Αφηρημένο

Ιστορικό

Η αλληλεπίδραση των περιβαλλοντικών χημικών ουσιών και των μεταβολιτών τους με βιολογικά μακρομόρια μπορεί να οδηγήσει σε κυτταροτοξικά και γενοτοξική δράση. 4-αμινοδιφαινύλιο (4-ΑΒΡ) και διάφορα άλλα συναφή αρυλαμίνες έχουν δειχθεί ότι είναι αιτιολογικά εμπλέκεται στην επαγωγή ανθρώπινων καρκίνων της ουροδόχου κύστης. Οι γονοτοξικές και η καρκινογόνα αποτελέσματα του 4-ΑΒΡ εκτίθενται μόνο όταν είναι μεταβολικά μετατρέπεται σε ένα δραστικό ηλεκτρόφιλο, τα ιόντα nitrenium αρύλιο, το οποίο στη συνέχεια δεσμεύεται με το DNA και να προκαλέσει βλάβες. Αν και αρκετές μελέτες έχουν αναφέρει το σχηματισμό των προϊόντων προσθήκης 4-ΑΒΡ-DNA, καμία εκτεταμένη εργασία έχει γίνει για να διερευνήσει την ανοσογονικότητα του 4-ΑΒΡ-τροποποιημένο DNA και η πιθανή συμμετοχή της στη δημιουργία αντισωμάτων σε ασθενείς με καρκίνο της ουροδόχου κύστης.

Μεθοδολογία /Κύρια Ευρήματα

Ανθρώπινο DNA τροποποιήθηκε με το Ν-υδροξυ-4-acetylaminobiphenyl (

Ν

ΟΗ-AABP), ο ενεργός μεταβολίτης της 4-ΑΒΡ. Δομικές διαταραχές στο

N

-ΟΗ-AABP τροποποιημένο DNA αξιολογήθηκαν με υπεριώδη, φθορισμού, και φασματοσκοπία κυκλικού διχρωματικόν καθώς και με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης. Γονοτοξικότητας του

Ν

ΟΗ-AABP τροποποιημένο DNA επιβεβαιώθηκε από κομήτη δοκιμασία. Υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης (HPLC) του φυσικού και του τροποποιημένου δειγμάτων DNA επιβεβαίωσε τον σχηματισμό του

N

– (δεοξυγουανοσίνη-8-υλ) -4-αμινοδιφαινύλιο (dG-C8-4ABP) στην

N

ΟΗ-AABP κατεστραμμένο DNA. Τα πειραματικά προκληθέντα αντισώματα έναντι

N

-ΟΗ-AABP-τροποποιημένο DNA εμφάνισε πολύ καλύτερη αναγνώριση του DNA που απομονώθηκε από ασθενείς με καρκίνο της ουροδόχου κύστης σε σύγκριση με το DNA που λαμβάνεται από υγιή άτομα σε ανταγωνιστική ELISA σύνδεσης.

Συμπεράσματα /Σημασία

Αυτή η εργασία παρουσιάζει την κατανομή επιτόπου μεταξύ του DNA που απομονώθηκε από ασθενείς με καρκίνο της ουροδόχου κύστης και το

Ν

ΟΗ-AABP-τροποποιημένο DNA που εμπλέκουν το ρόλο της 4-ΑΒΡ μεταβολιτών στο DNA βλάβη και νεο-αντιγονική γενιά επιτόπου που θα μπορούσε να οδηγήσει στην επαγωγή αντισωμάτων σε ασθενείς με καρκίνο της ουροδόχου κύστης

Παράθεση:. Shahab U, Moinuddin, Ahmad S, Dixit Κ, Habib S, Alam K, et al. (2013) γονοτοξική δράση του

Ν

-υδροξυ-4-Acetylaminobiphenyl για τα Ανθρώπινα DNA: Επιπτώσεις σε καρκίνο της ουροδόχου κύστης. PLoS ONE 8 (1): e53205. doi: 10.1371 /journal.pone.0053205

Επιμέλεια: Rizwan Χασάν Χαν, Aligarh μουσουλμανική Πανεπιστήμιο, την Ινδία

Ελήφθη: 31 του Ιουλίου 2012? Αποδεκτές: 26 του Νοεμβρίου 2012? Δημοσιεύθηκε: 31, Ιανουαρίου 2013

