Αφηρημένο

Η οικογένεια NEDD4 της Ε3 λιγάσες ουβικιτίνης περιλαμβάνει εννέα μέλη. Κάθε είναι μια σπονδυλωτή πρωτεΐνη, που περιέχει ένα Ν-τερματικό τομέα C2 για την κυτταρική εντόπιση, δύο έως τέσσερις κεντρικές περιοχές WW για την αναγνώριση υποστρώματος και ένα Ο-τερματικό, καταλυτική περιοχή HECT, το οποίο είναι υπεύθυνο για την κατάλυση της αντίδρασης ubiquitylation. Μέλη αυτής της οικογένειας είναι γνωστό ότι επηρεάζουν οδούς κεντρικές στην παθογένεση του ορθοκολικού καρκίνου, συμπεριλαμβανομένου του WNT, ΤΟΡβ, EGFR, και μονοπάτια p53. Πρόσφατα,

NEDD4

mRNA αναφέρθηκε ότι υπερεκφράζεται σε καρκίνο του παχέος εντέρου, αλλά το στάδιο του όγκου, δεν θεωρήθηκε στην ανάλυση. Η έκφραση των άλλων μελών της οικογένειας δεν έχει μελετηθεί σε καρκίνο του παχέος εντέρου. Στο παρόν, δεν προσδιορίζονται τα πρότυπα έκφρασης των εννέα μελών της οικογένειας NEDD4 σε 256 ασθενείς που παρουσιάζονται με τη νόσο που κυμαίνονται από προκαρκινικές αδένωμα στο στάδιο του καρκίνου του παχέος IV.

NEDD4

mRNA ήταν σημαντικά αυξημένη σε όλα τα στάδια καρκίνου του παχέος εντέρου. Σε αντίθεση,

NEDD4L

mRNA, το πιο κοντινό ομόλογο να

NEDD4

, ήταν η πιο μεγάλη μειωτικά μέλος της οικογένειας, και ήταν σημαντικά προς τα κάτω σε όλα τα στάδια όγκου. Βρήκαμε επίσης NEDD4L πρωτεΐνη μειώθηκε σημαντικά από τη δυτική αποτύπωση σε παχέος δείγματα καρκίνου σε σύγκριση με το παρακείμενο φυσιολογικό βλεννογόνο. Επιπλέον, NEDD4L, αλλά όχι καταλυτικά ανενεργό NEDD4L, ανέστειλε κανονική σηματοδότηση Wnt στο ή κάτω από το επίπεδο του β-κατενίνης

in vitro

. Τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν ότι NEDD4L μπορεί να παίζει ρόλο κατασταλτικό όγκου σε καρκίνο του παχέος εντέρου, πιθανώς μέσω αναστολής της κανονικής σηματοδότησης WNT

Παράθεση:. Tanksley JP, Chen X, Coffey RJ (2013) NEDD4L ρυθμίζεται προς τα κάτω σε καρκίνο του παχέος εντέρου και αναστέλλει Canonical σηματοδότηση Wnt. PLoS ONE 8 (11): e81514. doi: 10.1371 /journal.pone.0081514

Επιμέλεια: Chunming Liu, το Πανεπιστήμιο του Κεντάκι, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 22 Ιούλ, 2013? Αποδεκτές: 23 Οκτ 2013? Δημοσιεύθηκε: 28 Νοεμβρίου του 2013

Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης, χωρίς όλα τα πνευματικά δικαιώματα, και δεν μπορεί να αναπαραχθεί ελεύθερα, διανεμηθεί, να μεταδοθεί, τροποποιηθεί, χτισμένο πάνω, ή ειδάλλως να χρησιμοποιηθεί από οποιονδήποτε για οποιονδήποτε νόμιμο λόγο. Το έργο γίνεται διαθέσιμα υπό την Creative Commons CC0 αφοσίωση δημόσιο τομέα

Χρηματοδότηση:. Jarred Tanksley υποστηρίχθηκε από NCIP5095103, RO1CA46413 και GM007347. Xi Chen υποστηρίχθηκε από RO1CA158472. Robert J. Coffey υποστηρίχθηκε από NCIP5095103 και RO1CA46413. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Καρκίνος του παχέος εντέρου (CRC) είναι η τρίτη πιο κοινή μορφή καρκίνου στις Ηνωμένες Πολιτείες από την εμφάνιση, και το δεύτερο μετά τον καρκίνο του πνεύμονα σε θνησιμότητα, προκαλώντας περίπου 50.000 θανάτους κάθε χρόνο [1]. Η διαδικασία της ογκογένεσης σε σποραδικές CRC τυπικά αρχίζει με μια μετάλλαξη αδρανοποίησης στην

αδενωματώδη πολυποδίαση coli (APC)

γονίδιο που οδηγεί σε ανώμαλη ενεργοποίηση του κανονικού μονοπατιού σηματοδότησης WNT [2]. Στις υπόλοιπες περιπτώσεις, υπάρχει συχνά μια μετάλλαξη σε

CTNNB1

, το οποίο κωδικοποιεί β-κατενίνης [3]. Το αποτέλεσμα του καθενός από αυτές τις μεταλλάξεις είναι η μείωση ή απώλεια της ικανότητας ενός κυττάρου να στοχεύσει σωστά κυτταροπλασματικής β-κατενίνης με την πολυ-πρωτεΐνη Ε3 λιγκάσης της ουμπικουϊτίνης, πρωτεΐνη που περιέχει επανάληψη β-τρανσντουσίνης (β-TRCP), η οποία πολυ-ubiquitylates β κατενίνης, και στοχεύει στην πρωτεασώματος για την αποικοδόμηση [4]. Αντ ‘αυτού, β-κατενίνη συσσωρεύεται στον πυρήνα, και συνεργάζεται με τον παράγοντα μεταγραφής /LEF TCF να οδηγεί ένα μεταγραφικό πρόγραμμα που τελικά οδηγεί σε νεοπλασία. Σε αυτό το σενάριο, είναι η αδυναμία του κυττάρου να ελέγχουν τα επίπεδα της β-κατενίνης μέσω αποικοδόμησης ubiqitin μεσολάβηση που προωθεί την ογκογένεση. Ωστόσο, η διαδικασία του ubiquitylation σύνολό πιστεύεται ότι ρυθμίζεται προς τα πάνω στον καρκίνο, η οποία έχει οδηγήσει στην χρήση αναστολέων πρωτεασώματος σε θεραπεία CRC [5].

