Αφηρημένο

D, L-σουλφοραφάνη (SFN), ένα συνθετικό ρακεμικό ανάλογο του μπρόκολου συστατικό L- σουλφοραφάνη, είναι μια πολλά υποσχόμενη καρκινικού παράγοντα χημειοπροληπτική με

in vivo

αποτελεσματικότητα έναντι χημικά επαγόμενης καθώς ογκογονίδιο με γνώμονα καρκίνο σε μοντέλα τρωκτικών προκλινικές. Καρκίνος χημειοπροστατευτική δράση του SFN χαρακτηρίζεται από G σύλληψη

2 /M φάση του κύκλου κυττάρου, επαγωγή απόπτωσης, και η αναστολή της κυτταρικής μετανάστευσης και της εισβολής. Επιπλέον, SFN αναστέλλει πολλαπλά μονοπάτια σηματοδότησης ογκογόνο συχνά υπερκινητικά σε καρκίνους του ανθρώπου, συμπεριλαμβανομένων παράγοντα-κΒ, Akt, μετατροπέα πυρηνική σήματος και ενεργοποιητής της μεταγραφής 3, και του υποδοχέα ανδρογόνων. Η παρούσα μελέτη σχεδιάστηκε για να προσδιοριστεί ο ρόλος της σηματοδότησης Notch, το οποίο είναι ουσιαστικά δραστική σε πολλούς ανθρώπινους καρκίνους, σε αντικαρκινικές δράσεις της SFN χρησιμοποιώντας κυττάρων καρκίνου του προστάτη ως μοντέλο. Η έκθεση ανθρώπινων κυττάρων καρκίνου του προστάτη (PC-3, LNCaP, και /ή LNCaP-C4-2B) προς SFN, καθώς και του φυσικώς απαντώμενα θειο-, σουλφινύλιο, και σουλφονύλιο-αναλόγων οδήγησε σε διάσπαση (ενεργοποίηση) του Notch 1, Notch2, και Notch4, η οποία συνοδεύεται από μια μείωση στα επίπεδα των μορφών Notch πλήρους μήκους ειδικά στα χρονικά σημεία 16- και 24-ωρών. Το SFN Διάσπαση με την μεσολάβηση των ισομορφών Notch συνδέθηκε με την ενεργοποίηση της μεταγραφής της, όπως αποδεικνύεται από RBP-Jk-, HES-1A /Β- και HEY-1 ανιχνεύσεις αναφοράς της λουσιφεράσης. Η μετανάστευση των PC-3 και LNCaP κύτταρα μειώθηκε σημαντικά με παρεμβολή RNA του Notch 1 και Notch2, αλλά όχι Notch4. Επιπλέον, SFN μεσολάβηση αναστολή της PC-3 και LNCaP κυτταρική μετανάστευση επηρεάστηκε μόνο οριακά από knockdown του Notch 1 και Notch2. Εντυπωσιακά, η χορήγηση SFN να Διαγονιδιακά αδενοκαρκίνωμα του προστάτη Mouse διαγονιδιακά ποντίκια απέτυχαν να αυξήσουν τα επίπεδα του Notch 1 διασπάται, διασπάται Notch2, και HES-1 πρωτεΐνες

in vivo

σε προστατική ενδοεπιθηλιακή νεοπλασία, καλά διαφοροποιημένο καρκίνωμα ή κακώς-διαφοροποιημένα προστάτη καρκίνος αλλοιώσεις. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η ενεργοποίηση Notch είναι σε μεγάλο βαθμό περιττή για SFN μεσολάβηση αναστολή της κυτταρικής μετανάστευσης, η οποία θα πρέπει να θεωρηθεί ως ένα θεραπευτικό πλεονέκτημα ως ενεργοποίηση Notch είναι συχνές σε ανθρώπινους καρκίνους του προστάτη

Παράθεση:. Hahm ER, Chandra-Kuntal Κ, Desai D, Amin S, Singh SV (2012) Notch ενεργοποίησης δεν είναι απαραίτητη για D, L-σουλφοραφάνη-Mediated Αναστολή Ανθρώπινης Καρκίνος του προστάτη κυτταρική μετανάστευση. PLoS ONE 7 (9): e44957. doi: 10.1371 /journal.pone.0044957

Επιμέλεια: Xiaolin Zi, του Πανεπιστημίου της Καλιφόρνια Irvine, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 22 Ιουν, 2012? Αποδεκτές: 10 Αύγ, 2012? Δημοσιεύθηκε: 7 του Σεπτεμβρίου του 2012

Copyright: © Hahm et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η έρευνα υποστηρίχθηκε από την CA115498-07 επιχορήγηση Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου. Αυτή η έρευνα χρησιμοποιήθηκε μια εγκατάσταση των ιστών και την έρευνα παθολογία που υποστηρίζεται από μια επιχορήγηση από το Εθνικό Ίδρυμα Καρκίνου (P30 CA047904). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

D, L-σουλφοραφάνη (SFN), ένα συνθετικό ανάλογο ρακεμικό του μπρόκολου προερχόμενο L-ισομερές (L-SFN), είναι ένας πολλά υποσχόμενος παράγοντας του καρκίνου χημειοπροληπτική με αξιόλογη δραστηριότητα σε προκλινικά μοντέλα ζώων [1], [2]. Talalay και οι συνάδελφοι του ήταν οι πρώτοι που παρατηρούν την πρόληψη του καρκίνου του μαστού 9,10-διμεθυλο-1,2-βενζανθρακενικού επαγόμενη σε αρουραίους με αυτή την ένωση [3]. Καρκίνο του χημειοπροληπτικές αποτελεσματικότητα των SFN ή L-SFN επεκτάθηκε στη συνέχεια σε άλλα μοντέλα χημική καρκινογένεση. Για παράδειγμα, η χορήγηση SFN δείχθηκε να καταστέλλει αζοξυμεθάνιο επαγόμενη κολονική παρεκκλίνουσα κρυπτικές εστίες σε αρουραίους [4]. Ομοίως, η θεραπεία είχε σαν αποτέλεσμα SFN πρόληψη του βενζο [α] πυρένιο-προκληθέντα καρκίνο προστομάχου και αναστολή κακοήθη εξέλιξη των αδενωμάτων των πνευμόνων που προκαλείται από καρκινογόνο καπνό 4- (μεθυλονιτροζαμινο) -1- (3-πυριδυλ) -1-βουτανόνη σε ποντικούς [5 ], [6]. Πιο πρόσφατες μελέτες έχουν χρησιμοποιήσει διαγονιδιακά μοντέλα ποντικών για τη δημιουργία χημειοπροληπτική αποτελεσματικότητα του SFN έναντι καρκίνων ογκογονίδια οδηγείται. Για παράδειγμα, διαιτητική χορήγηση 300 και 600 ppm SFN για 3 εβδομάδες για να ApcMin /+ ποντίκια είχε σαν αποτέλεσμα καταστολή της πολύποδες στο λεπτό έντερο με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο [7]. Προηγούμενες μελέτες από το εργαστήριο μας έχουν δείξει ότι η στοματική σίτιση των 6 μmol SFN (τρεις φορές την εβδομάδα) που αρχίζει στις 6-7 εβδομάδες της ηλικίας αναστέλλει σημαντικά την επίπτωση και το βάρος της προστατικής ενδοεπιθηλιακής νεοπλασίας (ΡΙΝ) ή /και καλά διαφοροποιημένο καρκίνο του προστάτη (WD ), καθώς και η πνευμονική μετάσταση πολλαπλότητα σε διαγονιδιακά αδενοκαρκίνωμα του προστάτη Mouse (TRAMP) ποντικούς χωρίς να προκαλεί οποιεσδήποτε παρενέργειες [8]. Σε συμφωνία με αυτά τα δεδομένα [8], 8-εβδομάδων ποντίκια ηλικίας TRAMP τροφοδοτείται με 240 mg του λαχανάκια Βρυξελλών /ποντικό /ημέρα εμφάνισαν σημαντική μείωση στην ανάπτυξη του όγκου του προστάτη σε μια άλλη μελέτη [9]. Επιπλέον, η ανάπτυξη του PC-3 ανθρώπινου καρκίνου του προστάτη κύτταρα ξενομόσχευμα σε αρσενικούς αθυμικούς ποντικούς ήταν καθυστερημένος σημαντικά από του στόματος θεραπεία με SFN [10]