Copyright: © 2013 Shahab et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο χρηματοδοτήθηκε εν μέρει από την ICMR δεν χορηγούν. Ανοσο 18/11 /18/2008 ECD-Ι (όπου σήμερα βρίσκεται ολοκληρώθηκε) και τα κεφάλαια από το Πανεπιστήμιο (Aligarh μουσουλμανική Πανεπιστήμιο). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Το DNA των κυττάρων που εκτίθενται σε χημικά καρκινογόνα σχεδόν πάντα περιέχει ένα σύνολο από δομικά διαφορετικών καρκινογόνο-νουκλεοτίδιο προσαγωγές [1]. Υπάρχει η υποψία ότι κακής αντιγραφής ή misrepair από ένα υποσύνολο αυτών των προϊόντων προσθήκης προκαλεί μεταλλάξεις, οι οποίες με τη σειρά τους μπορεί να είναι οι πρόδρομοι γενετική του φαινοτύπου του καρκίνου. Ένα τέτοιο καρκινογόνο είναι 4-αμινοδιφαινύλιο, μια αρωματική αμίνη. Αυτά είναι ικανά να επάγουν μία ποικιλία τοξικών επιδράσεων, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου και met-hemoglobinemia [2]. 4-ABP είναι μια περιβαλλοντική και επαγγελματική πρόσμειξη που παράγεται κυρίως από τον καπνό των τσιγάρων, την καύση των ορυκτών καυσίμων και από καουτσούκ, άνθρακα, της κλωστοϋφαντουργίας και εκτύπωση βιομηχανίες [3] – [5]. 4-ΑΒΡ έχει δειχθεί ότι είναι ένας σημαντικός αιτιολογικός παράγοντας του καρκίνου ανθρώπινης κύστης, και επίσης ένας ισχυρός ουροδόχου καρκινογόνο κύστη σε πειραματόζωα [6], [7]. έχουν κατάλοιπα 4-ΑΒΡ έχουν αναφερθεί σε αιμοσφαιρίνη και στο DNA που απομονώθηκε από την ουροδόχο κύστη των καπνιστών [8], [9]? δυνητικά εμπλέκοντας 4-ΑΒΡ στην αιτιολογία του καρκίνου της ουροδόχου κύστης. Η χημική δομή της 4-ΑΒΡ και φυσιολογικών μεταβολίτη της,

N

-ΟΗ-AABP, τοποθετείται ως σχήμα 1Α

Ηλεκτροφόρηση πηκτής αγαρόζης των ιθαγενών και

N

. – OH-AABP τροποποιημένο ανθρώπινο DNA [b]. δείγματα DNA από λωρίδες 2-5 υποβλήθηκαν σε θεραπεία με αυξανόμενη συγκέντρωση

N

-ΟΗ-AABP. Διαδρομή 1: Native ανθρώπινο DNA? Λωρίδα 2: Native ανθρώπινου DNA με 0,378 mm

Ν

ΟΗ-AABP? Διαδρομή 3: Native ανθρώπινου DNA με 0.757 mm

Ν

ΟΗ-AABP? Διαδρομή 4: Εγγενής ανθρώπινου DNA με 1.136 mm

Ν

ΟΗ-AABP? Διαδρομή 5: Native ανθρώπινου DNA με 1.515 mm

Ν

ΟΗ-AABP

Η

Οι γενοτοξικές και καρκινογόνες επιδράσεις εκτίθενται όταν 4-ΑΒΡ είναι μεταβολικά μετατρέπεται σε ένα δραστικό ηλεκτρόφιλο.. Το πρωταρχικό βήμα είναι

Ν

οξείδωση των αρυλαμίνες και arylacetamides από συγκεκριμένες κυτοχρώματος

P

450 (CYP1A2) σε ηπατική ιστούς [10], που ακολουθείται από σύζευξη του

Ν

υδροξύλ λειτουργία με οξικό, θειικό, γλυκουρονικό ή [11] – [14]. Τα ενεργοποιημένα παράγωγα του ηλεκτρόφιλη 4-ΑΒΡ ασκούν γονοτοξική δράση τους μέσω της αλληλεπίδρασης με προϊόντα προσθήκης που σχηματίζουν DNA που έχουν αναφερθεί για ένα ρόλο στην καρκινογένεση κύστη τόσο σε πειραματόζωα [15] – [17] και στον άνθρωπο [18], [19]. Οι προσαγωγές DNA έχει επίσης αναφερθεί κατά την έκθεση των ανθρώπινων κυττάρων της ουροδόχου κύστης σε

