Οι

Αφηρημένο

υποδοχείς του αυξητικού παράγοντα ινοβλαστών (FGFRs) ενεργοποιείται από μετάλλαξη και υπερεκφράζεται σε κύστης καρκίνους (ΣΔ), και αναστολείς FGFR αξιολογούνται επί του παρόντος σε κλινικές δοκιμές σε ασθενείς με BC. Ωστόσο, τα κύτταρα π.Χ. εμφανίζουν αξιοσημείωτη ετερογένεια στις απαντήσεις τους στο FGFR αναστολείς, και οι βιολογικοί μηχανισμοί που διέπουν αυτή την ετερογένεια δεν είναι σαφώς καθορισμένες. Εδώ χρησιμοποιήσαμε ένα νέο αναστολέα του FGFRs 1-3 και RNAi να προσδιοριστούν τα αποτελέσματα της αναστολής FGFR1 ή FGFR3 σε ένα πάνελ ανθρώπινων κυτταρικών γραμμών BC. Παρατηρήσαμε ότι FGFR1 εκφράστηκε σε κύτταρα π.Χ. που εξέφρασαν επίσης την «μεσεγχυματικά« δείκτες ZEB1 και βιμεντίνης, ενώ η έκφραση FGFR3 περιορίστηκε στο E-cadherin- και p63-θετικά «επιθηλιακά» υποσύνολο. Ευαισθησία στο ανασταλτικές της ανάπτυξης επιδράσεις της bgj-398 επίσης περιορίζονται στα «επιθηλιακά» κύτταρα BC και συσχετίζονται απευθείας με τα επίπεδα mRNA FGFR3 αλλά όχι με την παρουσία του την ενεργοποίηση FGFR3 μεταλλάξεων. Σε αντίθεση, bgj-398 δεν ανέστειλε έντονα τον πολλαπλασιασμό αλλά έκανε μπλοκ εισβολή στα «μεσεγχυματικά» κύτταρα π.Χ. in vitro. Παρομοίως, bgj-398 δεν ανέστειλε πρωτογενή ανάπτυξη του όγκου αλλά μπλοκάρει την παραγωγή των κυκλοφορούντων κυττάρων όγκου (ΚΜΑ) και το σχηματισμό λεμφαδένα και απομακρυσμένων μεταστάσεων σε ποντίκια που φέρουν εμφυτευμένα ορθοτοπικά «μεσεγχυματικά« κύτταρα UM-UC3. Μαζί, τα δεδομένα μας δείχνουν ότι FGFR1 και FGFR3 έχουν σε μεγάλο βαθμό μη αλληλεπικαλυπτόμενες ρόλους στη ρύθμιση εισβολή /μετάσταση και τον πολλαπλασιασμό σε διακριτές «μεσεγχυματικά» και «επιθηλιακά» υποσύνολα ανθρώπινων κυττάρων BC. Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι ο φαινότυπος EMT όγκου θα είναι ένας σημαντικός καθοριστικός παράγοντας των βιολογικών επιδράσεων των αναστολέων FGFR σε ασθενείς

Παράθεση:. Cheng Τ, Roth Β, Choi W, Μαύρο PC, Dinney C, McConkey DJ (2013 ) αυξητικού παράγοντα ινοβλαστών υποδοχείς-1 και -3 Παίξτε διακριτούς ρόλους στον κανονισμό της ουροδόχου κύστης ανάπτυξη του καρκίνου και μετάσταση: Συνέπειες για θεραπευτική στόχευση. PLoS ONE 8 (2): e57284. doi: 10.1371 /journal.pone.0057284

Επιμέλεια: Chih-Hsin Tang, η Κίνα Ιατρικού Πανεπιστημίου, Ταϊβάν

Ελήφθη: 25 Οκτωβρίου, 2012? Αποδεκτές: 21 Ιαν 2013? Δημοσιεύθηκε: 26 του Φεβρουαρίου 2013

Copyright: © 2013 Cheng et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη χρηματοδοτήθηκε από το MD Anderson ουροδόχου κύστης σπορίων (Ρ50 CA91846), το Ίδρυμα Baker, και το MD Anderson CCSG (P30 016 672). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει κανένα ανταγωνιστικών συμφερόντων

Εισαγωγή

καρκίνου της ουροδόχου κύστης (π.Χ.) είναι η πέμπτη πιο κοινή μορφή καρκίνου στις δυτικές χώρες. καρκίνοι της ουροδόχου κύστης μπορεί να χωριστεί σε δύο μεγάλες υποομάδες που διαθέτουν διακριτές παθολογικές, κλινικές και μοριακά χαρακτηριστικά [1], [2]. Οι περισσότεροι BCs (70% -80%) είναι χαμηλής ποιότητας, μη επεμβατική μυών θηλώδες ( «επιφανειακή») όγκοι (NMIBCs) που σπάνια προχωρήσει, έτσι ώστε οι ασθενείς με αυτή τη μορφή καρκίνου έχουν μια πολύ καλή πρόγνωση. Από την άλλη πλευρά, οι ασθενείς με διηθητικό καρκίνους της ουροδόχου κύστης (MIBCs) έχουν πολύ χειρότερη πρόγνωση (& lt? 50% επιβίωση 5-ετή) [1], [2]. MIBCs συχνά την πρόοδο για να γίνει μεταστατική, και οι ασθενείς με μεταστατική νόσο έχουν μια μελαγχολική ποσοστό επιβίωσης 5 ετών μικρότερη από 5%. Κατά συνέπεια, ο προσδιορισμός των μοριακών μηχανισμών που εμπλέκονται στην π.Χ. εισβολή και τη μετάσταση και την αναγνώριση θεραπευτικών στρατηγικών που στοχεύουν αυτές οι διαδικασίες είναι πολύ υψηλές προτεραιότητες στην εν εξελίξει έρευνα.