Λόγω ελπιδοφόρα αποτελέσματα σε μοντέλα τρωκτικών προκλινικές [3] – [8]., [10] διαλεύκανση του μηχανισμού απόκρισης υποκείμενου καρκίνου chemopreventive να SFN έχει αποτελέσει θέμα έντονης έρευνας κατά την τελευταία δεκαετία. Μηχανισμοί που συμβάλλουν στην χημειοπρόληψη του καρκίνου με SFN περιλαμβάνουν: αναστολή της CYP2E1 [11], διακοπή του κυτταρικού κύκλου [12], [13], η επαγωγή απόπτωσης [12], [14], η καταστολή της αγγειογένεσης [15], η αναστολή της δεακετυλάσης ιστόνης [16 ], πρωτεΐνη σύνδεσης [17], η επαγωγή της φάσης 2 ενζύμων [18], επιγενετική καταστολή του

hTERT

[19], και η αναστολή της αυτο-ανανέωσης των βλαστικών κυττάρων του καρκίνου του μαστού [20]. Μηχανιστικές μελέτες χρησιμοποιώντας καλλιεργημένα καρκινικά κύτταρα έχουν επίσης αποκαλύψει SFN μεσολάβηση καταστολή διαφόρων ογκογόνο οδών συχνά υπερκινητικά σε ανθρώπινους καρκίνους, συμπεριλαμβανομένων των πυρηνικών παράγοντα-κΒ, υποδοχέα ανδρογόνου, Bcl-2, Bcl-xL, και μετατροπέα σήματος και ενεργοποιητής της μεταγραφής 3 [14 ], [21] – [23]. Ενώ η ενεργοποίηση του μετατροπέα σήματος και ενεργοποιητής της μεταγραφής 3 παρέχει μέτρια προστασία έναντι SFN-επαγόμενη απόπτωση, αντιδραστικά είδη οξυγόνου μιτοχόνδρια προερχόμενα (ROS) παρέχουν αρχικό σήμα για δέσμευση απόπτωσης σε καρκινικά κύτταρα που εκτίθενται σε αυτόν τον παράγοντα [14], [24].

Η σηματοδότηση Notch έχει ενοχοποιηθεί για την ανάπτυξη καρκίνου του προστάτη και τη μετάσταση [25] – [28]. Για παράδειγμα, μια μελέτη που περιλαμβάνει δείγματα όγκων από 154 άνδρες έδειξαν υπερέκφραση του Jagged-1, ένα πρόσδεμα Notch, σε μεταστατικό καρκίνο του προστάτη σε σύγκριση με εντοπισμένο καρκίνο και καλοήθη ασθένεια προστάτη [26]. Ομοίως, Bin Hafeez et al. [27] διαπιστώθηκε αυξημένη έκφραση του Notch 1 σε καρκίνους του προστάτη. Επιπλέον, knockdown του

Notch 1

ανέστειλε την εισβολή ανθρώπινων καρκινικών κυττάρων του προστάτη σε συνδυασμό με την αναστολή της μεταλλοπρωτεϊνάσης-9 (ΜΜΡ-9) και ενεργοποιητή πλασμινογόνου ουροκινάσης [27]. Κάτω ρύθμιση της Notch 1 και συνδέτη του Jagged-1 έχει αποδειχθεί ότι αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων καρκίνου του προστάτη [28]. Η παρούσα μελέτη χρησιμοποίησε καλλιεργημένα ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα του προστάτη (PC-3, LNCaP και LNCaP-C4-2B), και dorsolateral ιστούς του προστάτη από τον έλεγχο και SFN-αγωγή ποντίκια TRAMP [8] για να καθορίσει το ρόλο του Notch 1, Notch2 και Notch4 σε αντικαρκινικές επιδράσεις της SFN.

Αποτελέσματα

SFN Θεραπεία αυξημένα επίπεδα διασπασμένου Notch1, σχισμένα Notch2, και διασπάται Notch4 σε κύτταρα που καλλιεργήθηκαν Ανθρωπίνων Καρκίνος του προστάτη

