Αφηρημένο

Ιστορικό

Υπάρχει μια αυξανόμενη ζήτηση για ακριβή βιοδεικτών για την πρόωρη μη επεμβατική παχέος ανίχνευση του καρκίνου. Χρησιμοποιήσαμε ένα γονιδίωμα-κλίμακας μέθοδος ανακάλυψης δείκτη για τον εντοπισμό και την επαλήθευση βιοδείκτες μεθυλίωση υποψήφιο DNA για το αίμα που βασίζεται ανίχνευση του καρκίνου του παχέος εντέρου.

Μεθοδολογία /Κύρια Ευρήματα

Χρησιμοποιήσαμε τα στοιχεία της μεθυλίωσης του DNA από 711 παχέος όγκων, 53 συμφωνημένα παρακείμενα-δείγματα φυσιολογικού ιστού του κόλου, 286 υγιή δείγματα αίματος και 4201 δείγματα όγκου των 15 διαφορετικών τύπων καρκίνου. δεδομένα μεθυλίωση του DNA παράχθηκαν από την Illumina Infinium HumanMethylation27 και τις πλατφόρμες HumanMethylation450, που καθορίζουν την κατάσταση μεθυλίωσης των 27.578 και των 482.421 CpG θέσεις αντίστοιχα. Πραγματοποιήσαμε πρώτα μια πολλαπλών βημάτων επιλογή δείκτη για τον εντοπισμό υποψήφιων δεικτών με υψηλή μεθυλίωση σε όλους τους όγκους παχέος εντέρου, ενώ φιλοξενεί χαμηλή μεθυλίωσης σε υγιή δείγματα και άλλων τύπων καρκίνου. Στη συνέχεια χρησιμοποιήσαμε προ-θεραπευτική δείγματα πλάσματος και ορού από 107 ασθενείς με καρκίνο του παχέος εντέρου και 98 ελέγχους χωρίς καρκίνο του παχέος εντέρου, η οποία επιβεβαιώθηκε από την κολονοσκόπηση, προκειμένου να επαληθεύεται υποψήφιος δείκτες. Έχουμε επιλέξει δύο δείκτες για περαιτέρω αξιολόγηση: μεθυλιωμένο

THBD

(THBD-Μ) και μετουσιωμένο

C9orf50

(C9orf50-Μ). Όταν δοκιμάζονται σε κλινικά δείγματα πλάσματος και ορού αυτοί οι δείκτες ξεπέρασαν καρκινοεμβρυϊκό αντιγόνο (CEA), η μέτρηση του ορού και οδήγησε σε υψηλά ευαίσθητη και ειδική επιδόσεις τεστ για την πρώιμη ανίχνευση ορθοκολικού καρκίνου.

Συμπεράσματα /Σημασία

μας συστηματική ανακάλυψη δείκτη και μελέτη επαλήθευσης για τους δείκτες της μεθυλίωσης του DNA με βάση το αίμα οδήγησε σε δύο νέες παχέος βιοδείκτες του καρκίνου, THBD-Μ και C9orf50-M. THBD-Μ ιδίως έδειξε πολλά υποσχόμενη απόδοση σε κλινικά δείγματα, που δικαιολογούν περαιτέρω βελτιστοποίηση της και κλινικών δοκιμών

Παράθεση:. Lange CPE, Campan Μ, Hinoue Τ, Schmitz RF, van der Meulen-de Jong ΑΕ, Slingerland Η , et al. (2012) Genome-Scale ανακάλυψη του DNA-μεθυλίωση βιοδείκτες για βάση το αίμα διάγνωση του καρκίνου του παχέος εντέρου. PLoS ONE 7 (11): e50266. doi: 10.1371 /journal.pone.0050266

Επιμέλεια: Carmen J. Marsit, Dartmouth Medical School, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 8 Αύγ, 2012? Αποδεκτές: 17 Οκτωβρίου του 2012? Δημοσιεύθηκε: 28 του Νοέμβρη 2012

Copyright: © 2012 Lange et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτοί οι συγγραφείς δεν έχουν καμία υποστήριξη ή χρηματοδότηση για να αναφέρετε

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς θα ήθελαν να δηλώσουν ότι PW Laird κατέχει τα ακόλουθα εκδίδονται διπλώματα ευρεσιτεχνίας για την τεχνολογία MethyLight ( «Διαδικασία για Throughput DNA Υψηλή Ανάλυση μεθυλίωσης»? US Patent # 6,331,393? Ημερομηνία Filed: May 14, 1999? Ημερομηνία Έκδοσης: 18 Δεκεμβρίου, 2001. «Διαδικασία για High Throughput μεθυλίωσης του DNA ανάλυση «? US Patent # 7,112,404? Ημερομηνία Filed: 10 Δεκέμβρη του 2001? Ημερομηνία Έκδοσης: Σεπτέμβριος 26, 2006« Διαδικασία για την Υψηλή ανάλυση DNA Η μεθυλίωση Throughput «? Ημερομηνία Filed: 10 του Δεκέμβρη 2001? Ημερομηνία Έκδοσης: 30 Ιουνίου, 2009), τα οποία έχουν άδεια να Epigenomics AG. Επιπλέον, P.W. Laird, D. Weisenberger, και Μ Campan ονομάζονται ως εφευρέτες στην ακόλουθη εκκρεμεί αίτηση διπλώματος ευρεσιτεχνίας για την τεχνολογία Digital MethyLight ( «μεθυλίωσης του DNA Ανάλυση από την Digital Bisulfite γονιδιωματική αλληλούχιση και ψηφιακή MethyLight»? Παμπ App No: 20080254474? Ημερομηνία Filed: 14 Απριλίου 2008) . D.J. Weisenberger είναι σύμβουλος για Zymo Έρευνας. Δεν υπάρχουν περαιτέρω διπλώματα ευρεσιτεχνίας, τα προϊόντα για την ανάπτυξη ή την εμπορία προϊόντων που να δηλώνουν. Αυτό δεν μεταβάλλει τους συγγραφείς, η προσήλωση σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

