Αφηρημένο

SLD5 είναι μέλος του συγκροτήματος εκκοκκιστήρια που αποτελείται από PSF1, PSF2, PSF3 και SLD5, παίζει έναν κρίσιμο ρόλο στη διαμόρφωση της διχάλα αντιγραφής του DNA με CDC45 στις ζύμες. Προηγουμένως, είχαμε απομονώσει έναν ορθόλογο PSF1 από μια βιβλιοθήκη αιμοποιητικών βλαστικών κυττάρων DNA ποντικού και ήταν τότε σε θέση να προσδιορίσει ορθόλογα από όλα τα άλλα μέλη εκκοκκιστήρια από τον ζυμομύκητα δυο υβριδίων προσέγγιση χρησιμοποιώντας PSF1 ως δόλωμα. Αυτά τα εκκοκκιστήρια ορθόλογα μπορεί επίσης να λειτουργεί στην αντιγραφή του DNA σε κύτταρα θηλαστικών επειδή αποτελούν τετραμερή σύμπλοκα όπως παρατηρήθηκε σε ζυμομύκητες, και μεταλλάγματα διαγραφής γονιδίου τόσο PSF1 και SLD5 αποτέλεσμα την έλλειψη πολλαπλασιασμού επιβλάστιο και την πρώιμη εμβρυϊκή θνησιμότητα. Ωστόσο, βρήκαμε ότι PSF1 εμπλέκεται επίσης σε χρωμοσωμικό διαχωρισμό σε φάση Μ, σύμφωνα με τις πρόσφατες προτάσεις που ομόλογα των γονιδίων που σχετίζονται με την αντιγραφή του DNA σε κατώτερους οργανισμούς ρυθμίζουν επίσης κυτταρικά γεγονότα εκτός αντιγραφή του DNA σε κύτταρα θηλαστικών. Εδώ αναλύσαμε την λειτουργία του SLD5 πλην αντιγραφή του DNA και διαπίστωσε ότι είναι ενεργός σε βλάβη του DNA και την επισκευή. Εξασθένηση των SLD5 αποτελέσματα έκφρασης σε αξιοσημείωτη βλάβη στο DNA και σε φυσιολογικά κύτταρα και καρκινικά κύτταρα, υποδηλώνοντας ότι προστατεύει από βλάβη του DNA. Εξασθένηση της SLD5 καθυστερεί την απόκριση επιδιόρθωσης του DNA και την αποκατάσταση του κυτταρικού κύκλου στα φυσιολογικά κύτταρα, αλλά όχι σε καρκινικά κύτταρα. Αυτά τα ευρήματα υποδηλώνουν ότι SLD5 θα μπορούσε να αντιπροσωπεύει ένα θεραπευτικό μόριο-στόχο που ενεργεί στο επίπεδο των στρωματικών κυττάρων του όγκου και όχι των ίδιων των καρκινικών κυττάρων, επειδή ανάπτυξη της μικροπεριβάλλον του όγκου θα μπορούσε να καθυστερήσει ή να διαταράσσεται από την καταστολή της έκφρασης του στις κανονικές τύπους κυττάρων εντός της όγκου

Παράθεση:. Γκονγκ ZY, Kidoya η Mohri Τ, Han Υ, Takakura Ν (2014) Βλάβη DNA Ενισχυμένη από την εξασθένηση της SLD5 Καθυστερήσεις κυτταρικού κύκλου Αποκατάσταση σε φυσιολογικά κύτταρα αλλά όχι στα καρκινικά κύτταρα. PLoS ONE 9 (10): e110483. doi: 10.1371 /journal.pone.0110483

Επιμέλεια: Ryuichi Morishita, Osaka University Graduate School of Medicine, Ιαπωνία

Ελήφθη: 12 Αύγ του 2014? Αποδεκτές: 15 του Σεπτέμβρη 2014? Δημοσιεύθηκε: 21 Οκτωβρίου του 2014

Copyright: © 2014 Gong et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Η συγγραφείς επιβεβαιώνουν ότι όλα τα δεδομένα που διέπουν τα ευρήματα είναι πλήρως διαθέσιμα χωρίς περιορισμούς. Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του χαρτιού

Χρηματοδότηση:. Η εργασία αυτή χρηματοδοτήθηκε από το Υπουργείο Παιδείας, Πολιτισμού, Αθλητισμού, Επιστημών και Τεχνολογίας και επιχορηγήσεις-in-Ενισχύσεις για την Επιστημονική Έρευνα (KAKENHI) Ιάπωνες από την Ιαπωνία Εταιρεία την προώθηση της επιστήμης. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Nobuyuki Takakura είναι τώρα ένας ακαδημαϊκός συντάκτης του περιοδικού. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων να PLoS ONE Editorial πολιτικές και κριτήρια.

Εισαγωγή

Τα κύτταρα εκτίθενται συνεχώς σε γονιδιωματική βλάβη στο DNA που προκαλούνται από εσωτερικούς και εξωτερικούς παράγοντες, όπως το οξειδωτικό στρες και την υπεριώδη ακτινοβολία, αντίστοιχα. Λάθη στην επιδιόρθωση της βλάβης του DNA μπορεί να οδηγήσει σε ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων [1], [2]. Για την πρόληψη ογκογόνο μετασχηματισμό, τα φυσιολογικά κύτταρα παρακολουθεί και επισκευή βλάβης του DNA στο γονιδίωμα τους θέτοντας σημεία ελέγχου του κυτταρικού κύκλου [3]. Ωστόσο, τα καρκινικά κύτταρα είναι ικανά να ανεχθούν βλάβη του DNA, έτσι ώστε αντιγραφή συνεχίζεται χωρίς επιδιόρθωση, με αποτέλεσμα τη συσσώρευση του ανώμαλη έκφραση μεταλλαγμένου γονιδίου [4]. Αυτό το γεγονός έχει προταθεί ως μια από τις αιτίες της χημειοθεραπείας και ραδιο-αντίσταση ανάπτυξης σε κακοήθη καρκινικά κύτταρα.