Ubiquitylation είναι μια διαδικασία διαδοχικής, τριών σταδίων που περιλαμβάνει ένα Ε1, Ε2, Ε3 και ουβικιτίνης λιγάση που έχει ως αποτέλεσμα την ομοιοπολική σύνδεση του ουβικιτίνη (ες), μια πρωτεΐνη 76 αμινοξέων, σε ένα υπόλειμμα (ες) Lys ενός υποστρώματος ή στόχου πρωτείνης. Είναι κομβικής σημασίας για την κυτταρική ομοιόσταση, βασικά με τη στόχευση πρωτεϊνών στο πρωτεασώματος ή λυσοσώματα για αποικοδόμηση μέσω της προσάρτησης της ουβικιτίνης αλυσίδες (πολυ-ubiquitylation). Ωστόσο, ubiquitylation έχει επίσης δειχθεί ότι παίζουν σημαντικό ρόλο στη διακίνηση, εντοπισμός και δραστικότητα των πρωτεϊνών, ειδικά όταν υπάρχει η προσθήκη μόνο ενός ημίσεως ubiquityl, ονομάζεται μονο-ubiquitylation [6]. ειδικότητα στόχου παρέχεται κυρίως από Ε3 λιγάσες, που καταλύουν το τελικό στάδιο της ουβικιτίνης προσκόλληση. Στο ανθρώπινο γονιδίωμα, υπάρχουν πάνω από 600 Ε3 λιγάσες, έναντι περίπου 30 E2s και δύο E1s. Μια δεδομένη Ε3 μπορεί να έχει πολλούς στόχους, και μπορεί να ενεργοποιήσει ή να αναστείλει πολλαπλές οδούς κυτταρικής σηματοδότησης [7]. Υπάρχουν δύο κύριες οικογένειες Ε3:. το πολύ ενδιαφέροντα νέο γονίδιο (RING) οικογένεια, η οποία περιλαμβάνει 95% όλων των Ε3, και η ομόλογη με την οικογένεια Ε6-ΑΡ καρβοξυλο άκρο (HECT), που περιλαμβάνει το υπόλοιπο 5% [8]

Η οικογένεια NEDD4 του HECT τύπου Ε3 περιλαμβάνει εννέα μέλη [9]. Κάθε μέλος είναι μια σπονδυλωτή πρωτεΐνη, με μια Ν-τελική περιοχή C2, δύο έως τέσσερις κεντρικές περιοχές WW, και ένα Ο-τερματικό, καταλυτική περιοχή HECT. Οι τομείς WW είναι υπεύθυνοι για την επιλογή στόχου, και να αλληλεπιδρούν με τέσσερα μοτίβο αμινοξέων (PY μοτίβο, PPXY) στην πρωτεΐνη-στόχο, ενώ οι ενισχύσεις τομέως C2 στην κατάλληλη κυτταρική εντόπιση. Ο τομέας HECT είναι υπεύθυνο για την πρόσληψη του Ε2, η οποία χρησιμεύει ως φορέας για ουμπικουϊτίνης και άμεσα συζυγή ουβικουϊτίνης στο στόχο υπόλειμμα Lys, μια διαδικασία που απαιτεί μια δραστική θέση υπολείμματος Cys. Το ιδρυτικό μέλος αυτής της οικογένειας, NEDD4, έχει πρόσφατα δειχθεί ότι ρυθμίζεται προς τα πάνω σε CRC, και να προωθήσει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων CRC

in vitro

, αν και ο μηχανισμός παραμένει ασαφής [10]. Πέρα από τη μελέτη αυτή, τίποτα δεν είναι γνωστό σχετικά με τις μορφές έκφρασης της οικογένειας NEDD4 στο CRC. Αξίζει να σημειωθεί ότι πολλά από τα μέλη της οικογένειας NEDD4 έχουν βρεθεί να στοχεύουν πρωτεΐνες που είναι αναπόσπαστο παίκτες σε μονοπάτια πιστεύεται ότι είναι πιο σημαντικό στην γένεση και την εξέλιξη της CRC.

Σε αυτή τη μελέτη, επιδιώξαμε να προσδιοριστεί η έκφραση του mRNA επίπεδα καθενός από τα εννέα μέλη της οικογένειας NEDD4 σε όγκους από μια μεγάλη ομάδα ατόμων με ορθοκολικό νεοπλασία. Βρήκαμε ότι

NEDD4

είναι η πιο μεγάλη απορυθμίζεται μέλος της οικογένειας. Παραδόξως,

NEDD4L

, η οποία μοιράζεται την μεγαλύτερη ομολογία αλληλουχίας με το

NEDD4

, ήταν ο πιο υψηλά μειωτικά μέλος της οικογένειας στο CRC. Επιβεβαιώσαμε την προς τα κάτω ρύθμιση του NEDD4L στο πρωτεϊνικό επίπεδο σε ανθρώπινα δείγματα CRC. Πρόσφατα, NEDD4L δείχθηκε να υποβαθμίσει DVL2, αναστέλλοντας έτσι σηματοδότηση Wnt, όπως προσδιορίζεται με μειωμένη δραστηριότητα TOPFlash [11]. Βρήκαμε επίσης ότι NEDD4L αναστέλλει τη δραστικότητα TOPFlash στο ή κάτω από το επίπεδο της β-κατενίνης. Στο σύνολό τους, τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν ότι NEDD4L έχει τη δυνατότητα να δρα ως καταστολέας των όγκων στο CRC.