Καρκίνος του παχέος εντέρου (CRC) είναι μια κοινή ασθένεια με κατ ‘εκτίμηση 143.460 νέες περιπτώσεις το ΗΠΑ το 2012 [1]. CRC είναι η τρίτη πιο συχνά διαγιγνώσκεται ο καρκίνος σε άνδρες και γυναίκες στον δυτικό κόσμο και ένα σημαντικό ποσοστό των ασθενών που παρουσιάζουν με CRC θα έχουν απομακρυσμένες μεταστάσεις (στάδιο IV) κατά τη διάγνωση, η οποία συχνά είναι ανίατη. Είναι σαφές ότι εντοπισμένο καρκίνο (στάδιο I /II) ανιχνεύεται νωρίς είναι πιο δεκτικά σε θεραπευτική αγωγή, προσφέροντας ανώτερη πρόγνωση [2], [3]. Κατά συνέπεια, οι διαγνωστικές μέθοδοι που έχουν ως αποτέλεσμα την έγκαιρη ανίχνευση κακοήθων ή ακόμη και προ-κακοήθη νόσο μπορεί να έχουν σημαντικά κλινικά οφέλη, μείωση της θνησιμότητας και της νοσηρότητας των ασθενών με καρκίνο του παχέος εντέρου. Διαθέσιμο δυναμικό τεχνικές ελέγχου για CRC περιλαμβάνουν κοπράνων δοκιμή λανθάνουσας αιμορραγίας, διπλή αντίθεση κλύσμα βαρίου, ενδοσκόπηση, με προτίμηση για pancolonoscopy, και την εικονική κολονοσκόπηση [4], [5]. Η μέτρηση του καρκινοεμβρυονικού αντιγόνου ορού (CEA) έχει επίσης προταθεί ως ένα πιθανό τροπικότητα διαλογής αλλά δεν διαθέτει επαρκή ευαισθησία στην ανίχνευση CRC σε πρώιμο στάδιο, και το επίπεδο του είναι επίσης αυξημένα σε μη κακοήθεις ασθένειες (π.χ. εκκολπωματίτιδα, γαστρίτιδα, διαβήτης) [6].

Μια βέλτιστη διαγνωστική εξέταση αναμένεται να είναι ιδιαίτερα ευαίσθητη και ειδική, δεν ενέχουν κανένα κίνδυνο για τους ασθενείς, και έχουν υψηλή αποδοχή από τον ασθενή. Θα πρέπει επίσης να είναι οικονομικά αποδοτικό και εύκολο να εκτελέσει. Όπως τρέχουσες διαδικασίες διαλογής δεν διαθέτουν επαρκείς θετική προγνωστική αξία, απαιτεί δυσάρεστες παρασκεύασμα ή να προκαλέσει δυσφορία, υπάρχει μια ανάγκη για την ανάπτυξη νέων μη επεμβατικές εξετάσεις για την ανίχνευση του CRC σε ένα στάδιο αρκετά νωρίς για θεραπεία να είναι επιτυχής. Οι δείκτες της μεθυλίωσης DNA υπόσχεται εργαλεία που θα μπορούσαν να είναι χρήσιμες για την έγκαιρη ανίχνευση του καρκίνου. Κατά την τελευταία δεκαετία έχει γίνει σαφές ότι τα καρκινικά κύτταρα έχουν παρεκκλίνοντα πρότυπα της μεθυλίωσης του DNA και ότι αυτές οι ανωμαλίες μπορεί να ανιχνευθεί σε όγκους που προέρχονται DNA που βρίσκονται στο πλάσμα ή στον ορό των ασθενών με καρκίνο [7], [8]. Αρκετές μελέτες έχουν τεκμηριώσει την παρουσία ελεύθερου DNA που προέρχεται από συμπαγείς όγκους στην κυκλοφορία του αίματος των ασθενών με καρκίνο, η οποία αυξάνει την πιθανότητα ανίχνευσης αυτών καρκίνο ειδικά μόρια σε άτομα με προϋπάρχουσα ασθένεια [9] – [22].

Ένας αριθμός μελετών έχουν ήδη αναφέρει τη χρήση δεικτών μεθυλίωσης DNA για βάση το αίμα ανίχνευση CRC με ποικίλα αποτελέσματα [9] – [22]. Ωστόσο, οι περισσότερες από αυτές τις μελέτες έχουν στηριχθεί σε δοκιμή ενός περιορισμένου αριθμού προ-επιλεγμένων γονιδίων και για τη χρήση των μη ποσοτικών μεθόδων ανίχνευσης, όπως τζελ με βάση μεθυλίωσης-ειδική PCR. Ο στόχος αυτής της μελέτης είναι να προσδιορίσει με βάση το αίμα βιοδεικτών μεθυλίωσης DNA για CRC χρησιμοποιώντας ένα γονιδίωμα κλίμακας προσέγγιση μεθυλίωσης DNA για την ανακάλυψη δείκτη και για τη δοκιμή των επιλεγμένων δεικτών στο προεγχειρητική κλινικά δείγματα αίματος από ασθενείς που υποβάλλονται σε θεραπευτική χειρουργική για CRC.

Μέθοδοι

Ανθρώπινα δείγματα και δήλωση Δεοντολογίας

Οι τοπικές και περιφερειακές συμβούλια θεσμική αναθεώρηση ενέκρινε την εν λόγω μελέτη. Ενημερωμένη συγκατάθεση λήφθηκε από όλους τους συμμετέχοντες ασθενείς και τους ελέγχους. Προ-θεραπευτική δείγματα πλάσματος και ορού ελήφθησαν από CRC ασθενείς στα εξωτερικά ιατρεία μέσω φλεβοτομία του διάμεσου κυβοειδείς φλέβα από τον Απρίλιο 2008 έως τον Δεκέμβριο του 2011. πλάσματος και ορού απομονώθηκαν μέσα σε 30 λεπτά της διατρήσεως φλέβας όπως περιγράφηκε προηγουμένως [22]. Κάθε δείγμα πλάσματος ή ορού διαχωρίζεται περαιτέρω σε δύο ξεχωριστούς σωλήνες και αποθηκεύτηκε στους -80 ° C μέχρι την επεξεργασία. Η CEA στον ορό μετρήθηκε σε κάθε διατρήσεως φλέβας σε ασθενείς CRC.

Οι έλεγχοι ορίστηκαν ως άτομα χωρίς CRC ή οποιαδήποτε κακοήθεια κατά τα τελευταία πέντε χρόνια και συμπεριλήφθηκαν σε αυτή τη μελέτη στο τμήμα ενδοσκόπηση. Τα άτομα που υποβάλλονται σε κολονοσκόπηση, ο οποίος έδειξε κανένα σημάδι ενός παχέος κακοήθεια, είχαν δικαίωμα συμμετοχής. Ενδείξεις για κολονοσκόπηση για αυτούς τους ασθενείς ήταν κολονοσκοπήσεις επιτήρηση λόγω της φλεγμονώδους νόσου του εντέρου (IBD? Νόσος του Crohn ή ελκώδης κολίτιδα), θετικό οικογενειακό ιστορικό CRC, γαστρεντερικών ενοχλήσεων ή του ορθού απώλεια αίματος. Ένας έμπειρος γαστρεντερολόγο εκτελούνται όλες τις κολονοσκοπήσεις. Οι ασθενείς με ήπια, ελεγχόμενη IBD συμπεριλήφθηκαν όσο ήταν δυνατό να επιθεωρήσει αξιόπιστα το βλεννογόνο του κόλου σε κολονοσκόπηση

και

εάν οι βιοψίες επιτήρησης που συνήθως λαμβάνονται κατά μήκος ολόκληρου του παχέος συστήματος ήταν παθολογικά φυσιολογικά (δεν δείχνει σημάδια δυσπλασία). Τα δείγματα πλάσματος και ορού απομονώθηκαν από αυτά τα άτομα που χρησιμοποιούν το ίδιο πρωτόκολλο όπως για τους ασθενείς CRC.

