Αφηρημένο

Παρά την πρόσφατη πρόοδο στον τομέα της ιατρικής, σχεδόν το 50% των ασθενών με καρκίνο του παχέος εντέρου εμφάνιση υποτροπής της νόσου. Αν και οι λόγοι για την υψηλή υποτροπή δεν είναι πλήρως κατανοητοί, η παρουσία των χημείο- και ραδιοθεραπεία ανθεκτικά καρκινικά βλαστικά /βλαστικά κύτταρα όμοια, όπου πολλά oncomirs σαν microRNA-21 (MIR-21) ρυθμίζεται προς τα πάνω, θα μπορούσε να είναι μία από τις βασικές αιτίες. miR-21 ρυθμίζει τις διαδικασίες της εισβολής και της μετάστασης από ρύθμιση προς τα κάτω πολλαπλές μεταστατικές ογκοκατασταλτικών γονιδίων /συμπεριλαμβανομένης της PTEN (φωσφατάση και tensin ομόλογο). Tumor καταστολέα πρωτεΐνης ΡΤΕΝ ελέγχει αυτο-ανανέωση των βλαστικών κυττάρων. Πράγματι, τα τρέχοντα δεδομένα μας καταδεικνύουν μία σημαντική ρύθμιση προς τα κάτω του ΡΤΕΝ σε SCID ποντικούς ξενομοσχευμάτων του miR-21 υπερ-εκφράζοντα κύτταρα HCT116 καρκίνο του παχέος εντέρου. Colonospheres που είναι εμπλουτισμένο σε βλαστικά καρκίνο /βλαστικά κύτταρα που μοιάζουν αποκαλύπτουν αυξημένη miR-21 έκφρασης και μειωμένη PTEN. Διφθοριώνεται κουρκουμίνη (CDF), μία νέα ανάλογο της διαιτητικής συστατικό κουρκουμίνη, η οποία έχει αποδειχθεί ότι αναστέλλει την ανάπτυξη του 5-φλουορουρακίλη + οξαλιπλατίνη ανθεκτικά καρκινικά κύτταρα κόλου, μειωτικά miR-21 σε χημειο-ανθεκτικού HCT116 καρκίνο του παχέος εντέρου και ΗΤ-29 κυττάρων και αποκατέστησε τα επίπεδα ΡΤΕΝ με επακόλουθη μείωση της φωσφορυλίωσης Akt. Παρόμοια αποτελέσματα παρατηρήθηκαν επίσης σε μεταστατικό καρκίνο του παχέος εντέρου SW620 κύτταρα. Από ΡΤΕΝ-Ακί προσδίδει αντοχή φαρμάκου σε διαφορετικές κακοήθειες, συμπεριλαμβανομένων καρκίνου του παχέος εντέρου, η παρατήρηση μας για ομαλοποίηση του miR-21-ΡΤΕΝ-Akt μονοπάτι από CDF υποδηλώνει ότι η ένωση θα μπορούσε να είναι ένας πιθανός θεραπευτικός παράγοντας για χημειοθεραπεία ανθεκτικά ορθοκολικό καρκίνο.

Παράθεση: Roy S, Yu Υ, Padhye SB, Sarkar FH, Majumdar AP (2013) διφθοριώνεται-κουρκουμίνη (CDF) Επαναφέρει ΡΤΕΝ έκφρασης για τον καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα από τα κάτω ρύθμιση miR-21. PLoS ONE 8 (7): e68543. doi: 10.1371 /journal.pone.0068543

Επιμέλεια: Ajay Goel, Πανεπιστήμιο Baylor Medical Center, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 28 Μαρτίου 2013? Αποδεκτές: 30 Μάη, 2013? Δημοσιεύθηκε: 24 Ιουλίου 2013

Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης, χωρίς όλα τα πνευματικά δικαιώματα, και δεν μπορεί να αναπαραχθεί ελεύθερα, διανεμηθεί, να μεταδοθεί, τροποποιηθεί, χτισμένο πάνω, ή ειδάλλως να χρησιμοποιηθεί από οποιονδήποτε για οποιονδήποτε νόμιμο λόγο. Το έργο γίνεται διαθέσιμα υπό την Creative Commons CC0 αφοσίωση δημόσιο τομέα