ενεργοποίηση Notch περιλαμβάνει τη δέσμευση της ο υποδοχέας να γειτνιάζουν συνδετήρες που ακολουθείται από μια διαμορφωτική αλλαγή εντός της διάσπασης του υποδοχέα και Notch που διαμεσολαβείται από το σύμπλοκο γ-σεκρετάσης σε μία θέση που βρίσκεται εντός της περιοχής του Notch διαμεμβράνης [29]. Το καθαρό αποτέλεσμα αυτών των αντιδράσεων είναι απελευθέρωση του Notch ενδοκυττάρια περιοχή στο κυτταρόπλασμα, η οποία στη συνέχεια μετατοπίζεται στον πυρήνα για τη ρύθμιση της έκφρασης του γονιδίου-στόχου [25], [29]. Χρησιμοποιήσαμε PC-3 (ένα ανθρώπινου προστάτη καρκινική κυτταρική σειρά ανδρογόνο-ανεξάρτητες στερείται λειτουργικής ρ53), LNCaP (ένα ανδρογόνο αποκρίνονται ανθρώπινου καρκίνου του προστάτη κυτταρική γραμμή με άγριου τύπου ρ53), και LNCaP-C4-2B (μια παραλλαγή ανεξάρτητου από ανδρογόνο της κυτταρικής γραμμής LNCaP) για τη μελέτη του ρόλου της σηματοδότησης Notch σε αντικαρκινικά αποτελέσματα του SFN. Επίπεδα διασπάται Notch 1, διασπάται Notch2, και διασπάται πρωτεΐνες Notch4 αυξήθηκαν σημαντικά κατά την επεξεργασία με SFN σε PC-3 (Εικ. 1Α), LNCaP (Εικ. 1Β), και LNCaP-C4-2B κύτταρα (Σχ. 1C), αν και με διαφορετική κινητική. Για παράδειγμα, σε αντίθεση με τα κύτταρα LNCaP (Εικ. 1Β), η διάσπαση του Notch 1 κατά την κατεργασία με SFN ήταν παροδική (αυξημένη διάσπαση παρατηρηθεί μόνο σε 8 hour- χρονικό σημείο) σε PC-3 κύτταρα (Σχ. 1Α). Μοριακή βάση για κυτταρική γραμμή-ειδικές διαφορές στην ενεργοποίηση Notch με SFN δεν είναι σαφής, αλλά η ενεργοποίηση Notch με SFN συνοδευόταν από μείωση των επιπέδων της πλήρους μήκους Notch 1, Notch2, και Notch4 σε κάθε κυτταρική σειρά ειδικά στην 16- και 24 ώρες χρονικά σημεία (Εικ. 1Α-C). Αξίζει να σημειωθεί, Notch2 ήταν γενικά πιο ευαίσθητη σε διάσπαση από SFN σε σύγκριση με Notch 1 ή Notch4 (Εικ. 1Α-C). Συλλογικά, αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η θεραπεία με SFN είχε ως αποτέλεσμα διάσπαση του Notch 1, Notch2, και στις δύο Notch4 ανθρώπινο καρκίνο του προστάτη κύτταρα μη εξαρτώμενου από ανδρογόνα και που αποκρίνονται στο ανδρογόνο.

Ανοσοκηλίδωση για διασπάται και πλήρους μήκους Notch 1, Notch2, και Notch4 χρησιμοποιώντας προϊόντα λύσης από το (Α) PC-3, (Β) LNCaP, και (Γ) LNCaP-C4-2B κύτταρα μετά από θεραπεία 8-, 16-, ή 24-ώρες με DMSO ή SFN (10 ή 20 μΜ). Οι κηλίδες απογυμνώθηκαν και επανα-διερευνήθηκαν με αντι-ακτίνης αντισώματος ως έλεγχος φόρτωσης. Ανοσοκηλίδωση για κάθε πρωτεΐνη έγινε τουλάχιστον δύο φορές χρησιμοποιώντας ανεξάρτητα παρασκευάζονται προϊόντα λύσης. Οι αριθμοί πάνω από μπάντα αντιπροσωπεύουν μεταβολές στα επίπεδα πρωτεΐνης σε σχέση με αντίστοιχο έλεγχο DMSO-αγωγή.

Η

Επιδράσεις της φυσικώς απαντώμενα ανάλογα των SFN για Notch ενεργοποίησης σε PC-3 και LNCaP κύτταρα

χρησιμοποιούνται φυσικά απαντώμενες θειο-, σουλφινύλιο, σουλφονύλιο και-ανάλογα της SFN με διαφορετικό μήκος αλκυλικής αλυσίδας (Εικ. 2Α) για να προσδιοριστεί εάν η ενεργοποίηση του Notch ήταν μοναδική για SFN. έκθεση οκτώ ωρών από PC-3 (Σχ. 2Β) και κύτταρα LNCaP (Σχ. 2C) προς θειο- (Iberverin, Erucin, και Berteroin) και σουλφινυλο-αναλόγων (Iberin και Alyssin) οδήγησε σε διάσπαση των Notch 1 και Notch2 (Εικ . 2Β, C). Επιπλέον, οι θειο- και σουλφινυλο-ανάλογα ήταν σχετικά πιο ισχυρός στην πρόκληση διάσπασης του Notch 1 και Notch2 σε σύγκριση με σουλφονυλο-αναλόγων (Cheirolin, Erysolin, και Alyssin Σουλφόνη) σε δύο PC-3 (Σχ. 2Β) και κύτταρα LNCaP (Εικ . 2C). Παραδόξως, τα επίπεδα της διασπασμένης Notch4 μειώθηκαν σε διαφορετικό βαθμό κατά την κατεργασία με θειο- και σουλφινυλο-αναλόγων, αλλά όχι σουλφονυλο-αναλόγων στις δύο κυτταρικές σειρές. Συλλογικά, αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι τα φυσικά απαντώμενες θειο- και σουλφινυλ-ανάλογα της SFN ήταν αποτελεσματικές στην πρόκληση διάσπαση του Notch 1 και Notch2. Από την άλλη πλευρά, η ενεργοποίηση Notch4 φαίνεται μοναδικό για SFN.

(Α) Χημικές ονομασίες, οι κοινές ονομασίες και οι χημικοί τύποι των αναλόγων που χρησιμοποιούνται στην παρούσα μελέτη. Ανοσοκηλίδωση για διασπάται Notch 1, Notch2, και Notch4 χρησιμοποιώντας προϊόντα λύσης από (Β) PC-3, και (Γ) LNCaP κύτταρα μετά από αγωγή 8 ωρών με DMSO ή διαφορετικά ανάλογα (10 ή 20 μΜ). Οι κηλίδες απογυμνώθηκαν και επανα-διερευνήθηκαν με αντι-ακτίνης αντισώματος ως έλεγχος φόρτωσης. Ανοσοκηλίδωση για κάθε πρωτεΐνη έγινε τουλάχιστον δύο φορές χρησιμοποιώντας ανεξάρτητα παρασκευάζονται προϊόντα λύσης. Οι αριθμοί πάνω μπάντα αποτελούν οι αλλαγές στα επίπεδα της πρωτεΐνης σε σχέση με τον έλεγχο DMSO-θεραπεία.