CRC ιστός ελήφθη κατά τη διάρκεια της χειρουργικής εκτομής του όγκου και αμέσως αποστέλλεται στον παθολόγο. Ο παθολόγος αποσυντίθενται ένα αντιπροσωπευτικό μέρος του όγκου και αποθηκεύεται το φρέσκο-κατεψυγμένο δείγμα στους -80 ° C μέσα σε μία ώρα μετά τη χειρουργική εκτομή. Επιπλέον, ένας παθολογικά κανονικό δείγμα του παχέος εντέρου ελήφθη τουλάχιστον 10 εκατοστά μακριά από την άκρη του όγκου και αποθηκεύονται με τον ίδιο τρόπο

Marker Ανακάλυψης:. Τεχνολογίες και Σύνολα

Στην ανακάλυψη δείκτη φάση της μελέτης αυτής χρησιμοποιήθηκαν δεδομένα της μεθυλίωσης του DNA που παράγονται από Illumina Infinium HumanMethylation27 BeadChip® (HM27) και τα HumanMethylation450 BeadChip® (HM450) πλατφόρμες. Η δοκιμασία Infinium ποσοτικοποιεί τα επίπεδα μεθυλίωσης του DNA σε συγκεκριμένα υπολείμματα κυτοσίνης που γειτνιάζουν με κατάλοιπα γουανίνης (CpG loci), με υπολογισμό της αναλογίας (β-value) των εντάσεων μεταξύ μεθυλιωμένων και μη μεθυλιωμένων δεσμευμένο σε σφαιρίδια ανιχνευτές ειδικής θέσεως. Η τιμή β είναι μια συνεχής μεταβλητή, κυμαινόμενη από 0 (μη μεθυλιωμένα) έως 1 (πλήρως μεθυλιωμένα) [23]. Η HM27 BeadChip® αξιολογεί το επίπεδο μεθυλίωσης του DNA του 27578 CpG θέσεις που βρίσκονται στις περιοχές προαγωγού του 14.495 γονιδίων που κωδικοποιεί την πρωτεΐνη. Το HM450 BeadChip® αξιολογεί την κατάσταση μεθυλίωσης του DNA των 482.421 CpG τόπους και καλύπτει το 99% των γονιδίων REFSEQ και 96% των UCSC νησίδες CpG (www.ncbi.nlm.nih.gov/RefSeq, www.illumina.com).

χρησιμοποιηθούν τα διαθέσιμα δεδομένα Infinium HM27 και HM450 από 711 όγκων παχέος εντέρου, 53 συνδυάζεται δίπλα-δείγματα φυσιολογικού ιστού του κόλου και 10 λεμφοκυττάρων αίματος (PBL) δείγματα περιφερικού των υγιών ατόμων για τον εντοπισμό και την επαλήθευση των δεικτών μεθυλίωσης του όγκου υποψήφιο DNA. Επιπλέον, χρησιμοποιήσαμε δεδομένα Infinium από δημόσια διαθέσιμες σύνολα δεδομένων (GEO και TCGA) που αντιπροσωπεύουν 274 υγιή δείγματα PBL και 4201 κακοήθη δείγματα ιστών από 15 διαφορετικούς τύπους καρκίνου για τη μεγιστοποίηση της CRC ειδικότητας (βλέπε Πίνακα 1). Οι β-τιμές των 611 CRC όγκων και 24 ταιριάζουν δίπλα-δείγματα φυσιολογικού ιστού του κόλου ανακτήθηκαν από το σύνολο δεδομένων της μεθυλίωσης DNA για CRCs δημοσιεύτηκε στο The Cancer Genome Atlas (TCGA) Πύλη δεδομένων (http: //tcga-data.nci.nih. gov /TCGA /tcgaHome2.jsp). Δεδομένα από τις άλλες 100 CRC όγκων και 29 συμφωνημένα παρακείμενων-δείγματα φυσιολογικού ιστού του παχέως δημιουργήθηκαν στο επιγονιδίωμα Κέντρο USC σε μια προηγούμενη μελέτη [24]. δεδομένων Infinium των 274 δειγμάτων PBL είχαν κατεβάσει από γονιδιακής έκφρασης Omnibus βάση δεδομένων (GEO) στο National Center for Biotechnology Information (NCBI, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/, αριθμός ένταξης GSE 19711). Τα στοιχεία για τα υπόλοιπα δείγματα 10 PBL δημιουργήθηκαν χρησιμοποιώντας την πλατφόρμα HM27 για μια προηγούμενη μελέτη ανακάλυψη δείκτη στο USC επιγονιδίωμα Κέντρο [25]. Έγγραφο S1 συνοψίζει τους αριθμούς αρχείο όλων των διαθέσιμων στο κοινό GEO και TCGA σύνολα δεδομένων που χρησιμοποιούνται σε αυτή τη μελέτη. κατάσταση μεθυλίωσης του DNA εκτιμήθηκε με τη χρήση του BeadChip HM27 για 336 δείγματα CRC, 29 δείγματα φυσιολογικού παχέως εντέρου και 274 δείγματα PBL (Πίνακας 1). Για τα υπόλοιπα 375 CRC όγκους και 24 φυσιολογικά δείγματα κόλου, η κατάσταση μεθυλίωσης του DNA αξιολογήθηκε με την BeadChip HM450 (Πίνακας 1). Έχουμε, επίσης, δημιουργούνται δεδομένα HM450 σε δύο δείγματα PBL από τη συλλογή των 10 που μελετήθηκαν στην πλατφόρμα HM27. Του 375 CRC, τα δεδομένα από μόλις 40 δείγματα ήταν διαθέσιμα κατά το χρόνο που πραγματοποιείται η ανακάλυψη δείκτη. δεδομένα μεθυλίωσης του DNA από τα άλλα 335 όγκοι CRC δεν χρησιμοποιήθηκαν στον αλγόριθμο επιλογής δείκτη. Κάναμε, όμως, χρησιμοποιούν τα δεδομένα αυτά για την επαλήθευση των δύο τελικών δείκτες επιλέγονται