Χρηματοδότηση:. Η εργασία αυτή χρηματοδοτήθηκε από τις επιχορηγήσεις με τον Δρ Majumdar από τα Εθνικά Ινστιτούτα /Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας για τη Γήρανση (AG014343) και το Τμήμα Υποθέσεων βετεράνων (VA Merit αναθεώρηση). Οι χρηματοδότες της έρευνας αυτής δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

η αναδυόμενη πρόκληση στη θεραπεία του καρκίνου του παχέος εντέρου (CRC), την τρίτη πιο κοινή μορφή καρκίνου, είναι η υποτροπή της νόσου. Σχεδόν το 50% των ασθενών που παρουσιάζουν CRC υποτροπή της νόσου. Η παρουσία της χημειοθεραπείας και ραδιοθεραπείας στελέχους του καρκίνου ανθεκτική /βλαστικά κύτταρα που μοιάζουν με (ΚΕΠ /CSLCs) θα μπορούσε να είναι μία από τις βασικές αιτίες [1]. Αυτά τα κύτταρα είναι μικρός πληθυσμός της έναρξης κύτταρα αδιαφοροποίητα όγκου που έχει άπειρη ικανότητα αυτοανανέωσης και ως εκ τούτου, αναφέρονται ως τα καρκινικά κύτταρα για την έναρξη [2]. ΡΤΕΝ (φωσφατάση και tensin ομόλογο), ένα γονίδιο καταστολέα όγκου έχει αναφερθεί ότι παίζει ρόλο στην βλαστικών κυττάρων αυτο-ανανέωση [3]. ΡΤΕΝ λειτουργεί ως ένα λιπίδιο φωσφατάση να αποφωσφορυλιώνει φωσφατιδυλινοσιτόλη 3,4,5-τριςφωσφορικής (ΡΙΡ3), ανταγωνίζεται το μονοπάτι ΡΙ3-Κ /Akt. Προς τα κάτω ρύθμιση της ΡΤΕΝ σε διαφορετικούς ανθρώπινους όγκους έχει αποδειχθεί ότι οδηγεί σε αντίσταση στη συμβατική θεραπεία και υποτροπής του καρκίνου μετά την αρχική θεραπεία [4]. Η ΡΤΕΝ-Ακί μονοπάτι προσδίδει αντοχή φαρμάκου σε διαφορετικές κακοήθειες, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του παχέος [5], [6], [7], [8].

ΡΤΕΝ είναι μία από τις πρωτεΐνες-στόχους του miR-21, η οποία είναι ρυθμισμένη προς τα πάνω σε πολλές κακοήθειες, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του παχέος [9]. microRNAs ρυθμίζουν αρνητικά την έκφραση των γονιδίων στόχων με διάσπαση mRNA ή μέσω της μετάφρασης καταστολή [10]. miR-21 ρυθμίζει όχι μόνο την ανάπτυξη του όγκου, αλλά και την προσβολή και μετάσταση με τη στόχευση του όγκου πολλαπλούς /μεταστατικό γονίδια καταστολής όπως ΡΤΕΝ [11]. Έχουμε αναφέρει ότι το 5-φθοριοουρακίλη και οξαλιπλατίνη (FU-Ox) ανθεκτικά [χημειο-ανθεκτική (CR)] HCT116 καρκίνο του παχέος εντέρου και ΗΤ29 κύτταρα παρουσιάζουν εμπλουτισμό των ΚΕΠ /CSLCs και αυξημένα επίπεδα των ώριμων miR-21 και ότι miR-21 επάγει βλαστική ικανότητα σε καρκινικά κύτταρα κόλου [12]. Αυτές οι παρατηρήσεις μας ώθησε να ψάξετε παράγοντα (ες) που θα ρυθμίζουν κυτταρικά συμβάντα που σχετίζονται με miR-21-επαγωγή βλαστική ικανότητα σε καρκινικά κύτταρα κόλον.