SLD5 είναι μέλος του συγκροτήματος εκκοκκιστήρια που αποτελείται από PSF1, PSF2 και PSF3. Αυτό το σύμπλοκο ρυθμίζει την διχάλα αντιγραφής του DNA σε εκκολαπτόμενους μαγιά [5]. Στην έναρξη της αντιγραφής του DNA, το σύμπλοκο αναγνώριση προέλευσης (ORC) συνδέεται με το αυτόνομα αντιγραφόμενη ακολουθία (ARS) που λειτουργεί ως τομέας εκκίνηση της αντιγραφής του DNA. Στη συνέχεια, τον κύκλο κυτταρικής διαίρεσης (CDC) 6 και cdc1 συνδέονται με ARS καθοδηγείται από το ORC και να προκαλέσει τη δέσμευση της συντήρησης μίνι-χρωμόσωμα (ΕΚΜ), πρωτεΐνες πάνω ARS. Αυτά ονομάζονται συμπλέγματα προ-αντιγραφής (pre-RC) [6] – [8]. Περαιτέρω, Cdc45 και εκκοκκιστήρια προσλαμβάνονται σε προ-RC και σχηματίζουν ενεργοποιηθεί CMG (Cdc45-MCM-Τζιν) ελικάση στη διχάλα αντιγραφής του DNA [9] – [12].

Εντοπίσαμε ένα ορθόλογο ποντικού του PSF1 σε μια βιβλιοθήκη DNA που προέρχεται από αιμοποιητικά βλαστικά κύτταρα κατά τη διάρκεια της εμβρυογένεσης στα οποία ο πληθυσμός των κυττάρων πολλαπλασιάζονται ενεργά [13]. Στη συνέχεια, προσδιορίσαμε SLD5 χρησιμοποιώντας μια δύο-υβριδίων ζυμομύκητα σύστημα με PSF1 ως δόλωμα [14]. Επιπλέον, προσδιορίσαμε όλα τα μέλη του τζιν σε ποντίκια και επιβεβαίωσαν ότι σχηματίζουν σύμπλοκα όπως παρατηρείται σε ζυμομύκητες [15]. Αναφέραμε προηγουμένως ότι ποντίκια με ανεπάρκεια μεταλλαγμένο για PSF1 ή SLD5 παρουσιάζουν πρώιμα εμβρυϊκά θνησιμότητα που προκαλείται από την αύξηση σύλληψη epiblasts σε εμβρυϊκή ημέρα 6.5 [13], [16]. Αυτά τα ευρήματα υποδεικνύουν ότι PSF1 και SLD5 είναι λειτουργικά στα θηλαστικά και είναι ουσιώδης για τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, πιθανώς συνδυασμού με αντιγραφή του DNA όπως παρατηρείται σε ζυμομύκητες.

υψηλή έκφραση γονιδίων εκκοκκιστήρια έχει παρατηρηθεί σε καρκίνους και συσχέτιση του επιπέδου του έκφραση με κακοήθεια έχει προταθεί [17] – [19]. Επίσης ανέφεραν ότι τα καρκινικά κύτταρα που δείχνουν δραστικότητα προαγωγέα υψηλότερες PSF1 είναι κίνησης του καρκίνου /κυττάρων σε ένα μοντέλο ποντικού μεταμόσχευσης των καρκινικών κυττάρων [20] βλαστικά. Ένα χαρακτηριστικό των κακοήθων καρκινικών κυττάρων είναι χημειοθεραπεία και ραδιο-αντίσταση. Υψηλού επιπέδου έκφραση των γονιδίων τζιν μπορεί να προκαλέσει όχι μόνο την ανάπτυξη των κυττάρων, αλλά και την αντίσταση στη χημειοθεραπεία. Ωστόσο, δεν έχει καθοριστεί αν η λειτουργία των γονιδίων εκκοκκιστήρια εμπλέκεται σε βλάβη ή επιδιόρθωση του DNA. Παρατηρώντας κυτταρικότητα του μυελού των οστών σε μεταλλαγμένα ποντίκια, έχουμε βρει προηγουμένως ότι απλοανεπάρκεια του PSF1, αλλά όχι SLD5, μειώνει την κυτταρική ανάπτυξη [13], [16]. Ως εκ τούτου, είναι περίπλοκο να αναλυθεί η λειτουργία των PSF1 σε βλάβες του DNA με να χτυπήσει κάτω έκφραση PSF1 επειδή η ίδια η κυτταρική ανάπτυξη επηρεάζεται επίσης από την έλλειψη του παράγοντα αυτού. Σε περίπτωση SLD5, ετερόζυγη SLD5

+/- ποντίκια, τα οποία ήταν υγιή και γόνιμα, γεννήθηκαν σε Μέντελ συχνότητα και παρουσίασαν φυσιολογική ανάπτυξη. Επιπλέον, δεν υπάρχει μεγάλη διαφορά κυτταροβρίθεια του μυελού των οστών μεταξύ άγριων και SLD5

+/- ποντίκια [16]. Ως εκ τούτου, χρησιμοποιήσαμε SLD5

+/- ποντίκι εμβρυϊκών ινοβλαστών (ΠΜΑ) για την ανάλυση του DNA αποκατάστασης των ζημιών και την ανάπτυξη των κυττάρων μετά από βλάβη του DNA. Επιπλέον, σε σύγκριση με τη λειτουργία των SLD5 στην επιδιόρθωση βλαβών του DNA χρησιμοποιώντας πειράματα knock-down siRNA στα καρκινικά κύτταρα.

