Αφηρημένο

YAP αποτελεί βασικό συστατικό του μονοπατιού σηματοδότησης Hippo και διαδραματίζει έναν κρίσιμο ρόλο στην ανάπτυξη και την εξέλιξη των πολλαπλών τύπων καρκίνου, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου των ωοθηκών. Ωστόσο, τα αποτελέσματα της YAP στην ανάπτυξη καρκίνου των ωοθηκών

in vivo

και κατάντη δράστες παραμένουν αβέβαιες. Σε αυτή τη μελέτη βρήκαμε ότι η ισχυρή έκφραση YAP συσχετίστηκε με κακή καρκίνο των ωοθηκών επιβίωση του ασθενούς. Συγκεκριμένα, δείξαμε για πρώτη φορά ότι τα επίπεδα έκφρασης υψηλού YAP σχετίστηκαν θετικά με την έκφραση του γονιδίου TEAD4, και συν-έκφραση τους ήταν ένας προγνωστικός δείκτης για φτωχή επιβίωση του καρκίνου των ωοθηκών. Υπερενεργοποίηση YAP μεταλλάσσοντας πέντε ανασταλτική θέσεις φωσφορυλίωσης της (YAP-5SA) αυξημένο πολλαπλασιασμό των ωοθηκών καρκινικού κυττάρου, αντίσταση σε χημειοθεραπευτικά φάρμακα, κυτταρική μετανάστευση, και ανεξάρτητο από αγκύρωση ανάπτυξη. Αντίθετα, η έκφραση μιας κυρίαρχης αρνητικής YAP μεταλλαγμένο αντιστραφεί αυτών φαινοτύπων σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών και τα δύο

in vitro

και

in vivo

. Τα αποτελέσματά μας πρότεινε ότι YAP προκάλεσε αυτές τις επιπτώσεις με την προώθηση μιας μετάβασης επιθηλιακών-to-μεσεγχυματικά. Έτσι, YAP προωθεί την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών και ογκογένεση τόσο

in vitro

και

in vivo

. Περαιτέρω, η υψηλή YAP και της έκφρασης TEAD4 είναι ένας προγνωστικός δείκτης για την εξέλιξη του καρκίνου των ωοθηκών και πιθανός στόχος για τη θεραπεία του καρκίνου των ωοθηκών

Παράθεση:. Xia Υ, Chang Τ, Wang Υ, Liu Υ, Λι W, Λι Μ, et al. (2014) YAP Προωθεί ωοθηκών Cancer Cell Ογκογένεση και είναι ενδεικτικό της κακής πρόγνωσης για καρκίνο των ωοθηκών ασθενείς. PLoS ONE 9 (3): e91770. doi: 10.1371 /journal.pone.0091770

Επιμέλεια: Hongmei Wang, Ινστιτούτο Ζωολογίας, Κινεζική Ακαδημία Επιστημών, η Κίνα

Ελήφθη: 10 Γενάρη του 2014? Αποδεκτές: 14 Φεβ 2014? Δημοσιεύθηκε: 12 Μαρ του 2014

Copyright: © 2014 Xia et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (81172473), του Εθνικού Προγράμματος βασικής Έρευνας της Κίνας (2011CB944504, 2012CB944403), και βασική επιστημονική έρευνα Χρηματοδότηση του Πανεπιστημίου Zhejiang (2011QN81001). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή καρκίνοι των ωοθηκών

Τα επιθηλιακά (EOCs) αποτελούν την πλειοψηφία των κακοήθων όγκων των ωοθηκών σε γυναίκες και έχουν τη χειρότερη πρόγνωση μεταξύ των θηλυκών καρκίνων με βάση τα ποσοστά επιβίωσης 5 ετών τους. Αυτοί οι ασθενείς συχνά παρουσιάζουν μη ειδικά πυέλου ή κοιλιακά συμπτώματα. Οι συμβατικές θεραπείες περιλαμβάνουν συνήθως χειρουργική επέμβαση, πλατίνα και ταξόλη χημειοθεραπείες με βάση, και ακτινοθεραπεία. Λόγω της έλλειψης συγκεκριμένων συμπτωμάτων και αποτελεσματικές μεθόδους ελέγχου, οι ασθενείς συχνά διαγιγνώσκεται όταν βρίσκεται σε προχωρημένο στάδιο και την πρόγνωση τους είναι ακόμη χειρότερη από ό, τι με άλλες μορφές καρκίνου.

Το μονοπάτι Hippo είναι ένα πρόσφατα ανακαλύφθηκε μονοπατιού μεταγωγής σήματος. Τα βασικά συστατικά της οδού Hippo, συμπεριλαμβανομένων MST1 /2, LATS, Sav1 και YAP, είναι πολύ συντηρημένες από τη μύγα των φρούτων (

Drosophila

) σε θηλαστικά [1] – [6]. MST1 /2 αποτελέσματα ενεργοποίησης στη φωσφορυλίωση και την ενεργοποίηση των άμεσων υποστρωμάτων τους LATS1 /2. Ενεργοποιημένο LATS1 /2, με τη σειρά του, φωσφορυλιώνει και αναστέλλουν YAP και TAZ μεταγραφή συν-ενεργοποιητή [7], [8]. YAP προάγει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, αναστέλλει την κυτταρική απόπτωση, και επίσης προωθεί ένα επιδερμικό-μεσεγχυματικών μετάβαση (ΕΜΤ) [9] – [12]. YAP συνδέεται στενά με ογκογένεση ως κρίσιμο μεταγραφής συν-ενεργοποιητή στην οδό Hippo.

Αρκετοί παράγοντες μεταγραφής, συμπεριλαμβανομένου ErbB4, RUNX2, τα μέλη της οικογένειας ΗΣΑΤΚ, και ρ73, έχουν βρεθεί να είναι YAP γονίδια προς τα κάτω στόχος [ ,,,0],13] – [16]. Επειδή στερείται τομέα δέσμευσης DNA, YAP προσδένεται στο Ο-τερματική περιοχή του ΗΣΑΤΚ, προκειμένου να ρυθμίσει την μεταγραφή και μετάφραση κατάντη γονίδια ». Zhao

κ.ά.