διφθοριώνεται κουρκουμίνη (CDF), ένα μη τοξικό ανάλογο της διαιτητικής συστατικό κουρκουμίνη με πολύ μεγαλύτερη βιοδιαθεσιμότητα από τη μητρική ένωση [13], [14], είναι μία τέτοια ένωση. CDF έχει αποδειχθεί ότι διαμορφώνουν την έκφραση του miR-21 και ΡΤΕΝ σε καρκίνο του παγκρέατος [15], [16], [17], [18] και να αναστέλλουν την ανάπτυξη του καρκίνου του CR κόλον κύτταρα, και προκαλεί αποσύνθεση των colonospheres που είναι εμπλουτισμένο σε ΚΕΠ /CSLCs [19]. Επιπλέον, βρήκαμε CDF να ρυθμίζει την έκφραση του miR-34 [20], το οποίο φέρεται να ρυθμίζεται προς τα κάτω σε καρκίνο του παχέος εντέρου [21]. Για να προσδιορίσετε αν το CDF μεσολάβηση αναστολή της ανάπτυξης της ΚΟ του καρκίνου του παχέος εντέρου θα μπορούσαν εν μέρει να αποδοθεί στην αποκατάσταση της miR-21-PTEN-Akt άξονα, έχουμε εξετάσει (α) η σχέση μεταξύ του miR-21 και PTEN και (β) την επίδραση της CDF για την έκφραση του miR-21, ΡΤΕΝ και ενεργοποίηση του άξονα Akt σε διάφορους καρκίνου του παχέος εντέρου κύτταρα.

Υλικά και Μέθοδοι

Κυτταρικές σειρές και συνθήκες καλλιέργειας

το ανθρώπινο κόλον καρκινικά κύτταρα HCT-116 (ρ53 άγριου τύπου?

K-ras

μεταλλαγμένο), HCT-116 (p53 null?

K-ras

μεταλλαγμένο), ΗΤ-29 (μεταλλαγμένο p53?

K-ras

wt) και SW620 ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD). Chemo-ανθεκτικά (CR) καρκίνο του κόλου κύτταρα δημιουργήθηκαν στο εργαστήριο μας όπως έχει περιγραφεί προηγουμένως [12]. Εν συντομία, HCT116 και ΗΤ29 κύτταρα επωάστηκαν με κλινικώς δόση FU-Ox (25 μΜ 5-FU και 0,625 μΜ οξαλιπλατίνη) για 72 ώρες. Το μέσο απομακρύνθηκε και τα προσκολλημένα κύτταρα, τα οποία επιβίωσαν από την προσβολή FU-Ox, καλλιεργήθηκαν σε ϋΜΕΜ που περιέχει 10% FBS χωρίς τα φάρμακα για 3 έως 4 ημέρες. Το add-αφαίρεση κύκλο FU-Ox επαναλήφθηκε 12 φορές. Τα επιζώντα κύτταρα στη συνέχεια περάστηκαν και εκτέθηκαν σε υψηλότερες δόσεις συνδυασμού FU-Ox (100 μΜ της 5-FU + 2,5 μΜ οξαλιπλατίνη) για 2-3 εβδομάδες. Τέλος, οι χημειο-ανθεκτικά κύτταρα διατηρήθηκαν σε κανονικό μέσο καλλιέργειας που περιέχει 50 μΜ 5-FU + 1,25 μΜ οξαλιπλατίνη. SW620 καρκίνος του παχέος εντέρου κυτταρική γραμμή διατηρήθηκε σε RPMI, συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου βοός (FBS)

Colonospheres παρήχθησαν από γονικές κυτταρικές σειρές HCT116 και ΗΤ29 χρησιμοποιώντας DMEM /F12. (1: 1) μέσα συμπληρωμένα με Β27 (Life Technologies, Gaithersburg, MD), όπως έχει ήδη αναφερθεί [12] [22]. Εν συντομία, τα κύτταρα αφέθηκαν να αναπτυχθούν σε μη διαφοροποίηση κατάσταση (βλαστοκυττάρων μέσα) σε εξαιρετικά πλάκες χαμηλής προσκόλλησης (Corning Inc, Lowell, ΜΑ) για 10-14 ημέρες. Το μέσο βλαστοκυττάρων συμπληρώθηκε με Β27 ,, 20 ng /ml EGF (Sigma, St Louis, ΜΟ), 10 ng /ml αυξητικού παράγοντα των ινοβλαστών (Sigma), και αντιβιοτικό /αντιμυκητιασικό. Μέχρι το τέλος του 5 ημέρες, μόνο το στέλεχος που μοιάζει με κύτταρα ήταν σε θέση να επιβιώσουν σε μη-προσκολλημένα συνθήκες ενώ το μη-βλαστικών κυττάρων που μοιάζουν πέθαναν off. Νωπό μέσο βλαστοκυττάρων χορηγήθηκε στον επιζώντα κύτταρα κάθε 5 ημέρες. Τα σφαιροειδή που σχηματίζονται φωτογραφήθηκαν σε μεγέθυνση 10x. Τα κύτταρα ανακαλλιεργήθηκαν χρησιμοποιώντας 0,05% θρυψίνη-ΕϋΤΑ (Invitrogen) όταν συρροή.