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθική δήλωση

Όλα τα ανθρώπινα δείγματα που χρησιμοποιούνται στην χειρόγραφο μας συλλέχθηκαν και αναλύθηκαν σε συμφωνία με ένα πρωτόκολλο που εγκρίθηκε από την Institutional Review Boards στο Vanderbilt University Medical Center, Νάσβιλ, TN, και Moffitt Κέντρο Καρκίνου, Tampa, FL. Τα δείγματα που χρησιμοποιούνται στην παρούσα δημοσίευση έχουν περιγραφεί προηγουμένως [12], [13]. Τα προκύπτοντα δεδομένα αναλύθηκαν ανώνυμα.

Ανθρώπινο δείγμα ιστού ανάλυση μικροσυστοιχιών

Ένα σύνολο 250 δειγμάτων ανθρώπινου ιστού CRC συλλέχθηκαν σε VUMC (Ν = 55) και MCC (Ν = 195). Από αυτά τα δείγματα CRC, 33 ήταν σταδίου Ι (13,2%), 76 Στάδιο ΙΙ (30,4%), 82 Στάδιο ΙΙ (32,8%), και 59 Stage IV (23,6%). Παρακείμενο φυσιολογικό ιστό συλλέχθηκε σε MCC από δέκα από αυτούς τους ασθενείς. Από αυτά, τα δύο συλλέχθηκαν από το Στάδιο Ι, πέντε από το στάδιο ΙΙ, και τρεις από τους ασθενείς σταδίου ΙΙΙ. Επιπλέον έξι αδενώματα συλλέχθηκαν σε MCC. Τα δείγματα που χρησιμοποιούνται στην παρούσα δημοσίευση έχουν περιγραφεί προηγουμένως [12], [13]. λήφθηκε RNA από αυτούς τους ιστούς και υβριδοποιήθηκε με τον Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 GeneChip Έκφραση Array. Οι ακόλουθοι ανιχνευτές αναλύθηκαν:

NEDD4

(213012_at),

NEDD4L

(237498_at, 241396_at, 212445_s_at, 212448_at),

WWP1

(212637_s_at, 212638_s_at),

WWP2

(1552737_s_at, 1554580_a_at, 204022_at, 210200_at),

ITCH

(209743_s_at, 209744_x_at, 217094_s_at, 235057_at, 239101_at),

SMURF1

(1559426_at, 212666_at, 212668_at, 215458_s_at, 232665_x_at ),

SMURF2

(205596_s_at, 227489_at, 232020_at),

NEDL1

(210331_at, 215584_at), και

NEDL2

(232080_at, 243080_at). Από τα τέσσερα ανιχνευτές ειδικούς για

NEDD4L

, εστιάσαμε την προσοχή μας σε 212445_s_at καθώς κωδικοποιεί ένα τμήμα της μεταφρασμένης πρωτεΐνης. Τρεις από τις τέσσερις NEDD4L ανιχνευτές σημαντικά προς τα κάτω σε ένα παρόμοιο τρόπο, ενώ ένα (237498_at) παρέμεινε αμετάβλητη με την εξέλιξη.

Οι ασθενείς στην ομάδα VUMC είχαν διάμεση παρακολούθηση 50,2 μηνών, με ελάχιστο ακόλουθα μέχρι 0,4 μήνες και κατ ‘ανώτατο όριο 111,3 μήνα. Εκείνοι στην ομάδα MCC είχαν διάμεση παρακολούθηση 44,7 μηνών, με ελάχιστο 0,92 και μέγιστο 142,8 μήνα. Όλα αυτά τα δείγματα συλλέχθηκαν και αναλύθηκαν σε συμφωνία με ένα πρωτόκολλο που εγκρίθηκε από την Institutional Review Boards τόσο VUMC και MCC.

ανάλυση Western blot

CRC ιστό και τα γειτονικά φυσιολογικά δείγματα βλεννογόνο του κόλου συλλέχθηκαν από 20 άτομα σε χειρουργική εκτομή σε VUMC και καταψύχθηκαν σε υγρό άζωτο. Τα δείγματα στη συνέχεια υποβάλλονται σε λύση εντός 8 Μ ουρίας, κατεργασία με υπερήχους και φυγοκεντρήθηκαν στις 14.000 rpm. Το υπερκείμενο απομακρύνθηκε, και η πρωτεΐνη ποσοτικοποιήθηκε με μέτρηση της απορρόφησης στα 280 nm. Τα δείγματα στη συνέχεια σε ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου 7,5% και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες νιτροκυτταρίνης. Οι μεμβράνες κηλιδώθηκαν με αντισώματα αντι-NEDD4L (1:2000) (Bethyl Laboratories, Montgomery, ΤΧ) και αντι-α-τουμπουλίνης (1:2000) (TUBA) (Calbiochem, San Diego, CA), και ανιχνεύθηκαν με τη χρήση κατάλληλων HRP συζευγμένο δευτερογενή αντισώματα και τη μέθοδο χημειοφωταύγειας. Οι εντάσεις των κηλίδων κατόπιν ποσοτικοποιούνται χρησιμοποιώντας το λογισμικό ImageJ, και αναλύθηκαν.