Υλικά και Μέθοδοι

κυτταρικής καλλιέργειας και επεξεργασίας των ναρκωτικών

ΠΜΑ, Β16 κύτταρα (κύτταρα μελανώματος ποντικού), και τα κύτταρα colon26 (καρκίνος του παχέος εντέρου ποντικού κύτταρα) αναπτύχθηκαν σε μέσο Eagle τροποποιημένο κατά Dulbecco (ϋΜΕΜ) (Sigma) με 10% ορό εμβρύου βοός (FBS? Sigma), και πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη (Sigma) σε 37 ° C υπό ατμόσφαιρα 5% CO

2. Οι MEF παρασκευάστηκαν από άγριου τύπου (WT) ή SLD5

+/- ποντίκια σε εμβρυϊκή ημέρα (Ε) 15,5, σύμφωνα με τη συνήθη μέθοδο [16]. Β16 κύτταρα και τα κύτταρα colon26 αγοράστηκαν από την τράπεζα κυττάρων Riken (Tsukuba, Japan). Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή με 1 μΜ ή 10 μΜ ετοποσίδη (Sigma). Για να προκληθεί βλάβη στο DNA έντονα, χρησιμοποιήσαμε 10 μΜ ετοποσίδη. Ωστόσο, 10 μΜ ετοποσίδη επάγεται σοβαρά κυτταρικής απόπτωσης. Ως εκ τούτου, χρησιμοποιήσαμε 1 μΜ ετοποσίδη να παρατηρήσουν την αποκατάσταση του κυτταρικού κύκλου. Τα ζώα στεγάστηκαν σε περιβαλλοντικά ελεγχόμενες δωμάτια της εγκατάστασης πειραμάτων σε ζώα στο Πανεπιστήμιο Οσάκα. Όλα τα πειράματα διεξήχθησαν σύμφωνα με τους ισχύοντες νόμους και τις κατευθυντήριες γραμμές για τη φροντίδα και τη χρήση των πειραματόζωων στο Ινστιτούτο Έρευνας για μικροβιακών ασθενειών, του Πανεπιστημίου της Οσάκα, το οποίο εγκρίθηκε από την επιτροπή των ζώων Πείραμα του Ινστιτούτου Έρευνας για Μικροβιακή Νόσων, Πανεπιστήμιο Οσάκα (αριθμός αδείας 3239- 6). Όλες οι χειρουργικές επεμβάσεις έγινε υπό αναισθησία πεντοβαρβιτάλης νατρίου, και όλες οι προσπάθειες έγιναν για να ελαχιστοποιήσουν την ταλαιπωρία.

siRNA επιμόλυνση

έκφραση SLD5 στα κύτταρα Β16 και Colon26 ήταν παροδικά γκρέμισε με μικρό παρεμβαλλόμενο RNA (siRNA) . Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen) χρησιμοποιήθηκε για την επιμόλυνση του πλασμιδίου και siRNA σε κύτταρα, ακολουθώντας τα πρωτόκολλα των κατασκευαστών, και τα πειράματα έγιναν 48 ώρες μετά την επιμόλυνση. Χρησιμοποιήσαμε δύο διαφορετικά siRNA ολιγονουκλεοτίδια ειδικά για SLD5? στόχου siRNA αλληλουχίες ήταν: 5′-GGA CCA CAC GGA GAC CCA CUU ΧΓΕ Α-3 ‘(# 1)? 5’-GAU GAG CAG AGA GAC UAC GUG AUU G-3 ‘(# 2).

μπλε Τρυπάνης δοκιμασία αποκλεισμού για τη βιωσιμότητα των κυττάρων και την αναγέννηση μετά από θεραπεία με ετοποσίδη

5 × 10

3 κύτταρα σπάρθηκαν σε κάθε φρεάτιο μιας πλάκας καλλιέργειας 24 φρεατίων (Βϋ Falcon) σε 500 μΙ μέσου. Μετά από 24 ώρες, τα φρεάτια εκτέθηκαν σε 1 μΜ ετοποσίδη για 12 ώρες. Αφού το φάρμακο απομακρύνθηκε, τα κύτταρα συλλέχθηκαν αμέσως (0 ώρες). Η βιωσιμότητα των κυττάρων εκτιμήθηκε με αποκλεισμό trypan blue. Ο ίδιος αριθμός ζωντανών κυττάρων επαναιωρήθηκε σε φρέσκο ​​μέσο, ​​και τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν για 24, 48 ή 72 ώρες. Στη συνέχεια αποσπάται με την προσθήκη 100 μΙ θρυψίνης-ΕϋΤΑ σε κάθε φρεάτιο? κύτταρα στη συνέχεια πλύθηκαν και επανα-αιωρήθηκαν σε 400 μΐ μέσου. 20 μΐ εκ νέου αιωρούμενα κύτταρα αναμείχθηκαν με 20 μΐ διαλύματος 0.4% κυανού τρυπανίου χρωστικής (Life Technologies) για 1 λεπτό. Τα κύτταρα αμέσως μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα μικροθάλαμο Neubauer με ένα μικροσκόπιο φωτός. Όλες οι μετρήσεις έγιναν χρησιμοποιώντας τέσσερις τεχνικές αντίγραφα του κάθε δείγματος. Μέσα και πρότυπες αποκλίσεις υπολογίστηκαν για κάθε υποκαλλιέργεια.