Ν

ΟΗ-ΑΒΡ,

Ν

ΟΗ-AABP και

Ν

-ΟΑε-AABP [20 ] – [22]. Ωστόσο, το μείζον προϊόν προσθήκης (80%) του DNA που σχηματίζεται έχει ταυτοποιηθεί ως

N

– (deoxyguanosin-8-υλ) -4-αμινοδιφαινύλιο (dG-C8-ΑΒΡ) [19]. Ακόμα κι αν οι μεγάλες βλάβες DNA είναι ένα αποτέλεσμα του σχηματισμού ομοιοπολικών προϊόντος προσθήκης, αυτοί οι μεταβολίτες προκαλούν επίσης την οξειδωτική βλάβη του DNA που παράγουν δραστικά είδη οξυγόνου [23] που δημιουργούν τελικά διάσπαση της έλικας του DNA και τις τροποποιήσεις βάσης, όπως 8-οξο-γουανίνης και συναφή προϊόντα [24] , [25].

Ο τρόπος δράσης των διαφόρων καρκινογόνων διαπιστώνεται καλύτερα με την ανάλυση γονοτοξικότητας τους [26]. Η παρούσα μελέτη παρουσιάζει τις διαρθρωτικές αλλαγές στο ανθρώπινο DNA μετά την επώαση με

Ν

ΟΗ-AABP για 24 ώρες. Το τροποποιημένο DNA χαρακτηρίστηκε με διάφορες φασματοσκοπικές τεχνικές, ηλεκτροφόρηση πηκτής και μελέτες θερμική μετουσίωση. Η γονοτοξικότητας του

Ν

ΟΗ-AABP διαπιστώθηκε μέσω κομήτη δοκιμασία. Αντισώματα έναντι

N

-ΟΗ-AABP-DNA προκλήθηκαν σε θηλυκά κουνέλια και να χρησιμοποιηθεί ως ανιχνευτής ανοσοχημική για την ανίχνευση των βλαβών που προκαλούνται από 4-ΑΒΡ μεταβολίτες, στο DNA των ασθενών με καρκίνο της ουροδόχου κύστης.

Ηθική δήλωση-

η μελέτη αυτή έχει εγκριθεί από την Επιτροπή Θεσμικών Ζωικά Δεοντολογίας της JN Medical College, AMU, Aligarh, Ινδία (επιτρέπουν αρ. 401 /CPCSEA). δείγματα αίματος από ασθενείς και υγιή άτομα συλλέχθηκαν μετά από ενημέρωση προφορική συγκατάθεση.

Υλικά και Μέθοδοι

Ν

ΟΗ-AABP ήταν από Midwest ερευνητικό ινστιτούτο του Κάνσας. DNA ανθρώπινου πλακούντα, μεθυλιωμένη λευκωματίνη βόειου ορού (MBSA), βρωμιούχο αιθίδιο, πρωτεΐνη Α-αγαρόζη (2.5 ml προ-συσκευασμένη στήλη), συζυγών αντι-κουνελιού IgG αλκαλική φωσφατάση, φωσφορικό ρ-νιτροφαινύλιο, Tween-20, πλήρης & amp του Freund? ατελή ανοσοενισχυτικά, Histopaque 1077, χαμηλού σημείου τήξεως αγαρόζη (LMPA), RPMI 1640, Triton-Χ 100, trypan blue, και αλατόνερο ρυθμισμένο με φωσφορικό (PBS) Ca

+ και Mg2

2+ ήταν από την Sigma Chemical Company , ΗΠΑ. Πολυστυρένιο μικροτιτλοδότησης επίπεδου πυθμένα πλάκες ELISA από την Nunc (Δανία). Όλα τα άλλα χημικά και τα αντιδραστήρια που χρησιμοποιήθηκαν ήταν από τις υψηλότερες αναλυτικού βαθμού.

Τροποποίηση του DNA ανθρώπινου πλακούντα

DNA ανθρώπινου πλακούντα (15 μΜ) τροποποιήθηκε με επώαση στους 37 ° C για 24 ώρες με διάφορες συγκεντρώσεις (0,378 mM, 0.757 mM, 1.136 mM και 1.515 mM) του

Ν

ΟΗ-AABP σε DMSO. Χωρίς περιορισμούς συστατικά απομακρύνθηκαν με εκτεταμένη διαπίδυση έναντι ρυθμιστικού φωσφορικού νατρίου (10 mM, ρΗ 7.4) που περιέχει 150 mM NaCl.