TOPFlash δοκιμασία

Οι επιμολύνσεις πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας Metafectene (Biontex, San Diego, CA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. ΗΕΚ293 κύτταρα (2 χ 10

5) τοποθετήθηκαν σε ένα τρυβλίο 12 φρεατίων, αφέθηκαν να προσκολληθούν, και επιμολύνονται την επομένη με 0,1 μg κάθε πλασμιδίου. Τα ακόλουθα πλασμίδια χρησιμοποιήθηκαν: πλασμίδιο TOPFlash δημοσιογράφος, πλασμίδιο ανταποκριτής FOPFlash, pcDNA3.1, NEDD4L (KIAA0439) (Addgene πλασμίδιο 27000), και NEDD4L (C & gt? Α) (Addgene πλασμίδιο 27001) [14]. Τα κατασκευάσματα που περιέχουν άγριου τύπου (wt) β-κατενίνης και της μεταλλαγμένης β-κατενίνης (ΔN89) ήταν ένα δώρο από τον Ethan Lee στο Πανεπιστήμιο Vanderbilt. Την ημέρα μετά την επιμόλυνση, το μέσο απομακρύνθηκε, και μέσο ελεύθερο ορού που περιέχει 20 ng /ml Wnt3A και 100 ng /ml R-spondin (Vanderbilt Αντίσωμα και Πρωτεΐνη κοινός πόρος) προστέθηκε. Την επόμενη ημέρα, τα κύτταρα λύθηκαν και υποβάλλονται σε επεξεργασία σε συμφωνία με το κιτ δοκιμασίας λουσιφεράσης (Promega, Fitchburg, WI). TOPFlash δραστηριότητα ομαλοποιήθηκε με τη δραστηριότητα FOPFlash, και διπλώστε ενεργοποίηση προσδιορίστηκε με κανονικοποίηση με τη δραστηριότητα TOPFlash και FOPFlash σε μη διεγερμένα κύτταρα. Όλα τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν τουλάχιστον τρεις φορές.

NEDD4L knock-down

λεντοϊών πλασμίδια που περιέχουν shRNA (Open Biosystems, Huntsville, AL) ενάντια στην ανθρώπινη

NEDD4L

μετήχθησαν σε κύτταρα ΗΕΚ293 χρησιμοποιώντας Metafectene. Την επόμενη ημέρα, προστέθηκε φρέσκο ​​μέσο. Την επόμενη ημέρα το μέσο διηθήθηκε (0,45 μm φίλτρα). Για να μολύνουν DLD-1 και κυττάρων RKO, 2.0 × 10

5 κύτταρα τοποθετήθηκαν σε κάθε φρεάτιο μιας 6-φρεατίων, και έχουν μολυνθεί με τον φακοϊό. Μετά από δύο ημέρες, η έκφραση GFP παρετηρήθη, και μολυσμένα κύτταρα επιλέχθηκαν με πουρομυκίνη (5 μg /ml) και ταξινομημένο για έκφραση GFP. Αποτελεσματικότητα των knock-down προσδιορίστηκε από NEDD4L κηλίδωση western.

Η στατιστική ανάλυση

Για να συγκρίνουν το επίπεδο έκφρασης του κάθε αισθητήρα μεταξύ της κανονικής, αδένωμα, και τα δείγματα καρκινικού ιστού, η δοκιμασία αθροίσματος κατάταξης Wilcoxon χρησιμοποιήθηκε [12], [13]. Για τον προσδιορισμό των σχετικών επιπέδων πρωτεΐνης, τα επίπεδα της πρωτεΐνης NEDD4L κανονικοποιήθηκαν σε επίπεδα τούμπα, log-μετασχηματισμένα, και συγκρίθηκε με χρήση ενός αντίστοιχου t-test. ανάλυση επιβίωσης Kaplan-Meier διεξήχθη για το σύνολο δεδομένων μικροσυστοιχίας προκειμένου να καθοριστεί συγκεκριμένες ασθένειες επιβίωση. Νόσος-ειδική επιβίωση ορίστηκε ως μια τεκμηριωμένη θανάτου από καρκίνο που σχετίζονται με [12]. επίπεδα σημαντικότητας στο πείραμα δοκιμασία ρεπόρτερ TOPFlash προσδιορίστηκαν με τη χρήση t-test του Student.

