Αφηρημένο

Η ανάπτυξη αποτελεσματικών θεραπειών κατά του καρκίνου αποτέλεσε θέμα έντονου ενδιαφέροντος για αρκετές δεκαετίες. Η συνδυασμένη χορήγηση ορισμένων μορίων και κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος έχει δειχθεί ότι είναι μια αποτελεσματική μορφή θεραπείας κατά του καρκίνου. Εδώ, εξετάσαμε τις επιδράσεις της χορήγησης ενός ανοσοποιητικού πεπτιδίου διεγερτική (WKYMVm), 5-φθορο-ουρακίλη (5-FU), και ώριμα δενδριτικά κύτταρα (mDCs) έναντι του καρκίνου ετερότοπη ζωικό μοντέλο. Η χορήγηση του τριπλού συνδυασμού μειωθεί σημαντικά ο όγκος του όγκου σε CT-26-εμβολιάζονται ετεροτοπικό καρκίνο ζωικό μοντέλο. Η επαγόμενη δραστικότητα κατά του όγκου ήταν καλά συσχετίζεται με την έκφραση FAS, η ενεργοποίηση της κασπάσης-3, και καρκινικών κυττάρων απόπτωση. Ο τριπλός θεραπεία συνδυασμού προκάλεσε την πρόσληψη των CD8 Τ λεμφοκυττάρων και των φυσικών φονικών κυττάρων (ΝΚ) εντός του όγκου. Η παραγωγή των δύο κυτοκινών, ΙΡΝ-γ και IL-12, ήταν έντονα διεγείρεται από τη χορήγηση του τριπλού συνδυασμού. Η εξάντληση των CD8 Τ λεμφοκύτταρα ή κύτταρα ΝΚ με χορήγηση αντι-CD8 ή αντι-asialoGM1 αντίσωμα ανέστειλε την δραστηριότητα και παραγωγή κυτοκινών αντινεοπλασματική του τριπλού συνδυασμού. Ο τριπλός συνδυασμός αναστέλλεται ισχυρά μετάσταση των καρκινικών κυττάρων του παχέος εντέρου σε ένα ετεροτοπική καρκίνο ζωικό μοντέλο, καθώς και σε ένα μεταστατικό καρκίνο ζωικό μοντέλο, και να ενισχυθεί το ποσοστό επιβίωσης του μοντέλου ποντικών. Η θετή μεταφορά των CD8 Τ λεμφοκυττάρων και κυττάρων ΝΚ ενίσχυσε περαιτέρω το ποσοστό επιβίωσης. Στο σύνολό τους, προτείνουμε ότι η χρήση του τριπλού συνδυασμού θεραπείας της WKYMVm, 5-FU και mDCs μπορεί να έχει επιπτώσεις σε στερεά και μετάσταση όγκου θεραπεία

Παράθεση:. Kim SD, Lee ΗΥ, Shim JW, Κιμ HJ , Μπεκ SH, Zabel ΒΑ, et al. (2012) Μια WKYMVm Περιέχουν Συνδυασμός Διεγείρει ισχυρή αντι-όγκου δραστηριότητα σε Ετεροτοπική Καρκίνο ζωικό μοντέλο. PLoS ONE 7 (1): e30522. doi: 10.1371 /journal.pone.0030522

Επιμέλεια: Hana Algul, Τεχνικό Πανεπιστήμιο του Μονάχου, Γερμανία

Ελήφθη: 12 Αυγ του 2011? Αποδεκτές: 18 Δεκ, 2011? Δημοσιεύθηκε: 25 Ιανουαρίου 2012

Copyright: © 2012 Kim et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από μια επιχορήγηση από το Εθνικό Δίκτυο Έρευνας & amp? Πρόγραμμα Ανάπτυξης για τον έλεγχο του καρκίνου, Υπουργείο Υγείας, Πρόνοιας και Οικογενειακών Υποθέσεων, Δημοκρατία της Κορέας (0920220) (Υ-Δ)? Εθνικό Ίδρυμα Ερευνών της Κορέας επιχορήγησης η οποία χρηματοδοτήθηκε από την κυβέρνηση της Κορέας (2009 0093198) (Υ-Δ)? και National Institutes of Health χορηγούν ΑΙ-079320 (BZ). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ανάπτυξη της θεραπείας κατά του καρκίνου έχει ένα σημαντικό ζήτημα για αρκετές δεκαετίες [1], [2]. Η θεραπεία με αντικαρκινικά μέσα είναι ένα από τα πιο ευρέως χρησιμοποιούμενη τρόποι θεραπείας κατά του όγκου. Διάφοροι αντικαρκινικοί παράγοντες έχουν αναπτυχθεί, συμπεριλαμβανομένου του 5-φθορο-ουρακίλη (5-FU) [3]. Μηχανιστικά, οι αντι-καρκινικοί παράγοντες έχουν αναφερθεί ότι προκαλούν απόπτωση των καρκινικών κυττάρων, η οποία προκαλεί την έναρξη της αντικαρκινικών ανοσοαποκρίσεων [4]. Στο ανοσοποιητικό σύστημα του ξενιστή, δενδριτικά κύτταρα (DCs) φαίνεται να διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στην δραστικότητα κατά του όγκου. ΑΧ αναγνωρίζουν και πρόσληψη καρκινικά αντιγόνα, και να παρουσιάσει τα επεξεργασμένα αντιγόνα σε μείζον σύμπλεγμα ιστοσυμβατότητας μορίων [5], [6], [7]. Έτσι, DCs μπορούν να διεγείρουν τα Τ λεμφοκύτταρα, με αποτέλεσμα την κυτταροτοξική δράση των Τ λεμφοκυττάρων. ΑΧ εκκρίνουν επίσης αρκετές κυτοκίνες που είναι σημαντικές στην αποτελεσματική αντικαρκινική δραστικότητα [7].