προσδιορίζονται παράγοντες μεταγραφής της οικογένειας ΗΣΑΤΚ ως οι πλέον ισχυροί στόχοι YAP και τα μέλη της οικογένειας ΗΣΑΤΚ ήταν σημαντικές για τη λειτουργία προαγωγής ανάπτυξης του YAP [14], [17] – [21].

Προηγούμενες μελέτες έδειξαν ότι YAP ήταν εντόνως εκφρασμένο σε ανθρώπινους ιστούς καρκίνου των ωοθηκών και ότι η υψηλή δραστικότητα YAP προήγαγαν τον πολλαπλασιασμό και την επιβίωση των καλλιεργημένων καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών [9], [22]. Ωστόσο, ο ρόλος της YAP στην ανάπτυξη καρκίνου των ωοθηκών

in vivo

και τη σύνδεση των YAP /ΗΣΑΤΚ με καρκίνο των ωοθηκών επιβίωση ασθενών δεν έχουν διερευνηθεί σχολαστικά.

Στην παρούσα μελέτη δείξαμε ότι η συνεχής YAP ενεργοποίηση επάγει αυξημένο πολλαπλασιασμό των ωοθηκών καρκινικού κυττάρου, αντίσταση στη σισπλατίνη που προκαλείται από κυτταρική απόπτωση, απώλεια αναστολής επαφής, αυξημένη κυτταρική μετανάστευση, και ανεξάρτητη από προσκόλληση ανάπτυξη τόσο

in vitro

και

in vivo

. Σε συμφωνία με τα αποτελέσματα αυτά, βρήκαμε επίσης ότι η έκφραση υψηλού YAP συσχετίστηκε με κακή καρκίνο των ωοθηκών επιβίωση του ασθενούς. Περαιτέρω, τα μέλη της οικογένειας ΗΣΑΤΚ επίσης εκφράζεται σε ιστούς καρκίνου των ωοθηκών. Είναι ενδιαφέρον ότι, η έκφραση YAP συσχετίστηκε θετικά με την έκφραση TEAD4 και συν-έκφρασή τους ήταν στενά συνδεδεμένη με την κακή καρκίνο των ωοθηκών επιβίωση των ασθενών. Λαμβανόμενα μαζί αυτά τα ευρήματα δείχνουν ότι YAP αποτελεί βασικό ογκογονίδιο ωοθηκών και ότι YAP /TEAD4 συν-έκφραση μπορεί να είναι ένας προγνωστικός δείκτης της κακής πρόγνωσης για τον καρκίνο των ωοθηκών του ανθρώπου.

Υλικά και Μέθοδοι

γυμνό ξενομοσχευμάτων ποντίκια και

In Vivo

θεραπείες

γυμνά ποντίκια ελήφθησαν από το Κέντρο Πειραματικής Ζώα, Πανεπιστήμιο Zhejiang.

τα ποντίκια υποβάλλονται σε επεξεργασία σύμφωνα με τον οδηγό ΝΙΗ για το φροντίδα και χρήση των πειραματόζωων, έχει εγκριθεί από επιτροπή δεοντολογίας του Πανεπιστημίου Zhejiang. Οι ποντικοί στεγάστηκαν σε ένα ελεγχόμενης θερμοκρασίας δωμάτιο με κατάλληλη σκοτάδι-φως κύκλους, τροφοδοτείται με μια κανονική δίαιτα, και διατηρείται υπό την φροντίδα της Μονάδας Laboratory Animal, Πανεπιστήμιο Zhejiang, Κίνα. Τα ποντίκια κυττάρων που μεταμοσχεύονται καρκίνου των ωοθηκών ήταν examinined καθημερινά, και υποβλήθηκαν σε ευθανασία με τη μέθοδο εισπνοή CO2 πριν θυσιαστεί. Για να εξεταστούν οι επιδράσεις της δραστηριότητας YAP σε όγκους

in vivo

, σταθερές κυτταρικές σειρές που εκφράζουν YAP-5SA ή κυρίαρχο αρνητικό YAP καλλιεργήθηκαν και χρησιμοποιήθηκαν για την επαγωγή όγκων με εμφύτευση 2 χ 10

6 κύτταρα σε 100 μλ του PBS υποδορίως στην δεξιά κοιλιακή πλευρά των ηλικίας 4-6 εβδομάδων θηλυκών γυμνών ποντικών. Για να προσδιοριστεί εάν YAP έχει επίδραση στην χημειο-αντίσταση, κύτταρα A2780cp YAP-5SA-ΔΟ και τα κύτταρα ελέγχου (2 × 10

6 κύτταρα ανά ποντικό σε κάθε ομάδα) εμβολιάσθηκαν χωριστά (s.c.) σε γυμνά ποντίκια. Μετά όγκοι αναπτύχθηκαν σε περίπου 5 mm σε διάμετρο, 3,5 mg /βάρος σώματος (kg) /ημέρα CDDP χορηγήθηκε (ε.π.) με τη γυμνά ποντίκια μια φορά την εβδομάδα για 4 εβδομάδες. Τα μεγέθη των όγκων (τόσο σε διαμήκη και εγκάρσια πλάτη) μετρήθηκαν με ένα παχύμετρο.