ηλεκτροφόρησης πηκτής αγαρόζης

Η αλλαγή στην ηλεκτροφορητική εικόνα του φυσικού και του τροποποιημένου DNA παρατηρήθηκε επί 1% αγαρόζης σε 30 mA για 2 ώρες σε ρυθμιστικό διάλυμα ΤΑΕ (40 mM τρις-οξικό, 2 mM EDTA, ρΗ 8,0). Τα πηκτώματα χρωματίστηκαν με βρωμιούχο αιθίδιο και κατέστησαν ορατά υπό υπεριώδες φως.

Απομόνωση των λεμφοκυττάρων

Ηπαρινισμένο δείγματα αίματος (2 ml) από υγιείς δότες και ασθενείς αραιώθηκαν καταλλήλως σε Ca

2+ και Mg

2 + δωρεάν PBS. Λεμφοκύτταρα απομονώθηκαν από αίμα χρησιμοποιώντας Histopaque 1077 και τα κύτταρα τελικά αιωρούνται σε RPMI 1640.

Βιωσιμότητα Αξιολόγηση των λεμφοκυττάρων

Τα λεμφοκύτταρα ελέγχθηκαν για τη βιωσιμότητά τους πριν από την έναρξη και μετά το τέλος της αντίδραση χρησιμοποιώντας δοκιμασία εξαίρεσης κυανούν τρυπανίου [27]. Η βιωσιμότητα των κυττάρων βρέθηκε να είναι μεγαλύτερη από 93%.

λεμφοκυττάρων Θεραπεία

λεμφοκύτταρα (1 × 10

5 κύτταρα) εκτέθηκαν σε διαφορετικές συγκεντρώσεις Ν-ΟΗ-AABP (0,378 mM, 0,757 mM, 1,136 mM, 1,515 mM) σε ένα συνολικό όγκο αντίδρασης 1 ml και επωάστηκαν στους 37 ° C για 90 λεπτά. Μετά την επώαση, το μίγμα φυγοκεντρήθηκε στις 4000 rpm, το υπερκείμενο απορρίφθηκε και τα σφαιροποιήθηκαν λεμφοκύτταρα επαναιωρήθηκαν σε 100 μΐ PBS (Ca

+ και Mg2

2+ δωρεάν) και κατεργάζεται περαιτέρω για Comet δοκιμασίας.

Comet δοκιμασία

Comet δοκιμασία διεξήχθη σύμφωνα με το πρωτόκολλο που έχει δώσει με προηγούμενη δημοσίευση από το εργαστήριο μας [28].

Φυσικοχημικές ανάλυση

Η ανάλυση φθορισμού ήταν πραγματοποιείται σε Shimadzu (RF-5301-PC) spectrofluorophotometer. Τα δείγματα διεγείρεται στα 325 nm και το προφίλ των εκπομπών καταγράφηκε στο εύρος 500 έως 700 nm. Κυκλικό διχρωϊσμού (CD) μετρήσεις της φυσικής και τροποποιημένης ανθρώπινο DNA καταγράφηκαν σε Jasco J-815 φασματοπολωσίμετρο στην περιοχή μήκους κύματος 220 – 400 nm. Όλες οι σαρώσεις καταγράφηκαν σε διάστημα 1 nm.

Υγρή Χρωματογραφία Υψηλής Απόδοσης

ανάλυση

Υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης (HPLC) του φυσικού και του τροποποιημένου DNA διεξήχθη επί συστήματος ροής Βιολογικός Duo, BioRad (USA) εφοδιασμένο με ανιχνευτή πολλαπλών μηκών κύματος υπεριώδους-ορατού. Η απορρόφηση παρακολουθήθηκε στα 245 nm. Εν συντομία δείγμα DNA 50 μΜ υδρολύθηκε σε 0.1 Ν HCl (1 ml /mg ϋΝΑ) στους 100 ° C για 30 λεπτά (με σκοπό την απελευθέρωση των βάσεων) και ξηραίνεται υπό κενό. Οι βάσεις διαλύθηκαν σε 50 μΐ 0,1 Μ ρυθμιστικού διαλύματος Tris HCl, ρΗ 8,5 και διηθείται μέσω 0.42 μΜ MILEX, φίλτρο μίας χρήσης σύριγγας πριν από τη φόρτωση επί C-18 στήλη ανάστροφης φάσης (Supelco, Discovery 25 cm × 4,6 mm). Το ρυθμιστικό μέσο έκλουσης ήταν 12.5 mM κιτρικό οξύ, 25 mM οξικό νάτριο, 25 μΜ αιθυλενοδιαμινοτετραοξικό (EDTA), ρΗ 5.2 και μια ταχύτητα ροής 1 ml /min διατηρήθηκε καθ ‘όλη.