Αποτελέσματα

Τα επίπεδα έκφρασης των μελών της οικογένειας NEDD4 στο CRC

Τα εννέα μέλη της NEDD4 οικογένεια του Ε3 λιγάσες ουβικιτίνης είναι αρθρωτά πρωτεΐνες (Σχήμα 1). Ως σύνολο, η οικογένεια NEDD4 είναι γνωστό ότι εμπλέκεται στην ρύθμιση ενός αριθμού πρωτεϊνών και οδούς που είναι κεντρικής σημασίας για την ανάπτυξη της CRC. Ο πίνακας 1 είναι μια συλλογή από γνωστά υποστρώματα, μονοπάτια που επηρεάζονται, και τα επίπεδα έκφρασης σηματοδότησης σε διάφορους καρκίνους όλων των μελών της οικογένειας NEDD4. Υπάρχει υψηλή ομολογία αλληλουχίας μεταξύ των μελών της οικογένειας, η οποία εξηγεί τον κοινόχρηστο στόχους πολλών από τα μέλη της οικογένειας. Ωστόσο, υπάρχουν επίσης παραδείγματα διαφορετικών μελών της οικογένειας που έχουν αντίθετα αποτελέσματα επί της ίδιας οδού σηματοδότησης. Για παράδειγμα, NEDD4 προκαλεί την προς τα κάτω ρύθμιση SMAD1 και CBL, η οποία αναστέλλει την μορφογενετική πρωτεΐνη οστού σηματοδότηση (ΒΜΡ) και ενεργοποιεί τον υποδοχέα του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGFR) σηματοδότησης, αντίστοιχα [15], [16]. Από την άλλη πλευρά, NEDD4L επιπτώσεις μετασχηματισμού αυξητικού παράγοντα-β (ΤΟΡβ) σηματοδότησης, αλλά όχι BMP σηματοδότηση, μέσω της αποδόμησης του SMAD 2 και 3 και του τύπου Ι ΤΟΡβ υποδοχέα και καταργεί EGFR σηματοδότηση μέσω μεσολάβηση της ουβικιτίνης, αποδόμηση των ενεργοποιημένων CDC42 κινάση 1 (ACK1) [14], [17], [18]. Επιπλέον, NEDD4 έχει δειχθεί ότι ρυθμίζουν προς τα κάτω την ογκοκατασταλτικού ΡΤΕΝ [19]. Ωστόσο, NEDD4 φάνηκε να προωθήσει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων CRC

in vitro

, ανεξάρτητα από την επίδραση στα επίπεδα PTEN [10].

Τα εννέα μέλη της οικογένειας NEDD4 είναι αρθρωτά πρωτεΐνες. Στο Ν-άκρο τους, το καθένα έχει μια περιοχή C2, η οποία παίζει ρόλο στην σωστή κυτταρική εντόπιση. Το κεντρικό τμήμα κάθε πρωτεΐνης περιέχει δύο έως τέσσερα WW πεδία, τα οποία είναι υπεύθυνα για την αναγνώριση στόχου. WW περιοχές είναι 20-23 αμινοξέων, Trp-based μοτίβα που αναγνωρίζουν μοτίβα ΡΥ (PPXY, LPXY), καθώς επίσης και κάποια φωσφο-Ser- ή μοτίβα φωσφο-Thr-βάση. Στο C-τελικό άκρο είναι ο τομέας HECT, το οποίο συζεύγνυται άμεσα χαρακτηριστική ομάδα ubiquityl στην πρωτεΐνη-στόχο. Τα μέλη της οικογένειας συγκεντρώνονται από το όνομα και ομολογίας. ITCH είναι περισσότερο ομόλογο με WWP1 και 2 από ό, τι σε άλλα μέλη της οικογένειας.

Η

Για να προσδιοριστεί μια πιθανή ρόλο για την οικογένεια NEDD4 στην έναρξη ή την εξέλιξη της CRC, υποβάλλαμε 250 CRC δείγματα ασθενών όγκου των διαφορετικών σταδίων, έξι δείγματα αδένωμα, και 10 παρακείμενα φυσιολογικά δείγματα για ανάλυση μικροσυστοιχιών, σημειώνοντας πως η έκφραση του κάθε μέλους της οικογένειας άλλαξε με εξέλιξης (Σχήμα 2Α). Είναι ενδιαφέρον, το στενά ομόλογο ζεύγος

NEDD4

και

NEDD4L

ήταν αντίθετα ρυθμιζόμενη (Σχήμα 2Β, C).

NEDD4

(213012_at) κινήθηκαν προς τα άνω κατά το στάδιο αδένωμα, αλλά ήταν σημαντικά αυξημένα στο Στάδιο 1 CRC και παρέμεινε σημαντικά αυξημένα κατά τη διάρκεια της προόδου του όγκου. Αντίθετα,

NEDD4L

(212445_s_at) έκφραση μειώθηκε, τείνοντας προς τα κάτω στα αδενώματα, και μειώθηκε σημαντικά σε όλα τα στάδια της CRC (Σχήμα 2C).

(Α) Η έκφραση όλων των εννέα οικογένειας NEDD4 μελών εξετάστηκε σε CRC από microarray προφίλ. Εμφανίζεται εδώ είναι ο μέσος όρος πολλαπλή μεταβολή όλων των ανιχνευτών για κάθε μεμονωμένο γονίδιο στο ΝΙ (Ν = 10), Ad (Ν = 6), CA 1 (Ν = 33), Ca2 (Ν = 76), Ca3 (Ν = 82) και CA4 (Ν = 59). (Β)

NEDD4

(213012_at) είναι η πιο μεγάλη απορυθμίζεται μέλος της οικογένειας NEDD4 στο CRC. (C)

NEDD4L

(212445_s_at) είναι η πιο μεγάλη μειωτικά μέλος της οικογένειας NEDD4 στο CRC. NL = φυσιολογικό, Ad = αδένωμα, και Α 1-4 = CRC, το στάδιο I-IV. * P & lt?. 0.05

Η

πρωτεΐνη NEDD4L μειώνεται στο CRC

Καθώς τα επίπεδα μεταγραφής ενός συγκεκριμένου γονιδίου δεν συσχετίζονται πάντα με τα επίπεδα της πρωτεΐνης, είμαστε δίπλα καθοριστεί αν η μείωση στην

NEDD4L

επίπεδα mRNA οδήγησε σε μείωση της NEDD4L πρωτεΐνη. Για να γίνει αυτό, πραγματοποιήθηκε ανάλυση στυπώματος western σε γειτονικά δείγματα φυσιολογικού ανθρώπινου ιστού CRC και από 20 ασθενείς που χρησιμοποιούν ιστός συλλέγεται στο Ιατρικό Κέντρο του Πανεπιστημίου Vanderbilt (Σχήμα 3Α, Β). Παρατηρήσαμε μια σημαντική μείωση στα επίπεδα της πρωτεΐνης NEDD4L (~42%) σε ανθρώπινο CRC σε σύγκριση με το φυσιολογικό ιστό, ένα εύρημα σύμφωνο με την ανάλυση μικροσυστοιχιών.