WKYMVm ταυτοποιήθηκε ως ανοσο-διέγερσης συνθετικό πεπτίδιο από μία βιβλιοθήκη πεπτιδίων διαλογή [8], [9]. WKYMVm διεγείρει λευκοκύτταρα όπως μονοκύτταρα, ουδετερόφιλα, κύτταρα φυσικοί φονείς (ΝΚ), και DCs [9], [10], [11], [12]. Λόγω των μονοκυττάρων και των ουδετερόφιλων διέγερση, χημειοτακτική μετανάστευση, την παραγωγή ανιόντος υπεροξειδίου και την παραγωγή ορισμένων φλεγμονωδών μεσολαβητών όπως λευκοτριενίων Β

4 διεγείρεται από WKYMVm [9], [13], [14]. διέγερση ΝΚ κυττάρων με WKYMVm αποτελέσματα κυτταρολυτική δραστικότητα και χημειοτακτική μετανάστευση [11]. Το πεπτίδιο που διεγείρεται μετανάστευση χημειοτακτικό των DCs [12]. Τρία μέλη της οικογένειας υποδοχέα πεπτιδίου φορμυλίου (FPR) έχουν αναφερθεί ότι είναι γνωστική υποδοχείς επιφανείας κυττάρου για WKYMVm σε ανθρώπους [15], [16]. Mouse FPR έχει επίσης αναφερθεί να δρα ως υποδοχέας WKYMVm [17]. Αν και WKYMVm έχει αναφερθεί ότι διεγείρει λευκοκύτταρα τα οποία παίζουν σημαντικούς ρόλους κατά καρκινικών αντιγόνων, λίγα είναι γνωστά για τον ρόλο των WKYMVm σε αντικαρκινική δράση.

συνδυασμένη χορήγηση ορισμένων μορίων μπορεί να επάγει αποτελεσματική αντικαρκινική δράση. Αν και διάφορες αντικαρκινικών παραγόντων ή αντικαρκινικές θεραπείες έχουν αναφερθεί, η ανάπτυξη νέων αντικαρκινικών θεραπειών οι οποίες είναι αποτελεσματικές και ειδικές με χαμηλή τοξικότητα εξακολουθεί να είναι αναγκαία. Σε αυτή τη μελέτη διερευνήσαμε την θεραπευτική δράση των WKYMVm όταν χορηγήθηκε με ένα αντικαρκινικό παράγοντα (5-FU) και ένα ανοσοενισχυτικό φυσικό εμβόλιο (ώριμο DCs, mDCs). Ο μηχανισμός δράσης του τριπλού συνδυασμού θεραπείας χαρακτηρίστηκε επίσης.

Αποτελέσματα

συνδυασμένη χορήγηση WKYMVm, 5-FU, και mDCs προκαλεί αντικαρκινική δραστικότητα σε ετεροτοπική καρκίνο ζωικό μοντέλο

εξετάστηκε η υποθετική δραστικότητα κατά του όγκου του WKYMVm, 5-FU, ή mDCs. WKYMVm, 5-FU, ή mDCs αρχικά χορηγήθηκαν μεμονωμένα. Για παράδειγμα, όπως φαίνεται στο Σχ. 1Α, WKYMVm (100 μg /κεφαλή) εγχύθηκε τέσσερις φορές σε διαστήματα 12 ώρες. Ενιαία διοίκηση, προκάλεσε μικρή μείωση στον όγκο του όγκου (Εικ. 1Β). Όταν οι παράγοντες δοκιμάστηκαν σε ζεύγη (WKYMVm + 5-FU? WKYMVm + mDCs? MDCs + 5-FU) κατά ένα ζωικό μοντέλο, δραστικότητα κατά του όγκου ενισχύθηκε (Σχήμα 1Β).. Η παρουσία της 5-FU φάνηκε να ενισχύουν περαιτέρω δραστικότητα κατά του όγκου (Σχ. 1Β, 5-FU + WKYMVm και 5-FU + mDCs). Επιπλέον, όταν ο τριπλός συνδυασμός (WKYMVm + 5-FU + mDCs) χορηγήθηκε στην ετεροτοπική καρκίνο ζωικό μοντέλο, η πιο ισχυρή αντι-ογκική δραστικότητα παρατηρήθηκε (Εικ. 1Β).

(Α) Πρωτόκολλο για η μελέτη της δραστικότητας κατά του όγκου του WKYMVm, 5-FU, και mDCs. (Β) Ο τριπλός συνδυασμός WKYMVm, 5-FU, και mDCs έχει την πιο ισχυρή δράση κατά των όγκων. CT-26 κύτταρα (5 × 10

5 κύτταρα σε 100 μΙ PBS) εγχύθηκαν υποδορίως στο δεξί πλευρό των ποντικών Balb /c (n = 8) την ημέρα -3. Τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε αγωγή σύμφωνα με το πρωτόκολλο στο (Α). Ο όγκος του όγκου μετρήθηκε και τα δεδομένα παρουσιάζονται ως η μέση ± SEM (n = 8).

***

P

& lt?. 0.001 σε σύγκριση με τον έλεγχο

Η

Η συνδυασμένη χορήγηση WKYMVm, 5-FU και mDCs προκαλεί όγκου απόπτωση

Δεδομένου ότι η απόπτωση όγκου είναι στενά συνδεδεμένη με δραστικότητα κατά του όγκου, μετρήθηκε η επίδραση της κάθε διοίκησης στην απόπτωση όγκου. Όπως φαίνεται στο Σχ. 2, εφάπαξ χορήγηση WKYMVm, 5-FU, ή mDCs επαγόμενη χαμηλά επίπεδα των κυττάρων του όγκου θανάτου, και διπλό συνδυασμοί έδειξαν περαιτέρω αύξηση σε κυτταρικό θάνατο, με τον τριπλό συνδυασμό με αποτέλεσμα την δραματική αύξηση του θανάτου των καρκινικών κυττάρων στο ζωικό μοντέλο ετεροτοπική καρκίνου (Εικ . 2). Οι TUNEL-θετικών κυττάρων συνέπεσε με έκφραση FAS, υποδεικνύοντας ότι το κύτταρο όγκου θάνατος παρατηρείται οφείλεται σε απόπτωση (Σχ. 2). Caspase-3 δραστικότητα κατά την αγωγή προσδιορίστηκε με χρώση ανοσοφθορισμού χρησιμοποιώντας αντι-φωσφο-κασπάση-3 αντίσωμα. Σε συμφωνία με τα αποτελέσματα χρώσης TUNEL και έκφραση FAS, κασπάσης-3 ενεργοποίησης αυξήθηκε καθώς ο αριθμός των συνδυασμένων παραγόντων αυξήθηκε, με τον τριπλό συνδυασμό WKYMVm + 5-FU + mDCs προκαλεί μια δραματική αύξηση της κασπάσης-3 δραστικότητα (Εικ. 2). Τα επίπεδα της απόπτωσης κυττάρων όγκου και δραστικότητα κασπάσης-3 συσχετίζονται καλά με τα δεδομένα του όγκου του όγκου στο Σχ. 1Β.