κηλίδωση Western

Τα κύτταρα συλλέχθηκαν και λύθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα δείγματος SDS (50 mM Tris-HCL, ρΗ 6.8, 2% δωδεκυλοθειικό νάτριο, 6 % 2-μερκαπτοαιθανόλη, 10% γλυκερίνη, 0,003% βρωμοφαινόλη μπλε) που περιέχει ένα κοκτέιλ από αναστολείς πρωτεάσης. Οι πρωτεΐνες διαχωρίστηκαν σε 10% ή 15% SDS-PAGE και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες PVDF. Μετά τον αποκλεισμό για 1 ώρα σε TBST (25 mM Tris, ρΗ 7.5, 1.37 Μ NaCl, 27 mM ΚΟΙ, 0,05% Tween20) που περιέχει 2% άπαχο ξηρό γάλα, οι μεμβράνες επωάστηκαν με αντι-SLD5 (1:1000? Iwaki) , αντι-γ-Η2ΑΧ (1:500? Cell Signaling), αντι-Rad51 (H-92? 1:1000? Santa Cruz), ή ποντικού αντι-β-ακτίνης αντίσωμα σε ρυθμιστικό δέσμευσης για όλη τη νύχτα. Οι μεμβράνες στη συνέχεια πλύθηκαν με TBST και επωάστηκαν με συζευγμένο με HRP αντι-αρουραίου, κουνελιού ή αίγας αντισώματα (1:10000) για 1 ώρα. Τα δεσμευμένα αντισώματα ανιχνεύθηκαν με κιτ ECL (Amersham). Οι ανοσοαντιδραστικές πρωτεΐνες οπτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας το σύστημα ECL Detection Prime Western Blotting (GE Healthcare, Buckinghamshire). Τα στυπώματα σαρώθηκαν με τη χρήση του πυκνόμετρου απεικόνισης Las-300 mini (Fujifilm, Tokyo, Japan).

Στατιστική Ανάλυση

Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέση τιμή ± SD.

t

δοκιμή Student χρησιμοποιήθηκε για τη στατιστική ανάλυση. Οι διαφορές θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές όταν

σ

& lt?. 0.05

Αποτελέσματα

Ενισχυμένη βλάβες του DNA από την εξασθένηση της έκφρασης SLD5 σε ΠΜΑ

Για να εκτιμηθεί κατά πόσον SLD5 αφορά την ανταπόκριση βλάβη του DNA, συγκρίναμε τη διαφορά μεταξύ της βλάβης του DNA χρησιμοποιώντας ΠΜΑ από ποντίκια WT και SLD5

+/- ποντίκια [16]. Επιβεβαιώσαμε ότι το επίπεδο των SLD5 σε SLD5

+/- ΠΜΑ ήταν περίπου το μισό από αυτό το WT ΠΜΑ (Εικόνα 1Α και Β). Για να διερευνήσουν βλάβη του DNA, έχουμε προκλήθηκαν ΠΜΑ με ετοποσίδη, έναν αναστολέα τοποϊσομεράσης Π που επάγει DNA δίκλωνα σπασίματα [21], [22]. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 0,01% DMSO σαν ένας έλεγχος ή με 10 μΜ ετοποσίδη για 1 ώρα. Στην σταθερή κατάσταση (έκθεση σε DMSO), το επίπεδο της φωσφορυλίωσης της χρωματίνης δεσμευμένου ιστόνης Η2ΑΧ (γ-Η2ΑΧ), το οποίο είναι ένα ποσοτικό δείκτη για την απόκριση βλάβης DNA στη θέση δίκλωνα σπασίματα [23], [ ,,,0],24], ήταν ομοίως χαμηλό τόσο WT και SLD5

+/- ΠΜΑ (Εικόνα 1C και D). Η έκθεση σε ετοποσίδη οδήγησε σε αύξηση του επιπέδου της γ-Η2ΑΧ τόσο WT και SLD5

+/- ΠΜΑ, αλλά σημαντικά περισσότερο στην τελευταία (Σχήμα 1 C και D).

(Α) ανάλυση Western blot της έκφρασης SLD5 στο WT και SLD5

+/- ΠΜΑ. β-ακτίνη ήταν ο εσωτερικός έλεγχος. (Β) Ποσοτική εκτίμηση της έκφρασης SLD5 όπως αποκαλύπτεται στο (Α) με βάση την πυκνομετρική ανάλυση. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως πολλαπλή μεταβολή σε σύγκριση με το επίπεδο που σημειώθηκε στο WT ΠΜΑ. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± SD. *,

P

& lt? 0,05 (n = 3). (C) Ανάλυση Western blot της έκφρασης γ-Η2ΑΧ σε WT και SLD5

+/- Οι MEF μετά από θεραπεία με ετοποσίδη (ΕΤΟ) ή φορέα ελέγχου (DMSO). β-ακτίνη ήταν ο εσωτερικός έλεγχος. (Δ) Ποσοτική αξιολόγηση της έκφρασης γ-Η2ΑΧ όπως αποκαλύπτεται στο (C). Τα αποτελέσματα είναι πτυσσόμενα μεταβολές σε σύγκριση με το επίπεδο φαίνεται στο WT ΠΜΑ που έλαβαν θεραπεία με DMSO. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± SD. *,

P

& lt?. 0.05 (n = 3)

Η

Καθυστέρηση της αποκατάστασης του κυτταρικού κύκλου από την εξασθένηση της έκφρασης SLD5 στην ΠΜΑ μετά από βλάβη του DNA

Για να διαλεύκανση αν σημειώνονται βλάβες του DNA που προκαλείται από την εξασθένηση της έκφρασης SLD5 αναφέρεται σε επιδιόρθωση της βλάβης του DNA, μετρήσαμε το επίπεδο της Rad51 πρωτεΐνη, η οποία είναι το βασικό συστατικό για ομόλογο ανασυνδυασμό [25]. Όπως περιγράφεται παραπάνω, Οι MEF υποβλήθηκαν σε αγωγή με 1 μΜ ετοποσίδη για 12 ώρες, και η έκφραση της πρωτεΐνης Rad51 στη συνέχεια αναλύθηκε στις 0, 24, 48 και 72 ώρες μετά την απομάκρυνση του (Σχήμα 2Α, Β). Το επίπεδο της έκφρασης Rad51 ήταν ισοδύναμη με WT και SLD5