Η

Marker Ανακάλυψης:. Κριτήρια Φίλτρο

Σας απασχολούσε διαδικασία πολλών σταδίων φιλτραρίσματος στη φάση ανακάλυψης αυτής της μελέτης. δεδομένα μεθυλίωση DNA που παράγεται από τις δύο διαφορετικές BeadChips (HM27 και HM450) αναλύθηκαν χωριστά, αλλά χρησιμοποιώντας τα ίδια βήματα φιλτραρίσματος (Σχήμα 1 και 2). Ξεκινήσαμε με τον αποκλεισμό όλων των ανιχνευτών Infinium που απέτυχε σε κανένα από τα δείγματα. HM27 ανιχνευτές που δεν είχαν μοναδικά ευθυγραμμιστεί με το ανθρώπινο γονιδίωμα (hg19, GRCh37), ή ότι συνδέονταν με πολυμορφισμούς ενός νουκλεοτιδίου (SNPs) εντός 10 ζεύγη βάσεων του στόχου CpG (ταυτοποιηθούν χρησιμοποιώντας το NCBI dbSNP χτίζει 126 και 128), ή ανιχνευτές που καλύπτονται επαναλαμβανόμενα στοιχεία (τα οποία προσδιορίζονται από RepeatMasker) έχουν επίσης αποκλειστεί. Προσδιορίσαμε την υψηλότερη β-τιμή για κάθε ανιχνευτή σε 10 υγιείς δείγματα PBL (β-PBL

H) και το 10

εκατοστημόριο των β-τιμές CRC όγκου (β-CRC

10) (Εικόνα 2Α). Εμείς αποκλείονται όλοι οι ανιχνευτές με ένα β-PBL

H μεγαλύτερη από 0,2 ή μεγαλύτερο από το αντίστοιχο β-CRC

10. Εμείς στη συνέχεια διηθείται τα υπόλοιπα ανιχνευτές έναντι κανονικού ιστού κόλον και 15 άλλους τύπους καρκίνου. Αναλυτικότερα, προσδιορίσαμε την μέση β-τιμή κάθε ανιχνευτή σε φυσιολογικό ιστό κόλου (β-NC

Μ) και εξαλείφονται όλοι οι ανιχνευτές που είχε μια β-NC

M τιμή υψηλότερη από 0.2 ή μεγαλύτερη από το αντίστοιχο β -CRC

10 τιμή (Σχήμα 2Β). Έχουμε επιλέξει τις κορυφαίες 25 δείκτες και στα δύο σύνολα δεδομένων μετά την κατάταξη τους ανιχνευτές με βάση τη διαφορά μεταξύ της β-CRC

10 και β-PBL

H (Σχήμα 2C). Για το φιλτράρισμα ενάντια σε άλλους τύπους καρκίνου, προσδιορίσαμε την μέση β-τιμή (β-OC

Μ) για τις υπόλοιπες ανιχνευτές σε κάθε τύπο καρκίνου και εξαλείφονται όλοι οι ανιχνευτές που είχε μια β-OC

M υψηλότερη από τη μέση CRC β-αξίας (β-CRC

Μ). Οι υπόλοιποι ανιχνευτές επιλέχθηκαν για το σχεδιασμό αντίδρασης MethyLight και περαιτέρω αξιολόγηση.

Χρησιμοποιήσαμε τα στοιχεία της μεθυλίωσης του DNA από το Infinium HumanMethylation27 Beadchip (HM27) και HumanMethylation450 Beadchip πλατφόρμες (HM450) Infinium στην οθόνη 27578 (HM27) και 482.421 (HM450 ) CpG θέσεις για την κατάσταση μεθυλίωσης τους σε δείγματα CRC, δείγματα PBL από υγιή άτομα, σε συνδυασμό φυσιολογικά δείγματα ορθοκολικού ιστού (NC) και 15 άλλους τύπους καρκίνου (OC). Χρησιμοποιήσαμε μια σταδιακή προσέγγιση εξαλείφοντας ανιχνευτές που απέτυχε σε οποιοδήποτε από τα δείγματα, οι ανιχνευτές που περιείχαν SNPs ή επαναλαμβάνουν αλληλουχίες, ανιχνευτές με υψηλότερη PBL β-αξίας (β-PBL

H) ή μια μέση ιστού φυσιολογικό κόλον β-τιμή ( β-NC

Μ) υψηλότερη από την συνδεδεμένων 10ο εκατοστημόριο του όγκου β-τιμές CRC (β-CRC

10) ή υψηλότερες από 0,2 σε οποιοδήποτε από τα δείγματα PBL ή NC (πίνακας Infinium). Οι υπόλοιποι ανιχνευτές κατατάσσονται με βάση τη διαφορά μεταξύ της β-CRC

10 και β-PBL

H και την κορυφή 25 επιλέχθηκαν από δύο σύνολα δεδομένων (HM27 και HM450) για το φιλτράρισμα κατά δείγματα OC. Ανιχνευτές με μέση OC β-τιμή υψηλότερη από τη μέση τιμή που σχετίζεται CRC β-αξίας (β-CRC

Μ) είχαν εξαλειφθεί. Συνολικά 15 MethyLight αντιδράσεων (δείκτες) σχεδιάστηκαν για 10 ιχνηλάτες και δοκιμάζονται σε μια ακολουθία σταδίων επαλήθευσης (πίνακας MethyLight). Δείκτες είχαν εξαλειφθεί αν η απόδοσή τους ήταν μη ικανοποιητικός σε ελέγχους, όπως

in vitro

μεθυλιωμένο

Sss

1 DNA, PBL και τα δείγματα πλάσματος από υγιείς μάρτυρες και τους ιστούς όγκων CRC. Μαρκαδόροι επίσης εξαλειφθεί, εάν αποτύχει να ανιχνεύσουν CRC μετουσιωμένο DNA σε δεξαμενή πλάσματος και ορού από ασθενείς με CRC. Δύο δείκτες πληρούσε όλα τα κριτήρια επιλογής και έχουν προχωρήσει στο στάδιο της προετοιμασίας για περαιτέρω έλεγχο σε μεμονωμένα δείγματα ασθενών. (* Probes που απέτυχε σε οποιοδήποτε από τα δείγματα, καθώς και εκείνες που περιλαμβάνονται SNPs και επαναλάβετε ακολουθίες? Τα ** Άλλοι τύποι καρκίνου του που χρησιμοποιούνται στην παρούσα μελέτη συνοψίζονται στον Πίνακα 1, *** Μ

Sss

Ι αντιμετωπίζονται DNA)

η

Ένα (επάνω εικόνα:. HM27, κάτω σχήμα: HM450), scatterplots της υψηλότερης PBL β-αξίας (β-PBL