ποντικοί Balb /c εμβολιάστηκαν με κύτταρα CT-26 και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με WKYMVm, 5-FU, και mDCs σύμφωνα με το πρωτόκολλο στο Σχ. 1Α. Τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε ευθανασία 42 ημέρες μετά τον εμβολιασμό του όγκου και οι όγκοι αποκόπηκαν χειρουργικά, και υποβάλλονται σε επεξεργασία για χρώση αιματοξυλίνης και ηωσίνης, ανοσοϊστοχημεία για χρώση FAS, χρώση κασπάσης-3, και χρώση TUNEL, όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. Τα στοιχεία που παρουσιάζονται είναι αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων.

Η

Διοίκηση του τριπλού συνδυασμού προκαλεί την πρόσληψη των CD8 Τ κυττάρων και ΝΚ κυττάρων εντός του όγκου

Για να ξεκινήσετε ένα αντι-όγκου του ανοσοποιητικού απάντηση, λευκοκύτταρα θα πρέπει να προσληφθούν στην περιοχή του όγκου [18]. Από τη χορήγηση του τριπλού συνδυασμού (WKYMVm + 5-FU + mDCs) προκάλεσε ισχυρή δραστικότητα κατά του όγκου έναντι ετερότοπου καρκίνος ζωικό μοντέλο, εξετάσαμε τι τύποι κυττάρων έχουν προσληφθεί μέσα στον όγκο με ανοσοϊστοχημεία χρησιμοποιώντας αντι-CD3, αντι-CD4, αντι-CD8, αντι-CD11b, ή αντίσωμα αντι-DX5. Η χορήγηση του τριπλού συνδυασμού προκάλεσε δραματικές στρατολόγηση των CD8 Τ λεμφοκυττάρων και κυττάρων ΝΚ στην περιοχή του όγκου, καθώς και ελαφρές στρατολόγηση των CD4 Τ-λεμφοκυττάρων (Εικ. 3Α).

(Α) Ποντίκια Balb /c εμβολιάστηκαν με κύτταρα CT-26 και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με WKYMVm, 5-FU, και mDCs σύμφωνα με το πρωτόκολλο στο Σχ. 1Α. CD8 Τ κύτταρα, CD4 Τ κύτταρα ή ΝΚ κύτταρα εξαντλήθηκαν με ε.π. ένεση 100 μg αντι-CD8 (Β), αντι-CD4 (C) ή αντι-asialoGM1 αντίσωμα (D) σε ποντικούς Balb /c. Τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε ευθανασία 42 ημέρες μετά τον εμβολιασμό του όγκου και οι όγκοι αποκόπηκαν χειρουργικά, και υποβάλλονται σε επεξεργασία για ανοσοκηλιδώσεως με χρησιμοποίηση αντι-CD3, αντι-CD4, αντι-CD8 και αντι-asialoGM1 αντισώματα, όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. CD3

+ CD8

+ κύτταρα, CD3

+ CD4

+ κύτταρα, και CD11b

+ DX5

+ κυττάρων δείχνουν CD8 Τ λεμφοκυττάρων, τα CD4 Τ λεμφοκύτταρα, και ΝΚ κυττάρων, αντίστοιχα . Τα δεδομένα που παρουσιάζονται είναι αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων.

Η

Η χορήγηση του μονοκλωνικού αντισώματος αντι-CD8 πριν από την τριπλού συνδυασμού προκάλεσε δραματική αναστολή της πρόσληψης λεμφοκυττάρων CD8 Τ στην περιοχή του όγκου, χωρίς να επηρεάζει την πρόσληψη των κυττάρων ΝΚ ( Σχ. 3Β). Όταν αντι-asialoGM1 αντίσωμα χορηγήθηκε πριν από την ένεση του τριπλού συνδυασμού, στρατολόγηση κυττάρων ΝΚ στην περιοχή του όγκου μπλοκαρίστηκε ισχυρά, αλλά CD8 Τ λεμφοκυττάρων πρόσληψη δεν επηρεάστηκε (Σχ. 3D). χορήγηση αντισώματος αντι-CD4 πριν από την ένεση του τριπλού συνδυασμού δεν επηρέασε CD8 Τ λεμφοκυττάρων ή στρατολόγηση των κυττάρων ΝΚ (Σχ. 3C).

CD8 Τ κύτταρα και ΝΚ κύτταρα παίζουν κύριους ρόλους στην αντικαρκινική δραστικότητα του η θεραπεία τριπλού συνδυασμού

Για την αποτελεσματική ενεργοποίηση του αντικαρκινική δράση σε ένα πειραματόζωο, διάφορους τύπους λευκοκυττάρων επικοινωνούν μεταξύ τους και να δράσουν concertedly. Εξετάσαμε τη σχετική συμβολή των μεμονωμένων τύπων λευκοκυττάρων επί της δραστικότητας κατά του όγκου που προκαλείται από την τριπλή θεραπεία συνδυασμού, με χορήγηση αντισωμάτων έναντι κάθε λευκοκυττάρων. Όταν αντι-CD8 αντίσωμα χορηγήθηκε σε ετερότοπου καρκίνο ζωικό μοντέλο, η δραστικότητα κατά του όγκου του τριπλού συνδυασμού ήταν σχεδόν πλήρως ανασταλεί (σχ. 4Α). Η χορήγηση του αντι-asialoGM1 αντίσωμα προκάλεσε μερική αναστολή της δραστικότητας κατά του όγκου του τριπλού συνδυασμού θεραπείας (Εικ. 4Β). Ωστόσο, η χορήγηση του αντι-CD4 αντίσωμα δεν επηρέασε την αντικαρκινική δραστικότητα του τριπλού συνδυασμού (δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι CD8 Τ κύτταρα και ΝΚ κύτταρα παίζουν κύριους ρόλους στην αντικαρκινική δραστικότητα του τριπλού συνδυασμού WKYMVm, 5-FU, και mDCs.

Ποντίκια Balb /c εμβολιάστηκαν με κύτταρα CT-26 και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με WKYMVm, 5-FU, και mDCs σύμφωνα με το πρωτόκολλο στο Σχ. 1Α. CD8 Τ κύτταρα ή ΝΚ κύτταρα εξαντλήθηκαν με ε.π. ένεση 100 μg αντι-CD8 (Α) ή αντι-asialoGM1 αντίσωμα (Β) σε ποντικούς Balb /c. Ο όγκος του όγκου μετρήθηκε και τα δεδομένα παρουσιάζονται ως η μέση ± SEM (n = 8).