συστοιχία ιστών και Ανάλυση IHC

φορμαλίνη σταθερών και συστοιχία ωοθηκών ιστού εγκλεισμένα σε παραφίνη ελήφθη από US Biomax, Inc . (Rockville, MD). Η μικροσυστοιχία ιστός ανοσοϊστοχημικά χρώση για YAP (# 4912, Cell Signaling), S127 φωσφορυλιωμένη-YAP (# 4911S, Cell Signaling), TEAD1 (5178 – 1, Epitomics), TEAD2 (LS-C119063, διάρκεια ζωής Biosciences), TEAD3 (LS -C30406, διάρκεια ζωής Biosciences), και TEAD4 (ab97460, Abcam). Επιπλέον, 45 ανθρώπινα δείγματα καρκίνου των ωοθηκών για την παρακολούθηση των ασθενών είναι από το Τμήμα Παθολογίας, Xijing Νοσοκομείο της τέταρτης Στρατιωτικό Ιατρικό Πανεπιστήμιο. Η χρήση των ωοθηκών δείγμα του καρκίνου και το πρωτόκολλο της μελέτης εγκρίθηκε από την Επιτροπή Δεοντολογίας της Xijing Νοσοκομείο, και γραπτή συγκατάθεση λήφθηκε από κάθε ασθενή.

Όλοι το τελικό σκορ του κάθε δείγματος (αρνητική ή θετική) βαθμολογήθηκε ανεξάρτητα από δύο παθολόγους και αξιολογούνται με την προσθήκη των βαθμολογιών για την ένταση και την έκταση της χρώσης. Η ένταση της χρώσης βαθμολογήθηκε ως 0 (αρνητική), 1 (ασθενής), ή 2 (ισχυρή). Η έκταση της χρώσης βαθμολογήθηκε με βάση το ποσοστό των θετικών κυττάρων όγκου: 0 (αρνητική), 1 (1% -30%), 2 (30% -60%), και 3 (61% -100%). Κάθε περίπτωση τελικά θεωρείται αρνητικό αν το τελικό σκορ ήταν 0 (αρνητικός) ή 1 (ασθενές θετικό) και θετικό αν το τελικό σκορ ήταν 2 έως 3 (+) ή 4-5 (ισχυρή θετική).

τηλέφωνα γραμμές

Όλες οι κυτταρικές σειρές που χρησιμοποιούνται σε αυτήν τη μελέτη είχαν αρχικά αγοράστηκαν από την ATCC. Όλα τα μέσα κυτταρικής καλλιέργειας ήταν από την Invitrogen. SKOV-3 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε μέσο McCoy 5Α με 10% FBS. Α2780 κύτταρα αναπτύχθηκαν σε μέσο ϋΜΕΜ υψηλής γλυκόζης συμπληρωμένο με 10% FBS και 1% διάλυμα πενικιλλίνης-στρεπτομυκίνης. κύτταρα OVCAR3 καλλιεργήθηκαν σε μέσο ϋΜΕΜ με 0,01 mg /ml ινσουλίνης και 15% FBS. κύτταρα OVCAR8 αναπτύχθηκαν σε RPMI 1640 με 10% FBS. Όλες οι κυτταρικές σειρές καλλιεργήθηκαν με 10 μονάδες /ml πενικιλλίνης και 10 ng /ml στρεπτομυκίνη. Σταθερές κυτταρικές γραμμές αναπτύχθηκαν σε μέσο καλλιέργειας και επιλέγονται με τη χρήση διαφόρων συγκεντρώσεων πουρομυκίνης.

Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων

δοκιμασία

Για κάθε κατάσταση που περιγράφεται ανωτέρω, τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε φρεάτια εις τριπλούν σε πλάκες των 96 φρεατίων σε 2000 κύτταρα /Λοιπόν. Η κυτταρική ανάπτυξη προσδιορίστηκε με μέτρηση της απορρόφησης με μια συσκευή ανάγνωσης πλακών (Bio-Rad) μετά από καλλιέργεια για 24 ώρες. Τρία ανεξάρτητα πειράματα έγιναν για κάθε θεραπεία.

Western Blot ανάλυση

κυτταρικά εκχυλίσματα που περιέχουν 30 μg πρωτεΐνης αναλύθηκαν με SDS-PAGE και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες PVDF (Millipore Corp., Bedford, ΜΑ ). Μετά από ανίχνευση με πρωτεύοντα αντισώματα, οι μεμβράνες επωάστηκαν με υπεροξειδάση αρμορακίας-συνδεδεμένη αντισώματα αντι-κουνελιού (Cell Signaling Technologies, Danvers, ΜΑ) και στη συνέχεια πλένονται. Τα δεσμευμένα αντισώματα οπτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα ενισχυμένο κιτ ανίχνευσης χημειοφωταύγειας (Amersham). Τα πρωτογενή αντισώματα ήταν: YAP (# 4912), S127 φωσφορυλιωμένη-YAP (# 4911S), PARP (# 9542), διασπασμένη κασπάση 3 (# 9664), β-ακτίνη (# AC40), Ε-καδερίνης (# 3195) , Slug (# 3195), και σαλιγκάρι (# 3895) από την Cell Signaling. Μια TEAD1 (5178-1) αντίσωμα ήταν από Epitomics. TEAD2 (LS-C119063) και TEAD3 (LS-C30406) αντισώματα ήταν από την διάρκεια ζωής των Βιοεπιστημών. Ένα TEAD4 (ab97460) αντίσωμα ήταν από Abcam.

Flat αποικία και μαλακό προσδιορισμούς σχηματισμού αποικιών άγαρ

Τα κύτταρα τοποθετήθηκαν σε φρεάτια εις τριπλούν σε πλάκες των 6-φρεατίων για 14 ημέρες για μια δοκιμασία σχηματισμού αποικίας επίπεδη . Για μια δοκιμασία μαλακού άγαρ, 2000 κύτταρα τοποθετήθηκαν σε πλήρες μέσο συν 0,6% άγαρ σε φρεάτια εις τριπλούν σε πλάκες των 6 φρεατίων. Το μέσο αντικαθίσταται κάθε 48 ώρες και ορατές αποικίες μετρήθηκαν με μικροσκοπία φωτός μετά από 21 ημέρες.