Θεραπεία του καρκίνου κυτταρικών γραμμών κόλον

CDF διαλύθηκε σε DMSO. Ενδεχομένως, CR HCT116, CR ΗΤ29 ή κύτταρα SW620 υποβλήθηκαν σε θεραπεία με 100 ηΜ CDF για 72 ώρες. κύτταρα ελέγχου έλαβαν 0,05% DMSO. Μετά από 72 ώρες, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε DNA, RNA και πρωτεϊνών απομόνωση.

δείγματα ξενομοσχεύματος ιστού

Το ερευνητικό πρωτόκολλο ζώων εγκρίθηκε από Πολιτειακό Πανεπιστήμιο Wayne Θεσμικών φροντίδα των ζώων και την Επιτροπή Χρήση (IACUC) . Ξενομοσχεύματος που προέρχονται από κύτταρα HCT116, επιμολυσμένα σταθερώς είτε με miR-21 ή τον φορέα (pCMV), δημιουργήθηκαν σε ποντίκια SCID, όπως αναφέρθηκε νωρίτερα [12]. Φορμαλίνη σταθερού εμπεδωθεί με παραφίνη (FFPE) σε ιστούς ξενομοσχεύματος χρησιμοποιήθηκαν για να απομονωμένο RNA χρησιμοποιώντας miRNeasy FFPE Kit (Qiagen) όπως περιγράφηκε προηγουμένως [20].

σε πραγματικό χρόνο RT-PCR

Το RNA απομονώνονται από ιστούς FFPE χρησιμοποιώντας miRNeasy FFPE Kit (Qiagen) και από καλλιεργημένα κύτταρα χρησιμοποιώντας κιτ miREasy (Qiagen). Είκοσι νανογραμμαρίων συνολικού RNA μεταγράφηκαν ανάστροφα σε cDNA χρησιμοποιώντας το Universal cDNA Synthesis Kit (Exiqon, Woburn, ΜΑ) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Για την εκτίμηση των σχετικών επιπέδων του ΡΤΕΝ-mRNA, 500 ng RNA μεταγράφηκαν ανάστροφα σε cDNA χρησιμοποιώντας κιτ Gene Amp Gold RNA PCR (Applied Biosystems). Πραγματικού χρόνου PCR χρησιμοποιώντας ειδικούς εκκινητές για miR-21 (Exiqon) και ΡΤΕΝ [23] μαζί με SYBR

® Πράσινη PCR Αντιδραστήρια (Applied Biosystems). Η σχετική ποσότητα του miR-21 και ΡΤΕΝ-mRNA κανονικοποιήθηκαν προς RNU1α (Exiqon) και ανθρώπινο γονίδιο β-ακτίνης, αντίστοιχα.

ανάλυση Western ανάλυση κηλίδος

κηλίδος Western διεξήχθη σύμφωνα με τυποποιημένες μας πρωτόκολλο [22]. Εν συντομία, τα κύτταρα λύθηκαν? η συγκέντρωση της πρωτεΐνης προσδιορίσθηκε με την Bio-Rad Protein Assay kit (Bio-Rad). Τα προϊόντα λύσης υποβλήθηκαν σε ηλεκτροφόρηση με SDS-PAGE και οι πρωτεΐνες μεταφέρθηκαν πάνω διφθοριούχου πολυβινυλιδενίου (PVDF) μεμβράνες (Millipore) και ακολούθησε αποκλεισμός με BSA σε θερμοκρασία δωματίου για 1 ώρα. Αυτά στη συνέχεια επωάστηκαν με πρωτεύοντα αντισώματα όλη τη νύχτα στους 4 ° C, στη συνέχεια πλύθηκαν και επωάστηκαν με συμβατά δευτερεύοντα αντισώματα. Οι πρωτεϊνικές ζώνες έγιναν ορατές με προνομιακή δυτική αντιδραστηρίου κηλίδωσης ανίχνευσης ECL (GE Healthcare Biosciences). Οι μεμβράνες απογυμνώθηκαν όπως απαιτείται για περαιτέρω διερεύνηση.