,

P

& lt? 0,05,

***

P

& lt?. 0.001 σε σύγκριση με τον έλεγχο

Η

Διοίκηση της WKYMVm, 5-FU, και mDCs τριπλός συνδυασμός προκαλεί μια αλλαγή του προφίλ κυτοκίνης σε ένα ετεροτοπική καρκίνο ζωικό μοντέλο

Δοκιμάσαμε αν η χορήγηση του WKYMVm, 5-FU, και mDCs σε διάφορους συνδυασμούς προκαλεί αλλαγές στο προφίλ κυτοκίνης σε σύγκριση στο προϊόν λύσης του όγκου ελέγχου. Όπως φαίνεται στο Σχ. 5Α, η χορήγηση του τριπλού συνδυασμού προκάλεσε δραματικές αλλαγές στα επίπεδα της ΙΡΝ-γ και IL-12 που παράγεται από προϊόντα λύσης όγκου στον καρκίνο ετεροτοπική ζωικό μοντέλο. Η παραγωγή της ΙΡΝ-γ στον όγκο αυξάνεται σταδιακά καθώς ο αριθμός των συνδυασμένων παραγόντων αυξήθηκε, με διπλό συνδυασμούς γενικά δείχνουν μεγαλύτερη παραγωγή ΙΡΝ-γ από απλή χορήγηση, και ο τριπλός συνδυασμός που δείχνει το υψηλότερο επίπεδο παραγωγής ΙΡΝ-γ (Σχ. 5Α ). Όταν μετρήθηκαν IL-12 επίπεδα, βρήκαμε ότι απλή χορήγηση κάθε παράγοντα δεν προκαλεί την παραγωγή IL-12, και ανάμεσα στα διπλά συνδυασμούς, μόνο ο συνδυασμός των mDCs WKYMVm + ενισχυμένη παραγωγή IL-12 στο ζωικό μοντέλο (Σχ. 5Β). Η χορήγηση του τριπλού συνδυασμού (WKYMVm + mDCs + 5-FU) αυξήθηκε δραματικά IL-12 σε ένα επίπεδο που ήταν δύο φορές υψηλότερη από ό, τι το WKYMVm + mDCs διπλό συνδυασμό (Εικ. 5Β).

Balb /c ποντικών εμβολιάστηκαν με κύτταρα CT-26 και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με WKYMVm, 5-FU, και mDCs σύμφωνα με το πρωτόκολλο στο Σχ. 1Α. (Α, Β) ΙΡΝ-γ και IL-12 επίπεδα μετρήθηκαν από λύμα ιστό όγκου. Μετρήθηκαν τα επίπεδα (C-F) ΙΡΝ-γ και IL-12 στο περιφερικό αίμα κατά την τριπλή θεραπεία συνδυασμού. 100 μα αντι-CD8 (C, D) ή αντι-asialoGM1 αντίσωμα (Ε, F) εγχύθηκε ί.ρ. σε ποντικούς Balb /c. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως η μέση ± SEM (n = 8).

,

P

& lt? 0,05,

***

P

& lt? 0.001, σε σύγκριση με την τιμή ελέγχου?

#

P

& lt?. 0.05, διαφέρει σημαντικά από την WKYMVm + 5-FU + mDCs επεξεργασμένο έλεγχο

Η

παρατηρήθηκε επίσης Διοίκησης του τριπλού συνδυασμού για την ενίσχυση της η παραγωγή ΙΡΝ-γ και IL-12 στο περιφερικό αίμα (Σχ. 5C-5F). Για να εξεταστεί ο ρόλος των CD8 Τ λεμφοκυττάρων και ΝΚ κυττάρων στην παραγωγή αυτών των δύο κυτοκινών μετά τριπλός συνδυασμός χορήγηση, αντι-CD8 ή αντι-asialoGM1 αντίσωμα χορηγείται πριν από την τριπλή θεραπεία συνδυασμού. Η χορήγηση των αντι-CD8 ή αντι-asialoGM1 αντίσωμα μπλοκάρει τριπλός συνδυασμός επαγόμενης ΙΡΝ-γ και IL-12 παραγωγή στο περιφερικό αίμα (Σχ. 5C-5F). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι CD8 Τ λεμφοκύτταρα και κύτταρα ΝΚ παίζουν ένα ρόλο στην ΙΡΝ-γ και IL-12 παραγωγή επάγεται από τριπλή θεραπεία συνδυασμού. Δραστηριότητα

Anti-μετάστασης συνδυασμένη χορήγηση WKYMVm, 5-FU, και mDCs

Κατά την ανάπτυξη μιας αποτελεσματικής αντι-όγκου θεραπευτικού παράγοντα, είναι σημαντικό να αναπτυχθούν παράγοντες οι οποίοι αναστέλλουν την υποτροπή του όγκου [19]. Η μεταστατική ικανότητα των καρκινικών κυττάρων να μεταναστεύουν από την καταγωγή τους σε άλλους ιστούς-στόχους είναι ένας από τους βασικούς λόγους που καθιστούν δύσκολη την ανάπτυξη ενός αποτελεσματικού αντικαρκινικού παράγοντα [20], [21]. Στην ετεροτοπική μας καρκίνος ζωικό μοντέλο, παρατηρήσαμε ότι υποδόριο εμβολιασμό των καρκινικών κυττάρων CT-26 κόλον που προκαλείται αυθόρμητη μετάσταση των κυττάρων στον ιστό των πνευμόνων (Εικ. 6Α). Η χορήγηση του τριπλού WKYMVm + mDCs + 5-FU συνδυασμός μπλοκάρει σχεδόν πλήρως μετάσταση των καρκινικών κυττάρων του παχέος εντέρου στους πνεύμονες (Εικ. 6Α). Αυτή η τριπλή αντι-μετάσταση συνδυασμός επαγόμενης μπλοκαρίστηκε με την χορήγηση αντι-CD8 ή αντι-asialoGM1 αντίσωμα (Εικ. 6Α), υποδεικνύοντας ότι η αντι-μετάσταση προκαλείται από CD8 Τ λεμφοκυττάρων και τη δραστηριότητα των κυττάρων ΝΚ.