δοκιμασία ξυστό

Τα κύτταρα τοποθετήθηκαν σε πλάκες 6-φρεατίων και καλλιεργήθηκαν σε μέσο άνευ ορού για να εμποδίσει τον πολλαπλασιασμό . Μετά από 12 ώρες, τα κύτταρα γδαρμένο χρησιμοποιώντας ένα ρύγχος πιπέτας 200 μΐ. Στη συνέχεια, οι εικόνες 10 γρατσουνιές ανά κυτταρική σειρά αποκτήθηκαν σε 0 h, 12 h και 24 h.

Προσδιορισμός απόπτωσης

Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε μέσο με διαφορετικές συγκεντρώσεις σισπλατίνης για 48 ώρες. Στη συνέχεια, τα κύτταρα συλλέχθηκαν με ένα κιτ ανίχνευσης απόπτωσης (BD Biosciences, 559763) με κυτταρομετρία ροής και για ανάλυση Western blot.

In vitro

και

in vivo

μεταστατικό μοντέλο και απεικόνιση βιοφωταύγειας

Α (μέγεθος πόρων 8-μm, Corning, USA) 24-φρεατίων transwell πλάκα χρησιμοποιήθηκε για να προσδιοριστεί η μετανάστευση και επεμβατική ικανότητα της κάθε κυτταρικής γραμμής. Για επικοινωνούντα δοκιμασίες μετανάστευσης, 5 × 10

4 κύτταρα σπάρθηκαν στον άνω θάλαμο που επενδύεται με ένα μη επικαλυμμένο μεμβράνη. Οι κάτω θαλάμους προστέθηκαν όλα σε μέσο καλλιέργειας 500 ul με 20% FBS. Προσδιορίστηκαν οι μέσες τιμές προσδιορισμών εις τριπλούν για κάθε πειραματική συνθήκη.

Για

in vivo δοκιμασίες

μετάσταση, HO8910 PM-YAP △ C σταθερών κυττάρων μολύνθηκε με ένα lusiferase πλασμίδιο ανταποκριτή και εγχέεται στο ουραία φλέβες των θηλυκών ποντικιών με ανενεργό 4 εβδομάδων. Μετά από δύο εβδομάδες, τα ζώα απεικονίστηκαν εβδομαδιαίως από την μηχανή απεικόνισης ζώο χρησιμοποιώντας μια συζευγμένη συσκευή εντατικοποιηθεί φορτίου (CCD) σύστημα κάμερας. Για

in vivo

βιοφωταύγεια απεικόνισης, οι ποντικοί αναισθητοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα μίγμα 1-2% ισοφλουράνιο /αέρα και εγχύθηκε με ένα μόνο (ΙΡ) δόση των 100 mg /kg λουσιφερίνης (Promega, WI) και βιοφωταύγεια ανιχνεύθηκε με IVIS 100 Σύστημα απεικόνισης (Xenogen).

Εκτός από την απεικόνιση βιοφωταύγειας, τα ποντίκια εκτελέστηκαν σε 60 ημέρες μετά από τον καρκίνο των ωοθηκών κύτταρο-έγχυσης για τη διερεύνηση των μεταστάσεων όργανο μετά τον εμβολιασμό.

Στατιστική ανάλυση

Για τα 45 άτομα με πλήρη ανοσοϊστοχημική και την έκβαση των δεδομένων, που αφορούν συγκεκριμένες νόσους 5-ετή επιβίωση υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας τη μέθοδο Kaplan-Meier και συγκρίθηκαν μεταξύ των ομάδων με τη χρήση τεστ log-rank. ανάλυση συσχέτισης ολοκληρώθηκε από Chi-square test. t-test του Student χρησιμοποιήθηκε για να συγκρίνουν τα αποτελέσματα της κάθε μετρούμενη μεταβλητή με τα αποτελέσματα του ελέγχου. Ρ-τιμές των n = 5. Στατιστικά σημαντικές διαφορές σε σύγκριση με ένα μάρτυρα όπως προσδιορίζεται από έλεγχος τ συμβολίζεται με * (Ρ & lt? 0,05) ή ** (Ρ & lt? 0,01)

Η

Για να διερευνήσουν το ρόλο. για YAP στον πολλαπλασιασμό των ωοθηκών καρκινικών κυττάρων και τη μετάσταση, δημιουργήσαμε Α2780 και σταθερές κυτταρικές σειρές OVCAR8 που υπερεκφράζεται ουσιαστικά δραστική YAP (YAP με μεταλλάξεις ιστοσελίδα πέντε LATS1 /2 φωσφορυλίωση? YAP-5SA) και κυρίαρχο αρνητικό YAP (YAP-5SA με C- τερματική διαγραφή τομέα διενεργοποίησης? YAP-5SA-ΔΟ? Σχήμα 2Β-C). καμπύλες ανάπτυξης των κυττάρων έδειξαν ότι YAP-5SA κύτταρα που εκφράζουν είχαν μεγαλύτερη πολλαπλασιαστική δραστικότητα από τους μάρτυρες (Σχήμα 2D, άνω πάνελ). Σε αντίθεση, YAP-5SA-ΔΟ κύτταρα που εκφράζουν OVCAR8 είχαν μειωμένο ρυθμό πολλαπλασιασμού σε σχέση με τα κύτταρα ελέγχου (Εικόνα 2D, κάτω πλαίσιο).

Στη συνέχεια, διερευνήσαμε αν δραστηριότητα YAP επηρεάζονται κυτταρικό μετασχηματισμό και τη μετανάστευση σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών χρησιμοποιώντας μια δοκιμασία σχηματισμού αποικίας πλάκα. Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι ουσιαστικά δραστική YAP-5SA προωθείται σχηματισμό κλώνο, αλλά ότι κυρίαρχο αρνητικό YAP-5SA-ΔΟ κατέστειλε κλώνος σχηματισμό (Σχήμα 2Ε). Επιπλέον, χρησιμοποιήσαμε μία δοκιμασία μαλακό άγαρ για να προσδιοριστεί αγκύρωση ανάπτυξη ανεξάρτητη, άλλος δείκτης της ογκογόνο. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2F, δραστικότητα YAP συσχετίστηκε θετικά με ικανότητα σχηματισμού αποικιών των καρκινικών κυττάρων »των ωοθηκών σε μαλακό άγαρ.