+/- ΠΜΑ πριν από τη θεραπεία με ετοποσίδη. Σε WT Οι MEF, το επίπεδο της Rad51 αυξήθηκε σημαντικά ταχέως μετά έκθεση σε ετοποσίδη, αλλά σε μικρότερο βαθμό στην SLD5

+/- ΠΜΑ, και σταδιακά μειώθηκε σε 24, 48 ώρες, σχεδόν επιστρέφοντας στην αρχική της σε 72 ώρες. Σε αντίθεση, Rad51 πρωτεΐνης σε SLD5

+/- ΠΜΑ αυξήθηκε πιο αργά από ό, τι WT ΠΜΑ και διατηρήθηκε για μεγαλύτερο χρονικό διάστημα. Αυτό υποδηλώνει ότι ένα μεγαλύτερο χρονικό διάστημα απαιτείται για την επιδιόρθωση του DNA μετά από εκτεταμένη βλάβη στο DNA SLD5

+/- ΠΜΑ. Παρατεταμένο χρόνο επιδιόρθωση του DNA στα SLD5

+/- ΠΜΑ με τη σειρά του δείχνει καθυστερημένη αποκατάσταση του κυτταρικού κύκλου μετά από βλάβη του DNA. Ως εκ τούτου, μετρήθηκε ο αριθμός των βιώσιμων κυττάρων μετά την αγωγή με ετοποσίδη, όπως περιγράφεται παραπάνω. Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων προσδιορίστηκε με την trypan blue δοκιμή αποκλεισμού. Δεν υπήρχε σημαντική διαφορά μεταξύ WT και SLD5

+/- MEF πολλαπλασιασμός μετά την έκθεση στον έλεγχο DMSO (Σχήμα 3Α), υποδηλώνοντας ότι η έκφραση διχοτομημένα SLD5 σε ΠΜΑ δεν επηρεάζει το ίδιο κυτταρική ανάπτυξη. Αντιθέτως, κατά την έκθεση σε ετοποσίδη, SLD5

+/- ΠΜΑ εμφανίζεται σημαντικά καθυστερημένη ανάπτυξη των κυττάρων σε σύγκριση με την WT ΠΜΑ (Σχήμα 3Β).

(Α) ανάλυση Western blot της έκφρασης Rad51 σε WT και SLD5

+/- ΠΜΑ. β-ακτίνη ήταν ο εσωτερικός έλεγχος. Οι MEF υποβλήθηκαν σε αγωγή με ετοποσίδη για 12 h (-12~0) και λύθηκαν στους χρόνους που υποδεικνύονται. (Β) Ποσοτική εκτίμηση της έκφρασης Rad51 όπως αποκαλύπτεται στο (Α) με βάση την πυκνομετρική ανάλυση. Τα αποτελέσματα είναι πολλαπλή μεταβολή σε σύγκριση με το επίπεδο που σημειώθηκε σε αυτοφυείς πριν από τη θεραπεία με ετοποσίδη. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± SD *,

P

& lt?. 0.05 (n = 3)

Η

Οι MEF υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με DMSO (Α) ή ετοποσίδη (Β), όπως αναφέρεται στο. Εικόνα 2 και τον ίδιο αριθμό ζωντανών κυττάρων, όπως αναφέρεται καλλιεργήθηκαν με φρέσκο ​​μέσο για 72 ώρες. Τα κύτταρα μετρήθηκαν στον υποδεικνυόμενο χρόνο. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± SD. *,

P

& lt? 0,05 (n = 3)

Η

βλάβη του DNA ενισχύεται σε καρκινικά κύτταρα με την εξασθένηση της έκφρασης SLD5

Σε φυσιολογικά κύτταρα, όπως. ως ΠΜΑ, βλάβης του DNA ήταν έντονα επάγεται από την εξασθένηση της έκφρασης SLD5. Είμαστε δίπλα ελεγχθεί αν τα καρκινικά κύτταρα εμφανίζουν επίσης παρόμοιες απαντήσεις σε ετοποσίδη όταν εμποδίζεται η έκφραση SLD5. Για το σκοπό αυτό, η έκφραση SLD5 χτυπήθηκε κάτω σε κύτταρα μελανώματος Β16 του ποντικιού και καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα Colon26 ποντίκι με επιμόλυνση siRNA (# 1 και # 2) στρέφεται κατά SLD5 (siRNA Β16 και siRNA Colon26). Επιβεβαιώσαμε ότι η έκφραση SLD5 μπορούσε να σιγήσει αποτελεσματικά με ειδικές siRNA σε Β16 και Colon26 κύτταρα αλλά όχι με κωδικοποιημένα ελέγχου siRNA (SCR Β16 και SCR Colon26) (Σχήμα 4Α-D). Χρησιμοποιώντας αυτά τα κύτταρα, εμείς ποσοτικοποιηθεί βλάβη του DNA με μέτρηση του επιπέδου της γ-Η2ΑΧ με κηλίδωση Western. Μετά τη συντήρηση σε πλήρες μέσο για 48 ώρες, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με DMSO ως μάρτυρα ή 10 μΜ ετοποσίδης επί 0,5 ώρα. Το αρχικό επίπεδο έκφρασης γ-Η2ΑΧ δεν ήταν υψηλό ούτε SCR Β16 ή κύτταρα siRNA Β16 (Σχήμα 5Α, Β). Η έκθεση σε ετοποσίδη οδήγησε σε αυξημένο επίπεδο γ-Η2ΑΧ σε αμφότερες κύτταρα SCR Β16 και κύτταρα siRNA Β16, αλλά ήταν σημαντικά υψηλότερη στην τελευταία (Σχήμα 5Α, Β). Ομοίως, σε κύτταρα Colon26, η εξασθένηση της έκφρασης SLD5 ενισχυμένη βλάβη του DNA από ετοποσίδη (Σχήμα 5C, D). Στο σύνολό τους, καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι η έκφραση SLD5 σχετίζεται με βλάβη του DNA στα φυσιολογικά κύτταρα και καρκινικά κύτταρα.