Πρόγραμμα Εμβολιασμών

Τυχαία φυλής, New Zealand White (NZW) θηλυκά κουνέλια ανοσοποιήθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [28], [29]. Εν συντομία, τα κουνέλια (η = 4? Δύο κάθε για φυσική και τροποποιημένου DNA) ανοσοποιήθηκαν ενδομυϊκά σε πολλαπλές θέσεις με 50 μg των αντίστοιχων αντιγόνων σε σύμπλοκο με μετουσιωμένο BSA σε 1:01 αναλογία (β /β) και γαλακτωματοποιήθηκε με ίσο όγκο του Freund ανοσοενισχυτικό.

καθαρισμό αντισωμάτων

ανοσοσφαιρίνη G (IgG) ήταν καθαρισμένο με συγγένεια από προάνοσο και άνοσο ορούς σε μια πρωτεΐνη Α-αγαρόζη στήλη [30]. Η ομοιογένεια της απομονωμένης IgG επιβεβαιώθηκε με 7.5% SDS-PAGE.

Απομόνωση DNA από ανθρώπινο αίμα

Συλλέχθηκαν δείγματα αίματος σε φιαλίδια EDTA από διαφορετικούς ασθενείς με καρκίνο της ουροδόχου κύστης και φυσιολογικά υγιή άτομα. DNA των λεμφοκυττάρων απομονώθηκε σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. 5 ml αίματος προστέθηκαν σε 500 μΙ πρωτεάσης Qiagen και στη συνέχεια ρυθμιστικό διάλυμα AL (6 ml) αναμίχθηκε ακολουθήθηκε από έντονη ανακίνηση. Το μίγμα επωάστηκε στους 70 ° C για 10 λεπτά και 5 ml αιθανόλης (98%) προστέθηκε στο δείγμα και αναμίχθηκαν με αναστροφή του σωλήνα και έντονη ανακίνηση. Το διάλυμα μεταφέρθηκε προσεκτικά πάνω σε στήλη QIAamp Maxi τοποθετήθηκε σε ένα φυγοκεντρικό σωλήνα των 50 ml και φυγοκεντρήθηκαν στα 1850 χ g (3000 rpm) για 3 λεπτά. Το διήθημα απορρίφθηκε και προστέθηκαν 5 ml ρυθμιστικού AW2 και πάλι σε φυγοκέντρηση σε 4500 χ g (5000 rpm) για 1 λεπτό. Και πάλι 5 ml ρυθμιστικού AW2 προστέθηκε και φυγοκεντρήθηκε στα 4500 χ g (5000 rpm) για 15 λεπτά και το διήθημα απορρίφθηκε. Στη συνέχεια, 600 μΐ ρυθμιστικού ΑΕ χύθηκε κατευθείαν πάνω στη μεμβράνη της στήλης που αργότερα επωάστηκε για 5 λεπτά, και φυγοκεντρήθηκε στα 4500 χ g (5000 rpm) για 2 λεπτά. Το έκλουσμα επαναφόρτωση επί της μεμβράνης της στήλης, επωάστηκαν για 5 λεπτά, και φυγοκεντρήθηκε στα 4500 χ g (5000 rpm) για 5 λεπτά. Το έκλουσμα που περιέχει DNA ξηράνθηκε αέρα και διαλύθηκε σε PBS, ρΗ 7.4. Η καθαρότητα και η συγκέντρωση της προετοιμασίας DNA επιβεβαιώθηκε με A

260 και Α

280 μετρήσεις.

ELISA

Η ειδική δέσμευση των αντισωμάτων διαπιστώθηκε σε δοκιμασία ανταγωνιστικής δέσμευσης [31]. Η ποσοστιαία αναστολή υπολογίστηκε από το δεδομένο τύπο:.