ινοβλαστών υποδοχείς του αυξητικού παράγοντα (FGFRs) είναι πολύ ελκυστικό υποψήφιο στόχους σε δύο υποσύνολα BCs [3]. Τουλάχιστον τα δύο τρίτα του NMIBCs περιέχουν ενεργοποίησης FGFR3 μεταλλάξεις που οδηγούν σε ανεξάρτητη από πρόσδεμα διμερισμό του υποδοχέα και συστατική μεταγωγής κατάντη σήματος [4], [5], [6], [7], και μελέτες in vitro απέδειξαν ότι οι αναστολείς FGFR εμποδίσει τον πολλαπλασιασμό σε φυσιολογικά urothelial κύτταρα που υπερεκφράζουν αυτούς τους υποδοχείς [8], [9]. Αν και η συχνότητα ενεργοποίησης FGFR3 μεταλλάξεων στο MIBCs είναι πολύ χαμηλότερο (& lt? 25%), πολλοί από αυτούς εκφράζουν υψηλά επίπεδα του FGFR3 και άλλων FGFRs [3], [10], [11]. Εκτός από την προώθηση του πολλαπλασιασμού, έχουν FGFRs εμπλακεί στη ρύθμιση της επιθηλιακής προς μεσεγχυματικά μετάβαση (ΕΜΤ), εισβολή, και ανεξάρτητη από προσκόλληση ανάπτυξη σε κύτταρα BC [11].

bgj-398 είναι ένας επιλεκτικός αναστολέας της FGFRs 1, 2, και 3, που συντέθηκε χρησιμοποιώντας μια νέα χημική προσέγγιση [12]. Παρουσιάζει IC

50 περίπου 5 ηΜ έναντι FGFRs άγριου τύπου και η πιο κοινή μεταλλαγμένη μορφή του FGFR3 που εκφράζεται σε BCs (S249C) [12]. Αρχικό χαρακτηρισμό ανασταλτικά αποτελέσματα αύξησης της ένωσης σε ένα πάνελ από 8 ανθρώπινες κυτταρικές σειρές BC αποκάλυψε αξιοσημείωτη ετερογένεια στις αποκρίσεις, όπου εμφανίζεται IC

50 5-30 ηΜ στο μισό από τις κυτταρικές σειρές και IC

50 της πάνω από 1 μΜ στο άλλο μισό [12]. Η παρατηρηθείσα ετερογένεια συμφωνεί με τα αποτελέσματα που λαμβάνονται χρησιμοποιώντας μια διακριτή χημικού αναστολέα [13], αλλά η μοριακή βάση για αυτή την ετερογένεια παραμένει ασαφής. Ως εκ τούτου, άρχισε η παρούσα μελέτη να αποκτήσουν μια καλύτερη κατανόηση των επιπτώσεων της αναστολής FGFR στα κύτταρα π.Χ., με στόχο τον εντοπισμό βιολογικών μηχανισμών και βιολογικών δεικτών που θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν για τον εντοπισμό μελλοντικά FGFR-εξαρτώμενων όγκων. Τα αποτελέσματά μας αποκαλύπτουν διακριτές, EMT που σχετίζονται με τους ρόλους για FGFR3 και FGFR1 στον πολλαπλασιασμό οδήγησης και την εισβολή που έχουν σημαντικές συνέπειες για την ανάπτυξη των FGFR θεραπείες με αναστολείς που βασίζονται σε ασθενείς.

Υλικά και Μέθοδοι

Χημικά και αντιδραστήρια

bgj-398 γενναιόδωρα παρέχεται από τη Novartis. Για in vitro μελέτες, bgj-398 ανασυστάθηκε σε DMSO σε μία συγκέντρωση αποθέματος από 10 mmol /L και αποθηκεύθηκε στους -20 ° C. Το απόθεμα bgj-398 αραιώθηκε σε μέσο ακριβώς πριν από τη χρήση έτσι ώστε η συγκέντρωση του DMSO δεν υπερέβη ποτέ το 0,1%. Για in vivo μελέτες, bgj-398 διαλύθηκε σε 10% Tween-80.

Γραμμές του όγκου των κυττάρων και συνθήκες καλλιέργειας

Οι κυτταρικές σειρές που ελήφθησαν από το Πανεπιστήμιο του Τέξας MD Anderson Cancer Center της ουροδόχου κύστης SPORE Tissue Bank, και η ταυτότητά τους επιβεβαιώθηκε με αποτυπωμάτων DNA χρησιμοποιώντας το AmpFlSTR® Identifiler® Amplification (Applied Biosystems) ή AmpFlSTR® Profiler® ενίσχυση PCR (Applied Biosystems) πρωτόκολλα. Όλες οι κυτταρικές γραμμές διατηρήθηκαν ως μονοστοιβάδες εντός τροποποιημένου ΜΕΜ Eagle συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου, βιταμίνες, πυροσταφυλικό νάτριο, L-γλουταμίνη, πενικιλλίνη, στρεπτομυκίνη, και μη απαραίτητα αμινοξέα στους 37 ° C σε ένα 5% CO

2 θερμοκοιτίδα .

Ζώα

Γυναίκα αθυμικά γυμνά ποντίκια (NCr-ηυ) αγοράστηκαν από το National Cancer Institute. Τα ποντίκια στεγάστηκαν κάτω από ειδικές συνθήκες άνευ παθογόνων στην εγκατάσταση ζώων πυρήνα στο Πανεπιστήμιο του Τέξας Μ D. Anderson Κέντρο Καρκίνου. Η εγκατάσταση έχει λάβει έγκριση από την Αμερικανική Ένωση για τη Διαπίστευση του Εργαστηρίου Φροντίδα Ζώων και σε συμφωνία με τους ισχύοντες κανονισμούς και τα πρότυπα του Αμερικάνικο Υπουργείο Υγείας και Ανθρωπίνων Υπηρεσιών, το Τμήμα Γεωργίας των Η.Π.Α., και το NIH. Τα ποντίκια που χρησιμοποιήθηκαν σε αυτά τα πειράματα ήταν ηλικίας 6 έως 8 εβδομάδων.

FGFR3 Mutation Αναλύσεις

DNA απομονώθηκε από τις κυτταρικές σειρές BC χρησιμοποιώντας ένα κιτ εκχύλισης γενωμικού DNA (Qiagen). PCR διεξήχθη για να ενισχύσει τα εξόνια 7 και 10 χρησιμοποιώντας AmpliTaq Gold ϋΝΑ πολυμεράση (Applied Biosystems) και τους εκκινητές 5′-ΟΤΟ CGGCAGTGGCGGTGGTG–3 ‘(νοηματικό) και 5′-GGC AGCACCGCCGTCTGGTT-3′ (antisense) για το εξόνιο 7 (23 ) και 5’-CCTCAACGCCCATGTCTTT-3 ‘(νοηματικό) και 5′-AGGCAGCTCAGAACCTGGTA-3’ (antisense) για το εξόνιο 10 (αγοράστηκε από την Sigma Genosys). Οι ακόλουθες μεταβλητές ποδηλασία χρησιμοποιήθηκαν: 95 ° C για 10 λεπτά, στη συνέχεια 35 κύκλοι των 95 ° C για 30 s, 65 ° C (εξόνιο 7) ή 58 ° C (εξόνιο 10) για 30 s και 72 ° C για 30 s, που ακολουθείται από μία τελική επώαση στους 72 ° C για 10 λεπτά (23). Ασυγχώνευτος εκκινητές και δεοξυνουκλεοτίδια απομακρύνθηκαν χρησιμοποιώντας αλκαλική φωσφατάση γαρίδας και εξωνουκλεάση Ι (U.S. Biochemical). Τα προϊόντα αναλύθηκαν με Big Dye Terminator Cycle Sequencing (Applied Biosystems), και τα δεδομένα αναλύθηκαν με ανάλυση ακολουθίας Ανάλυση 3,0 λογισμικό (Applied Biosystems).