H) 10 (HM27) και 2 (HM450) δείγματα υγιών μαρτύρων (Χ-άξονας) έναντι των συνδεδεμένων 10ο εκατοστημόριο των β-τιμές CRC όγκου (β-CRC

10) επί του Υ-άξονα. Οι μπλε κουκκίδες αντιπροσωπεύουν τις εξαλειφθεί ανιχνευτές (HM27: n = 23049? HM450: n = 367833) και τα κόκκινα στίγματα (HM27: n = 695? HM450: n = 30.207) αντιπροσωπεύουν τις διατηρούνται ανιχνευτές με β-CRC

10 & gt ? β-PBL

Η ή β-PBL

H & lt? 0.2. Β, scatterplots της μέσης κανονικής β-αξία ιστού κόλον (β-NC

Μ) για τις διατηρούνται ανιχνευτές από τον Πίνακα Α (Χ-άξονας) έναντι του αντίστοιχου β-CRC

10 (Υ-άξονας). Οι κόκκινες κουκίδες (HM27: n = 512? HM450: n = 28.428) αντιπροσωπεύουν τις εξαλειφθεί ανιχνευτές, οι πράσινες κουκκίδες αντιπροσωπεύουν τις διατηρούνται ανιχνευτές (HM27: n = 183? HM450: n = 1779) με β-CRC

10 & gt ? β-NC

M ή β-NC

M & lt? 0.2. C, scatterplots των διατηρούμενων ιχνηλατών από τον Πίνακα Β (πράσινο) που εμφανίζεται κατά τη διαφορά μεταξύ β-CRC

10 και β-PBL

H (X-άξονας) έναντι του αντίστοιχου β-CRC

10 (Y -άξονας). Οι κουκίδες στο εσωτερικό της κίτρινο τετράγωνο είναι οι ιχνηλάτες που επιλέγονται για επιπλέον φιλτράρισμα έναντι άλλων τύπων καρκίνου. Τα λευκά βέλη δείχνουν τις ιχνηλατών από τις δύο υποψήφιες δείκτες. D, ROC καμπύλες για τους ανιχνευτές που χρησιμοποιούνται στην πολύπλοκη αντίδραση με βάση β-τιμές μεθυλίωση 335 ανεξάρτητων παχέος δείγματα καρκίνου και 23 ανεξάρτητοι συμφωνημένα κανονικά δείγματα ορθοκολικού ιστού (τα στοιχεία μεθυλίωσης του DNA από τα δείγματα αυτά δεν χρησιμοποιήθηκαν στον αγωγό ανακάλυψη δείκτη). Το σκούρο γκρι χρώμα είναι η περιοχή κάτω από την καμπύλη.

Η

DNA Εκχύλιση και τροποποίηση όξινου θειώδους

DNA

από δύο υγιή δείγματα PBL και 25 δείγματα όγκου CRC εκχυλίζονται σύμφωνα με την περιγραφείσα προηγουμένως πρωτόκολλο [25]. DNA από δείγματα πλάσματος και ορού εξήχθη χρησιμοποιώντας το QIAamp® Κυκλοφορούν νουκλεϊκών οξέων Kit (Qiagen), ειδικά σχεδιασμένο για να ανακτήσει το μέγιστο ποσό των κυκλοφορούντων κυττάρων χωρίς DNA από τον ορό ή το αίμα. Η Zymo® EZ κιτ μεθυλίωση του DNA (Zymo Research) χρησιμοποιήθηκε για να θειώδους μετατρέψει την εκχύλιση του DNA. Όλες οι εκχυλίσεις και οι μετατροπές διεξήχθησαν σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η ποιότητα και η ποσότητα του όξινου θειώδους-μετατρέπονται DNA, καθώς και η πληρότητα της διθειώδους μετατροπής, αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα πάνελ αντιδράσεων ποιοτικού ελέγχου, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [26].

MethyLight Ανάλυση

Η δοκιμασία MethyLight διεξήχθη όπως περιγράφεται προηγουμένως [27]. Η αλληλουχία των εκκινητών MethyLight και ανιχνευτές που χρησιμοποιούνται σε αυτές τις αναλύσεις περιγράφονται στον Πίνακα S1. Οι αντιδράσεις MethyLight αξιολογήθηκαν σε τέσσερα στάδια. Πρώτον, Μ

Sss

Ι (New England Biolabs) επεξεργασία PBL DNA (Promega) χρησιμοποιήθηκε για να προσδιοριστεί αν η αντίδραση ενισχύεται

in vitro

μεθυλιωμένο DNA ελέγχου [28]. Αντιδράσεις με ένα κατώτατο όριο κύκλου [C (t)] υψηλότερο από 35 εξαιρέθηκαν. Δεύτερον, οι αντιδράσεις υποβλήθηκαν σε διαλογή έναντι 50 ng DNA ΡΒί ​​από δύο υγιή άτομα. Αντιδράσεις με C (t) τιμής κατώτερης των 40 εξαιρέθηκαν. Οι υπόλοιπες αντιδράσεις δοκιμάστηκαν σε 25 δείγματα CRC DNA, χρησιμοποιώντας μία αντίδραση MethyLight ALU-based και Μ

Sss

1 καμπύλη πρότυπο DNA για να υπολογιστεί το ποσοστό του μεθυλιωμένος Αναφοράς (PMR) όπως περιγράφηκε προηγουμένως [27], [29]. Αντιδράσεις με PMR & lt? 10 σε περισσότερες από μία όγκους CRC είχαν εξαλειφθεί. Τέλος, οι αντιδράσεις εξετάστηκαν σε 10 δείγματα πλάσματος από υγιείς δότες (ισοδύναμο 100 μΙ πλάσματος) και κατατάσσονται ανάλογα με C τους (t) τιμές. Αντιδράσεις με C (t) με τιμές μικρότερες του 50 σε ένα ή περισσότερα από αυτά τα δείγματα είχαν εξαλειφθεί.

Ψηφιακές MethyLight Ανάλυση

συγκεντρωμένων κλινικών δειγμάτων.