(Α) ποντίκια Balb /c εμβολιάστηκαν με κύτταρα CT-26 και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με WKYMVm, 5-FU, και mDCs σύμφωνα με το πρωτόκολλο στο Σχ. 1Α. CD8 Τ κύτταρα ή ΝΚ κύτταρα εξαντλήθηκαν με την έγχυση 100 μα αντι-CD8 ή αντι-asialoGM1 ε.π. αντίσωμα σε ποντικούς Balb /c. Την ημέρα 42, ποντικοί θυσιάστηκαν και παρατηρήθηκαν οζίδια όγκων στην επιφάνεια των πνευμόνων. (Β) κύτταρα CT-26 (2 χ 10

5 κύτταρα σε 100 μΙ PBS) εγχύθηκαν στην ουραία φλέβα ποντικών Balb /c. Μετά από 14 ημέρες, τα ποντίκια θυσιάστηκαν και αιματοξυλίνη και εοσίνη χρώση πραγματοποιήθηκε με τη χρήση των απομονωμένων πνεύμονες. Οι εικόνες που παρουσιάζονται είναι αντιπροσωπευτικά από οκτώ ανεξάρτητων πειραμάτων.

**

P

& lt? 0,01,

**

P

& lt?. 0.01 σε σύγκριση με τον έλεγχο

Η

Επίσης χρησιμοποιήσαμε ένα τεχνητό μετάσταση ζωικό μοντέλο για να δοκιμαστεί η επίδραση των διαφορετικών συνδυασμών WKYMVm, 5-FU, και mDCs έναντι μετάστασης. Ένεση του CT-26 κύτταρα καρκίνου κόλου στην ουραία φλέβα προκαλεί μετάσταση στους πνεύμονες. Οι πνεύμονες απομονώθηκαν 14 ημέρες μετά την CT-26 ένεση των κυττάρων. Δραματικές μετάσταση πνεύμονα παρατηρήθηκε με θεραπεία με όχημα ποντικούς (Σχ. 6Β). Μονά ή διπλά συνδυασμούς WKYMVm, mDCs, και 5-FU ανέστειλε μετάσταση όγκου σε διάφορους βαθμούς για τη μείωση της μεταστάσεως του πνεύμονα, και η πιο ισχυρή επίδραση παρατηρήθηκε με τον τριπλό συνδυασμό (Εικ. 6Β).

συνδυασμένη χορήγηση WKYMVm, 5-FU και mDCs βελτιώνει τα ποσοστά επιβίωσης σε ένα ετεροτοπικό καρκίνο ζωικό μοντέλο

εξετάστηκε το ποσοστό επιβίωσης του ετερότοπου καρκίνου ζωικό μοντέλο κατά την συνδυασμένη θεραπεία. Δοκιμάσαμε τους συνδυασμούς που έδειξαν σχετικά υψηλή δραστικότητα κατά του όγκου σε προηγούμενες δοκιμασίες μας πάνω? 5-FU μόνη της, 5-FU + WKYMVm, 5-FU + mDCs, και 5-FU + mDCs + WKYMVm. Η χορήγηση μόνο του 5-FU, 5-FU mDCs +, ή 5-FU + WKYMVm μόνο ελαφρώς αυξημένο ποσοστό επιβίωσης, αλλά η χορήγηση του τριπλού + mDCs + WKYMVm συνδυασμός 5-FU ενισχύεται έντονα ποσοστό επιβίωσης (σχ. 7Α). Όλα τα ποντίκια στην ομάδα ελέγχου πέθαναν μετά από 65 ημέρες, ενώ 80% του τριπλού συνδυασμού ομάδα-χορηγείται ήταν ζωντανός σε 80 ημέρες (Εικ. 7Α).

(Α) ποσοστό επιβίωσης των ποντικών που υπέστησαν αγωγή με συνδυασμούς WKYMVm, 5-FU, και mDCs. ποντικούς Balb /c εμβολιάστηκαν με κύτταρα CT-26 (5 × 10

5 κύτταρα /κεφαλή) και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με WKYMVm, 5-FU, και mDCs σύμφωνα με το πρωτόκολλο στο Σχ. 1Α. (Β) Η ανοσιακή μεταφορά του CD8 Τ λεμφοκύτταρα ή κύτταρα ΝΚ μπορεί να ενισχύσει το ποσοστό επιβίωσης των τριπλής ετεροτοπική καρκίνο ποντίκια ζωικό μοντέλο συνδυασμός επεξεργασία. ποντικούς Balb /c εμβολιάστηκαν με κύτταρα CT-26 (1 χ 10

6 κύτταρα /κεφαλή) και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με WKYMVm, 5-FU, και mDCs σύμφωνα με το πρωτόκολλο στο Σχ. 1Α, και απομονωμένα CD8 Τ λεμφοκύτταρα (1 × 10

6 κύτταρα /κεφαλή) ή κύτταρα ΝΚ (1 × 10

6 κύτταρα /κεφαλή) μεταφέρθηκαν μέσα στην φλέβα της ουράς. Το ποσοστό επιβίωσης παρακολουθήθηκε για 80 ημέρες.

**

P

& lt? 0,01,

***

P

& lt?. 0.001 σε σύγκριση με τον έλεγχο

Η

Για να δοκιμάσετε αν θετή μεταφορά των CD8 Τ λεμφοκυττάρων και κυττάρων ΝΚ θα μπορούσε να ενισχύσει τον τριπλό συνδυασμό επαγόμενη επιβίωση των ετεροτοπική ποντικών καρκίνος ζωικό μοντέλο, έχουμε εμβολιάστηκαν αυξημένο αριθμό κυττάρων καρκίνου του κόλου (1 × 10

6 κύτταρα /κεφαλή) σε ποντικούς. Σε αυτό το μοντέλο, το αποτέλεσμα του τριπλού συνδυασμού μειώθηκε, μειώνοντας το ποσοστό επιβίωσης 40% σε 80 ημέρες (σχ. 7Β). Υπό αυτές τις συνθήκες πραγματοποιήθηκε θετή μεταφορά των CD8 Τ λεμφοκυττάρων ή κυττάρων ΝΚ. Θετή μεταφορά των CD8 Τ λεμφοκυττάρων ή κυττάρων ΝΚ αυξήθηκε ελαφρά μόνο την επιβίωση βαθμολογία που προκαλείται από τριπλή διοίκηση συνδυασμού, ενώ σε συνδυασμό θετή μεταφορά των CD8 Τ λεμφοκυττάρων και ΝΚ κυττάρων δραματικά αυξημένο ποσοστό επιβίωσης (Εικ. 7Β). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι και οι δύο CD8 Τ λεμφοκύτταρα και κύτταρα ΝΚ μπορεί να ενισχύσει το ποσοστό επιβίωσης που προκαλείται από τον τριπλό συνδυασμό σε ετεροτοπική καρκίνο ζωικό μοντέλο.