Η

Επίδραση των SFN Θεραπεία για μεταγραφική δραστηριότητα του Notch

Προχωρήσαμε για να ελεγχθεί αν SFN μεσολάβηση διάσπαση των Notch 1 , Notch2 και Notch4 συνοδεύτηκε από μεταγραφική ενεργοποίηση του Notch χρησιμοποιώντας λουσιφεράση δοκιμασίες ανταποκριτή. Η RBP-jk [δέσμευσης πρωτεΐνης Ο παράγοντας 1 /κατασταλτικά του άτριχα /Lag1 (CBF1 /Su (H) /Lag 1)] είναι ένας ευθύς κατάντη ρυθμιστής της σηματοδότησης Notch [25], [29]. Η έκθεση των κυττάρων PC-3 και LNCaP στα 20 μΜ SFN για 8 ή /και 24 ώρες είχε ως αποτέλεσμα μία στατιστικά σημαντική αύξηση στη δραστηριότητα λουσιφεράσης RBP-Jk (Σχ. 3Α). Σε συμφωνία με αυτά τα αποτελέσματα, τα επίπεδα της πυρηνικής HES-1, ένα προς τα κάτω στόχος του Notch, αυξήθηκαν κατά 24 ώρες θεραπεία του PC-3 και LNCaP κυττάρων με SFN σε σύγκριση με διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO) κύτταρα κατεργασμένα ελέγχου (Σχ. 3Β ). Η δραστικότητα λουσιφεράσης που σχετίζεται με τα γονίδια-στόχους Notch

HES-1Α /Β

και

HEY-1

(Σχ. 3C, D) επίσης αυξήθηκε σημαντικά κατά την επεξεργασία με 20 μΜ SFN στα καρκινικά κύτταρα του προστάτη . Μαζί, αυτές οι παρατηρήσεις υπέδειξαν ότι η θεραπεία SFN προκαλείται μεταγραφική ενεργοποίηση του Notch σε καλλιεργημένα κύτταρα καρκίνου του προστάτη.

(Α) Επίδραση της θεραπείας SFN επί της δραστικότητας ανταποκριτή λουσιφεράσης RBP-Jk (ένα μέτρο της μεταγραφικής δραστικότητας του Notch) σε PC -3 και LNCaP κυττάρων μετά από θεραπεία 8- ή 24-ώρες με DMSO ή 20 μΜ SFN. (Β) ανοσοφθορισμού μικροσκοπικές εικόνες που απεικονίζουν την πυρηνική επίπεδα πρωτεΐνης HES-1 σε PC-3 και LNCaP κύτταρα μετά από θεραπεία 24 ωρών με DMSO ή 10 μΜ SFN (χ 100 στόχος μεγέθυνση). δραστηριότητα (C) HES-1Α /Β λουσιφεράσης ανταποκριτή σε PC-3 και LNCaP κύτταρα μετά τη θεραπεία 8- ή 24-ώρες με DMSO ή 20 μΜ SFN. (D) HEY-1 (PC-3 κύτταρα) ή HES-1Α /Β (LNCaP-C4-2B κύτταρα) δραστικότητα λουσιφεράσης μετά τη θεραπεία 8- ή 24-ώρες με DMSO ή 20 μΜ SFN. Στο πάνελ Α, C, και D, τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται είναι μέση τιμή ± SD (η = 6? Συνδυασμένα δεδομένα από δύο ανεξάρτητα πειράματα έκαστο πραγματοποιήθηκε εις τριπλούν). * Σημαντικά διαφορετική (

P

& lt? 0,05) σε σύγκριση με το αντίστοιχο έλεγχο DMSO-αντιμετωπίζονται από Φοιτητών

t-test

(πάνελ Α, Γ, και Δ). Κάθε πείραμα διεξήχθη δύο φορές.

Η

Επίδραση της παρεμβολής RNA του Notch 1 σε SFN-παρεμπόδιση που προκαλείται από PC-3 και LNCaP κυττάρων Μετανάστευση

τα κάτω ρύθμιση του Notch 1 δείχθηκε να αναστέλλει προστάτη καρκίνος κυτταρική μετανάστευση και εισβολή [28]. Ως εκ τούτου, έχουν σχεδιαστεί πειράματα χρησιμοποιώντας κύτταρα PC-3 και LNCaP να προσδιορίσουν τις συνέπειες της ενεργοποίησης Notch 1 σε SFN μεσολάβηση αναστολή της κυτταρικής μετανάστευσης. Τα κύτταρα LNCaP PC-3 και παροδικά διαμολυσμένα με Notch 1 στοχευμένη siRNA εμφάνισαν 80% ή μεγαλύτερη μείωση στα επίπεδα του πλήρους μήκους Notch 1 σε σύγκριση με τα κύτταρα που επιμολύνθηκαν με έναν έλεγχο siRNA (Σχ. 4Α). Παρεμβολή RNA του Notch 1 και μόνο ως αποτέλεσμα τη σημαντική μείωση της PC-3 και LNCaP κυτταρική μετανάστευση (Σχ. 4Β, C). Ωστόσο, η SFN μεσολάβηση αναστολή της PC-3 και LNCaP κυτταρική μετανάστευση επηρεάστηκε μόνο οριακά από knockdown του Notch 1 (Εικ. 4C). Με βάση αυτά τα αποτελέσματα, καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι η ενεργοποίηση Notch 1 είναι σε μεγάλο βαθμό περιττή για SFN μεσολάβηση αναστολή της μετανάστευσης του προστάτη καρκινικών κυττάρων.

(Α) Ανοσοκηλίδωση για πλήρους μήκους Notch 1 πρωτεΐνης χρησιμοποιώντας λύματα από PC-3 και LNCaP κύτταρα παροδικά επιμολυσμένα με έλεγχο (μη ειδική) siRNA ή Notch1 στοχευμένες siRNA. (Β) Αντιπροσωπευτικές εικόνες (δοκιμασία θαλάμου Boyden) απεικονίζει μετανάστευση των PC-3 και LNCaP κύτταρα μορφομετατραπέντα με ένα έλεγχο (μη ειδική) siRNA ή μια Notch 1 στόχευση siRNA και υποβλήθηκε σε επεξεργασία για 24 ώρες με DMSO ή 10 μΜ SFN (χ 100 μεγέθυνση). (Γ) Ο ποσοτικός προσδιορισμός της PC-3 και LNCaP κυτταρική μετανάστευση από τα δεδομένα δείχνονται στον πίνακα Β Δύο έως τρεις τομείς σε κάθε φίλτρο βαθμολογήθηκαν για την κυτταρική μετανάστευση υπό ένα ανεστραμμένο μικροσκόπιο. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν τοις εκατό κυτταρική μετανάστευση κανονικοποιούνται για τον έλεγχο siRNA επιμολυσμένα κύτταρα που υπέστησαν αγωγή με DMSO (μέση ± SD, η = 6? Συνδυασμένα δεδομένα από δύο ανεξάρτητα πειράματα έκαστο πραγματοποιήθηκε εις τριπλούν). Διαφέρουν σημαντικά (

P

& lt? 0,05)

acompared με τις αντίστοιχες DMSO-θεραπεία ελέγχους (κύτταρα επιμολυσμένα με siRNA έλεγχο ή Notch1 στοχευμένες siRNA), και

bbetween siRNA ελέγχου επιμολυσμένα κύτταρα και Notch1 στοχευμένες siRNA επιμολυσμένα κύτταρα με μονόδρομη ANOVA που ακολουθείται από το τεστ πολλαπλής σύγκρισης του Bonferroni. Κάθε πείραμα διεξήχθη δύο φορές.