μεσολάβηση RNAi εξόντωση FGFR3, FGFR1 ή bFGF

UM-UC14 και RT4 επιμολύνθηκαν με μικρά παρεμβαλλόμενα RNA (siRNAs) που στοχεύουν FGFR3 και FGFR1 χρησιμοποιώντας Oligofectamine (Invitrogen) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Στοχευμένη ολιγονουκλεοτίδια (αλληλουχία) και μια μη-στόχευσης ελέγχου αγοράστηκαν από Ambion. Ολικό RNA συλλέχθηκε 48 ώρες μετά την επιμόλυνση και αναλύθηκαν με RT-PCR για να επιβεβαιωθεί knockdown στόχο. Παράλληλα, siRNA επιμολυσμένα κύτταρα συλλέχθηκαν στις 48 ώρες και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και δοκιμασίες κυτταρικού κύκλου που περιγράφονται παρακάτω. UM-UC3 και UM-UC13 μετήχθησαν με λεντοϊού σύντομο RNAs φουρκέτα (Τα siRNAs) (Open Biosystems). Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν συνεχώς για 5~7 ημέρες σε 10% ΜΕΜ που περιέχει πουρομυκίνη. Ολικό RNA συλλέχθηκε μετά από επιλογή και αναλύθηκαν με RT-PCR για να επιβεβαιωθεί knockdown στόχο. Σταθερά κύτταρα knockdown διατηρήθηκαν σε πουρομυκίνη και χρησιμοποιήθηκε στις δοκιμασίες εισβολή θαλάμου ΜΤΤ και Boyden περιγράφεται κατωτέρω.

ανοσοαποτύπωσης Αναλύσεις

Τα κύτταρα συλλέχθηκαν σε -75% έως 85% συρροή και λύονται. Οι συγκεντρώσεις πρωτεΐνης μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας την δοκιμασία Bradford (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Κυτταρολύματα έβρασαν σε ρυθμιστικό διάλυμα δείγματος (62,5 mmol /L Tris-HCl (ρΗ 6.8), 10% (w /v) γλυκερόλη, 100 mmol /L ϋΤΤ, 2.3% SDS, 0,002% κυανούν βρωμοφαινόλης) για 5 λεπτά και ψύχθηκε επί πάγου για 5 λεπτά. Τα δείγματα διαχωρίστηκαν σε πηκτώματα 8% ή 12% SDS-PAGE σε 110 V σε ρυθμιστικό ηλεκτροφόρησης (25 mmol /L Tris-HCl (ρΗ 8.3), 192 mmol /L γλυκίνη, 0,1% SDS) και, στη συνέχεια, μεταφέρθηκαν ηλεκτροφορητικά πάνω σε μεθανόλη-προδιαβροχοποιημένες διφθοριούχο πολυβινυλιδένιο (PVDF) μεμβράνες σε ρυθμιστικό διάλυμα μεταφοράς (25 mmol /L Tris-HCl, 192 mmol /L γλυκίνη, 20% μεθανόλη) για 1 ώρα στους 100 mV. Οι μεμβράνες επωάστηκαν σε ρυθμιστικό αποκλεισμού (TBS: 10 mmol /L Tris-HCl (ρΗ 8.0), 150 mmol /L NaCl, 5% άπαχο γάλα) επί 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου υπό ανακίνηση και στη συνέχεια ξεπλένονται μία φορά σύντομα με ΤΒδ-Τ (TBS που περιέχει 0.1% Tween-20). Οι μεμβράνες επωάστηκαν με πρωτεύοντα αντισώματα αραιωμένα 1:1000 σε ρυθμιστικό αποκλεισμού επί μία νύκτα, πλύθηκαν και στη συνέχεια επωάστηκαν με δεύτερο αντίσωμα (αντι-ποντικού ή αντι-ανοσοσφαιρίνη κουνελιού, υπεροξειδάση αρμορακίας-συνδεδεμένο F (ab) 2 θραύσμα από ποντικό) αραιωμένο 1: 8000 σε ρυθμιστικό αποκλεισμού για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου υπό ανακίνηση. Ανοσοαντιδραστικές πρωτεΐνες ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας ενισχυμένη χημειοφωταύγεια (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

γονιδιακής έκφρασης

προφίλ γονιδιακής έκφρασης εκτελέστηκε σε ένα πάνελ από 30 ανθρωπίνων κυτταρικών γραμμών BC χρησιμοποιώντας την πλατφόρμα Illumina. Για κάθε κυτταρική σειρά, το mRNA παράχθηκε από ένα μόνο καλλιέργεια λογαριθμικής φάσης. καθαρότητα και την ακεραιότητα του RNA μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα NanoDrop ND-1000 και ένα Agilent Bioanalyzer, και υψηλής ποιότητας RNA μόνο χρησιμοποιήθηκε για cRNA ενίσχυση. Βιοτίνη σημασμένο cRNA παρασκευάστηκε χρησιμοποιώντας το κιτ ενίσχυσης RNA Illumina (Ambion, Inc, Austin, ΤΧ), και ενισχύθηκαν cRNA υβριδίστηκε σε Illumina HT12 V4 chips (Illumina, Inc., San Diego, CA). Αφού πλύθηκαν, τα πλακίδια σαρώθηκαν με iSCAN (Illumina, Inc.). εντάσεις σήματος ποσοτικοποιήθηκαν με GenomeStudio (Illumina, Inc.), και ποσοστημόριο ομαλοποίηση χρησιμοποιήθηκε για την κανονικοποίηση των δεδομένων. BRB ArrayTools έκδοση 4.2 που αναπτύχθηκε από το Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου [14] χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση των δεδομένων. Για να παρατηρήσουμε τα μοτίβα έκφρασης του διαφορικά εκφρασμένων γονιδίων, ειδικές τιμές γονιδιακή έκφραση, ρυθμίστηκε σε μια μέση τιμή μηδέν, χρησιμοποιήθηκαν για την ομαδοποίηση με Cluster και TreeView [15].