Β16 ή Colon26 κύτταρα επιμολύνθηκαν με περιπλεγμένο αρνητικό μάρτυρα (SCR) ή SLD5 siRNAs (# 1, # 2) και συλλέχθηκαν 48 ώρες μετά την επιμόλυνση. τα επίπεδα έκφρασης πρωτεΐνης SLD5 σε Β16 (Α, Β) ή Colon26 (C, D) ποσοτικοποιήθηκαν με κηλίδωση Western. β-ακτίνη ήταν ο εσωτερικός έλεγχος. Τα δεδομένα ποσοτικά αξιολογείται με βάση την πυκνομετρική ανάλυση (Β, D). Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως πολλαπλή μεταβολή σε σύγκριση με το επίπεδο φαίνεται στο Β16 κύτταρα siRNA-αγωγή (Β) ή Colon26 κύτταρα (D), αντίστοιχα. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± SD *,

P

& lt?.. 0.05 (n = 3)

Η

ανάλυση Western blot της έκφρασης γ-H2AX στο SCR ή SLD5 siRNA επιμολυσμένα Β16 (Α, Β) ή Colon26 (C, D) κυττάρων μετά την αγωγή με ετοποσίδη (ΕΤΟ) ή φορέα ελέγχου (DMSO). β-ακτίνη ήταν ο εσωτερικός έλεγχος. Τα δεδομένα ποσοτικά αξιολογείται με βάση την πυκνομετρική ανάλυση (Β, D). Τα αποτελέσματα είναι πολλαπλή μεταβολή σε σύγκριση με το επίπεδο φαίνεται στο SCR siRNA επεξεργασμένα Β16 κύτταρα (Β) ή Colon26 κύτταρα (D), αντίστοιχα. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± SD. *,

P

& lt? 0,05 (n = 3)

Η

Εξασθένηση της έκφρασης SLD5 σε καρκινικά κύτταρα δεν καθυστερεί την αποκατάσταση του κυτταρικού κύκλου μετά από βλάβη του DNA

. προέβλεψε ότι η εξασθένηση της έκφρασης SLD5 θα καθυστερήσει επιδιόρθωση του DNA και αποκατάσταση του κυτταρικού κύκλου στα καρκινικά κύτταρα, όπως παρατηρείται σε φυσιολογικά κύτταρα. Ωστόσο, αν και το επίπεδο της έκφρασης Rad51 ήταν η ίδια σε κύτταρα SCR Β16 και SLD5 siRNA Β16, και σε κύτταρα SCR Colon26 και SLD5 siRNA Colon26 πριν από τη θεραπεία με ετοποσίδη, εν συνεχεία, η ταχεία αύξηση του Rad51 παρομοίως παρατηρήθηκε σε όλες τις τέσσερις κυτταρικές γραμμές ( Εικόνα 6Α-D). Που αντιστοιχεί στο σημειώνεται βλάβη του DNA στα κύτταρα siRNA Β16 και siRNA Colon26, παρατεταμένη υψηλό επίπεδο έκφρασης Rad51 παρατηρήθηκε σε αυτές τις γραμμές. Έτσι, μία παρατεταμένη περίοδο για την επιδιόρθωση του DNA ήταν κοινή σε φυσιολογικά κύτταρα και καρκινικά κύτταρα, αλλά η μειωμένη ταχεία απόκριση σε βλάβη του DNA που προκύπτει από εξασθένηση της έκφρασης SLD5 σε φυσιολογικά κύτταρα δεν παρατηρήθηκε σε καρκινικά κύτταρα.

SCR ή SLD5 siRNA επιμολυσμένα Β16 (Α, Β) ή Colon26 (C, D) κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ετοποσίδη για 12 h (-12~0). Τα κύτταρα λύθηκαν στους χρόνους που υποδεικνύονται. αναλύσεις στυπώματος Western της έκφρασης Rad51 δείχνεται. β-ακτίνη ήταν ο εσωτερικός έλεγχος. Τα δεδομένα ποσοτικά αξιολογήθηκαν με βάση την πυκνομετρική ανάλυση. Τα αποτελέσματα είναι πολλαπλή μεταβολή σε σύγκριση με το επίπεδο που σημειώθηκε στο SCR Β16 (Β) ή SCR Colon26 (D) πριν από τη θεραπεία με ετοποσίδη. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± SD *,

P

& lt?.. 0.05 (n = 3)