(Α) επίπεδα NEDD4L προσδιορίστηκαν με western αποτύπωση της CRC (Ca ) και δίπλα κανονική (NL) βλεννογόνου από είκοσι άτομα. Επίπεδα ομαλοποιήθηκαν να TUBA και ΝΙ συγκρίθηκε με Ca. NEDD4L ήταν σημαντικά ρυθμισμένη προς τα κάτω (~42%) σε CRC (* ρ & lt? 0,05). Τα δεδομένα που εκπροσωπούνται στο κουτί και μουστακιού μορφή οικόπεδο. Οι γραμμές που συνδέουν τα σημεία δεδομένων δείχνουν τα σχετικά επίπεδα NEDD4L σε μια δεδομένη NL-Ca ζεύγος. Κόκκινο δηλώνει μειωμένα επίπεδα NEDD4L σε Ca, ενώ το μαύρο υποδηλώνει αύξηση. (Β) Τα προϊόντα της λύσης που παράγεται από ΝΙ-Ca ζεύγη αποτυπώθηκαν για NEDD4L και TUBA. Που παρουσιάζονται εδώ είναι τέσσερα αντιπροσωπευτικά ζεύγη.

Η

Είμαστε δίπλα φρόντισε να διαπιστώσει αν τα επίπεδα έκφρασης NEDD4L συσχετίζονται με συγκεκριμένες ασθένειες επιβίωσης στην ομάδα των ασθενών μας. Συγκρίναμε την επιβίωση των ασθενών στο υψηλότερο τεταρτημόριο της έκφρασης NEDD4L με εκείνη αυτών στο χαμηλότερο τεταρτημόριο (Σχήμα 4). Βρήκαμε ότι οι ασθενείς με την υψηλότερη έκφραση NEDD4L επέδειξε μία μεγαλύτερη περίοδο συγκεκριμένες ασθένειες επιβίωση από εκείνους τους ασθενείς με τα χαμηλότερα επίπεδα έκφρασης. Η διαφορά αυτή, ωστόσο, δεν ήταν στατιστικά σημαντική (p = 0,079).

Νόσος ειδικό επιβίωση σε ασθενείς CRC με την υψηλότερη και τη χαμηλότερη έκφραση NEDD4L συγκρίθηκε χρησιμοποιώντας ανάλυση Kaplan-Meier. Εκείνοι οι ασθενείς με δείγματα όγκου στο υψηλότερο τεταρτημόριο της έκφρασης NEDD4L έδειξε μία τάση προς μεγαλύτερη συγκεκριμένες ασθένειες επιβίωση για μια περίοδο 60 μηνών. p = 0,079.

Η

NEDD4L καταστέλλει την κανονική σηματοδότηση Wnt

Η σημαντική μείωση στην NEDD4L έκφραση στο CRC υποδηλώνει την πιθανότητα ότι NEDD4L παίζει έναν όγκο-κατασταλτικό ρόλο στην CRC. Με δεδομένη την κεντρικότητα της κανονικής σηματοδότηση Wnt στην έναρξη και την εξέλιξη της CRC, ερευνήσαμε αν NEDD4L μπορεί να καταστείλει κανονική σηματοδότηση WNT από την εκτέλεση της δοκιμασίας ρεπόρτερ TOPFlash, η οποία μετρά κανονική δραστηριότητα WNT με σύντηξη LEF στοιχεία TCF /απάντηση σε πυγολαμπίδα ανταποκριτή λουσιφεράσης. NEDD4L ανέστειλε δραστηριότητα TOPFlash όταν κανονική σηματοδότηση WNT ενεργοποιήθηκε με την προσθήκη Wnt3A και του συνενεργοποιητή, R-spondin (Σχήμα 5Α). Αναστολή φαίνεται να εξαρτάται από την ικανότητα του NEDD4L να ubiquitylate πρωτεΐνες-στόχους, όπως την καταλυτικά αδρανή μορφή NEDD4L, στην οποία η δραστική θέση Cys μεταλλάχθηκε σε Ala [NEDD4L (C & gt? A)] δεν έδειξε αναστολή της δραστηριότητας TOPFlash ( Εικόνα 5Α) [20]. Αυτά τα αποτελέσματα υποστηρίζουν το πρόσφατο εύρημα που NEDD4L αναστέλλει σηματοδότηση Wnt από ubiquitylating και στόχευση DVL2 στην πρωτεασώματος για την υποβάθμιση [11]. Ωστόσο, βρήκαμε επίσης ότι NEDD4L ανέστειλε κανονική σηματοδότηση WNT όταν κ.β. ή μεταλλαγμένων (ΔN89) β-κατενίνης χρησιμοποιήθηκε ως ενεργοποιητής (Σχήμα 5Β), γεγονός που υποδηλώνει NEDD4L καταστέλλει σηματοδότηση Wnt κατάντη του DVL παρουσία μεταλλαγμένου APC ή CTNNB1.