ΜΤΤ Δοκιμασίες

Cells ( 5 × 10

3) απλώθηκαν σε πλάκες 96-φρεατίων και αφέθηκαν να προσκολληθούν για 24 ώρες πριν αυτοί επωάστηκαν με ή χωρίς αυξανόμενες συγκεντρώσεις bgj-398 για 48 ώρες ή 5 ημέρες. ΜΤΤ (3- (4,5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ) -2,5-διφαινυλοτετραζολίου) δοκιμασίες χρησιμοποιήθηκαν για να μετρηθεί η σχετική αριθμούς κυττάρων με βάση τη μετατροπή του ΜΤΤ προς φορμαζάνη σε βιώσιμα κύτταρα. Πενήντα μΐ ΜΤΤ διαλύθηκε σε PBS (50 μg /ml) προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο και οι πλάκες επωάστηκαν για 3 ώρες. Το μέσο στη συνέχεια απομακρύνθηκε και 100 μΐ DMSO προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο για να λυθούν τα κύτταρα και να διαλυτοποιηθεί το formazan. Ένα πρότυπο αναγνώστη μικρο-πλάκας χρησιμοποιήθηκε για να προσδιοριστεί η απορρόφηση (600 nm). Κάθε πειραματικό σημείο δεδομένων αντιπροσωπεύει μέσες τιμές που λαμβάνονται από έξι αντίγραφα και κάθε πείραμα εκτελέστηκε τουλάχιστον δύο φορές.

Real-time PCR ανάστροφης μεταγραφάσης Αναλύσεις

Τα κύτταρα συλλέχθηκαν σε 75% έως 85% συρροή και απομονώθηκε ολικό RNA χρησιμοποιώντας κιτ απομόνωσης mirVANA ™ miRNA (Ambion, Life Science, CA). FGFRs και άλλα γονίδια των συμφερόντων αναλύθηκαν με Taqman με βάση πραγματικού χρόνου PCR (ΑΒΙ PRISM 7500? Applied Biosystems). Η συγκριτική μέθοδος CT χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό σχετικής γονιδιακής έκφρασης για κάθε γονίδιο στόχο? η κυκλοφιλίνη Α γονίδιο χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος για να κανονικοποιηθεί η ποσότητα του ενισχύσιμου RNA. εκκινητές Taqman αγοράστηκε από την κατασκευή (Applied Biosystem, CA) ως εξής: Ε-καδερίνης? Hs00170423_m1, TP63? Hs00978343_m1, ZEB1? Hs00232783_m1, βιμεντίνη? Hs00185584_m1, FGFR1? Hs00915142_m1, FGFR2? Hs01552926_m1, FGFR3? Hs00179829_m1, FGFR4? Hs01106908_m1, bFGF? Hs00266645_m.

Αναλύσεις Κύκλου Κυττάρου

Τα κύτταρα τοποθετήθηκαν σε πλάκες 6-φρεατίων και διατηρήθηκαν σε 10% FBS ΜΕΜ για 24 ώρες. Τα κύτταρα στη συνέχεια εξετέθησαν σε διάφορες συγκεντρώσεις bgj-398 για 48 ώρες ή αναπτύχθηκαν άλλες 24 ώρες (φθάνοντας -75% έως 85% συρροή) για να αναλυθούν τα αποτελέσματα της FGFR3 ή FGFR1 knockdown. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν με τρυψινοποίηση και σφαιροποιήθηκαν με φυγοκέντρηση. Τα σφαιρίδια στη συνέχεια επαναεναιωρήθηκαν σε PBS που περιέχει 50 μg /mL ιωδιούχου προπιδίου, 0,1% Triton Χ-100, και 0,1% κιτρικό νάτριο. Προπιδίου φθορισμού ιωδιούχου μετρήθηκε με φθορισμό ενεργοποιούμενη διαλογή κυττάρων (FL-3 καναλιών, Becton Dickinson, Mountain View, CA) χρησιμοποιώντας λογισμικό ανάλυσης κύκλου του οργάνου.

Boyden Επιμελητήριο εισβολή Αναλύσεις

θαλάμους Εισβολή που περιέχουν επικαλυμμένα με Matrigel πολυαιθυλενίου μεμβράνες τερεφθαλικού με 8 μm πόρους αγοράστηκαν από την BD Science σε μορφή πλάκας 24-φρεατίων. Τα κύτταρα (2.5 × 10

5) απελευθερώθηκαν από φιάλες καλλιέργειας ιστού με τη χρήση EDTA (1 mmol /L), φυγοκεντρείται, αιωρούνται σε ένα μέσο ελεύθερο ορού και τοποθετήθηκαν στο άνω διαμερίσματα των θαλάμων εισβολής. Τριάντα τοις εκατό μέσο ορό εμβρύου μόσχου τοποθετήθηκαν στα κάτω διαμερίσματα στο ένα χημειοελκυστικό και εισβολή δοκιμασίες διεξήχθησαν για 48 ώρες. Κάθε κυτταρική γραμμή επιστρώθηκαν εις τριπλούν. Για να εξεταστεί κύτταρο εισβολή μετά από έκθεση σε bgj-398, κύτταρα τα οποία δεν είχαν εισβάλει απομακρύνθηκαν και τα κύτταρα στην κάτω επιφάνεια του φίλτρου χρώσθηκαν με Diff-Quick (American Scientific Products, McGaw Park, IL). Διηθητική δραστικότητα μετρήθηκε με απαρίθμηση των κυττάρων που είχαν μεταναστεύσει στην κάτω πλευρά του φίλτρου. Για την αξιολόγηση εισβολή μετά την φίμωση FGFR1 ή bFGF, οι μεμβράνες αφαιρέθηκαν μετά από επώαση για 48 ώρες στους 37 ° C και χρωματίστηκαν σε ιωδιούχο προπίδιο (Sigma-Aldrich) χωρίς την αφαίρεση κυττάρων από τα άνω επιφάνειες των μεμβρανών. Τα φίλτρα τοποθετήθηκαν σε γυάλινες πλάκες και αναλύθηκαν με συνεστιακή μικροσκοπία στους 100 × μεγέθυνση. Τα αεροπλάνα της εστίασης ρυθμίστηκαν έτσι ώστε τα κύτταρα που δεν είχαν εισβάλει μπορούσαν να διακριθούν από τα κύτταρα εισέβαλαν και μετρήθηκαν σε 8 ανεξάρτητα πεδία. Επεμβατική δραστηριότητα μετρήθηκε με τον υπολογισμό των δεικτών της εισέβαλαν στο noninvaded κύτταρα.

Archorage ανεξάρτητη ανάπτυξη Δοκιμασία

UM-UC3 και UM-UC13 άγριου τύπου ή bFGF /FGFR1 σιωπήσουν τα κύτταρα τοποθετήθηκαν σε 1 × 10

4 κύτταρα ανά φρεάτιο σε 6 φρεατίων πλάκες συμπληρωμένο με 10% FBS ΜΕΜ που περιέχει 0,6% άγαρ. Τα κύτταρα αφέθηκαν να αναπτυχθούν για 2 εβδομάδες. Οι εικόνες ελήφθησαν με τη χρήση ενός μικροσκοπίου αντίθεσης ανεστραμμένης φάσης της Olympus IX. Ο συνολικός αριθμός των αποικιών ανά τυχαίων προβολή (100 ×) και η μέση διάμετρος των αποικιών ανά τυχαίων προβολή (100 ×) προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας αναλυτή εικόνας SliderBook.