Digital MethyLight είναι μια ποσοτική τεχνική PCR στην οποία όξινο θειώδες μετατρέπεται DNA αναλύεται χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία MethyLight PCR σε ένα διανεμητικό τρόπο πάνω από 96 θαλάμους αντίδρασης για κάθε δείγμα. Αυτή η τεχνική είναι μια αποτελεσματική και αποδοτική μέθοδος για τη συγκέντρωση πληροφοριών μεθυλίωσης του DNA για δείγματα με μικρές ποσότητες DNA και πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [25], [30]. Είμαστε προετοιμασμένοι τέσσερις χωριστές πισίνες του πλάσματος και τέσσερις πισίνες του DNA ορού για τη δοκιμή υποψήφιων δείκτες (Pool 1 = 16 μάρτυρες (χωρίς IBD), Pool 2 = 16 ασθενείς με ήπια IBD, Pool 3 = 16 ασθενείς με στάδιο I /II CRC και πισίνα 4 = 16 ασθενείς με τα στάδια III /IV CRC). Κάθε μία από αυτές τις πισίνες περιείχαν DNA από 190 μΙ πλάσματος ή ορού από κάθε ένα από τα 16 άτομα στην πισίνα. Για κάθε αντίδραση δοκιμάσαμε πρώτα DNA από 50 μΙ πλάσματος ή ορού από κάθε δεξαμενή. Για τις αντιδράσεις που δεν προκάλεσε καμία ενισχύσεις PCR (επισκέψεις) με 50 μΙ, ο όγκος αυξήθηκε σε 150 μΙ ισοδύναμο. Τέλος, οι αντιδράσεις που δεν οδηγούν σε καμία χτυπήματα στις πισίνες CRC ή έδωσαν επιτυχίες με τους ελέγχους, με ή χωρίς IBD αποκλείστηκαν.

Οι δύο υποψήφιες δείκτες που επιβίωσαν αυτή τη διαδικασία αποβολής σημάνθηκαν με διαφορετικά φθορισμοφόρα. Αυτό επέτρεψε αντίδραση συγκεκριμένες χρωματιστά αποτελέσματα PCR που μας επέτρεψε να διακρίνουμε επιτυχίες από κάθε ένα από αυτούς τους δείκτες, όταν έτρεξαν μαζί (multiplex). Όλες οι ανιχνευτές και οι εκκινητές συντέθηκαν από Biosearch Technology, Inc, Novota, Καλιφόρνια, ΗΠΑ.

Ατομική κλινικά δείγματα.

Ο πολυχώρος δύο σήμανσης δοκιμάστηκε σε δείγματα πλάσματος και ορού από 75 ανεξάρτητες CRC ασθενείς και 70 μάρτυρες με όγκο δοκιμής 1 ml. Ο πίνακας 2 παρέχει μια επισκόπηση των κλινικών χαρακτηριστικών των ασθενών CRC και τα θέματα ελέγχου που χρησιμοποιούνται για τον έλεγχο των κλινικών δεικτών στην παρούσα μελέτη.

Η

Στατιστική Ανάλυση

Ο υπολογισμός των διαστημάτων εμπιστοσύνης των περιοχών υπό η καμπύλη (AUCs) και οι στατιστικές δοκιμασίες διεξήχθησαν σε R (έκδοση 2.14.0), με το πακέτο R PROC [31]. Η μέθοδος όπως προτείνεται από DeLong και οι συνεργάτες του [32] χρησιμοποιήθηκε για τη δοκιμή.

Αποτελέσματα

Marker Discovery στο γονιδίωμα κλίμακας μεθυλίωσης του DNA Σύνολα δεδομένων

Πραγματοποιήσαμε μια σταδιακή ανάλυση ανακάλυψη δείκτη χρησιμοποιώντας τα διαθέσιμα σύνολα δεδομένων μεθυλίωσης του DNA από ένα μεγάλο αριθμό CRC όγκων, 15 διαφορετικά άλλους τύπους καρκίνου και δείγματα ελέγχου από το πλάσμα, PBL και συμφωνημένα παρακείμενο φυσιολογικό κολονικό ιστούς (Σχήματα 1 και 2, Πίνακας 1) για τον εντοπισμό CRC DNA δείκτες μεθυλίωσης. Χρησιμοποιήσαμε τα δεδομένα που παράγονται χρησιμοποιώντας δύο πλατφόρμες διαφορετικές Illumina Infinium HumanMethylation BeadChip, HM27 και HM450 (βλέπε Μέθοδοι ενότητα). Μετά την απομάκρυνση πιθανώς προβληματικές ανιχνευτές, οι αλληλουχίες ανιχνευτή που επικαλύπτονται SNPs ή επαναλαμβανόμενα στοιχεία, και ανιχνευτές που απέτυχε να εκτελέσει σε όλα τα δείγματα, υπήρχαν 23,049 ανιχνευτές HM27 και 367.254 ανιχνευτές HM450. Αυτών των ανιχνευτών, 695 παρέμειναν στην ομάδα HM27 και 29.640 στην ομάδα HM450, μετά την εξάλειψη εκείνων που είχαν υψηλότερα επίπεδα μεθυλίωσης του DNA στα υγιή δείγματα PBL από σε όγκους CRC. Επιπλέον, αποκλείσαμε όλοι οι ανιχνευτές με υψηλότερη μεθυλίωσης του DNA σε φυσιολογικό ιστό κόλου σε σχέση με το CRC και κατατάσσονται τα υπόλοιπα ανιχνευτές με βάση τη διαφορά μεταξύ υγιών PBL και CRC DNA όγκου μεθυλίωση. Η κατάσταση μεθυλίωσης του DNA των συνδυασμένων κορυφή 50 ανιχνευτές (ανάλογα με τη μεγαλύτερη διαφορά μεταξύ των υγιών PBL και CRC μεθυλίωσης του DNA) συγκρίθηκαν μεταξύ CRC και 15 άλλους τύπους καρκίνου. Ανιχνευτές με υψηλότερο μέσο επίπεδο μεθυλίωσης του DNA σε οποιονδήποτε άλλο τύπο καρκίνου από ό, τι CRC αποκλείστηκαν. Δέκα CRC-ειδικό υποψήφιο ανιχνευτές (που συνδέονται με δέκα μοναδικές προαγωγούς γονιδίου) παρέμειναν, τα οποία έδειξαν υψηλότερες μέσες τιμές της μεθυλίωσης του DNA στο CRC από τη μέση αντίστοιχη τιμή μεθυλίωσης του DNA όλων των άλλων μορφών καρκίνου.