Η

Επίδραση της Notch2 Πρωτεΐνη νοκ ντάουν για SFN-παρεμπόδιση που προκαλείται από PC-3 και LNCaP κυτταρική μετανάστευση

Έχουμε δείξει στο παρελθόν ότι η αποσιώπηση της πλήρους μήκους Notch2 πρωτεΐνη μειώνει σημαντικά την ικανότητα μετανάστευσης των δύο PC-3 και LNCaP κύτταρα [30]. Προχωρήσαμε να ελεγχθεί αν Notch2 ενεργοποίηση από SFN επηρέασε την ικανότητά του να αναστέλλει PC-3 και LNCaP κυττάρων μετανάστευση. Επίπεδο της πλήρους μήκους Notch2 πρωτεΐνη μειώθηκε κατά & gt? 90% και 60%, αντιστοίχως, κατά την παροδική επιμόλυνση των PC-3 και LNCaP κυττάρων με μία Notch2 στόχευση siRNA σε σύγκριση με τα αντίστοιχα κύτταρα επιμολυσμένα με τον έλεγχο siRNA (Σχ . 5Α). Σύμφωνα με προηγούμενες παρατηρήσεις μας [30], knockdown του Notch2 πρωτεΐνης μόνο μείωσε PC-3 και LNCaP κυτταρική μετανάστευση (Εικ. 5Β, C). Το SFN μεσολάβηση αναστολή της PC-3 και LNCaP κυτταρική μετανάστευση ήταν μετρίως αυξηθεί με παρεμβολή RNA του Notch2 (Εικ. 5C). Για παράδειγμα, PC-3 κυτταρική μετανάστευση αναστέλλεται κατά 43% και 18% (ισοδυναμεί με 59% αναστολή), αντίστοιχα, μετά από 24-ωρη θεραπεία του siRNA ελέγχου επιμολυσμένων κυττάρων με 10 μΜ SFN και παρεμβολή RNA του Notch2 μόνο. Η μετανάστευση των PC-3 κυττάρου αναστάλθηκε κατά 67% κατά την επεξεργασία με SFN σε Notch2 σιγήσει κύτταρα. Αυτά τα αποτελέσματα πρότειναν ότι Notch2 ενεργοποίηση από SFN προσδίδεται περιθωριακό αντίσταση ενάντια ανασταλτική δράση της για τη μετανάστευση των κυττάρων.

(Α) Ανοσοκηλίδωση για πλήρους μήκους Notch2 πρωτεΐνης χρησιμοποιώντας λύματα από PC-3 και LNCaP κύτταρα παροδικά επιμολυσμένα με ένα μάρτυρα ( μη ειδική) siRNA ή Notch2 στοχευμένες siRNA. (Β) Αντιπροσωπευτικές εικόνες (δοκιμασία θαλάμου Boyden) απεικονίζει μετανάστευση των PC-3 και LNCaP κύτταρα μορφομετατραπέντα με ένα έλεγχο (μη ειδική) siRNA ή ένα Notch2 στόχευση siRNA και υποβλήθηκε σε επεξεργασία για 24 ώρες με DMSO ή 10 μΜ SFN (χ 100 μεγέθυνση). (Γ) Ο ποσοτικός προσδιορισμός της PC-3 και LNCaP κυτταρική μετανάστευση από τα δεδομένα δείχνονται στον πίνακα Β Δύο έως τρεις τομείς σε κάθε φίλτρο βαθμολογήθηκαν για την κυτταρική μετανάστευση υπό ένα ανεστραμμένο μικροσκόπιο. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν τοις εκατό κυτταρική μετανάστευση κανονικοποιούνται για τον έλεγχο siRNA επιμολυσμένα κύτταρα κατεργασμένα με DMSO (μέση ± SD, η = 6? Συνδυασμένα δεδομένα από δύο ανεξάρτητα πειράματα έκαστο πραγματοποιήθηκε εις τριπλούν). (Δ) ανάλυση των απελευθέρωσης θραύσμα DNA ιστόνης σχετιζόμενη στο κυτοσόλιο σε PC-3 και LNCaP κύτταρα μορφομετατραπέντα με ένα έλεγχο (μη ειδική) siRNA ή ένα Notch2 στόχευση siRNA και υποβλήθηκε σε επεξεργασία για 24 ώρες με DMSO ή SFN. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν τον εμπλουτισμό απελευθέρωσης θραύσμα DNA ιστόνης σχετιζόμενη στο κυτταρόλυμα συγκριτικά με έλεγχο siRNA επιμολυσμένα κύτταρα κατεργασμένα με DMSO (μέση ± SD, η = 6? Συνδυασμένα δεδομένα από δύο ανεξάρτητα πειράματα έκαστο πραγματοποιήθηκε εις τριπλούν). Σε πάνελ C και D, σημαντικά διαφορετικές (

P

& lt? 0,05)

acompared με τις αντίστοιχες DMSO-κατεργασία ελέγχους (κύτταρα επιμολυσμένα με τον έλεγχο siRNA ή Notch2 στόχευση siRNA), και

bbetween siRNA ελέγχου επιμολυσμένα κύτταρα και Notch2 στόχευση siRNA επιμολυσμένα κύτταρα με μονόδρομη ANOVA που ακολουθείται από το τεστ πολλαπλής σύγκρισης του Bonferroni. Κάθε πείραμα διεξήχθη δύο φορές.

Η

O’Neill et al [31] έχουν δείξει προηγουμένως ότι Notch2 ρυθμίζει απόπτωση τουλάχιστον σε MDA-MB-231 ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου του μαστού. Ως εκ τούτου, ήταν λογικό να καθοριστεί εάν η ενεργοποίηση Notch2 επηρεάζονται SFN-επαγόμενη απόπτωση. Όπως φαίνεται στο Σχ. 5D, knockdown του Notch2 πρωτεΐνη από μόνη της δεν είχε καμία ουσιαστική επίδραση στην απελευθέρωση θραύσμα DNA ιστόνης σχετιζόμενη στο κυτοσόλιο, η οποία είναι μία καλά αποδεκτή μέθοδος για την ποσοτικοποίηση της απόπτωσης. Το SFN μεσολάβηση ιστόνης που σχετίζονται απελευθέρωσης θραύσμα DNA στο κυτταρόπλασμα ήταν ελαφρώς καταργήθηκε μετά παρεμβολή RNA του Notch2 σε κύτταρα LNCaP, αλλά αυτή η διαφορά δεν ήταν στατιστικά σημαντική στην κυτταρική σειρά PC-3 (Σχ. 5D). Λόγω των οριακά αποτελέσματα και line-ειδικές διαφορές κύτταρο, καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι η ενεργοποίηση Notch2 έχει ελάχιστη επίδραση στην ικανότητα του SFN να επάγει απόπτωση τουλάχιστον σε καρκινικά κύτταρα του προστάτη.