Η ποσοστιαία αναστολή = 1- (A

ανέστειλε /A

ανεμπόδιστη) × 100

Αποτελέσματα και Συζήτηση

το σχέδιο γέλη (Σχήμα 1Β) δείχνει μία αύξηση στην κινητικότητα του τροποποιημένου DNA με αυξανόμενη συγκέντρωση

N

-ΟΗ-AABP (λωρίδες 2-5). Η μέγιστη κινητικότητα παρατηρείται με 1.515 mm

Ν

ΟΗ-AABP? και οποιαδήποτε περαιτέρω αύξηση στη συγκέντρωση του οδήγησε σε πλήρη απώλεια της δομής του DNA. Η αύξηση της κινητικότητας του Ν-ΟΗ-AABP κατεργασία DNA μπορεί να οφείλεται στην παραγωγή του ενιαίου διαλείμματα κλώνου η οποία μπορεί να οδηγήσει στο σχηματισμό του μικρού μεγέθους DNA που έχουν ταχύτερη κινητικότητα σε σύγκριση με εγγενή DNA του λωρίδα 1. Μία απώλεια του φθορισμού του DNA παρατηρήθηκε επίσης ως συνάρτηση της αύξησης της συγκέντρωσης του

N

-ΟΗ-AABP. Αυτό δείχνει και πάλι προς τη βλάβη την ελικοειδή δομή του DNA.

Η ηλεκτροφόρηση μονοκύτταρους gel (SCGE) ή κομήτη δοκιμασία είναι μια πολύ ευαίσθητη μέθοδος για την αξιολόγηση της βλάβης του DNA. Κατά τη διάρκεια της ηλεκτροφόρησης το κατεστραμμένο DNA μεταναστεύει από τον πυρήνα προς την άνοδο, σχηματίζοντας ένα σχήμα «κομήτη» με μια κεφαλή (πυρήνα κυττάρου με ανέπαφο DNA) και μια ουρά (χαλαρή και θραυσμάτων DNA). Ως εκ τούτου, κομήτη δοκιμασία μπορεί να χρησιμοποιηθεί για να δοκιμαστεί η γονιδιοτοξικότητα των καρκινογόνων παραγόντων σε καλλιεργημένα κύτταρα, συμπεριλαμβανομένων των προσφάτως απομονωμένα ανθρώπινα λεμφοκύτταρα. Σε αυτή τη μελέτη έχουμε χρησιμοποιήσει τον κομήτη-δοκιμασία για την ανάλυση της βλάβης στην ανθρώπινη DNA λεμφοκυττάρων μετά τη θεραπεία

Ν

ΟΗ-AABP. Οι κομήτη εικόνες, κατά την κατεργασία των λεμφοκυττάρων με διαφορετικές συγκεντρώσεις

N

-ΟΗ-AABP, παρουσιάζονται στο Σχήμα 2. Ένα κομήτη με μια ουρά είναι ενδεικτική της διάσπασης του DNA σε ηλεκτροφόρηση γέλης μόνο κύτταρο. Τα αποτελέσματά μας απέδειξε σαφώς βλάβη του DNA κατά την κατεργασία με 1,515 mm

N

-ΟΗ-AABP, όπως προκύπτει από το σχηματισμό διακριτών ουράς από το διάχυτο κεφαλή (Σχήμα 2Ε). Παρατηρήσαμε ότι με αυξανόμενες συγκεντρώσεις

N

-ΟΗ-AABP, το ποσοστό του DNA σε ουρά αυξήθηκε επίσης. Στο 0,378 mM συγκέντρωση

Ν

ΟΗ-AABP, το 19% του DNA βρέθηκε στην ουρά. Ωστόσο, στο 0,757 mM και 1,136 mM του

N

-ΟΗ-AABP το ποσοστό του DNA ουράς αυξάνεται σε 27% και 58% αντίστοιχα. Αυξήθηκε περαιτέρω σε 89% σε 1.515 mm

Ν

ΟΗ-AABP. Οι παράμετροι βλάβη στο DNA, δηλαδή, τη στιγμή ουρά ελιάς (OTM) και το μήκος της ουράς μετρήθηκαν επίσης και βρέθηκε να αυξηθεί σημαντικά με 1,515 mm

N

-ΟΗ-AABP σε σύγκριση με 0.378 mM, 0,757 mM και 1,136 mM

Ν

ΟΗ-AABP. Μια αξιοσημείωτη αύξηση ΟΤΜ (94%) παρατηρήθηκε στα λεμφοκύτταρα σε επεξεργασία με 1,515 mm

N

-ΟΗ-AABP σε σύγκριση με τον έλεγχο (χωρίς επεξεργασία λεμφοκύτταρα). Επιπλέον, μια σημαντική αύξηση στο μήκος της ουράς καταγράφηκε επίσης. Βρέθηκε να είναι 72% πάνω από εκείνη του χωρίς επεξεργασία ελέγχου λεμφοκυττάρων. Τα αποτελέσματα συνοψίζονται στον Πίνακα 1.