Υποψήφιες Marker MethyLight Δοκιμασία Ανάπτυξης και

επαλήθευσης

Εμείς σχεδιαστεί και δοκιμαστεί συνολικά 15 δοκιμασίες PCR σε πραγματικό χρόνο με βάση MethyLight (δείκτες) για τις δέκα υπόλοιπες ανιχνευτές. τεχνικές MethyLight-based είναι ιδιαίτερα ευαίσθητα μέθοδοι για την ανίχνευση του μεθυλιωμένου μορίων του DNA [27]. Οι αλληλουχίες εκκινητή και ανιχνευτή για τις αντιδράσεις αυτές περιγράφονται στον Πίνακα S1. Η αλληλουχία των δοκιμών επαλήθευσης εκτελούνται σε αυτούς τους δείκτες απεικονίζεται στη δεξιά πλευρά του σχήματος 1. Τρεις MethyLight αντιδράσεις δεν ενισχύουν

in vitro

μεθυλιωμένη (Μ

Sss

Ι-θεραπεία) DNA ελέγχου και επομένως εξαλείφεται. Πέντε δείκτες που ήταν θετικά σε υγιή δείγματα PBL και τρεις δείκτες που είχαν PMR & lt? 10 σε περισσότερα από ένα από τα 25 CRC όγκων που δοκιμάζονται από MethyLight επίσης εξαλειφθεί. Τα τέσσερα εναπομείναντα δείκτες δοκιμάστηκαν σε δείγματα πλάσματος από δέκα υγιείς δότες και κανένας από αυτούς ανιχνεύθηκαν στα δείγματα αυτά (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Και οι τέσσερις δείκτες είχαν επόμενο αναλύθηκαν με Digital MethyLight σε ομαδοποιημένα δείγματα ορού και πλάσματος από τους ελέγχους, με ή χωρίς IBD και CRC ασθενείς. Δύο δείκτες που δεν μπορούσε να ανιχνευθεί στα ομαδοποιημένα δείγματα CRC είχαν εξαλειφθεί (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Τα δύο τελευταία βιοδείκτες της μεθυλίωσης του DNA υποψήφιος που πληρούσε όλα αυστηρά κριτήρια επιλογής μας ήταν:.

THBD

(THBD-Μ) και

C9orf50

(C9orf50-Μ)

Προκαταρκτική απόδοση αξιολόγηση των

THBD

και

C9orf50

η

αξιολογηθεί η απόδοση του

THBD

(Infinium αριθμό καθετήρα cg24562819) και

C9orf50

( Infinium αριθμός ανιχνευτή cg14015706) σε διακρίσεις CRC ιστό και παρακείμενο φυσιολογικό ορθοκολικό ιστό σε ένα ανεξάρτητο σύνολο δεδομένων 335 CRC όγκων (Πίνακας 1).

THBD

και

C9orf50

είχε β-τιμές & gt? 0,4 σε 95% και 100% όλων των όγκων που αναλύθηκαν CRC αντίστοιχα. Το Σχήμα 2 δείχνει το χαρακτηριστικό λειτουργίας λήπτη (ROC) καμπύλη για

THBD

και

C9orf50

στη διάκριση των δειγμάτων όγκου CRC έναντι των φυσιολογικών κολικό ιστό. Οι AUCs για

THBD

και

C9orf50

ήταν 0,97 και 1,0 αντίστοιχα. Είναι σημαντικό ότι, και οι δύο δείκτες αποκάλυψε χαμηλότερα επίπεδα μεθυλίωσης του DNA σε όλους τους άλλους τύπους καρκίνου, συμπεριλαμβανομένου του μαστού, του πνεύμονα, του προστάτη, του θυρεοειδούς, της μήτρας, των νεφρών, των ωοθηκών, του γαστρικού, του παγκρέατος και της ουροδόχου κύστης καρκίνους, καθώς επίσης και μελάνωμα, την οξεία μυελοειδή λευχαιμία, πολύμορφο γλοιοβλάστωμα και το κεφάλι και λαιμού καρκίνωμα των πλακωδών κυττάρων (Σχήμα 3).

οικόπεδα Jitter αντιπροσωπεύουν β-τιμές Infinium με βάση μεθυλίωσης του DNA των

THBD

(αριστερό πάνελ) και

C9orf50

(δεξιά πλευρά) σε 335 ανεξάρτητους όγκους CRC, αντιστοιχεί φυσιολογικούς ιστούς παχέος εντέρου, μια ποικιλία άλλων τύπων καρκίνου και PBL από υγιή άτομα. Ο συγκεκριμένος αριθμός δειγμάτων για κάθε τύπο ιστού περιγράφεται στον Πίνακα 1.

Η

Δοκιμή των επιδόσεων του THBD-Μ και C9orf50-Μ σε μεμονωμένα κλινικά δείγματα

Έχουμε αναπτύξει μια πολλαπλή αντίδραση για τις δύο δείκτες που χρησιμοποιούν διαφορετικές χρωστικές ρεπόρτερ για κάθε μία από τις αντιδράσεις. Ο ανιχνευτής THBD-M σημάνθηκε με ένα φθοροφόρο QUASAR που έχει ως αποτέλεσμα ένα κόκκινο σήμα φθορισμού και το καθετήρας C9orf50-M σημάνθηκε με το μπλε FAM φθοροφόρο. Οι εκκινητές και ανιχνευτές των δύο δεικτών δοκιμάστηκαν για παρεμβολή με το συνδυασμό τους σε ένα διάλυμα σε διάφορες συγκεντρώσεις με τη χρήση Μ

Sss

Ι αντιμετωπίζονται DNA ελέγχου για δοκιμασίες MethyLight και Digital MethyLight (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Από την πολλαπλή αντίδραση των δύο δεικτών που εκτελούνται, καθώς και τις ατομικές αντιδράσεις που χρησιμοποίησε το προηγούμενο για περαιτέρω κλινικές δοκιμές.

Ένα σύνολο 106 ασθενών CRC και 98 ελέγχους χωρίς CRC, επαληθεύεται από κολονοσκόπηση, συμπεριλήφθηκαν σε αυτή την προοπτική μελέτη. Ζεύγη δειγμάτων ορού και πλάσματος ήταν διαθέσιμα από όλους τους ελέγχους και 103 ασθενείς CRC, ενώ μόνο το πλάσμα ελήφθη από τρεις ασθενείς CRC. Παρά το γεγονός ότι το στάδιο IV CRC ήταν κριτήριο αποκλεισμού σε αυτή τη μελέτη, επιλεκτική ανωμαλίες παρατηρήθηκαν σε διαγνωστικά προεγχειρητική απεικόνιση για τρεις ασθενείς (π.χ. μικρά πνευμονικά οζίδια στην αξονική τομογραφία θώρακα), το οποίο αργότερα, αλλά πριν από τη χειρουργική επέμβαση, κατέληξε να είναι μακρινή μετάσταση. Αυτοί οι ασθενείς στη συνέχεια επισκίασε στο στάδιο IV CRC. Τριάντα δύο πλάσμα και ορό δείγματα από τους ελέγχους και τους ασθενείς CRC χρησιμοποιήθηκαν προηγουμένως στην ανάλυση ομαδοποιημένο δείγμα, όπως αναφέρεται ανωτέρω.