Η

Για να εκτιμηθεί πώς η ταχεία ανταπόκριση σε βλάβες του DNA σε SLD5 νοκ-κάτω τα καρκινικά κύτταρα επηρεάζει την αποκατάσταση του κυτταρικού κύκλου, έχουμε απαριθμούνται τα κύτταρα μετά την αγωγή με ετοποσίδη. ίδια κυττάρων πολλαπλασιασμός δεν επηρεάστηκε από χτυπήσει κάτω SLD5 σε κύτταρα είτε siRNA Β16 ή siRNA Colon26 παρουσία θεραπείας DMSO ελέγχου (Σχήμα 7Α, C). Σαράντα οκτώ ώρες μετά την ετοποσίδη μεσολάβηση βλάβες στο DNA, υπήρξε μόνο μικρή καθυστέρηση της αποκατάστασης του κυτταρικού κύκλου και στις δύο siRNA Β16 και siRNA Colon26 σε σχέση με αυτή που παρατηρήθηκε σε SCR Β16 και SCR Colon26. Ωστόσο, μετά από 72 ώρες, η κυτταρική ανάπτυξη προκλήθηκε σε SLD5-σιγήσει καρκινικά κύτταρα στον ίδιο βαθμό όπως στους ελέγχους και στα δύο κύτταρα Β16 και Colon26 (Σχήμα 7Β, D). Ως εκ τούτου, καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι οι εκτεταμένες βλάβες στο DNA που προκύπτουν από την εξασθένηση της έκφρασης SLD5 επηρεάζει σοβαρά την αποκατάσταση του κυτταρικού κύκλου σε κανονικό, αλλά δεν τα καρκινικά κύτταρα.

SCR ή SLD5 siRNA επιμολυσμένα Β16 (Α, Β) ή Colon26 (C, D κύτταρα) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με DMSO (A, C) ή ετοποσίδη (Β, D) όπως υποδεικνύεται στο Σχήμα 6 και τον ίδιο αριθμό ζωντανών κυττάρων, όπως αναφέρεται καλλιεργήθηκαν με φρέσκο ​​μέσο για 72 ώρες. Οι αριθμοί των κυττάρων καταγράφηκαν. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± SD *,

P

& lt?. 0.05 (n = 3)

Η

Συζήτηση

Έχει αναφερθεί ότι SLD5 σχηματίζει ένα τζιν. σύμπλοκο με άλλες χαρακτηριστικές ομάδες όπως PSF1, PSF2 και PSF3 και εμπλέκεται στην αντιγραφή του DNA σε ζυμομύκητες [5]. Στην παρούσα έκθεση, προτείνουμε ότι SLD5 συμμετέχει σε βλάβη του DNA και επιδιόρθωση σε κύτταρα θηλαστικών. Εξασθένηση της έκφρασης SLD5 οδήγησε σε σημαντική βλάβη του DNA από παράγοντες που προάγουν DNA διπλής διαλείμματα σκέλος? αυτό ήταν κοινή σε φυσιολογικά κύτταρα και καρκινικά κύτταρα. Μια μεγαλύτερη περίοδος που απαιτείται για την αποκατάσταση του κυτταρικού κύκλου, όταν βλάβες στο DNA ήταν εκτεταμένη. Για την απάντηση αυτή, τα κύτταρα πρέπει να ενισχυθεί η επιδιόρθωση του DNA. Όταν η έκφραση SLD5 μειώθηκε στα φυσιολογικά κύτταρα, η έκφραση του Rad51 καθυστέρησε, υποδηλώνοντας ότι SLD5 εμπλέκεται επίσης σε συσσωμάτωση πρωτείνης επιδιόρθωσης του DNA. Αντίθετα, η ταχεία Rad51 προκλήθηκε έκφραση σε καρκινικά κύτταρα μετά από βλάβη του DNA και την καθυστέρηση της αποκατάστασης του κυτταρικού κύκλου δεν ήταν τόσο σοβαρή όπως σε φυσιολογικά κύτταρα. Οι ρόλοι των γονιδίων εκκοκκιστήρια σε άλλους τύπους καρκίνων έχουν αναφερθεί [17], [26]. Ως εκ τούτου, αυτό δείχνει ότι η λειτουργία του SLD5 σε βλάβη του DNA και επιδιόρθωση χρησιμοποιείται επίσης σε άλλους τύπους κυττάρων όγκου από μελάνωμα και τον καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα που χρησιμοποιούνται στα πειράματά μας. Περαιτέρω πειράματα που απαιτείται για να διευκρινιστεί αυτό

Όπως περιγράφεται παραπάνω, το συγκρότημα εκκοκκιστήρια εμπλέκεται στην αντιγραφή του DNA.? Ωστόσο, τα συστατικά τζιν PSF1, PSF2, PSF3 και SLD5 δεν αποτελούν πάντα συγκροτήματα και μπορεί να έχουν και άλλες λειτουργίες. Για παράδειγμα, PSF1 ρυθμίζει οργάνωση των μικροσωληνίσκων σε Μ φάση και εμπλέκεται σε χρωμόσωμα διαχωρισμού [20]. Πρόσφατα, έχει αναφερθεί ότι ομόλογα μόρια συνδυασμού με αντιγραφή του DNA σε κατώτερους οργανισμούς μπορεί επίσης να ρυθμίζουν την κυτταρική επεισόδια, εκτός από την αντιγραφή του DNA [27] – [29]. Ως εκ τούτου, είναι πιθανό ότι SLD5, ένα μόριο που εμπλέκονται στην αντιγραφή του DNA σε ζυμομύκητες, είναι επίσης εμπλέκονται στην επιδιόρθωση της βλάβης του DNA. Μια προηγούμενη έκθεση ανέφερε ότι η βλάβη του DNA εμποδίζεται όταν χρωματίνη συμπυκνώνεται με ιστόνης [30]. Ωστόσο, κατά τη διάρκεια της αντιγραφής του DNA, γυμνό DNA διαχωρίζεται από ιστόνης και απειλείται από παράγοντες που επάγουν DNA διπλής διαλείμματα σκέλος. Πώς SLD5 προστατεύει από σπασίματα διπλό κλώνου DNA είναι μέχρι στιγμής ασαφής, αλλά μπορεί να εμπλέκεται στην τροποποίηση των ιστονών. Περαιτέρω απαιτείται ακριβής ανάλυση για τη διαλεύκανση του μηχανισμού προστασίας βλάβης του DNA που παρέχεται από SLD5.