Όλα τα λεμφοκύτταρα υποβλήθηκαν σε θεραπεία για 24 ώρες στους 37 ° C.

Η

Σε μια προηγούμενη δημοσίευση, παρατηρήθηκε 62% υπερχρωμικότητας σε 260 nm στο φάσμα υν απορρόφησης του

N

-ΟΗ-AABP τροποποιημένο ανθρώπινο DNA [32]. Η παρατηρούμενη υπερχρωμικότητας αντιπροσωπεύει την έκθεση του χρωμοφόρων ομάδων, ως αποτέλεσμα της δημιουργίας ρηγμάτων της έλικας και διάστασης των δεσμών υδρογόνου στην περίπτωση τροποποιημένου DNA.

Ούτε φυσικού DNA ούτε τροποποιημένη μορφή του έχει τη δική του φθορισμού της και ως εκ τούτου μια εξωγενή φθοροφόρο , βρωμιούχο αιθίδιο, χρησιμοποιήθηκε για φασματοσκοπία φθορισμού του DNA και

N

-ΟΗ-AABP-τροποποιημένη μορφή της. Native και

N

-ΟΗ-AABP τροποποιημένο DNA επωάστηκαν με βρωμιούχο αιθίδιο για 30 λεπτά και το προφίλ των εκπομπών καταγράφηκε χρησιμοποιώντας μήκος κύματος διέγερσης (325 nm) βρωμιούχου αιθιδίου (Σχήμα 3Α). Μια μείωση του 43,17% στην ένταση φθορισμού του τροποποιημένου DNA, σε σύγκριση με την φυσική του μορφή, σημαίνει διαταραχές στην DNA διπλής έλικας δομή ως αποτέλεσμα της

N

-ΟΗ-AABP τροποποίηση.

φάσματα εκπομπής φθορισμού του φυσικού ανθρώπινου DNA (—) και τροποποιήθηκε ανθρώπινου DNA με 1.515 mm

N

-ΟΗ-AABP (-) [a]. Εγκύκλιος φάσματα διχροϊκό του φυσικού ανθρώπινου DNA (-) και

Ν

ΟΗ-AABP τροποποιημένο ανθρώπινο DNA (—-) [b]

Η

Οι αλλαγές στη δομή του DNA ήταν. αξιολογείται με μετρήσεις ελλειπτικότητα. Η

N

-ΟΗ-AABP τροποποιημένο DNA επέδειξαν μία μετατόπιση 5 nm (από 275 στα 280 Nm) στο σήμα CD, μαζί με μια αύξηση στην ελλειπτικότητα από 5,57 να 9,27 ΟΕΙΠ (Σχήμα 3Β), δεικνύοντας δομικές αλλαγές σε το μόριο του DNA. Η αύξηση στην ελλειπτικότητα αντιστοιχεί σε απώλεια 39,9% στην δομή του DNA κατά την τροποποίησή τους. Αυτή η δομική ζημία μπορεί να οφείλεται σε unstacking βάσεων DNA ως αποτέλεσμα της έλικας αποσταθεροποίησης. Οι διαρθρωτικές διαταραχές προτείνουν ξεδίπλωμα του DNA, μπορεί να οφείλεται στη δημιουργία ενιαίου διαλείμματα σκέλος.