Συζήτηση

Στην παρούσα μελέτη, δείξαμε ότι η χορήγηση της ο τριπλός συνδυασμός του συνθετικού πεπτιδίου WKYMVm, mDCs, και 5-FU προικίζει ισχυρός ανοσία κατά του καρκίνου. Single (WKYMVm, mDCs, ή 5-FU) ή διπλή (mDCs WKYMVm +, 5-FU + WKYMVm ή 5-FU + mDCs) θεραπεία των ποντικών μειώθηκε ελαφρά τον όγκο του όγκου, αλλά η χορήγηση του τριπλού συνδυασμού δραματικά ανάπτυξη ανέστειλαν όγκου (Σχ . 1). Τα αποτελέσματα των μετρήσεων του όγκου του όγκου συσχετίστηκαν καλά με την έκφραση FAS, η δραστικότητα κασπάσης-3, και TUNEL αποτελέσματα χρώσης (Σχ. 1 και 2). Σύμφωνα με προηγούμενες εκθέσεις, ΙΡΝ-γ είναι γνωστό ότι επάγει την έκφραση των υποδοχέων κυτταρικού θανάτου όπως FAS [22], [23]. Σε αυτή τη μελέτη, δείξαμε ότι η χορήγηση διαφορετικών συνδυασμών WKYMVm, 5-FU, ή mDCs μπορεί να επάγει ΙΡΝ-γ έκφραση, με τον τριπλό συνδυασμό που προκαλεί την πιο ενισχυμένη παραγωγή ΙΡΝ-γ (Σχ. 5Α). Το επίπεδο έκφρασης του ΙΡΝ-γ ήταν καλά συσχετίζεται με την αντικαρκινική δραστικότητα του κάθε συνδυασμού, γεγονός που υποδηλώνει ότι η ΙΡΝ-γ που προκαλείται από τη χορήγηση κάθε παράγοντα ή συνδυασμός είναι κρίσιμα εμπλέκονται στην δραστικότητα κατά του όγκου στο ζωικό μοντέλο.

IL-12 μπορεί προνομιακή ή διεγείρουν CD4 Τ κύτταρα, CD8 Τ κύτταρα και ΝΚ κυττάρων [24], [25], [26]. Σε αυτή τη μελέτη, μόνο ορισμένοι συνδυασμοί, δηλαδή WKYMVm + mDCs και ο τριπλός συνδυασμός θα μπορούσε να επάγει IL-12 έκφραση στο ετεροτοπική καρκίνο ζωικό μοντέλο (Σχ. 5Β). Ενιαία διαχείριση των WKYMVm ή mDCs δεν προκάλεσε παραγωγή IL-12 (Εικ. 5Β). Αυτό υποδηλώνει ότι η διέγερση του mDCs με WKYMVm είναι υπεύθυνη για την αποτελεσματική επαγωγή της IL-12 στο ζωικό μοντέλο. Δεδομένου WKYMVm είναι ένας συνδέτης για την οικογένεια FPR, φαίνεται πιθανό ότι η ενεργοποίηση της οικογένειας FPR επάγει IL-12 έκφραση από mDCs. Στο πείραμα ποσοστό επιβίωσης, τριπλή χορήγηση mDCs WKYMVm + 5-FU + προκάλεσε μια ισχυρή ενίσχυση του ποσοστού επιβίωσης σε μια ετεροτοπική καρκίνο ζωικό μοντέλο, αλλά 5-FU κατεργασία + mDCs είχε πολύ μικρότερο αποτέλεσμα (Εικ. 7). Εφόσον η IL-12 είναι έντονα επάγεται από τον τριπλό συνδυασμό, αλλά όχι από την 5-FU + mDCs (Εικ. 5Β), μπορεί να είναι δυνατό ότι ο τριπλός συνδυασμός αυξάνει το ποσοστό επιβίωσης διεγείροντας την παραγωγή διαλυτών παραγόντων όπως IL-12.

ΝΚ και CD8 Τ κύτταρα πρόσφατα αναφέρθηκε ότι είναι σημαντικό στην οπισθοδρόμηση του καρκίνου [27], [28], [29]. Εδώ, αποδείξαμε ότι τα CD8 Τ και ΝΚ κύτταρα εμπλουτισμένα σε όγκους όταν ο τριπλός συνδυασμός χορηγήθηκε (Εικ. 3), και η εξάντληση των CD8 Τ κύτταρα ή ΝΚ κύτταρα αυξημένη ανάπτυξη του όγκου (Σχ. 4). Επιπλέον, η εξάντληση των CD8 Τ κύτταρα ή ΝΚ κύτταρα μείωσε τα επίπεδα των επαγόμενων IFN-γ και IL-12 (Σχ. 5C-5F). Τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν ότι τα CD8 Τ κύτταρα και τα κύτταρα ΝΚ συμμετέχουν στη δράση κατά του όγκου του τριπλού συνδυασμού. Τριπλό χορήγηση WKYMVm, mDCs και 5-FU προκάλεσε επίσης ένα αποτέλεσμα αντι-μετάσταση σε μια ετεροτοπική καρκίνο ζωικό μοντέλο (Εικ. 6). Ενδοφλέβια ένεση του ATRA-κατιονικό λιπόσωμα IL-12 συμπλέγματα /ρϋΝΑ δείχθηκε να ενισχυθεί η αναστολή της ανάπτυξης των μεταστατικών όγκων του πνεύμονα σε ποντικούς [30], υποστηρίζοντας αντίληψη μας ότι η IL-12 παραγωγή μπορεί να συνδέεται με αντι-μετάσταση του τριπλού συνδυασμού .

στην παρούσα μελέτη αποδείξαμε ότι CD8 Τ κύτταρα και ΝΚ κύτταρα παίζουν σημαντικό ρόλο στην δραστικότητα κατά του όγκου του τριπλού συνδυασμού. Προηγουμένως αναφέρθηκε ότι τα κύτταρα ΝΚ εκφράζουν λειτουργική οικογένεια FPR, και διέγερση των ΝΚ κυττάρων με FPR αγωνιστή WKYMVm εκμαιεύει παραγωγή ΙΡΝ-γ [11]. Σε αυτή τη μελέτη βρήκαμε επίσης ότι ποντικού κύτταρα ΝΚ εκφράζουν οικογένεια FPR, και διέγερση των ΝΚ κυττάρων ποντικού με WKYMVm προκαλεί την παραγωγή της IFN-γ (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Το εύρημα αυτό εξηγεί την ενεργοποίηση των κυττάρων που προκαλείται από WKYMVm ΝΚ ουσιαστικά απαιτείται για την αντικαρκινική δραστικότητα του τριπλού συνδυασμού έναντι ετεροτοπική καρκίνο ζωικό μοντέλο. Όσον αφορά την ενεργοποίηση των CD8 Τ κύτταρα και ο ρόλος τους στην ετεροτοπική καρκίνο ζωικό μοντέλο, προηγουμένως δείξαμε ότι τα Τ κύτταρα δεν εκφράζουν υποδοχείς για WKYMVm [31]. Δεδομένου ότι τα CD8 Τ κύτταρα μπορούν να ενεργοποιηθούν από mDCs και IL-12 [32], [33], θα ήταν λογικό να πιστεύουμε ότι η χορήγηση του τριπλού συνδυασμού που περιέχει WKYMVm μπορεί να επάγει την ενεργοποίηση των CD8 Τ κυττάρων θα διαμεσολαβείται από mDCs ή IL -12.