Λουσιφεράσης Δοκιμασία

κύτταρα HCT116-CR διαμολύνθηκαν είτε με αντι-νόημα miR-21 ή αρνητικό μάρτυρα [NC] (Ambion) σε συνδυασμό με το λουσιφεράση πλασμίδιο ρεπόρτερ που έχει αλληλουχία ΡΤΕΝ 3’ΙΙΤΡ σπόρων για miR-21 [11] και pMIR-ΕΚΘΕΣΗ πλασμίδιο ελέγχου β-gal DNA (Applied Biosystems) χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη

TM 2000 σύμφωνα με το πρωτόκολλο του manufaturer του. Έξι ώρες μετά την επιμόλυνση, το μέσο αλλάχθηκε και τα κύτταρα επιμολυσμένα με NC επωάστηκαν με 100 ηΜ CDF για 24 ώρες. Η δραστικότητα λουσιφεράσης προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας το κιτ λουσιφεράσης Promega ακολουθώντας το πρωτόκολλο manufaturer του. β-γαλακτοσιδάσης προσδιορισμοί πραγματοποιήθηκαν για να ομαλοποιήσει τη μεταβλητότητα διαμόλυνση. Τα δεδομένα παρουσιάστηκαν ως σχετική δραστικότητα λουσιφεράσης ανά πρωτεΐνη μικρογραμμάριο.

Στατιστική ανάλυση

Τα αποτελέσματα εκφράστηκαν ως μέσοι όροι ± SD. Συγκρίσεις των συνεχών μεταβλητών μεταξύ δύο ανεξάρτητες ομάδες υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας δοκιμή t δύο ουρών σπουδαστή. Η τιμή ρ & lt? 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική

Αποτελέσματα

έκφραση ΡΤΕΝ ήταν προς τα κάτω σε miR-21 υπερ- εκφράζουν ξενομόσχευμα

ΡΤΕΝ είναι ένας στόχος. oncomir miR-21. Για να εξεταστεί η σχέση μεταξύ miR-21 και ΡΤΕΝ, SCID ξενομοσχεύματα ποντικών που προέρχονται από miR-21 επί κυττάρων που εκφράζουν HCT116 (MIR-21) και τα κύτταρα ελέγχου φορέα-επιμολυσμένα (pCMV) αναλύθηκαν για την έκφραση του miR-21 και ΡΤΕΝ . Όπως ήταν αναμενόμενο, τα δεδομένα από την ανάλυση qRT-PCR αποκάλυψε ότι τα σχετικά επίπεδα του miR-21 ήταν σημαντικά υψηλότερα σε ξενομοσχεύματα από miR-21 που υπερεκφράζουν HCT-116 κύτταρα, σε σύγκριση με τους ελέγχους (Σχ. 1Α). Σε αντίθεση, τα επίπεδα ΡΤΕΝ mRNA σε ξενομοσχεύματα από miR-21 υπερ-εκφράζοντα κύτταρα ήταν σημαντικά μειωμένη σε σύγκριση με τους ελέγχους (Σχ. 1Β). Λαμβανόμενα μαζί, τα αποτελέσματα δείχνουν μια αντίστροφη σχέση μεταξύ miR-21 και ΡΤΕΝ. Η παρατήρηση αυτή είναι παρόμοιο με αυτό που σημειώσαμε νωρίτερα για τα επίπεδα της πρωτεΐνης ΡΤΕΝ σε-21 miR υπερέκφραση του καρκίνου του παχέος εντέρου HCT-116 κύτταρα (12).

ποσοτική πραγματικού χρόνου RT PCR πραγματοποιήθηκε με RNA που απομονώθηκε από φορμαλίνη ενσωματωμένα σε παραφίνη ξενομοσχεύματα.