Notch4 ενεργοποίησης ήταν διαθέσιμο και για SFN-μεσολαβούσης αναστολής PC -3 κυττάρων μετανάστευση

στη συνέχεια, προχωρήσαμε να προσδιοριστεί ο ρόλος της ενεργοποίησης Notch4 σε SFN μεσολάβηση αναστολή της μετανάστευσης κυττάρων χρησιμοποιώντας κύτταρα PC-3. Επίπεδο πλήρους μήκους Notch4 πρωτεΐνη μειώθηκε κατά 70% με την παροδική επιμόλυνση των PC-3 κυττάρων με μία Notch4 στοχευμένη siRNA σε σύγκριση με κύτταρα επιμολυσμένα με τον έλεγχο siRNA (Σχ. 6Α). Σε αντίθεση με Notch 1 (Εικ. 4C) ή Notch2 (Σχ. 5C), παρεμβολή RNA του Notch4 μόνος είχε ελάχιστο αποτέλεσμα επί PC-3 κυτταρική μετανάστευση (Σχ. 6Β, Γ). Επιπλέον, η αναστολή της PC-3 κυτταρική μετανάστευση που προκύπτουν από την έκθεση SFN δεν επηρεάστηκε από παρεμβολή RNA του Notch4 (Εικ. 6C). Ετσι η ενεργοποίηση του Notch4 ήταν επίσης απαραίτητη για την SFN μεσολάβηση αναστολή της PC-3 κυτταρική μετανάστευση τουλάχιστον σε PC-3 κύτταρα. Παρόμοιες μελέτες χρησιμοποιώντας Notch4 siRNA δεν διεξήχθησαν σε κύτταρα LNCaP.

(SFN) μεσολάβηση αναστολή της PC-3 κυτταρική μετανάστευση. (Α) Ανοσοκηλίδωση για πλήρους μήκους Notch4 πρωτεΐνης χρησιμοποιώντας λύματα από PC-3 κύτταρα παροδικά επιμολυσμένα με ένα έλεγχο (μη ειδική) siRNA ή ένα Notch4 στόχευση siRNA. (Β) Αντιπροσωπευτικές εικόνες (δοκιμασία θαλάμου Boyden) απεικονίζει μετανάστευση των PC-3 κύτταρα επιμολυσμένα με ένα έλεγχο (μη ειδική) siRNA ή ένα Notch4 στόχευση siRNA και υποβλήθηκε σε επεξεργασία για 24 ώρες με DMSO ή 10 μΜ SFN (χ 100 στόχος μεγέθυνση). (Γ) Ο ποσοτικός προσδιορισμός της PC-3 κυτταρική μετανάστευση από τα δεδομένα δείχνονται στον πίνακα Β Δύο έως τρεις τομείς σε κάθε φίλτρο βαθμολογήθηκαν για την κυτταρική μετανάστευση υπό ένα ανεστραμμένο μικροσκόπιο. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν τοις εκατό κυτταρική μετανάστευση κανονικοποιούνται για τον έλεγχο siRNA επιμολυσμένα κύτταρα που υπέστησαν αγωγή με DMSO (μέση ± SD, η = 6? Συνδυασμένα δεδομένα από δύο ανεξάρτητα πειράματα έκαστο πραγματοποιήθηκε εις τριπλούν).

aSignificantly διαφορετική (

P

& lt? 0,05) σε σύγκριση με τις αντίστοιχες DMSO-κατεργασία ελέγχους (κύτταρα που μορφομετατρέπονται με siRNA ελέγχου ή Notch4 στοχευμένες siRNA) με μονόδρομη ANOVA που ακολουθείται από το τεστ πολλαπλής σύγκρισης του Bonferroni. Κάθε πείραμα διεξήχθη δύο φορές.

Η

Imzmunohistochemical Ανάλυση για διασπασμένου Notch 1, σχισμένα Notch2, και HES-1 Πρωτεΐνες σε ραχιοπλευρικό Προστάτη τομές ιστών από τον έλεγχο και SFN-επεξεργασμένο TRAMP ποντικών

Χρησιμοποιήσαμε αρχειοθετημένα ιστούς παραφίνης προστάτη από προηγουμένως ολοκληρώσει τη μελέτη TRAMP μας [8] για να καθορίσει

in vivo

αποτέλεσμα της χορήγησης SFN στα επίπεδα διασπαστεί Notch1, σχισμένα Notch2, και πρωτεΐνες HES-1. Αντιπροσωπευτικές εικόνες για διασπάται Notch 1, διασπάται Notch2, και η έκφραση πρωτεΐνης HES-1 στο ΡΙΝ, WD, και κακώς διαφοροποιημένο καρκίνο του προστάτη (PD) του ελέγχου και SFN-ποντίκια με αγωγή TRAMP φαίνεται στο Σχ. 7Α. Παραδόξως, η διοίκηση SFN απέτυχε να αυξήσει τα επίπεδα αυτών των πρωτεϊνών στο PIN, WD, και PD. Ωστόσο, μια μικρή αλλά σημαντική μείωση στο συνολικό επίπεδο διασπαστεί Notch2 (συνδυασμένη έκφραση σε PIN, WD, και PD) ήταν διακριτό στην ραχιοπλευρικό προστάτη του SFN-αγωγή ποντίκια TRAMP σε σύγκριση με εκείνη των ποντικών TRAMP ελέγχου.

(Α) Αντιπροσωπευτική ανοσοϊστοχημική εικόνες που απεικονίζουν την έκφραση διασπασμένης Notch 1, διασπάται Notch2, και HES-1 πρωτεϊνών στα προστατική ενδοεπιθηλιακή νεοπλασία (ΡΙΝ), καλά διαφοροποιημένο καρκίνο του προστάτη (WD), και κακώς διαφοροποιημένο καρκίνο του προστάτη (PD) στον πλαγιοπίσθιο προστάτες από TRAMP ποντικών των υποδεικνυόμενων ομάδων (χ 200 στόχος μεγέθυνση). (Β) Ο ποσοτικός προσδιορισμός της έκφρασης (συνδυασμένη ανάλυση σε PIN, WD, και PD) εμφανίζεται ως H-βαθμολογία (μέσος όρος ± SD? N = 5). Η στατιστική σημαντικότητα προσδιορίστηκε μέσω του Student

t-test

.