ορθοτοπική Ξενομοσχεύματος Πειράματα

Το ανθρώπινο BC κυτταρική γραμμή UM-UC-3 μετήχθη με ένα που κωδικοποιεί λουσιφεράση βραδέος ιού φορέα (Luc) και κόκκινη φθορίζουσα πρωτεΐνη (RFP? mCherry) όπως περιγράφηκε προηγουμένως [16]. Μετά από σταθερή μεταγωγή με τον δημοσιογράφο Luc-RFP, τα κύτταρα κατατάσσονται σύμφωνα με τη κυττάρων ενεργοποιημένων με φθορισμό (FACS) χρησιμοποιώντας ένα διαλογέα Εισροή υψηλής ταχύτητας (BD Biosciences). Η δραστικότητα λουσιφεράσης προσδιορίστηκε ποσοτικά in vitro χρησιμοποιώντας D-λουσιφερίνης (150 μg /mL) και το σύστημα βιοφωταύγειας IVIS (Xenogen Co.). Για την παραγωγή όγκων σε γυμνούς ποντικούς, υποσυρρέουσες καλλιέργειες επισημασμένου UM-UC3 ανυψώθηκαν με θρυψίνη, αναμιγνύονται με 10% FBS ΜΕΜ, φυγοκεντρήθηκε στις 1200 rpm για 5 λεπτά, πλύθηκαν σε PBS και επαναιωρήθηκαν σε HBSS. Τα κύτταρα στη συνέχεια εγχέονται ορθοτοπικά εντός του τοιχώματος της ουροδόχου κύστης σε συγκέντρωση 5 × 10

5/50 μλ χρησιμοποιώντας ένα χαμηλότερο λαπαροτομία. Ποντικοί μεταστάσεις που φέρουν υπέστησαν ευθανασία 5 έως 8 εβδομάδες μετά την ένεση των κυττάρων του όγκου, ο λεμφαδένας και απομακρυσμένες μεταστάσεις αποκόπηκαν, κόπηκαν σε μικρά κομμάτια χρησιμοποιώντας νυστέρια, εκτέθηκαν σε 1% τρυψίνη για 20 λεπτά, φυγοκεντρήθηκε (1200 rpm για 5 λεπτά), και καλλιεργήθηκαν σε 10% συμπληρώνονται ΜΕΜ. Μετά διαλογή FACS, τα κύτταρα ανακυκλώνονται συρροής καλλιεργήθηκαν και επανεγχυθούν σε συγκέντρωση 2 × 10

5/50 μί HBSS όπως περιγράφεται παραπάνω. Έτσι, η ανακύκλωση των κυττάρων του όγκου διεξήχθη τρεις φορές, προκειμένου να επιλέξετε μια άκρως μεταστατική υποπληθυσμό UM-UC3 η οποία αναπτύσσει μεταστάσεις σε -75% των ποντικών. Για το πείραμα της θεραπείας μας, με ένεση την 4

ου κύκλου του ανακυκλωμένου UM-UC3 σε συγκέντρωση 2 × 10

5/50 μλ. Τα ποντίκια με ανιχνεύσιμη ανάπτυξη του όγκου κατά τον χρόνο της πρώτης απεικόνισης (5 ημέρες μετά την ένεση) τυχαιοποιήθηκαν σε δύο ομάδες (η = 7 /ομάδα).

In vivo βιοφωταύγεια Imaging

απεικόνισης βιοφωταύγεια ήταν πραγματοποιούνται σε ένα σύστημα απεικόνισης IVIS 100 με Ζώντας λογισμικό εικόνας (Xenogen) όπως περιγράφεται αλλού [16]. Εν συντομία, τα ζώα αναισθητοποιήθηκαν πριν από την απεικόνιση με ένα μείγμα 2,5% isoflurane /αέρα και εγχύθηκε s.c. με 15 mg /mL λουσιφερίνης άλατος καλίου σε PBS σε μία δόση των 150 mg /kg σωματικού βάρους. Μια ψηφιακή κλίμακας του γκρι ζώο εικόνα αποκτήθηκε και μία pseudocolored εικόνα αποτέθηκε αντιπροσωπεύει τη χωρική κατανομή των φωτονίων ανιχνεύεται αναδύονται από ενεργό λουσιφεράσης. ένταση του σήματος ήταν ποσοτικοποιηθεί ως το άθροισμα όλων των εντοπιστεί φωτόνια εντός της περιοχής ενδιαφέροντος ανά δευτερόλεπτο, ξεχωριστά μετρώντας κάθε πρωτογενούς όγκου και κάθε μεταστατική περιοχή.

Η συλλογή των πρωτογενών όγκων και κυκλοφορούντα καρκινικά κύτταρα (ΚΜΑ)

Σαράντα ημέρες μετά την ένεση, όταν τα ζώα στην ομάδα ελέγχου έγινε ετοιμοθάνατα ποντίκια αναισθητοποιήθηκαν με ισοφλουράνιο όπως περιγράφεται παραπάνω. Για τη μέτρηση του αριθμού των ΚΜΑ, η μέγιστη ποσότητα αίματος (600-1200 μΐ) συλλέχθηκε με καρδιακή παρακέντηση χρησιμοποιώντας σύριγγα του 1 ml, η βελόνα διαμετρήματος 22, και οι σωλήνες συλλογής ηπαρίνης επικαλυμμένα όπως περιγράφηκε προηγουμένως [17]. Οι ποντικοί στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε ευθανασία με μονοξείδιο του άνθρακα. Οι όγκοι αποκόπηκαν, και τα δείγματα είτε σταθεροποιημένα με φορμαλίνη και εγκλείστηκαν σε παραφίνη, ενσωματωμένα σε OCT (Miles, Inc), ή καταψύχθηκαν ταχέως σε υγρό άζωτο και αποθηκεύτηκαν στους -80 ° C για RNA και πρωτεϊνική εκχύλιση. Για την περαιτέρω επεξεργασία του αίματος, τα ερυθρά αιμοσφαίρια λύθηκαν δύο φορές επί 5 λεπτά με 1 ml ρυθμιστικό διάλυμα λύσης ACK (Invitrogen), και φυγοκεντρήθηκε για 5 λεπτά στις 1200 rpm σε σωλήνες Eppendorf. Το σφαιρίδιο τελικά λύονται και περαιτέρω επεξεργασία για πλήρη απομόνωση RNA χρησιμοποιώντας το κιτ απομόνωσης mirVANA ™ miRNA (Ambion, Life Science). Για PCR πραγματικού χρόνου ανάλυση, η τεχνολογία PCR (Στάδιο Ένα? Applied Biosystems) χρησιμοποιήθηκε μαζί με δοκιμασίες έκφρασης TaqMan® Gene (Applied Biosystems). Απόλυτη ποσοτικοποίηση χρησιμοποιήθηκε για να δημιουργήσει τιμές κατωφλίου κύκλου (CT) για την ανθρώπινη ειδικό εκκινητή HLA-C (Hs00740298_g1) για κάθε δείγμα. RT-PCR ανάλυση των δειγμάτων αίματος (εις τριπλούν) εκτελέστηκε μαζί με πρότυπο απομονώσεις (0, 2, 20, 200, 2000 και 20000 κύτταρα UM-UC3 σε 100 μΐ αίματος ποντικού). CT τιμές των προτύπων χρησιμοποιήθηκαν για να δημιουργήσουν μια πρότυπη καμπύλη για UM-UC3 CTC, και ο αριθμός των CTCs κάθε δείγματος αίματος ήταν υπολογίζονται αναλόγως.