YAP προάγει τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών και ογκογένεση

in vivo

Η

Προηγούμενες μελέτες δεν διερεύνησε αν YAP θα μπορούσε να ενισχύσει την ογκογένεση

in vivo

. Έτσι, υποδορίως με ένεση YAP-5SA και YAP-5SA-ΔΟ κύτταρα που εκφράζουν, καθώς και τα αντίστοιχα κύτταρα ελέγχου τους, σε 4-εβδομάδων γυμνούς ποντικούς. Μετά από 3 εβδομάδες, οι όγκοι που προέρχονται από σταθερά κύτταρα YAP-5SA ήταν σημαντικά μεγαλύτερα από εκείνα των ελέγχων (Σχήμα 2G). Αυτά τα αποτελέσματα ήταν σύμφωνα με το

in vitro δοκιμασίες

μας.

YAP ενισχύει την αντίσταση καρκινικές κυτταρικές γραμμές »των ωοθηκών στη σισπλατίνη και ταξόλη

Cisplatin και ταξόλη είναι τα κύρια αντικαρκινικά φάρμακα που χρησιμοποιούνται για τη θεραπεία του καρκίνου των ωοθηκών. Έτσι, επιδιώξαμε να καθορίσει εάν δραστηριότητα YAP επηρεάζονται ευαισθησίες καρκινικά κύτταρα »των ωοθηκών στη σισπλατίνη και ταξόλη. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3Α, YAP-5SA εκφράζουν κύτταρα ήταν περισσότερο ανθεκτικά σε δύο από αυτά τα φάρμακα από κύτταρα ελέγχου ήταν σε διαφορετικές δόσεις. Σε αντίθεση, YAP-5SA-ΔΟ που εκφράζουν κύτταρα ήταν περισσότερο ευαίσθητα και στα δύο φάρμακα από ό, τι ήταν τα κύτταρα ελέγχου. Τα αποπτωτικά δείκτες κυττάρου διασπασμένη PARP και διασπασμένη κασπάση 3 ανιχνεύθηκαν σε Α2780 κύτταρα ελέγχου μετά από θεραπεία Σισπλατίνη με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο (0-100 μΜ). Ωστόσο, οι αυξημένες εκφράσεις αυτών των δεικτών απόπτωσης ήταν λιγότερο σημαντική σε παρόμοια επεξεργασία YAP-5SA εκφράζουν κύτταρα (Σχήμα 3Β)

Α:. Βιωσιμότητα των YAP-5SA και YAP-5SA-ΔΟ κύτταρα που εκφράζουν μετά τη θεραπεία με ταξόλη ή CDDP, όπως αξιολογείται με ανάλυση ΜΤΤ. Β: κηλίδωση Western αποτελέσματα για τους δείκτες απόπτωσης διασπασμένη κασπάση 3 και PARP σε YAP-5SA εκφράζουν και τα κύτταρα ελέγχου μετά από θεραπεία με τις υποδεικνυόμενες δόσεις του CDDP για 48 ώρες. C: Η κυτταρομετρία ροής αποτελέσματα για απόπτωση των A2780cp κύτταρα με ή χωρίς YAP-5SA-ΔΟ διαμόλυνση και μετά τη θεραπεία με διαφορετικές δόσεις του CDDP για 48 ώρες. D: κηλίδωση Western αποτελέσματα για διασπασμένη κασπάση 3 και PARP σε YAP-5SA-ΔΟ που εκφράζουν και τα κύτταρα ελέγχου μετά από θεραπεία με τις υποδεικνυόμενες δόσεις του CDDP για 48 ώρες. F-G: Εικόνες και ποσοτικά αποτελέσματα για

in vivo

ογκογόνο ικανότητα των A2780cp κυττάρων με ή χωρίς την έκφραση YAP-5SA-ΔΟ. Γυμνοί ποντικοί ενέθηκαν με CDDP μέσω ενός ουραία φλέβα μία φορά κάθε εβδομάδα για τέσσερις εβδομάδες μετά ξενομοσχεύματα όγκου έφθασε 5 mm σε διάμετρο. H: Αποτελέσματα IHC για το δείκτη πολλαπλασιασμού Ki67 στα τμήματα υποδεικνυόμενες ιστό του όγκου. μπαρ κλίμακα = 100 μΜ.

Η

Η κυτταρομετρία ροής αποτελέσματα έδειξαν ότι έχουν αναφερθεί στο παρελθόν σισπλατίνη ανθεκτική κυτταρική σειρά καρκίνου των ωοθηκών (A2780cp) ήταν πράγματι είναι ανθεκτική στη θεραπεία με σισπλατίνη σε χαμηλές δόσεις (10-40 μΜ). Ωστόσο, η έκφραση YAP-5SA-ΔΟ στα κύτταρα αυτά προκάλεσε αύξηση στην κυτταρική απόπτωση μετά τη θεραπεία cisplatin σε όλες τις δόσεις που δοκιμάστηκαν (Σχήμα 3C-D). Επιπλέον, YAP-5SA-ΔΟ κύτταρα που εκφράζουν A2780cp έδειξαν εντυπωσιακά αυξημένη έκφραση της διασπασμένης PARP και κασπάσης 3 από ό, τι τα κύτταρα ελέγχου μετά από θεραπεία με σισπλατίνη (Σχήμα 3Ε).