εν κατακλείδι, τριπλός συνδυασμός ανοσοθεραπεία με mDCs, το συνθετικό πεπτίδιο WKYMVm, και 5-FU ήταν ανώτερη από μονά ή διπλά θεραπεία για την αναστολή εγκατεστημένος πρωτογενείς όγκους και μετάσταση, καθώς και την παράταση της επιβίωσης. Η αύξηση της θεραπευτικής αποτελεσματικότητας οφείλεται σε επιδράσεις που σημειώθηκαν τοπικά (ενισχυμένα επίπεδα FAS και της έκφρασης της κασπάσης-3) και συστημικά (αυξημένη παραγωγή ΙΡΝ-γ και IL-12). Ως εκ τούτου, η χρήση της τριπλής θεραπείας συνδυασμού μπορεί να έχει επιπτώσεις σε συμπαγή όγκο και μετάσταση θεραπεία.

Υλικά και Μέθοδοι

Ποντίκια

Η Κριτική Επιτροπή Θεσμικών για την φροντίδα των ζώων και Χρήση σε Dong-A Πανεπιστήμιο εγκριθεί ειδικά αυτή τη μελέτη (ID έγκρισης: DIACUC 6.7). ποντικοί Balb /c (αρσενικών, ηλικίας 6-8 εβδομάδων) λήφθηκαν από το Jackson Laboratory

Κυτταρική καλλιέργεια και υλικό

CT-26 κύτταρα (CRL-2638?. ATCC American Type Culture Collection ) είναι μια κυτταρική γραμμή αδενοκαρκινώματος κόλου που προέρχονται από ποντικούς Balb /c. CT-26 κύτταρα διατηρήθηκαν σε RPMI 1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA) που περιέχει 10% θερμο-απενεργοποιημένο ορό εμβρύου βοός και αντιβιοτικά στους 37 ° C σε ένα 5% CO

2 υγροποιημένο επωαστήρα. Το συνθετικό πεπτίδιο, WKYMVm, συντέθηκε σε Anygen (Kwangju, την Κορέα). Η καθαρότητα των συντίθεται WKYMVm ήταν & gt? 98%. 5-FU αγοράστηκε από Choongwae, Pharma Co. (Σεούλ, Κορέα).

DC προετοιμασία και ωρίμανση

κύτταρα του μυελού των οστών καλλιεργήθηκαν για 5 ημέρες σε μέσο DC (RPMI 1640 με 10 % FBS, 2 mM Ε-γλουταμίνη, 50 μΜ β-μερκαπτοαιθανόλη, αντιβιοτικά) παρουσία του GM-CSF ποντικού (1000 U /ml) και IL-4 (500 U /ml), όπως περιγράφεται [34]. GM-CSF και IL-4 ήταν αναπληρώνονται την ημέρα 2 και 4. Την ημέρα 5, τα κύτταρα συλλέχθηκαν και μεταφέρθηκαν πάνω σε μια νέα πλάκα με μέσο DC και διεγείρονται με λιποπολυσακχαρίτη (100 ng /ml? Sigma), CpG ολιγοδεοξυνουκλεοτίδιο 1826 (10 μg /ml), και CT-26 λύμα (100 μg /ml) επί 2 ημέρες για να προκληθεί ωρίμανση. Την ημέρα 7, DCs συλλέχθηκαν για χρήση ως εμβόλια.

Η ανάπτυξη του όγκου και η επιβίωση

Για τη μέτρηση της ανάπτυξης του όγκου, κύτταρα CT-26 (5 × 10

5 κύτταρα σε 100 μΙ PBS) εγχύθηκαν υποδορίως στο δεξί πλευρό των ποντικών Balb /c (n = 8) την ημέρα -3. Τις ημέρες 0 και 1, 5-FU (100 μg /100 μΐ) εγχύθηκε s.c. σε ποντικούς Balb /c. Την ημέρα 2, τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε αγωγή με τέσσερις ενέσεις WKYMVm (100 μg /100 μΐ) και mDCs (1 × 10

6 κύτταρα) στις 12 h-διαστήματα. Τις ημέρες 4 και 5, 5-FU (100 μg /100 μΐ) εγχύθηκε s.c. σε ποντικούς Balb /c. Στη συνέχεια, τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε αγωγή με s.c. ένεση 5-FU, mDCs και WKYMVm μία φορά την εβδομάδα για 4 εβδομάδες. Ο όγκος του όγκου προσδιορίστηκε με τον ακόλουθο τύπο: όγκοι του όγκου (σε mm

3) = μήκος (mm) χ πλάτος (mm)

2/2 [35]. Εκτός από την ανάπτυξη του όγκου παρακολούθησης, οι ποντικοί παρατηρήθηκαν για επιβίωση μετά τον εμβολιασμό του όγκου και τη θεραπεία.

αιματοξυλίνη και ηωσίνη και χρώση ανοσοφθορισμού

Τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε ευθανασία 42 ημέρες μετά τον εμβολιασμό του όγκου, και οι όγκοι αποκόπηκαν χειρουργικά , σταθερό για 24 ώρες σε 10% ρυθμισμένη φορμαλίνη ουδέτερου φωσφορικού (NBF), ενσωματωμένο σε παραφίνη, και τεμαχίστηκαν και χρωματίστηκαν με αιματοξυλίνη και ηωσίνη για μορφολογική ανάλυση. Για ανοσοκηλίδωση, χρησιμοποιήθηκαν τα ακόλουθα πρωτογενή αντισώματα: αντι-ποντικού Fas (Santa Cruz), αντι-ποντικού διασπασμένη κασπάση 3 (Cell Signaling), συζευγμένο με FITC αντι-ποντικού CD3 (BD ​​Pharmingen), ΡΕ-συζευγμένο αντι-ποντικού CD4 (BD Pharmingen), ΡΕ-συζευγμένο αντι-ποντικού CD8 (BD Pharmingen), ΡΙΤΟ-συζευγμένο αντι- ποντικού CD11b (BD Pharmingen), και αντι- DX5 ποντικού (BD Pharmingen) αντίσωμα συζευγμένο με ΡΕ. Για συνεστιακή μικροσκοπία, σταθερό ιστούς όγκων χρωματίστηκαν με ΡΙΤΟ-συζευγμένο αντι-ποντικού IgG και Alexa 594-συζευγμένη αντι-ποντικού IgG (BD Pharmingen).