Αποτελέσματα

Σχέση μεταξύ των E-cadherin και bFGF /FGFR έκφραση σε κύτταρα UC

Αναλύσαμε την έκφραση των 4 FGFRs και το κυρίαρχο καρκινο-συναφές συνδέτη (FGF-2 /βασικός FGF) στο επίπεδο του mRNA σε ένα πάνελ κυτταρικών γραμμών 30 UC με ολόκληρο προφίλ έκφρασης του γονιδιώματος (πλατφόρμα Illumina). Η έκφραση του FGFR3 συσχετίζονται απευθείας με την έκφραση του p63 [18], [19] και Ε-καδερίνης [20] (Εικ. 1Α), υποδεικνύοντας ότι FGFR3 εκφράζεται από την «επιθηλιακά» υποσύνολο των κυττάρων BC. Αντίθετα, η έκφραση των συσχετιζόμενων FGFR1 πιο άμεσα με το «μεσεγχυματικά» βιμεντίνη δείκτη (Σχ. 1Α). Χρησιμοποιήσαμε ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR αντίστροφης μεταγραφάσης (RT-PCR) για να καθορίσει με μεγαλύτερη ακρίβεια τα μοτίβα έκφρασης «επιθηλιακών» και «μεσεγχυματικά« δείκτες κατά μήκος του πάνελ των κυτταρικών γραμμών. Τα αποτελέσματα εμφανίζονται στο σχήμα 1Β, όπου οργανώνονται οι κυτταρικές σειρές BC σε όλες τις πλάκες σύμφωνα με την σχετική έκφραση τους της κανονικής «επιθηλιακά« δείκτη Ε-καδερίνης (Εικ. 1 Β, άνω αριστερό πλαίσιο) [20]. Η έκφραση της Ε-καδερίνης συσχετίζονται απευθείας με την έκφραση του p63 και αντιστρόφως με την έκφραση του ZEB1 και βιμεντίνης, αποδεικνύοντας ότι οι «επιθηλιακά» και «μεσεγχυματικά« δείκτες εκφράζονται σε μεγάλο βαθμό μη επικαλυπτόμενο τρόπο στις γραμμές π.Χ. (Εικ. 1Β) . Μόνο δύο από τις κυτταρικές σειρές (1A6 και UM-UC18) συν-εκφράζεται «επιθηλιακά» και «μεσεγχυματικά« δείκτες (Εικ. 1Β).

Α. Συσχέτιση FGFR1 και FGFR3 με κανονική δείκτες EMT. mRNA επίπεδα μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας ολόκληρο προφίλ έκφρασης mRNA γονιδιώματος (πλατφόρμα Illumina). Ο χάρτης θερμότητας απεικονίζει την έκφραση του FGFR1, FGFR3, FGF2 (bFGF), p63 (TP63), Ε-καντερίνη (Cdh1), Slug (SNAI2), και βιμεντίνη. B. Η ποσοτική ανάλυση της έκφρασης δείκτη EMT. Σχετικά επίπεδα της «επιθηλιακών« δείκτες Ε-καδερίνης (Cdh1) και ρ63, και του «μεσεγχυματικά« δείκτες ZEB1 και βιμεντίνης μετρήθηκαν με ποσοτική πραγματικού χρόνου RT-PCR.

Η

Στη συνέχεια μετράται η έκφραση του FGFRs 1-4 και FGF-2 με ποσοτική RT-PCR (Σχ. 2Α). Επιβεβαιώνοντας τη γονιδιακή έκφραση προφίλ αποτελέσματα, FGFR1 εκφράστηκε κυρίως από κύτταρα μέσα στο υποσύνολο «μεσεγχυματικά» (UM-UC3, UM-UC13, Τ24, BV και UC12) (Σχ. 2Α επάνω αριστερά), ενώ η έκφραση FGFR3 συμπυκνώθηκε στο πλαίσιο του » επιθηλιακών κυττάρων «, με RT4 με την υψηλότερη έκφραση που ακολουθείται από UM-UC14, SW780 και RT112 (Εικ. 2Α, πάνω δεξιά). FGFR2 εμφανίστηκε επίσης να είναι κάπως εμπλουτισμένο στο «επιθηλιακά» και FGFR4 στα κύτταρα «μεσεγχυματικά», αντίστοιχα, αλλά τα επίπεδα έκφρασης τους ήταν πολύ χαμηλότερα από τα επίπεδα του FGFR3 ή FGFR1 (μέση τιμή 36 κύκλων έναντι 30 κύκλους PCR), συνεπές με προηγούμενα ευρήματα [10]. Τέλος, τα κύτταρα «μεσεγχυματικά» εξέφραζαν υψηλότερα επίπεδα του FGF2 (bFGF) από ό, τι τα «επιθηλιακά» κύτταρα (Σχ. 2Α). Επιβεβαιώσαμε ότι η έκφραση FGFR3 εμπλουτίστηκε στο «επιθηλιακά» και FGFR1 και έκφραση bFGF εμπλουτίστηκε στο «μεσεγχυματικά» κυτταρικές σειρές στο επίπεδο πρωτεΐνης με ανοσοκηλίδωση (Εικόνα S1). Χρησιμοποιώντας μη παραμετρικές αναλύσεις συσχέτισης, επιβεβαιώσαμε ότι η έκφραση FGFR3 συσχετίζονται στενά και άμεσα με την έκφραση της Ε-καδερίνης (Spearman r = 0,8155, ρ & lt? 0,0001, Σχήμα 2Β.), Και αντιστρόφως με την έκφραση των «μεσεγχυματικών« δείκτες (Εικ S2.). Αντιστρόφως, η έκφραση της FGFR1 και bFGF στενά και άμεσα συσχετίζεται με την έκφραση του ZEB1 (Spearman r = 0.799, p = 0,0001 για FGFR1 και r = 0,6198, p = 0,008 για bFGF) (Σχ. 2Β). Επιπλέον, bFGF και έκφραση FGFR1 συσχετίζονται απευθείας με την άλλη, όπως αναμένεται (Σχ. 2Β). Στη συνέχεια εξετάστηκε αν μεταφραστούν σε διαφορική έκφραση οι παρατηρούμενες διαφορές στην έκφραση του mRNA στο πρωτεϊνικό επίπεδο σε ένα υποσύνολο των κυτταρικών σειρών με ανοσοκηλίδωση. Βρήκαμε ότι FGFR3 αλλά όχι FGFR1 εκφράστηκε σε επιθηλιακά UM-UC14, RT4 και RT112 κύτταρα, ενώ FGFR1 αλλά δεν FGFR3 εκφράστηκε σε μεσεγχυματικά UM-UC3, UM-UC12 και UM-UC13. FGF-2 εκφράστηκε σε όλες τις κυτταρικές σειρές 6, αλλά τα μεσεγχυματικά κύτταρα εξέφρασαν περισσότερο FGF-2 από το επιθηλιακό «κύτταρα έκανε. Μαζί, αυτά τα δεδομένα υποστηρίζουν την ιδέα ότι FGFR3 και bFGF /FGFR1 πιθανότατα λειτουργούν σε μη επικαλυπτόμενες επιθηλιακών και μεσεγχυματικών υποσύνολα των κυττάρων. Π.Χ.