Για να προσδιορίσετε αν YAP παρέχει ανθεκτικότητα στα φάρμακα για να τα καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών

in vivo

, εμείς υποδορίως γυμνά ποντίκια με κύτταρα A2780cp που εκφράζονται σταθερά YAP-5SA-ΔΟ και με κύτταρα ελέγχου. Σε 1 εβδομάδα μετά τις ενέσεις κυττάρων, τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε αγωγή με σισπλατίνη με ουραίο μάταια ένεση κάθε τρεις ημέρες. Τα μεγέθη των όγκων μετρήθηκαν σε 5 εβδομάδες μετά τις ενέσεις των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών. Σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου, όγκους που προήλθαν από YAP-5SA-ΔΟ που εκφράζουν κύτταρα ήταν μικρότερα σε μέγεθος σε σύγκριση με εκείνα που προέρχονται από τα κύτταρα ελέγχου (Σχήμα 3F-G). Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων δείκτη έκφρασης Κί67 ήταν ασθενέστερη σε YAP-5SA-ΔΟ κύτταρα που εκφράζουν ό, τι σε κύτταρα ελέγχου (Σχήμα 3Η).

YAP ενισχύει την μετανάστευση και ανεξάρτητη από προσκόλληση ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών

επόμενη ερεύνησε τις επιπτώσεις της δραστηριότητας YAP σχετικά με τη μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών. Σε αμφότερες τις δοκιμασίες το μηδέν (Σχήμα 4Α) και επικοινωνούντα προσδιορισμούς (Σχήμα 4Β), YAP-5SA κύτταρα που εκφράζουν μετανάστευσαν ταχύτερα, ενώ YAP-5SA-ΔΟ κύτταρα που εκφράζουν μετανάστευσαν βραδύτερα από τα κύτταρα ελέγχου.

A. Επούλωση πληγών δοκιμασία για τη μετανάστευση YAP-5SA και YAP-5SA-ΔΟ κύτταρα που εκφράζουν μετά από καλλιέργεια για 12 και 24 ώρες. Κλίμακα bar = 100 μΜ για όλους τους πίνακες. δοκιμασίες Β Transwell για τη μετανάστευση YAP-5SA και YAP-5SA-ΔΟ κύτταρα που εκφράζουν. ** P & lt? 0,01. δοκιμασίες απεικόνισης C. Η βιοφωταύγεια που δείχνει μετάσταση στους πνεύμονες του ελέγχου και της YAP-5SA-ΔΟ κύτταρα που εκφράζουν HO8910PM μετά εγχύθηκαν μέσα στην ουραία φλέβες γυμνών ποντικών. Δ HE και IHC χρώση των χώρων μετάσταση στους πνεύμονες φαίνεται στο Γ Ε-ΣΤ: Οι εικόνες και τα αποτελέσματα στατιστικής ανάλυσης των ηπατικών μεταστάσεων από ουραία φλέβα ένεση κυττάρων HO8910 μμ. G: HE και YAP IHC αποτελέσματα των χώρων μετάσταση στο ήπαρ φαίνεται στο EH αποτελέσματα κηλίδα Western για EMT εκφράσεις δείκτη σε καλλιεργημένα YAP-5SA και YAP-5SA-ΔΟ κύτταρα που εκφράζουν και

in vivo

ξενομοσχεύματα που προέρχονται από αυτά τα κύτταρα

Επιπλέον, κάναμε

in vivo

πειράματα για να ελέγξετε εάν δραστηριότητα YAP ήταν απαραίτητη για τη μετάσταση του καρκίνου των ωοθηκών. Ιδρύσαμε λουσιφεράσης που εκφράζουν σταθερές κυτταρικές σειρές χρησιμοποιώντας κύτταρα HO8910-PM, μια ανθρώπινη κυτταρική σειρά καρκίνου των ωοθηκών με υψηλό μεταστατικό χωρητικότητα YAP-5SA-ΔC- και, και εγχύθηκε αυτά τα κύτταρα σε γυμνούς ποντικούς μέσω ουραίο φλέβες τους (5 × 10

6 κύτταρα /ποντικό). Στις δύο εβδομάδες μετά την ένεση, τα ποντίκια απεικονίζεται για μετάσταση χρησιμοποιώντας ένα σύστημα απεικόνισης ζώο. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 4C-D, οι εν λόγω ξενομοσχεύματα που προέρχονται από YAP-5SA-ΔΟ κύτταρα που εκφράζουν ήταν μικρότερες από εκείνες που προέρχονται από τα κύτταρα ελέγχου. αποτελέσματα IHC έδειξαν ότι τα ξενομοσχεύματα ήταν θετικά για CA125 και YAP, η οποία επιβεβαίωσε την προέλευσή τους από τα καρκινικά κύτταρα εγχύθηκαν ωοθηκών. Σημαντικά, μεταστάσεις μετά τον εμβολιασμό ανιχνεύθηκαν στα ήπατα όλων των 10 ποντικών που ενέθηκαν με έλεγχο HO8910 κύτταρα, αλλά μόνο σε 2 από 10 ποντικούς ενίεται με YAP-5SA-ΔΟ-κύτταρα που εκφράζουν (Σχήμα 4Ε). Επιπλέον, YAP-5SA-ΔΟ-κύτταρα που εκφράζουν σχηματίζονται πολύ λιγότερα μεταστατικά οζίδια (YAP-θετικό) από ό, τι τα κύτταρα ελέγχου στα ήπατα του εγχέονται ποντικούς (Σχήμα 4F-G). Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η μειωμένη δραστηριότητα YAP καθυστερημένος μετάσταση των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών

in vivo

.

Μια επιθηλιακών-to-μεσεγχυματικά μετάβασης (EMT) πιστεύεται ότι είναι μια σημαντική διαδικασία κατά την εξαγορά των εν λόγω ακινήτων που απαιτείται για τη μετάσταση του όγκου. Σε αμφότερες καλλιεργημένα καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών και σε αυτούς που απομονώνονται από

in vivo

, YAP-5SA προώθησε την έκφραση του ΕΜΤ δείκτη σαλιγκάρι και ανέστειλε την έκφραση της επιθηλιακής δείκτη Ε-καδερίνης. Ωστόσο, YAP-5SA-ΔΟ είχε τα αντίθετα αποτελέσματα (Σχήμα 4Η).

