικνυόμενα κυτταρικές γραμμές (Α) ή τον καρκίνο των ωοθηκών ιστούς (Β) υποβλήθηκε σε πραγματικό χρόνο RT-PCR για την ποσοτικοποίηση

MMP-9

ή

κυκλίνης D1

έκφραση του mRNA. (Α) Η ΔΟΙ προσδιορίζεται ως η διαφορά μεταξύ της τιμής Ct της

MMP-9

ή

κυκλίνης D1

mRNA και ότι αραιωμένου 18S rRNA. Ενιαία αστερίσκοι υποδηλώνουν σημαντική διαφορά (

P

& lt? 0.05) στην τιμή ΔCt σε σύγκριση με τα κύτταρα HOSE1C (

MMP-9

) ή κύτταρα ΗΕΚ293 (

κυκλίνης D1

). (Β) Τα επίπεδα mRNA κανονικοποιήθηκαν προς 18S RNA. Τα σχετικά επίπεδα mRNA δείχνεται με διπλάσια αύξηση της αφθονίας του mRNA σε σχέση με το μέσο όρο της κανονικής ωοθηκών (αυθαίρετα ορίζεται σε 1). Pearson συντελεστής συσχέτισης R

2 μεταξύ

MMP-9

ή

κυκλίνης D1

και

ΝΙΚ

επίπεδα mRNA φάνηκε. Τα σχετικά επίπεδα mRNA υπολογίζεται φορές αύξηση στο mRNA αφθονία σε σχέση με εκείνη των κυττάρων HOSE1C (

ΜΜΡ-9

) ή ΗΕΚ293 κύτταρα (

Κυκλίνη D1

).

Η

Για να διερευνήσει τον τρόπο ΝΙΚ ρυθμίζει ΝΡ-κΒ-εξαρτώμενη μεταγραφή γονιδίων σε κυτταρικές γραμμές καρκίνου ωοθηκών, έχουμε δημιουργήσει ένα σύστημα κυψελών ανταποκριτή ΝΡ-κΒ με φακοϊό μεταγωγή. κύτταρα RMG-Ι και JHOC-5 μολύνθηκαν με φακοϊό φορείς που φέρουν ένα

λουσιφεράσης μονάδα μεταγραφής Firefly υπό τον έλεγχο του εξαρτώμενη από ΝΡ-κΒ προαγωγού ή

λουσιφεράσης Renilla μονάδα

μεταγραφής υπό τον έλεγχο του συστατική παράγοντα επιμήκυνσης 1α προερχόμενο προαγωγός ως ένας εσωτερικός έλεγχος. Ιδρύθηκε πισίνες κύτταρο στη συνέχεια μολύνθηκαν με φακοϊό ικανό να εκφράζει είτε shRNA στόχευσης

ΝΙΚ

ή

GFP

και υποβλήθηκε σε προσδιορισμούς λουσιφεράσης. Η εξάντληση του ΝΙΚ επαληθεύτηκε με ποσοτική RT-PCR και ανοσοαποτύπωση με την παρουσία του MG132 (Σχήμα 4Α). εξάντληση ΝΙΚ έκφραση μειώνεται ρ52 και έκφραση γονιδίου ανταποκριτή ΝΡ-κΒ-εξαρτώμενη σε RMG-Ι και JHOC-5 κυττάρων (Σχήμα 4Β και 4C). Έκφραση του άλλου shRNA στόχευσης

ΝΙΚ

mRNA οδήγησε σε παρόμοια καταστολή των εξαρτώμενων από NF-κΒ μεταγραφή, αποκλείοντας το ενδεχόμενο της off επιπτώσεις στόχου (Σχήμα S2A, Β).

(Α) RMG- Ι και JHOC-5 κύτταρα μολύνθηκαν με φακοϊό φορείς που εκφράζουν shRNA στόχευση

ΝΙΚ

(shNIK-1) ή

GFP

(shCtl). Ολικό RNA εκχυλίσθηκε από αυτά τα κύτταρα και υποβλήθηκε σε πραγματικό χρόνο RT-PCR για την ποσοτικοποίηση

ΝΙΚ

έκφραση mRNA. Η

ΝΙΚ

επίπεδα mRNA ήταν κανονικοποιημένα σε 18S RNA. Σχετική

Τα ΝΙΚ

επίπεδα mRNA δείχνεται με πλάσια αύξηση στο mRNA αφθονία σε σχέση με το μέσο όρο των shCtl (αυθαίρετα ορίζεται σε 1). Ενιαία αστερίσκοι υποδηλώνουν σημαντική μείωση (

P

& lt? 0,05) σε σύγκριση με τα κύτταρα shCtl. Παράλληλα, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με MG132 (20 μΜ) για 6 ώρες πριν από την παρασκευή των κυτταροπλασματικών εκχυλισμάτων. Κυτταροπλασματικά εκχυλίσματα (30 μg) υποβλήθηκαν σε Ανάλυση ανοσοκηλιδώσεως με τα υποδεικνυόμενα αντισώματα. (Β) RMG-Ι και JHOC-5 κύτταρα μολυσμένα με ένα φορέα που φέρει φακοϊό ένα ΝΡ-κΒ-εξαρτώμενο κασέτα έκφρασης λουσιφεράσης Firefly και ότι φέρει ένα EF-1α υποκινητή εξαρτώμενη

Renilla

λουσιφεράσης κασέτα έκφρασης. Ιδρύθηκε πισίνες κυττάρων μολύνθηκαν με φακοϊό φορείς που εκφράζουν shRNA στόχευση

ΝΙΚ

(shNIK-1) ή

GFP

(shCtl). Τα κύτταρα επιλέχθηκαν με πουρομυκίνη (4 μg /mL) για 72 ώρες και υποβλήθηκαν σε δοκιμασία διπλής λουσιφεράσης, στην οποία η ενεργότητα της λουσιφεράσης Firefly κανονικοποιήθηκε με

Renilla

δραστικότητα λουσιφεράσης. Οι σχετικές δραστηριότητες της λουσιφεράσης εκφράζεται ως φως μονάδα σε σύγκριση με το μάρτυρα (shCtl). Yang et al.