Α. Έκφραση των FGFRs 1-4 και bFGF σε σχέση με την έκφραση Ε-καδερίνης. Τα σχετικά επίπεδα mRNA μετρήθηκαν με ποσοτική πραγματικού χρόνου RT-PCR. Οι κυτταρικές σειρές σε κάθε πάνελ που διοργανώθηκε από σχετική έκφραση Ε-καδερίνης (χαμηλή προς υψηλή, από αριστερά προς τα δεξιά? βλέπε σχήμα 1Β.). Β ΝΕΦΕΛΟΓΡΑΜΜΑΤΑ απεικονίζει τις σχέσεις μεταξύ FGFR1, bFGF, FGFR3, και η έκφραση δείκτη EMT. Απαραμετρική συσχέτιση αναλύσεις χρησιμοποιήθηκαν για να αξιολογηθούν οι σχέσεις μεταξύ της Ε-καδερίνης (Cdh1) έκφραση FGFR3 και, FGFR1 και ZEB1 έκφραση, bFGF και έκφραση ZEB1, και bFGF και έκφραση FGFR1. Οι συντελεστές συσχέτισης και σ τιμές που αναφέρονται στο σχήμα.

Η

Επιπτώσεις της bgj-398 επί του κυτταρικού πολλαπλασιασμού

Προηγούμενες μελέτες κατέληξαν στο συμπέρασμα ότι οι αναστολείς FGFR εμποδίσει τον πολλαπλασιασμό σε ορισμένα ανθρώπινα κύτταρα π.Χ. in vitro [ ,,,0],12], [13]. Ως εκ τούτου, εξέτασαν τα αποτελέσματα bgj-398 επί του πολλαπλασιασμού σε 17 κυτταρικές γραμμές BC για να χαρακτηρίσει την έκταση της ετερογένειας στην ευαισθησία φαρμάκου. Επωάσαμε τα κύτταρα με αυξανόμενες συγκεντρώσεις bgj-398 για 48 ώρες και μετρήθηκαν κυτταροτοξικότητα και διακοπή της ανάπτυξης χρησιμοποιώντας δοκιμασίες ΜΤΤ. Εντοπίσαμε 5 κυτταρικές σειρές (UM-UC14, SW780, RT4, RT112 και UM-UC1) που ήταν ευαίσθητα σε φάρμακο όπως ορίζεται από ≥50% αναστολή της ανάπτυξης σε συγκεντρώσεις του φαρμάκου από 1 mmol /L ή χαμηλότερα (Εικ. 3Α αριστερό πάνελ και τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Για τον προσδιορισμό των σχετικών συνεισφορών των διακοπής της ανάπτυξης και θανάτου των κυττάρων σε αυτά τα αποτελέσματα, εκθέσαμε τα κύτταρα UM-UC14 και RT4 σε αυξανόμενες συγκεντρώσεις bgj-398 για 48 ώρες και μετράται απευθείας διακοπή του κυτταρικού κύκλου και απόπτωση με ιωδιούχο προπίδιο χρώση και ανάλυση FACS. Σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές αυξανόμενες συγκεντρώσεις bgj-398 παράγεται αυξήσεις στα ποσοστά των κυττάρων στην G1 φάση και παράλληλες μειώσεις στα ποσοστά των κυττάρων στη φάση S. Συγκεκριμένα, τα ποσοστά των κυττάρων εντός του G1 φάση αυξήθηκε από 47,5% και 54% έως 74,2% και 69,1%, ενώ τα ποσοστά των κυττάρων στη φάση S μειώθηκε από 33,5% και 25% σε 2,7% και 8,8% στην bgj-398- εκτεθειμένο UM-UC14 και RT4 κύτταρα, αντίστοιχα (Σχ. 3Α). Από την άλλη πλευρά, bgj-398 δεν επήγαγε απόπτωση σε κάθε κυτταρική σειρά σε συγκεντρώσεις κάτω από 10 μΜ (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Ως εκ τούτου, bgj-398 ασκεί κυρίως κυτταροστατικά αποτελέσματα στα κύτταρα π.Χ. in vitro.