Τα υψηλά επίπεδα πυρηνικής YAP και TAED4 που σχετίζονται με την κακή ανθρώπινο καρκίνο των ωοθηκών πρόγνωση

YAP δεν έχει δεσμευτική ένα DNA πεδίο ορισμού. Λειτουργεί ως μεταγραφή συν-ενεργοποιητή με σύνδεση με παράγοντες της οικογένειας ΗΣΑΤΚ μεταγραφής (TEAD1-4). Ωστόσο, δεν έχει διερευνηθεί εάν TEADs παίζει κανένα ρόλο στην πρόγνωση του καρκίνου των ωοθηκών. Έτσι, ερευνήσαμε TEAD1-4 έκφραση σε ανθρώπινα δείγματα καρκίνου των ωοθηκών. Οι εκφράσεις από τις 4 υποτύπους των πρωτεϊνών της οικογένειας ΗΣΑΤΚ διερευνήθηκαν ξεχωριστά σε μια μικροσυστοιχία καρκινικού ιστού των ωοθηκών με IHC (Σχήμα 5Α). αποτελέσματα της ανάλυσης συσχέτισης έδειξαν ότι YAP και pYAP ήταν συσχετίζεται θετικά με TEAD1-4 έκφραση, και ήταν πιο στενά με την έκφραση TEAD4 ανάλυση σύνδεσης (Σχήμα 5Β) .Ένα χρησιμοποιώντας 45 δείγματα ασθενών καρκίνου των ωοθηκών έγινε στις οποίες κατατάσσονται οι εκτιμήσεις επιβίωσης Kaplan-Meier . Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η έκφραση YAP συσχετίστηκε θετικά με την έκφραση TEAD4 (Σχήμα 5C, P = 0.0284).

Α. IHC Αποτελέσματα για TEADs έκφραση σε ανθρώπινους ιστούς καρκίνου των ωοθηκών. Κλίμακα bar = 100 μΜ. Β Σύλλογοι μεταξύ YAP /εκφράσεις pYAP και εκφράσεις ΗΣΑΤΚ σε μια σειρά καρκίνου του ιστού των ωοθηκών. Γ Σύλλογοι μεταξύ YAP και TEAD4 εκφράσεις σε 45 δείγματα ωοθηκικού καρκίνου ανάλογα με τις εκτιμήσεις επιβίωσης Kaplan-Meier. Δ YAP και TEAD4 συν-έκφραση συσχετίζεται με πτωχή πρόγνωση με τον ανθρώπινο καρκίνο των ωοθηκών. Υψηλή έκφραση ΗΣΑΤΚ έναντι έκφραση χαμηλή TEAD4 (αριστερά), υψηλή έκφραση YAP σε συνδυασμό με την υψηλή έκφραση TEAD4 σε σχέση με άλλες κατηγορίες (μεσαία), υψηλή έκφραση YAP και υψηλή έκφραση TEAD4 σε συνδυασμό με την υψηλή β-catanin σε σχέση με άλλες κατηγορίες (δεξιά).

θα διερευνηθεί περαιτέρω αν TEAD4 μόνη της μπορεί να σχετίζεται με τον καρκίνο των ωοθηκών επιβίωση των ασθενών. Οι εκτιμήσεις των Kaplan-Meier και συγκρίσεις για συγκεκριμένες ασθένειες επιβίωσης έδειξε ότι η υψηλή TEAD4 ένταση χρώσης συσχετίστηκε με κακή επιβίωση των ασθενών (Σχήμα 5D, αριστερό πάνελ). Η επιβίωση των ασθενών με τόσο υψηλή YAP και υψηλή έκφραση TEAD4 ήταν σημαντικά χειρότερη από ό, τι για τις άλλες κατηγορίες (Σχήμα 5D, μεσαίο πάνελ? P = 0,002). Επιπλέον, η εκτίμηση κατά Kaplan-Meier για συνδυασμό υψηλής YAP /TEAD4 και η έκφραση δείκτη EMT β-catanin ήταν επίσης στατιστικά σημαντική (Σχήμα 5D, δεξιά πλευρά). Στο σύνολό τους, αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι YAP και TEAD4 ήταν δύο σημαντικές ανεξάρτητες δείκτες για την κακή επιβίωση των ασθενών και σε συνδυασμό αξιολόγησή τους θα μπορούσε να είναι ένας ισχυρός ανεξάρτητος προγνωστικός δείκτης της νόσου ειδικά επιβίωσης για τους ασθενείς με καρκίνο των ωοθηκών.

Συζήτηση

YAP έχει ενοχοποιηθεί ως πιθανός ογκογονίδιο με διαφορετικές υποκυτταρικές εντοπισμοί ρυθμίζεται από ανάντη γονιδίων του στην οδό Hippo. Αυξημένη έκφραση YAP και ένα πυρηνικό εντοπισμό έχουν παρατηρηθεί σε πολλαπλούς ανθρώπινους καρκίνους, συμπεριλαμβανομένου του ήπατος, του παχέος εντέρου, των ωοθηκών, και καρκίνων του πνεύμονα [23] – [30]. Στην παρούσα μελέτη, δείξαμε ότι τα επίπεδα πρωτεΐνης YAP ήταν υψηλά σε πολλαπλές κυτταρικές γραμμές καρκίνου των ωοθηκών. Το πιο σημαντικό, YAP ήταν άκρως εκφράζεται σε δείγματα καρκίνου των ωοθηκών, αλλά όχι σε φυσιολογικό ιστό των ωοθηκών, το οποίο πρότεινε ότι η έκφραση YAP είχε άμεση σχέση με την ανάπτυξη καρκίνου των ωοθηκών ή της προόδου.