Η

Συζήτηση

σηματοδότηση Notch είναι αρκετά περίπλοκη περιλαμβάνει αλληλεπίδραση μεταξύ τεσσάρων υποδοχέα (Notch1, Notch2, Notch3, και Notch4) και πέντε συνδέτες [Jagged1, Jagged2, Delta-όπως και συνδετήρων (Dll1, Dll3 και Dll4)] [25], [29]. σηματοδότηση Notch εμπλέκεται σε προσδιορισμό κυττάρων μοίρα σε εμβρυϊκά και ιστούς ενηλίκων [32], [33], και φυσιολογική ανάπτυξη του προστάτη, καθώς και στην παθογένεση καρκίνων του προστάτη [25]. Η υπερέκφραση του Jagged-1 δείχθηκε σε μεταστατικό καρκίνο του προστάτη σε σύγκριση με εντοπισμένο καρκίνο και καλοήθη ασθένεια προστάτη [26]. Επιπλέον, Notch1 knockdown δείχθηκε ότι αναστέλλει την εισβολή του PC-3 κύτταρα [27] ΜΜΡ-9 και. Κάτω ρύθμιση των Jagged1 έχει δειχθεί ότι αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων καρκίνου του προστάτη [28]. Παρεμβολή RNA του Notch 1 αναστέλλει τη μετανάστευση των κυττάρων καρκίνου του προστάτη και εισβολή [28]. Η παρούσα μελέτη δείχνει ότι η θεραπεία SFN ενεργοποιεί σηματοδότηση Notch σε κυτταρικές σειρές ανθρώπινου καρκίνου του προστάτη ανεξάρτητα από την ανδρογόνο ανταπόκριση. Το SFN διαμεσολαβούμενη ενεργοποίηση της Notch 1, Notch2 και Notch4 χαρακτηρίζεται από διάσπαση τους και η αυξημένη μεταγραφική δραστικότητα. Η ενεργοποίηση του Notch 1 και Notch2, αλλά όχι Notch4, δεν είναι μοναδική για SFN καθώς ορισμένες από φυσικώς απαντώμενα ανάλογα του είναι αποτελεσματικά στην πρόκληση διάσπασης των δύο Notch 1 και Notch2 σε PC-3 και LNCaP κύτταρα. Σε συμφωνία με τα δεδομένα της βιβλιογραφίας [28], βρήκαμε επίσης ότι knockdown του Notch 1 και Notch2 μειώνει τη μετανάστευση των κυττάρων καρκίνου του προστάτη ανεξάρτητα από την ανδρογόνο ανταπόκριση. Παραδόξως, η ενεργοποίηση Notch με SFN έχει ελάχιστη επίδραση στην ικανότητά του να αναστέλλει τη μετανάστευση των κυττάρων καρκίνου του προστάτη. Συγκεκριμένα, νοκ ντάουν του Notch1, Notch2 ή Notch4 δεν έχει καμία επίδραση σε όλα ή μόνο οριακή επίδραση στην SFN μεσολάβηση αναστολή της μετανάστευσης προστάτη καρκινικών κυττάρων. Αυτές οι παρατηρήσεις δείχνουν ότι η ενεργοποίηση Notch είναι περιττή για SFN μεσολάβηση αναστολή της μετανάστευσης των κυττάρων καρκίνου του προστάτη.

Τα στοιχεία συνεχίζουν να συσσωρεύουν για να δείξει ότι οι δομικές διαφορές στις φυσικά απαντώμενες ισοθειοκυανικά (ITC) μπορεί να επηρεάσει βαθιά τη δραστηριότητά τους. Για παράδειγμα, η επαγωγή autophagy με SFN χρησιμεύει για την προστασία από την απόπτωση [34]. Αντίθετα, αυτοφαγία συντελεί σε κυτταρικό θάνατο από επαγωγή φαιναιθύλιο ισοθειοκυανικό (PEITC) [35], η οποία είναι μια φυσικώς ενυπάρχουσα συστατικό κάρδαμο με δομική ομοιότητα με SFN (δηλαδή, παρουσία της λειτουργικής ομάδας ITC). Η παρούσα μελέτη παρέχει ένα ακόμα παράδειγμα για να τονίσει μηχανιστικές διαφορές στα δομικά σχετικές ενώσεις ITC (π.χ., SFN και PEITC). Έχουμε δείξει στο παρελθόν ότι, σε αντίθεση με SFN (παρούσα μελέτη) ενεργοποίηση Notch από PEITC εμποδίζει την ανασταλτική δράση της για τη μετανάστευση προστάτη καρκινικών κυττάρων [30]. Αυτές οι παρατηρήσεις υπογραμμίζουν προσοχή σε παρέκταση των μηχανιστικών αποτελεσμάτων μεταξύ δομικά διαφορετικών ενώσεων ITC.

Η ενεργοποίηση του Notch2 από υπερέκφραση του ενδοκυτταρικού τομέα του έχει δειχθεί ότι προάγει απόπτωση σε MDA-MB-231 ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου του μαστού [31] . Επειδή επαγωγή απόπτωσης θεωρείται ένα σημαντικό μηχανισμό σε χημειοπρόληψη του καρκίνου με SFN [12], [14], ήταν ενδιαφέρον να προσδιορίσουν τις συνέπειες της ενεργοποίησης Notch2 επί προαποπτωτικών απόκριση σε SFN. Σε αντίθεση με MDA-MB-231 κύτταρα, knockdown του Notch2 δεν έχει επίδραση επί της απόπτωσης είτε PC-3 ή LNCaP κύτταρα. Επιπλέον, SFN επαγόμενη απόπτωση επηρεάζεται ελάχιστα από knockdown του Notch2 σε PC-3 και LNCaP κύτταρα. Έτσι προαποπτωτικής ρόλο της Notch2 μπορεί να είναι ένα φαινόμενο μοναδικό στα κύτταρα MDA-MB-231.