Α. Επιδράσεις της bgj-398 επί του πολλαπλασιασμού των κυττάρων σε κύτταρα ευαίσθητα σε φάρμακο. Στον αριστερό πίνακα, τα κύτταρα επωάστηκαν για 48 ώρες με την παρουσία των ενδεικνυόμενων συγκεντρώσεων bgj-398 και την κυτταρική ανάπτυξη μετρήθηκε με αναγωγή του ΜΤΤ. Η μέση ± SEM, η = 6. Στο κέντρο και δεξιά πάνελ, UM-UC14 ή RT4 κύτταρα επωάστηκαν με τις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις bgj-398 και τα ποσοστά των κυττάρων μέσα σε κάθε τεταρτημόριο κύκλου κυττάρου προσδιορίστηκαν ποσοτικά με χρώση ιωδιούχου προπιδίου και ανάλυση FACS . Η μέση ± SEM, η = 3. Β ευαισθησία στο αντι-πολλαπλασιαστικά αποτελέσματα της bgj-398 συσχετίζεται με την έκφραση FGFR3 αλλά όχι με την παρουσία του την ενεργοποίηση FGFR3 μεταλλάξεων. Το επίπεδο της αναστολής της ανάπτυξης που παρατηρείται μετά από έκθεση 48 ωρών σε 1 μΜ bgj-398 (όπως μετράται σε προσδιορισμούς ΜΤΤ) συσχετίστηκε με το σχετικό επίπεδο του FGFR3 (αριστερός πίνακας) ή FGFR1 (δεξί πάνελ) έκφραση mRNA σε ένα πάνελ 17 ανθρώπινης π.Χ. κυτταρικές σειρές .. C. Επίδραση της FGFR3 knockdown επί του πολλαπλασιασμού των κυττάρων. Αριστερό πλαίσιο: UM-UC14 ή RT4 κύτταρα επιμολύνθηκαν παροδικά με είτε μη-στόχευσης (ΝΤ) ή FGFR3 ειδικά siRNAs και την ανάπτυξη των κυττάρων μετρήθηκε στις 48 ώρες με αναγωγή του ΜΤΤ. Η μέση ± SEM, η = 6. Κέντρο και δεξιά πάνελ: UM-UC14 ή RT4 κύτταρα επιμολύνθηκαν παροδικά με είτε μη-στόχευσης (ΝΤ) ή FGFR3 ειδικά siRNAs και τα ποσοστά των κυττάρων μέσα σε κάθε φάση του κύκλου του κυττάρου προσδιορίστηκαν ποσοτικά με προπίδιο ιωδιούχο χρώση και ανάλυση FACS. Η μέση ± SEM, η = 3. Κάτω πίνακας: η αποτελεσματικότητα του FGFR3 σίγηση μετρήθηκε με ποσοτική RT-PCR και ανοσοστύπωμα

Η

Στη συνέχεια εξετάστηκε η σχέση μεταξύ bgj-398 ευαισθησία και την παρουσία ενεργοποίησης. μεταλλάξεις FGFR3. Χρησιμοποιώντας αλληλουχίας εξόνιο εντοπίσαμε 5 κυτταρικές σειρές στο πάνελ μας, που περιείχε την ενεργοποίηση μεταλλάξεις FGFR3 (UM-UC6, UM-UC14, UM-UC15, UM-UC16 και UM-UC17) (Εικ. S3). Εντυπωσιακά, μόνο μία από τις FGFR3-μεταλλαγμένες κυτταρικές σειρές (UM-UC14) ήταν επίσης bgj-398 ευαίσθητες. Από την άλλη πλευρά, παρατηρήσαμε μια καλή συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης FGFR3 mRNA και ευαισθησία φαρμάκου (Spearman r = 0,7247 ρ = 0,01) (Σχ. 3Β αριστερό πλαίσιο), ενώ δεν υπήρχε συσχέτιση μεταξύ της ευαισθησίας στην bgj-398 και έκφραση FGFR1 (Spearman r = -0,2931 p = 0,2536) (Εικ. 3Β δεξί πάνελ).

Λόγω της μη-επικαλυπτόμενα πρότυπα FGFR1 και της έκφρασης FGFR3, τα αποτελέσματα έδειξαν ότι FGFR3 παίζει πιο σημαντικό ρόλο από ό, τι FGFR1 στην οδήγηση ανθρώπινη πολλαπλασιασμό κύτταρα BC. Για να ελέγξετε πιο άμεσα αυτή η υπόθεση, χρησιμοποιήσαμε RNAi να γκρεμίσουμε FGFR1 ή FGFR3 στα bgj-398-ευαίσθητα κύτταρα UM-UC14 και RT4 και μέτρησε τις επιδράσεις στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό χρησιμοποιώντας δοκιμασίες ΜΤΤ. Ποσοτική RT-PCR αποκάλυψε αποδοτικότητες knockdown 50% και πάνω από 80% το RT4 και UM-UC14 κύτταρα επιμολυσμένα με FGFR3 ειδικά siRNAs, αντίστοιχα, σε σύγκριση με κύτταρα επιμολυσμένα με το μη ειδικό έλεγχο siRNA, και τα αποτελέσματα αυτά επιβεβαιώθηκαν επίσης κατά τη επίπεδο πρωτεΐνης με ανοσοκηλίδωση (Σχ. 3C κάτω πίνακας). Τα αντίστοιχα αποτελέσματα επί του πολλαπλασιασμού των κυττάρων ήταν πολύ παρόμοια, από το ότι ο πολλαπλασιασμός μειώθηκε κατά περίπου 50% στα κύτταρα RT4 και πάνω από 80% σε UM-UC14 επιμολυσμένα με το FGFR3 siRNA (Σχ. 3C αριστερό πάνελ). Οι αναλύσεις κυτταρικού κύκλου επιβεβαίωσε ότι FGFR3 knockdown αύξησε τα ποσοστά των κυττάρων στην G1 φάση και μειωμένη τα κλάσματα των κυττάρων στη φάση S (Σχ. κέντρο 3C /δεξιά πάνελ), σύμφωνα με τα αποτελέσματα του ΜΤΤ και τα προηγουμένως παρατηρούμενες επιδράσεις του bgj-398 [ ,,,0],12]. Αντίθετα, νοκ ντάουν της FGFR1 δεν είχε σημαντική επίδραση στον πολλαπλασιασμό (Εικ. S4).

Επιπτώσεις της bgj-398 στην εισβολή

Αν και οι «μεσεγχυματικά» UM-UC3 και UM-UC13 κύτταρα εξέφρασαν σχετικά υψηλά επίπεδα FGFR1, ήταν ανθεκτικοί στην αντι-πολλαπλασιαστικά αποτελέσματα της bgj-398 (Εικ. 4Α αριστερό πάνελ). Επειδή εισβολή, τη μετανάστευση, και η μετάσταση είναι χαρακτηριστικά γνωρίσματα της «μεσεγχυματικά» κύτταρα όγκου [20], εξετάσαμε τις επιδράσεις της bgj-398 για εισβολή στα κύτταρα UM-UC3 και UM-UC13, χρησιμοποιώντας δύο «επιθηλιακά», bgj-398 ανθεκτικών κυτταρικών σειρών (UM-UC6 και UM-UC9) ως μάρτυρες. Εμείς εκτεθειμένων κυττάρων σε αυξανόμενες συγκεντρώσεις bgj-398 και μετρήθηκαν εισβολή χρησιμοποιώντας τροποποιημένους θαλάμους Boyden.