Προηγούμενες μελέτες πρότειναν επίσης ότι YAP θα μπορούσε να λειτουργήσει ως ένα ογκογονίδιο στον καρκίνο των ωοθηκών [31]. Ωστόσο, καμία από αυτές τις μελέτες διερευνήθηκε πιθανές συσχετίσεις μεταξύ των επιπέδων έκφρασης YAP /ΗΣΑΤΚ και τον καρκίνο των ωοθηκών επιβίωση του ασθενούς. Σε αυτή τη μελέτη, δείξαμε ότι η υψηλή έκφραση YAP στους όγκους των ωοθηκών σχετίστηκε με μικρότερη συγκεκριμένες νόσους επιβίωση για τους ασθενείς του καρκίνου των ωοθηκών, και ότι η χαμηλή έκφραση YAP στους όγκους των ωοθηκών σχετίστηκε με μεγαλύτερη συγκεκριμένες νόσους επιβίωση για αυτούς τους ασθενείς. Περαιτέρω, βρήκαμε για πρώτη φορά ότι TEAD4, μια άμεση εταίρο δέσμευσης του YAP, επίσης στενά συνδεδεμένη με την επιβίωση του ασθενούς. Η συν-έκφραση του YAP και TEAD4 σε ιστούς καρκίνου των ωοθηκών ήταν ακόμα πιο εντυπωσιακά σχετίζονται με την κακή επιβίωση του ασθενούς. Έτσι, τα υψηλά YAP /επίπεδα TEAD4 θα μπορούσε να είναι ένας προγνωστικός δείκτης για τον προσδιορισμό των επιπέδων του καρκίνου των ωοθηκών κακοήθεια και για την εκτίμηση της πρόγνωσης των ασθενών αυτών.

Οι πρωτογενείς επιθηλιακούς καρκίνους ωοθηκών αντιμετωπίζονται συνήθως με φάρμακα με βάση την πλατίνα, όπως η σισπλατίνη σε συνδυασμό με ταξόλης. Αυτά τα φάρμακα χορηγούνται είτε ενδοφλεβίως είτε ενδοπεριτοναϊκώς. Τα αποπτωτικά και αντι-αποπτωτικών σημάτων είναι οι δύο πλευρές της κυτταρικής cross-talk μεταξύ κυτταρικής επιβίωσης και κυτταρικού θανάτου που καθορίζουν την τύχη των κυττάρων στις αντιδράσεις τους σε εξωγενείς συνθήκες. Για όγκους, προκαλούμενη από φάρμακα απόπτωση ρυθμίζεται όχι μόνο από την ρύθμιση προς τα άνω των αποπτωτικών παραγόντων ή καταστολείς όγκων, αλλά επίσης και από τη διαμόρφωση των παραγόντων κυτταρικής επιβίωσης. Στην παρούσα μελέτη, δείξαμε ότι επάνω και προς τα κάτω ρύθμιση δραστικότητας YAP μπορούσε ρυθμίζουν τον πολλαπλασιασμό, σχηματισμό αποικίας και δυνατότητες μετανάστευσης, και την αντίσταση σε χημειοθεραπευτικούς παράγοντες με καρκινικές κυτταρικές σειρές των ωοθηκών. Μία συστατικώς δραστική μεταλλαγμένη YAP αύξησε την αντίσταση σε φάρμακο απόπτωση που επάγεται από τα καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών, ενώ κυρίαρχα αρνητικά YAP αποκατασταθεί ευαισθησία φαρμάκου σε Cisplatin ανθεκτικά καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών.

Οι ακριβείς μηχανισμοί με τους οποίους YAP ενισχύει την αντίσταση του φαρμάκου παραμένουν ασαφείς . Αρκετές μελέτες επικεντρώθηκαν στην ΡΙ3Κ /Akt μονοπάτι για χημειο-αντίσταση σε καρκίνους των ωοθηκών και έδειξε ότι η σισπλατίνη θα μπορούσαν να ρυθμίζουν προς τα πάνω ρ53 και διεγείρει απόπτωση σε αυτά τα καρκινικά κύτταρα μετά την έκφραση της κυρίαρχης αρνητικής ΑΚΤ, η οποία πρότεινε ότι η σισπλατίνη μεσολάβηση ρ53 προς τα πάνω ρύθμιση ήταν αντίθετοι με ΑΚΤ. Η οδός ΡΙ3Κ /ΑΚΤ μπορούσε επίσης να συμμετέχει στην YAP μεσολάβηση αντοχής φαρμάκου, όπως έχει αποδειχθεί σαφώς ότι YAP είχε εμπλακεί σε cross-talk με οδούς ΡΙ3Κ και διευκόλυνε την ενεργοποίηση ΑΚΤ σε άλλους τύπους κυττάρων [32], [33]. Προηγούμενες μελέτες έδειξαν επίσης ότι υπερενεργοποίηση του μονοπατιού PI3K ξεκίνησε την ανάπτυξη του καρκίνου των ωοθηκών σε μοντέλα ποντικών. Η αλληλεπίδραση αυτών των δύο οδών θα πρέπει να διερευνηθεί περαιτέρω σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών.

Έχει διατυπωθεί η υπόθεση ότι τα καρκινικά κύτταρα χάνουν τα επιθηλιακά χαρακτηριστικά τους και να αποκτήσουν ορισμένες ιδιότητες μεσεγχυματικά που προωθούν εξωκυτταρικό περιβάλλον εισβολή και μακρινή μετάσταση σε EMT- σαν διαδικασία. Επιθηλιακά δείκτες που ρυθμίζεται προς τα κάτω κατά τη διάρκεια αυτής της μεταβατικής περιλαμβάνουν Ε-καδερίνης, κυτοκερατίνες, ΖΟ-1 και άλλα. Οι Hippo συστατικά μονοπατιού σηματοδότησης που απαιτούνται για το E-cadherin-εξαρτώμενη αναστολή επαφής του πολλαπλασιασμού.