Ήταν αναμενόμενο ότι θα απαιτείται μεγαλύτερο χρονικό διάστημα για την επιδιόρθωση του DNA σε κύτταρα με χειρότερη βλάβη του DNA ως αποτέλεσμα της έλλειψη SLD5. Υποθέσαμε ότι η ταχεία έκφραση Rad51 θα προκληθεί σε SLD5

+/- ΠΜΑ σε σύγκριση με το WT ΠΜΑ για την επισκευή σε μεγάλο βαθμό κατεστραμμένο DNA. Ωστόσο, SLD5 εξασθένηση βρέθηκε να καθυστερεί την έκφραση Rad51 σε ΠΜΑ, με αποτέλεσμα τη σοβαρή επιβράδυνση της αποκατάστασης κυτταρικού κύκλου. Αυτά τα ευρήματα υποδεικνύουν ότι SLD5 όχι μόνο προστατεύει έναντι βλάβης του DNA, αλλά ρυθμίζει την ταχύτητα της επιδιόρθωσης του DNA. Πρόσφατα, έχει αναφερθεί ότι PSF2, επίσης μέλος του συγκροτήματος τζιν, φωσφορυλιώνεται από ΑΤΜ πάνω σκέλος του DNA θραύση [31]. Ως εκ τούτου, είναι πιθανό ότι PSF2 εμπλέκεται στην επιδιόρθωση του DNA πάρα πολύ. Επιπλέον, έχει αναφερθεί ότι τα Ν-τερματικά και Ο-τερματικά πεδία του Sld5 αλληλεπιδρούν με το Ν-τερματικό και Ο-τερματικές περιοχές του Psf2 σε Κρυσταλλική δομή του συμπλόκου ανθρώπινης εκκοκκιστήρια [32], και Sld5 βρέθηκε να αλληλεπιδρά από δύο υβριδίων με PSF2 στο

Drosophila

[33]. Θα είναι ενδιαφέρον να αναλύσουμε τις αλληλεπιδράσεις μεταξύ SLD5 και φωσφορυλιωμένη PSF2 κατά την επισκευή του DNA.

Πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι η ανάπτυξη και μετάσταση όγκου δεν καθορίζονται μόνο από τα καρκινικά κύτταρα, αλλά και από διάφορες στρωματικά κύτταρα. Το στρώμα αποτελεί ένα μεγάλο μέρος των περισσότερων στερεών όγκων, και η αλληλεπίδραση των καρκινικών κυττάρων-στρωματικών συμβάλλει λειτουργικά στην ανάπτυξη και μετάσταση όγκου [34], [35]. Tumor στρώμα περιέχει πολλούς διαφορετικούς τύπους κυττάρων, συμπεριλαμβανομένων του καρκίνου που σχετίζεται με ινοβλάστες (CAF), περικύτταρα, ενδοθηλιακά κύτταρα, κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος διείσδυση. Μεταξύ αυτών, CAFS είναι ο κύριος τύπος κυττάρων που παίζουν καθοριστικό ρόλο στην ογκογένεση και τη μετάσταση [36], [37]. Τα αποτελέσματα των πειραμάτων μας έχουν δείξει ότι η εξασθένιση του SLD5 επάγεται σημαντική βλάβη του DNA και κατέστειλε την ταχεία αποκατάσταση του κυτταρικού κύκλου σε ΠΜΑ. Ως εκ τούτου, έχουμε προβλέψει ότι οι αναστολείς SLD5 θα μπορούσε να είναι υποψήφια φάρμακα κατά του καρκίνου. Βρήκαμε ότι σε καρκινικά κύτταρα, βλάβη του DNA είναι έντονα προκαλείται από την αποσιώπηση της έκφρασης SLD5, όπως παρατηρήθηκε σε ΠΜΑ? Ωστόσο, Rad51 αυξηθεί γρήγορα και αποκατάσταση του κυτταρικού κύκλου δεν επηρεάστηκε σε μεγάλο βαθμό. Αυτό υποδηλώνει ότι τα καρκινικά κύτταρα έχουν επιπλέον μηχανήματα επιδιόρθωση του DNA, ανεξάρτητα από SLD5, και με αυτόν τον τρόπο να διατηρήσει πολλαπλασιαστική ικανότητα. Σίγαση SLD5 σε καρκινικά κύτταρα δεν μπορούν επομένως να είναι αποτελεσματική ως μια στρατηγική για την αναστολή της ανάπτυξης του όγκου. Ωστόσο, δεν είναι μόνο τα καρκινικά κύτταρα αλλά επίσης φυσιολογικό τύπους κυττάρων όπως τα ενδοθηλιακά κύτταρα και ινοβλάστες πολλαπλασιάζονται στην ανάπτυξη υποστήριξη μικροπεριβάλλον του όγκου του όγκου ως συστατικά στρωματικών κυττάρων [38] – [40]. Αποκλεισμός αγγειογένεση έχει δειχθεί ότι είναι μια αποτελεσματική στρατηγική για την αναστολή της ανάπτυξης του όγκου και τη μετάσταση [41]. Ως εκ τούτου, φίμωση έκφραση SLD5 ή καταστολή της λειτουργίας SLD5 από μία μικρή ένωση ή ένα ανάλογο νουκλεοζίτη όπως microRNA σε στρωματικά κύτταρα του όγκου μπορεί να αναστέλλει την ανάπτυξη του μικροπεριβάλλον του όγκου και θα μπορούσε να είναι μια πολλά υποσχόμενη προσέγγιση για την αναστολή της ανάπτυξης όγκου παρόμοια με την στρατηγική αναστολής όγκου αγγειογένεση.

Ευχαριστίες

Σας ευχαριστούμε την κα Κ Fukuhara, κα Fujimoto για τεχνική βοήθεια.