Δοκιμάσαμε τα πολυπλεγμένα Digital δοκιμασίες MethyLight για THBD-M και C9orf50-M δείκτες σε μεμονωμένα δείγματα πλάσματος από 75 CRC και 66 ελέγχους και για μεμονωμένα δείγματα ορού από 72 CRC και 66 ελέγχους. Το σχήμα 4 δείχνει τον αριθμό των μορίων (άθροισμα των δύο δεικτών) ανιχνεύτηκε σε 1 ml πλάσματος (πίνακας Α) και στον ορό (πίνακας D) για τα διάφορα στάδια του CRC σε σύγκριση με τους μάρτυρες. Οι καμπύλες ROC απεικονίζουν την απόδοση της δοκιμής για την πολλαπλή αντίδραση ανά στάδιο της νόσου (πάνελ Β) και για τους δύο δείκτες χωριστά σε πλάσμα (πλαίσιο C) και στον ορό (πίνακας Ε και F). Οι AUCs ανά στάδιο της νόσου που περιγράφεται στο Σχήμα 4. Για όλες τις φάσεις, υπήρχε οριακά σημαντικά βελτιωμένη απόδοση της δοκιμής για τον ορό σε σύγκριση με το πλάσμα ως το μέσο δοκιμής (ρ = 0.06 για όλα τα στάδια της CRC). THBD-M απέδωσαν σημαντικά καλύτερα σε σύγκριση με C9orf50-Μ και στις δύο πλάσματος και ορού (p & lt? 0.001). Η προσθήκη C9orf50-M για να THBD-Μ για την ανίχνευση CRC δεν βελτίωσε την απόδοση της δοκιμής. Οι AUCs ανά στάδιο, για κάθε δείκτη ξεχωριστά και πολύπλοκη αντίδραση, συνοψίζονται στον Πίνακα S2.

Ψηφιακές MethyLight διεξήχθη σε 1 ml πλάσματος (Α) και στον ορό (D) για την ανίχνευση THBD-M και C9orf50- Μ σε δείγματα CRC και ελέγχου. Ο απόλυτος αριθμός των μορίων που ανιχνεύεται από τον πολυπλέκτη (άθροισμα των δύο δεικτών) αντίδραση καταγράφεται στον γ-άξονα. Τα δείγματα CRC που διοργανώνονται από το στάδιο. Οι αστερίσκοι (*) υποδεικνύουν δείγματα με περισσότερα από 25 μόρια ανιχνεύονται (μέχρι 153 μόρια στο πλάσμα και 157 μόρια σε ορό). καμπύλες ROC και AUCs (95% διαστήματα εμπιστοσύνης) των διαφόρων CRC σταδίων στο πλάσμα (Β) και στον ορό (Ε) με βάση τον αριθμό των μορίων ανιχνεύεται. ανάλυση ROC και AUCs (95% διαστήματα εμπιστοσύνης) για THBD-M, C9orf50-M ως μεμονωμένες αντιδράσεις και ως multiplex αντίδραση στο πλάσμα (C) και στον ορό (Ρ).

Η

Προσδιορίσαμε επίσης η επίπεδα CEA σε προεγχειρητική δείγματα ορού από 107 ασθενείς CRC. Μια αυξημένη CEA ορού (≥5.0 ng /ml) παρατηρήθηκε σε 35/107 (33%) ασθενείς. Για το στάδιο Ι CRC CEA στον ορό ήταν αυξημένα κατά 14%, για το στάδιο ΙΙ σε 33%, για το στάδιο ΙΙΙ σε 39% και για το στάδιο IV, σε ποσοστό 67%. Πίνακας S3 συνοψίζει προεγχειρητικά επίπεδα ορού του CEA όλων των ασθενών με το σχετικό αριθμό των διαπιστωμένων μορίων THBD-Μ και C9orf50-Μ ανά 1 ml του πλάσματος και ορού.

Συζήτηση

Ένα από τα σημαντικά μειονεκτήματα στις δημοσιευμένες μελέτες βιοδεικτών ΣΔΠ είναι η εξάρτηση από μια προσέγγιση υποψήφιο γονίδιο για την ανακάλυψη δείκτη. Αυτή η προσέγγιση βασίζεται συχνά σε μη συστηματικού επιλογή των γονιδίων δεικτών υποψηφίου, τα οποία έχουν δοκιμαστεί σε υγιή και καρκινικούς ιστούς και στη συνέχεια επικυρώνονται σε έναν πληθυσμό ασθενών [9] – [22]. Αν και ορισμένες από αυτές τις μελέτες έχουν οδηγήσει σε πολλά υποσχόμενες βιοδείκτες για την έγκαιρη ανίχνευση CRC, η έλλειψη μιας διεξοδικής στρατηγικής βιοδείκτη ανακάλυψη θέτει το ερώτημα κατά πόσο ανώτερη δείκτες μπορεί να έχουν αγνοηθεί. Με τις πιο προηγμένες τεχνολογίες που διατίθενται σήμερα, είναι δυνατόν να ληφθούν γονιδίωμα κλίμακας δεδομένα μεθυλίωσης του DNA που μπορεί να είναι χρήσιμη για την ανακάλυψη βιοδεικτών. Πραγματοποιήσαμε ένα γονιδίωμα κλίμακας πολλαπλών βημάτων ανακάλυψη δείκτη να εντοπίσει βιοδείκτες CRC χρησιμοποιώντας την πλατφόρμα HM27 και HM450 BeadChip? ο τελευταίος αξιολογεί την κατάσταση μεθυλίωσης του DNA άνω των 482.000 CpG τόπους και καλύπτει το 96% του συνόλου των νησιών UCSC CpG. Πραγματοποιήσαμε πρόσφατα μια παρόμοια στρατηγική δείκτη-αγωγών για τον καρκίνο των ωοθηκών και προσδιόρισε το νέο ευαίσθητο επανεμφάνιση των βιοδεικτών IFFO1-Μ [25]. Για την παρούσα μελέτη βελτιώσαμε τη στρατηγική ανακάλυψή μας με βάση τα στοιχεία της μεθυλίωσης του DNA από 4.201 δείγματα καρκίνου των διαφόρων προελεύσεων για τη βελτιστοποίηση της CRC ειδικότητα. Τα ευρήματά μας δείχνουν ότι η στρατηγική αυτή ανακάλυψη λειτουργεί με επιτυχία εδώ και CRC, με αποτέλεσμα σε δύο νέες βιοδείκτες: THBD-Μ και C9orf50-M. Με AUCs των 0,97 και 1,0 αντίστοιχα για την δοκιμασία Infinium, αυτές οι δύο δείκτες έχουν μια εξαιρετική ικανότητα να διακρίνουν μεταξύ των όγκων CRC και συμφωνημένα φυσιολογικό ιστό κόλου.

Δείτε το άρθρο

PubMed /NCBI

Google Scholar

Η

11.