(Α) NEDD4L αναστέλλει TOPFlash δραστικότητα σε κύτταρα ΗΕΚ293 σε σύγκριση με κενό φορέα (CTL) ή καταλυτικά ανενεργό NEDD4L [NEDD4L (C & gt? Α)]. Wnt3A (20 ng /ml) και το R-spondin (100 ng /ml) χρησιμοποιήθηκαν για να ενεργοποιήσουν κανονική σηματοδότηση WNT. (Β) όταν δύο διαφορετικά κατασκευάσματα β-κατενίνης, β-κατενίνης (wt) και β-κατενίνης (ΔN89), χρησιμοποιούνται για την ενεργοποίηση κανονική σηματοδότηση Wnt μία σημαντική μείωση της δραστηριότητας TOPFlash παρατηρήθηκε παρουσία NEDD4L υπερέκφρασης, σε σύγκριση με άδειο φορέα ή NEDD4L (C & gt? Α). Όλα τα αποτελέσματα κανονικοποιούνται σε FOPFlash δραστηριότητα. * P & lt?. 0.05

Η

Για να επεκτείνει το έργο αυτό, εξετάσαμε τις επιδράσεις της ανάπτυξης του να χτυπήσει κάτω ενδογενούς NEDD4L σε δύο ανθρώπινες κυτταρικές σειρές CRC, DLD-1 και RKO. κυττάρων DLD-1 περιέχει μια περικοπή μετάλλαξη στο

APC

, ενώ τα κύτταρα RKO δεν έχουν ούτε μια μετάλλαξη στο

APC

ούτε

CTNNB1

, αλλά έχουν μια μετάλλαξη αδρανοποίησης στην

NKD1

, ένας επαγώγιμος αρνητικός ρυθμιστής της σηματοδότηση Wnt [21]. Knock-down επαληθεύτηκε με στύπωση western (~ 80%) (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Μετρήσαμε την ανάπτυξη σε πλαστικό, και σε μαλακό άγαρ και το κολλαγόνο. Δεν παρατηρήσαμε σημαντικές διαφορές στην ανάπτυξη σε κύτταρα με NEDD4L knock-κάτω σε σύγκριση με κωδικοποιημένα ελέγχους (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Επιπλέον, NEDD4L knock-down δεν είχε καμία επίδραση στο μέγεθος του όγκου σε ξενομοσχεύματα γυμνού ποντικιού (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Συζήτηση

Η παρούσα μελέτη διεξήχθη για να αρχίσετε να καταλαβαίνετε αν υπάρχει ένας ρόλος για μέλη της οικογένειας NEDD4 του Ε3 λιγάσες ουβικιτίνης σε CRC. Εννέα μέλη περιλαμβάνουν αυτή την οικογένεια, και το καθένα έχει δειχθεί ότι επηρεάσουν τουλάχιστον μία από τις κεντρικές κυτταρικά μονοπάτια για την έναρξη και την εξέλιξη του CRC. Αρκετά μέλη δειχθεί ότι απορυθμίζεται σε έναν αριθμό διαφορετικών καρκίνων. Ωστόσο, μια συστηματική αξιολόγηση των επιπέδων έκφρασης όλων των μελών της οικογένειας στην ανθρώπινη CRC δεν έχει προηγουμένως πραγματοποιηθεί. Αξίζει να σημειωθεί ότι,

NEDD4

έκφραση του mRNA πρόσφατα φαίνεται να ρυθμίζεται προς τα πάνω στην CRC, αλλά αυτή η ανάλυση δεν εξέτασε το στάδιο της CRC, ή περιλαμβάνουν αδενώματα [10]. Θεωρήσαμε ότι το πρώτο βήμα στην αρχή να καταλάβει αυτή η οικογένεια της Ε3 στο CRC ήταν να εξετάσει τα επίπεδα έκφρασης του κάθε μέλους της οικογένειας σε CRCs από μια μεγάλη ομάδα ασθενών. Επιλέξαμε να εκτελέσει την ανάλυσή μας σε όλα τα στάδια, συμπεριλαμβανομένης της αδενώματα, καθώς υπάρχουν συνήθως μεταβολές σε παρόμοιες οδούς σε παρόμοιες σημεία κατά τη διάρκεια της εξέλιξης CRC [2]. Ορισμένα από αυτά τα μονοπάτια έχουν διαφορετικές λειτουργίες σε διαφορετικά στάδια. Για παράδειγμα, η οδός ΤΟΡβ είναι ένα ογκοκατασταλτικό νωρίς CRC, αλλά προωθεί την εξέλιξη και τη μετάσταση αργότερα [22].

Εδώ, αξιολογήσαμε το πώς η έκφραση του κάθε μέλους της οικογένειας αλλαγές NEDD4 με εξέλιξη από αδένωμα στο στάδιο IV CRC. Η πιο μεγάλη απορυθμίζεται μέλος της οικογένειας ήταν

NEDD4

, σε συμφωνία με τα προαναφερθέντα ευρήματα [10]. Εμείς πάμε για να δείξουμε ότι η αυξητική ρύθμιση εμφανίζεται νωρίς στη CRC (στάδιο Ι), και προς τα πάνω ρύθμιση διατηρείται κατά τη διάρκεια της εξέλιξης. Η πιο μεγάλη μειωτικά μέλος της οικογένειας στο σύνολο των δεδομένων μας ήταν

NEDD4L

. Βρήκαμε αυτό αποτελεί έκπληξη, δεδομένου ότι NEDD4L συμμερίζεται την υψηλότερη ομολογία αλληλουχίας με NEDD4, και έχει αποδειχθεί ότι έχουν μια σημαντική επικάλυψη με NEDD4 στην επιλογή στόχος [7]. Πρόσφατα, τα επίπεδα πρωτεΐνης NEDD4L δείχθηκαν να ρυθμίζεται προς τα κάτω σε γαστρικό καρκίνο, και αυτοί οι ασθενείς με το χαμηλότερο έκφραση με ανοσοϊστοχημική ανάλυση είχε μια χειρότερη πρόγνωση [23]. NEDD4L έχει επίσης βρεθεί ότι είναι και ρυθμίζεται προς τα πάνω και προς τα κάτω σε καρκίνο του προστάτη, η αυξημένη σε διηθητικό καρκίνο της χοληδόχου κύστης κύτταρα, και προς τα κάτω σε πιο επιθετική κακοήθη γλοιώματα [24] – [27]. Αυτά τα ανόμοια ευρήματα δεν είναι απροσδόκητο δεδομένου του αριθμού των στόχων και των κυτταρικών μονοπατιών σηματοδότησης επί των οποίων NEDD4L έχει βρεθεί να δρα.