Έχουμε δείξει στο παρελθόν ότι η χορήγηση SFN αναστέλλει συχνότητα και επιβάρυνση (πληγείσα περιοχή) PIN και WD, αλλά όχι PD, όπως καθώς και πνευμονική πολλαπλότητα μετάστασης σε ποντίκια TRAMP [8]. Είναι ενδιαφέρον ότι, η χορήγηση SFN δεν είναι σε θέση να αυξήσει τα επίπεδα της διασπαστεί Notch1, σχισμένα Notch2 ή HES-1

in vivo

στην ραχιοπλευρικό προστάτη των ποντικών TRAMP (παρούσα μελέτη). Από τη μία πλευρά, τα αποτελέσματα αυτά υποδηλώνουν ότι η πρόληψη του καρκίνου του προστάτη με SFN σε TRAMP ποντικών δεν σχετίζεται με σηματοδότηση Notch. Την ίδια στιγμή, η πιθανότητα ότι μια πιο έντονη δοσολογικό σχήμα του SFN (π.χ. υψηλότερες συγκεντρώσεις και ημερήσια χορήγηση) μπορεί να απαιτείται για να προκληθεί η ενεργοποίηση Notch

in vivo

δεν μπορεί να απορρίπτεται. Παρατηρούμενη απόκλιση μεταξύ των

in vitro

και

in vivo

συστήματα που αφορούν τις επιπτώσεις των SFN στην ενεργοποίηση εγκοπή μπορεί επίσης να σχετίζονται με μικροπεριβάλλον του όγκου. Ωστόσο, απαιτείται περαιτέρω εργασία για να διερευνήσει τις δυνατότητες αυτές.

Εν κατακλείδι, τα αποτελέσματα της παρούσας όχι μόνο αποκαλύπτει

in vitro

και

in vivo

διαφορές στην επίδραση της SFN στην ενεργοποίηση Notch αλλά επίσης δείχνουν ότι η ενεργοποίηση του Notch 1, Notch2 και Notch4 είναι σε μεγάλο βαθμό περιττή για κυτταρικές αποκρίσεις σε SFN (π.χ., αναστολή της κυτταρικής μετανάστευσης ή απόπτωση) τουλάχιστον σε ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου του προστάτη.

Μέθοδοι

Δήλωση Ηθικής

Χρησιμοποιήσαμε τμήματα αρχειοθετημένα ιστού από μας στο παρελθόν δημοσιευθεί

in vivo

μελέτη [8] για να προσδιοριστεί η επίδραση της χορήγησης SFN στην έκφραση της διασπαστεί Notch1, σχισμένα Notch2, και πρωτεΐνες HES-1. Η χρήση των ποντικών και τη φροντίδα τους εγκρίθηκε από και σύμφωνα με το Πανεπιστήμιο του Πίτσμπουργκ τις κατευθυντήριες γραμμές φροντίδας ζώων και την Επιτροπή Χρήσης.

Αντιδραστήρια και γραμμές κυττάρων

Η SFN συντέθηκε όπως περιγράφεται από Conaway et al. [6], ενώ φυσικώς απαντώμενα ανάλογά της αγοράστηκαν από LKT Laboratories (St. Paul, ΜΝ). Στοκ διαλύματα των SFN και τα ανάλογά της παρασκευάσθηκαν σε DMSO, φυλαγμένο στους -20 ° C, και αραιώνεται με φρέσκο ​​μέσο αμέσως πριν από τη χρήση. Ο ίδιος όγκος DMSO (τελική συγκέντρωση & lt? 0,1%) προστέθηκε στα δείγματα ελέγχου. αντιδραστήρια κυτταρικής καλλιέργειας όπως ορός εμβρύου βοός, μίγματα αντιβιοτικά, ρυθμισμένο με φωσφορικό αλατούχο (PBS), και τρυψίνη τα προμηθευτήκαμε από την Invitrogen-Life Technologies (Carlsbad, CA). Αντισώματα έναντι διασπασμένου Notch1, και πλήρους μήκους Notch2 ήταν από την Cell Signaling Technology (Danvers, ΜΑ)? ένα αντίσωμα ειδικό για την ανίχνευση διασπασμένων Notch2 ήταν από EMD-Millipore (Billerica, ΜΑ)? αντισώματα έναντι πλήρους μήκους Notch 1, Notch4 (αυτό το αντίσωμα ανιχνεύει τόσο πλήρους μήκους και διασπασμένο μορφές) και HES-1 ήταν από την Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA)? και αντι-ακτίνης αντίσωμα ήταν από τη Sigma-Aldrich (St. Louis, ΜΟ). Μικρά παρεμβαλλόμενα RNA που στοχεύουν ενάντια Notch1, Notch2 και Notch4 αγοράστηκαν από την Santa Cruz Biotechnology. Ένα μη ειδικό siRNA ελέγχου αγοράστηκε από την Qiagen (Germantown, MD). καρκινικές κυτταρικές σειρές PC-3 και LNCaP ανθρώπινου προστάτη ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (Manassas, VA) και καλλιεργήθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [14], [24]. LNCaP-C4-2B κυτταρική γραμμή αγοράστηκε από UroCor και διατηρείται όπως προτείνεται από τον προμηθευτή.

ανοσοαποτύπωσης

λύματα πλήρων κυττάρων παρασκευάστηκαν όπως περιγράφεται [36] και υποβλήθηκε σε νάτριο δωδεκυλο-θειικού πολυακρυλαμιδίου ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα [36], [37]. Η υγρή μεταφερόμενης μεμβράνη επωάστηκε με κατάλληλα πρωτογενή και δευτερογενή αντισώματα και οι ανοσοαντιδραστικές ζώνες ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας ενισχυμένη μέθοδο χημειοφωταύγειας. Πολυπλεξία ή απογύμνωση /εκ νέου σχολαστικά διεξήχθη για μερικές πρωτεΐνες σε ορισμένα πειράματα.

Luciferase Assay Reporter

Η μεταγραφική δραστικότητα της Notch προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας ένα κιτ ανταποκριτή λουσιφεράσης Cignal RBP-Jk (SABiosciences- Qiagen) σύμφωνα με τις συστάσεις του προμηθευτή. Για τον προσδιορισμό του HES-1Α /Β και η δραστηριότητα λουσιφεράσης HEY-1, χρησιμοποιήσαμε pGL2-HES-1A /B και pGL2-HEY-1 πλασμίδια απλόχερα μας δόθηκε από τον Δρ Kimberly Ε Εργοδηγός (Τμήμα Παθολογίας, Πανεπιστήμιο Loyola Ιατρικό Κέντρο, Maywood, IL). Τα παροδικά συν-επιμολυσμένα κύτταρα με το πλασμίδιο πυγολαμπίδας λουσιφεράση και λουσιφεράση της Renilla χρησιμοποιούν Fugene6 (Roche Applied Science, Indianapolis, ΙΝ) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με DMSO (έλεγχος) ή SFN για 8 ή 24 ώρες. Η δραστικότητα λουσιφεράσης μετρήθηκε με Dual-Luciferase Assay System Reporter (Promega, Madison, WI) ακολουθώντας τα πρωτόκολλα του κατασκευαστή.