η

PTEN-Akt μονοπατιού δραστηριοποιείται στο colonosphere

Colonospheres, θεωρείται ως υποκατάστατο των όγκων, είναι ιδιαίτερα εμπλουτισμένα σε ΚΕΠ /CSLCs [22]. Για να προσδιορίσετε αν το miR-21 και πρωτεΐνη-στόχο PTEN της εμπλέκονται στη ρύθμιση των λειτουργικών ιδιοτήτων των colonospheres, εκφράσεις του miR-21, PTEN και Akt, οι μεταγενέστεροι δράστες της PTEN αναλύθηκαν σε colonospheres παράγεται από HCT116 και ΗΤ29. Αμφότερες οι κυτταρικές γραμμές HCT116 και ΗΤ29 σχηματίζονται καλά στρογγυλεμένες σφαιροειδή (Σχήματα 2Α & amp?. Β? Ανώτερο πλαίσιο). Η έκφραση του miR-21, όπως προσδιορίζεται με qRT-PCR, βρέθηκε να είναι 4-5 φορές υψηλότερη σε colonospheres, που σχηματίζεται από τις δύο κυτταρικές σειρές, σε σύγκριση με αντίστοιχες γονικά κύτταρα τους (Σχήματα 2Α & amp?. 2Β? Μεσαίο πλαίσιο). Από την άλλη πλευρά, η ανάλυση Western κηλίδας αποκάλυψε μειωμένη έκφραση ΡΤΕΝ σε colonospheres, σε σύγκριση με τα αντίστοιχα γονικά κύτταρα (Σχήματα 2Α & amp?. 2Β? Κατώτερο πάνελ). Όπως ήταν αναμενόμενο, η μείωση του ΡΤΕΝ σε colonospheres συσχετίστηκε με αυξημένη ενεργοποίηση του Akt, όπως αποδεικνύεται από σημαντικές αυξήσεις σε σχετικές συγκεντρώσεις ρ-Akt όταν συγκρίνονται με τις αντίστοιχες γονικά κύτταρα (Σχήματα 2Α & amp?.. 2Β κάτω πίνακας). Στο σύνολό τους, τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η αύξηση της miR-21 σε colonospheres που οδηγεί σε μείωση της ΡΤΕΝ μονοπάτι σηματοδότησης ενεργοποιεί Akt, το οποίο μπορεί να παίζει ρόλο στη ρύθμιση των ογκογόνων ιδιοτήτων των colonospheres που είναι εμπλουτισμένα σε ΚΕΠ /CSLCs.

CDF αποκαθιστά την έκφραση ΡΤΕΝ σε καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου

Νωρίτερα, αποδείξαμε ότι CR καρκίνου του παχέος εντέρου κύτταρα δεν είναι μόνο εμπλουτισμένο σε ΚΕΠ /CSLCs αλλά και εκφράζουν σημαντικά υψηλότερα επίπεδα των miR-21 από τη γονική τους ομολόγους τους [12]. Από CDF έχει προγενέστερα δειχθεί ότι αναστέλλει τα κύτταρα CR ανάπτυξης καρκίνου του παχέος εντέρου HCT116 και ΗΤ29, μας ώθησε να προσδιοριστεί αν CDF-επαγόμενη αναστολή της ανάπτυξης των CR καρκίνου του παχέος εντέρου κύτταρα θα μπορούσαν να αποδοθούν σε αποκατάσταση της miR-21-ΡΤΕΝ-Ακί άξονα. Πράγματι, η έκφραση του miR-21 σε CR HCT116 και ΗΤ29 κύτταρα ήταν σημαντικά μειωμένη όταν επωάστηκαν με 100 ηΜ CDF, σε σύγκριση με τους αντίστοιχους ελέγχους DMSO (Σχήματα 3Α & amp?. 3Β? Ανώτερο πλαίσιο). Αυτό συνδέεται με αυξημένη έκφραση του ΡΤΕΝ και μείωσης pAkt (ενεργοποιημένη μορφή) σε CR HCT116 και ΗΤ29 κύτταρα (Σχήματα 3Α & amp?. 3Β? Κάτω πλαίσια)? καμία εμφανής αλλαγή σε μη-φωσφορυλιωμένη (σύνολο) μορφή της Akt σε κύτταρα είτε CR HCT116 ή CR ΗΤ29 παρατηρήθηκε σε απάντηση προς CDF (Σχήματα 3Α και 3Β?. κάτω πλαίσια). Η επίδραση της CDF για miR-21 που προκαλείται από την έκφραση ΡΤΕΝ επιβεβαιώθηκε με δοκιμασία λουσιφεράσης. κύτταρα CR-HCT116 διαμολύνθηκαν με κατασκεύασμα ανταποκριτή λουσιφεράσης που περιέχει ΡΤΕΝ αλληλουχία σπόρος 3’UTR miR-21 και στη συνέχεια επωάστηκαν με 100 ηΜ CDF για 24 ώρες. CDF αυξήθηκε σημαντικά δραστικότητα λουσιφεράσης, πάνω από το μάρτυρα (Σχ. 3C). Για λόγους σύγκρισης, τα κύτταρα CR-HCT116 διαμολύνθηκαν με αντι-νόημα-miR-21, η οποία αποκάλυψε μια αύξηση στην ΡΤΕΝ-λουσιφεράσης δραστικότητα (Σχ. 3C). Συλλογικά, τα δεδομένα αποκαλύπτουν ότι σε CR καρκινικά κύτταρα κόλου, CDF ρυθμίζει προς τα κάτω miR-21 με αποτέλεσμα την προς τα πάνω ρύθμιση του ΡΤΕΝ που οδηγεί σε μειωμένη ενεργοποίηση του Akt. Αυτές οι παρατηρήσεις δείχνουν ότι το CDF επαναφέρει τον άξονα miR-21-PTEN και Akt στην χημειο-ανθεκτική (CR) καρκίνου του παχέος εντέρου κύτταρα.