Μια πρόσφατη έκθεση έδειξε ότι NEDD4L αναστέλλει τόσο τις κανονικές και μη κανονικές σηματοδότηση Wnt μονοπάτια από ubiquitylating DVL2 , και στόχευση του πρωτεασώματος για καταστροφή [11]. Εδώ, βρήκαμε ότι NEDD4L μπορούν επίσης να αναστείλουν κανονική σηματοδότηση WNT στο επίπεδο του, ή προς τα κάτω από, β-κατενίνης. Αυτό έρχεται σε αντίθεση με την προαναφερθείσα χαρτί, στην οποία οι ερευνητές έδειξαν ότι NEDD4L δεν θα μπορούσε να αναστείλει TOPFlash όταν σηματοδότηση ενεργοποιείται με ένα μεταλλαγμένο β-κατενίνης (S37A). Στη μελέτη τους, ισομορφή 2 του NEDD4L (NM_001144964.1) χρησιμοποιήθηκε, ενώ χρησιμοποιήσαμε μια διαφορετική ισομορφή NEDD4L (KIAA00439). Αυτά τα δύο cDNAs διαφέρουν στο Ν-άκρο τους? το κατασκεύασμα που χρησιμοποιείται στη μελέτη μας έχει ένα επιπλέον υπολείμματα 141 αμινοξέων στο άμεσο Ν-τελικό άκρο, η οποία τροποποιεί τον τομέα C2, και 20 λιγότερα υπολείμματα σε ένα τμήμα πριν από τη δεύτερη περιοχή ww. Αυτό θα μπορούσε να συμβάλει στη διαφορική εντοπισμό ή υπόστρωμα στόχευση. Επιπλέον, διαφορετικά κατασκευάσματα β-κατενίνης ελέγχθηκαν? χρησιμοποιήσαμε βάρος και μεταλλαγμένων β-κατενίνης (ΔN89), και, στην προηγούμενη έκθεση, χρησιμοποιήθηκε β-κατενίνης (S37A).

Βρήκαμε ότι χτυπούν κάτω από την έκφραση των ενδογενών

NEDD4L

σε δύο γραμμές CRC δεν είχε καμία επίδραση στην ανάπτυξη. Αυτό θα μπορούσε να οφείλεται στο γεγονός ότι αυτές οι κυτταρικές σειρές έχουν ήδη εξελιχθεί ένα μηχανισμό για να ξεπεραστούν οι ανασταλτικές της ανάπτυξης επιδράσεις της NEDD4L, ή ότι τα κύτταρα έχουν ήδη επιτύχει μια ενδογενή μείωση της NEDD4L έκφραση σε ένα επίπεδο κάτω από αυτό το αναγκαίο για την αναστολή της ανάπτυξης. Μελλοντικές μελέτες θα αντιμετωπίσουν αυτό με την υπερεκφράζουν βάρος NEDD4L σε μια μπαταρία των γραμμών CRC. Τελικά, μπορεί να είναι απαραίτητο να δημιουργηθεί ένα μοντέλο ποντικού στο οποίο NEDD4L είναι νοκ-out νωρίς στη διαδικασία της ογκογένεσης.

Εν κατακλείδι, έχουμε εξετάσει την έκφραση του mRNA της οικογένειας NEDD4 της Ε3 λιγάσες ουβικιτίνης σε ένα μεγάλο ομάδα των ατόμων με ορθοκολικό νεοπλασία. Η πιο υψηλά ρυθμισμένη προς τα πάνω μέλος είναι

NEDD4

, το οποίο έχει προηγουμένως αποδειχθεί ότι ενισχύει τον πολλαπλασιασμό των ανθρώπινων κυττάρων CRC

in vitro

[10]. Η πιο μεγάλη μειωτικά μέλος είναι

NEDD4L

. Σε συμφωνία με τα προηγούμενα ευρήματα, NEDD4L υπερέκφραση σε κύτταρα ΗΕΚ293 ανέστειλε κανονική σηματοδότηση Wnt [11]. Εδώ, δείχνουμε επίσης ότι NEDD4L αναστέλλει σηματοδότηση Wnt στο ή προς τα κάτω του β-κατενίνης, η οποία είναι σημαντική στο πλαίσιο των πιο κοινών μετάλλαξη ενεργοποίησης σε κανονική σηματοδότηση WNT που βρίσκονται στο CRC. Ως εκ τούτου, προτείνουμε ότι NEDD4L μπορεί να δρα ως καταστολέας των όγκων στο CRC αναστέλλοντας κανονική σηματοδότηση WNT.

Ευχαριστίες

Οι συγγραφείς θα ήθελαν να αναγνωρίσουν Bruce Aronow, Dan Ayers, ο Tim Yeatman, και ο Josh Smith για τη βοήθειά τους με την ανάλυση των δεδομένων, και ο Jim Higginbotham για τη βοήθειά του με διαλογή ροής. Οι συγγραφείς επίσης να ευχαριστήσω Emily Poulin για την εκδοτική βοήθειά της.