Επί τόπου

TUNEL χρώση

τερματικό δεοξυ-νουκλεοτιδυλο τρανσφεράση μεσολάβηση διγοξιγενίνη dUTP nick τέλος επισήμανση (TUNEL) διεξήχθη για την ανίχνευση αποπτωτικών κυττάρων στους ιστούς του όγκου. τομές παραφίνης αποπαραφινοποιήθηκαν, ενυδατωμένο, υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 3% Η

2O

2 για 5 λεπτά, και ξεπλένονται με PBS για 15 λεπτά, και το

Επί τόπου

Death Detection Kit, POD, χρησιμοποιήθηκε (Roche, Penzberg, Γερμανία). Εν συντομία, διγοξιγενίνη dUTP άκρο σημασμένο DNA ανιχνεύθηκε με αντι-διγοξιγενίνη-υπεροξειδάση αντίσωμα που ακολουθείται από ανίχνευση υπεροξειδάσης με διαμινοβενζιδίνη (DAB). Οι ιστοί με αιματοξυλίνη Mayer του.

Ένζυμο-συνδεδεμένη ανοσορροφητική δοκιμασία (ELISA)

Την ημέρα 42, αίμα συλλέχθηκε από την καρδιά των ποντικιών και διαυγάζεται με φυγοκέντρηση. Ο ορός αποθηκεύεται στους -80 ° C μέχρι να είναι έτοιμο για ανάλυση κυτοκίνης. IL-12 (p70) και IFN-γ συγκεντρώσεις μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα τυποποιημένο σάντουιτς μέθοδος ELISA (BD Biosciences Pharmingen).

In vivo

υποσυνόλου ανοσοκυττάρων εξάντληση

για να καταστρέφουν CD4, CD8 Τ κύτταρα και ΝΚ κύτταρα, τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε αγωγή με το αντίστοιχο αντίσωμα κατά τις ημέρες -1, 0, και 5 (όπου ημέρα 0 είναι η ημέρα της πρωτογενούς τον εμβολιασμό του όγκου). Χρησιμοποιήθηκαν Το μονοκλωνικό αρουραίου αντι-ποντικού CD4 (GK1.5 κλώνος), αρουραίου αντι-ποντικού CD8 (κλώνος 53-6.7) και αντι-ποντικού αρουραίου asialoGM1 αντισωμάτων για ανοσοεξάντληση. Στις μελέτες απομακρύνσεως λευκοκυττάρων, 100 μα αντι-CD4, αντι-CD8, ή αντίσωμα αντι-asialoGM1 εγχύθηκε ί.ρ. σε ποντικούς Balb /c.

μετάσταση στους πνεύμονες

Για την ετεροτοπική πείραμα μετάσταση πνεύμονα, κύτταρα CT-26 (5 × 10

5 κύτταρα σε 100 μΙ PBS) εγχύθηκαν υποδορίως στο δεξί πλευρό των ποντικών Balb /c (n = 8) την ημέρα -3. 5-FU, WKYMVm, και mDCs χορηγήθηκαν για 3 εβδομάδες, όπως περιγράφεται παραπάνω για το πείραμα για τη μέτρηση του όγκου του όγκου. Την ημέρα 42, ποντικοί θυσιάστηκαν και παρατηρήθηκαν οζίδια όγκων στην επιφάνεια των πνευμόνων. Για το πείραμα της μεταστατικό καρκίνο ζώο, CT-26 κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές με PBS, και εγχύθηκαν στην ουραία φλέβα ποντικών Balb /c (2 χ 10

5 κύτταρα σε 100 μΙ PBS). Μετά από 14 ημέρες, τα ποντίκια θυσιάστηκαν και ο πνεύμονας ζυγίστηκε.

θετή μεταφορά

Για να ληφθεί CT26 όγκου-αντιδρώντα CD8 Τ κυττάρων, τα ποντίκια Balb /c ανοσοποιήθηκαν τρεις φορές (σε 1-εβδομάδα διαστήματα) με 1 × 10

7 CT26 λύματα όγκου (υποδόρια ένεση). Στις 21 μέρα, ανοσοποιημένοι ποντικοί θυσιάστηκαν, και CD8 Τ κύτταρα ή ΝΚ κύτταρα απομονώθηκαν χρησιμοποιώντας CD8 Τ κιτ απομόνωσης κυττάρων ή ΝΚ κιτ απομόνωσης κυττάρων (Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach, Γερμανία) από σπλήνα τους. Για θετή θεραπεία, οι όγκοι συστάθηκε με υποδόρια ένεση 5 × 10

6 καρκινικά κύτταρα CT26 στο δεξί πλευρό των ποντικών Balb /c. Ψηλαφητών όγκων (~ 5 mm σε διάμετρο) που σχηματίζονται συνήθως στο σημείο της ένεσης μετά από 4 έως 5 ημέρες. Πριν από τριπλή συνδυασμένη θεραπεία, καθαρισμένο CD8 Τ (1 × 10

6/100 μl κυττάρων) κύτταρα ή ΝΚ (1 × 10

6 κυττάρων /100 μΙ) κύτταρα μεταφέρονται (ενδοφλέβια ένεση) σε ποντίκια με όγκο φορτωμένο CT26 και στη συνέχεια να αρχίσει με τριπλή συνδυασμένη θεραπεία.

οι ανάλυση δεδομένων

αποτελέσματα παρουσιάζονται ως η μέση τιμή ± SEM των επαναλαμβανόμενων πειραμάτων. Η στατιστική σημαντικότητα των διαφορών προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας ANOVA. Τα δεδομένα επιβίωσης αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το τεστ log-rank.

P

& lt?.. 0.05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική

Ευχαριστίες

Σας ευχαριστούμε Δρ Min Sung Choi του Πανεπιστημίου Sungkyunkwan για συντακτική βοήθεια