Εικόνα 4Α και 4Β παρουσιάζουν αντιπροσωπευτικά χρωματογραφήματα HPLC των δειγμάτων οξύ υδρολύεται των ιθαγενών και

Ν

-ΟΗ- AABP τροποποιημένο ανθρώπινο DNA, αντίστοιχα. Καλά ορίζεται κορυφές σε χρόνο κατακράτησης 4,467 λεπτά, 7.332 λεπτά και 8.727 min παρατηρήθηκαν σε φυσική ανθρώπινη DNA. Ωστόσο, στην περίπτωση του τροποποιημένου DNA αυτές οι κορυφές μετατοπίζεται προς 4,631 λεπτά, 7.443 λεπτά και 9.164 min αντίστοιχα, υποδηλώνοντας τροποποίηση των βάσεων του DNA. Το επιπλέον κορυφή σε χρόνο κατακράτησης 22.029 λεπτά στο οξύ υδρόλυσης του τροποποιημένου DNA είναι χαρακτηριστική των dG-C8-4-ΑΒΡ προϊόν προσθήκης, ενός γνωστού δείκτη για το DNA που έχει πληγεί από 4-ΑΒΡ και

N

-ΟΗ- AABP [33]. Ο προσδιορισμός της ΓΔ-C8-4-ΑΒΡ προϊόντος προσθήκης είναι σε συμφωνία με τις δημοσιευμένες εκθέσεις σχετικά με το DNA-προσαγωγών με αρυλαμίνες σε πειραματόζωα [15] – [17]. Παρόμοια DNA-προσαγωγών έχουν αναφερθεί στα δείγματα βιοψίας της ανθρώπινης ουροδόχου κύστης [18], [19].

Αντιπροσωπευτικά HPLC χρωματογράφημα οξέος υδρόλυσης του

N

-ΟΗ-AABP τροποποιημένο ανθρώπινο DNA [b].

Η

Θηλυκά κουνέλια ανοσοποιημένα με

Ν

ΟΗ-AABP τροποποιημένο ανθρώπινο DNA έδειξε έντονη χυμική απόκριση προκαλέσουν ειδικά αντισώματα υψηλού τίτλου ανοσοποιητικό. Τα πειραματικά προκληθέντα αντισώματα χρησιμοποιήθηκαν σαν ένα ανοσοχημικό ανιχνευτής για την ανίχνευση των

N

-ΟΗ-AABP ή σχετίζονται με αρυλαμίνες επαγόμενες βλάβες στο γονιδιωματικό DNA των ασθενών με καρκίνο της ουροδόχου κύστης. Το μοτίβο δέσμευσης του DNA που απομονώθηκε από ασθενείς με καρκίνο της ουροδόχου κύστης ήταν αρκετά αποκαλυπτική δοκιμασία ανταγωνιστικής αναστολής. Η αναστολή της αντι

N

-ΟΗ-AABP-DNA IgG με DNA των λεμφοκυττάρων από ασθενείς με καρκίνο της ουροδόχου κύστης καταγράφηκε στην περιοχή από 60,5% έως 77,6%. Ενώ, η αναστολή που προκαλείται από DNA των λεμφοκυττάρων από φυσιολογικά υγιή άτομα ήταν αρκετά χαμηλή (Πίνακας 2). Σημαντικά υψηλή αναγνώριση του DNA των λεμφοκυττάρων από ασθενείς με καρκίνο της ουροδόχου κύστης από τις πειραματικώς προκληθέντα αντισώματα έναντι

N

τροποποιημένο -ΟΗ-AABP DNA αποτελεί σαφή ένδειξη του επιμερισμού επιτόπου μεταξύ του γονιδιωματικού DNA των ασθενών με καρκίνο της ουροδόχου κύστης και του ανθρώπινου DNA τροποποιημένο

in vitro από

Ν

ΟΗ-AABP. Αυτό οδηγεί στο συμπέρασμα ότι

Ν

ΟΗ-AABP, ή ένα σχετικό αρυλαμίνη, παράγει νεο-επιτόπων στο μόριο του DNA που αναγνωρίζονται ως «

αλλοδαπός

» ή

μη αυτο

από το ανοσοποιητικό σύστημα με αποτέλεσμα την παραγωγή αυτοαντισωμάτων σε ασθενείς με καρκίνο της ουροδόχου κύστης. Σημαντικά υψηλό επίπεδο αναγνώρισης του γενωμικού DNA από ασθενείς με καρκίνο της ουροδόχου κύστης από τις πειραματικώς προκληθέντα αντισώματα έναντι

N

-ΟΗ-AABP τροποποιημένο ανθρώπινο DNA είναι μια απόδειξη προς τη συμμετοχή των τροποποιημένων βάσεων και των περιφερειών μονό κλώνο στην παθογένεια της νόσου .

η

Ευχαριστίες

Οι συγγραφείς αναγνωρίζουν την υποστήριξη των υποδομών από DST-γροθιά εγκατάσταση του Τμήματος.