Οι έλεγχοι επωάστηκαν με DMSO. Western blot-(κατώτερο πάνελ) έδειξε μεταβολές των σχετικών συγκεντρώσεων του ΡΤΕΝ, pAkt και ολική Akt σε HCT116 και ΗΤ29 κύτταρα χημειο-ανθεκτικά σε απόκριση προς CDF ή DMSO. (Γ) CDF θεραπεία ή-miR-21 αντι διαμόλυνση αυξάνει τη δραστηριότητα λουσιφεράσης σε κύτταρα HCT116 χημειο-ανθεκτικού επιμολυσμένα με το κατασκεύασμα pGL3-Luc έχοντας ΡΤΕΝ-miR21 αλληλουχία σπόρων. NC = αρνητικού ελέγχου

Η

Για να εξετασθεί περαιτέρω κατά πόσον CDF θα μπορούσε να επηρεάσει την έκφραση του miR-21- PTEN -. Akt άξονα στο μεταστατικό καρκίνο του παχέος εντέρου, πραγματοποιήσαμε το ίδιο πείραμα με κυτταρική σειρά SW620 που δημιουργήθηκε από μετάσταση των ιστών του καρκίνου του παχέος εντέρου. Όπως έχει παρατηρηθεί για CR-HCT116 και ΗΤ29 κύτταρα, CDF προκάλεσε μια αξιοσημείωτη μείωση στην miR-21 έκφραση σε κύτταρα SW620 (Εικ. 4). Αυτό σχετίζεται με αυξημένα επίπεδα PTEN και μείωση στη φωσφορυλιωμένη μορφή της Akt, σε σύγκριση με τα αντίστοιχα στοιχεία ελέγχου (Εικ. 4).

Δυτική-κηλίδες (δεξιά πλευρά) δείχνει τις αλλαγές σε σχέση με την έκφραση της ΡΤΕΝ, Pakt και συνολικού Akt σε κύτταρα SW620 ακόλουθες 72 ώρες επώασης με CDF ή DMSO (μάρτυρες). Ανθρώπινης β-ακτίνης χρησίμευσε ως έλεγχος φόρτωσης.

Η

Συζήτηση

Παρά την πρόσφατη πρόοδο στον τομέα της ιατρικής, σχεδόν το 50% των ασθενών με υποτροπή CRC εμφάνιση όγκων. Αν και οι λόγοι γι ‘αυτό δεν είναι πλήρως κατανοητοί, μπορεί εν μέρει να συνδέεται με την αδυναμία να στοχεύουν ΚΕΠ /CSLCs που εκφράζουν δείκτες καρκίνου των βλαστικών κυττάρων, διατηρούν την απεριόριστες δυνατότητες για την ανάπλαση και είναι ανθεκτικά σε συμβατικές θεραπείες [24] με αποτέλεσμα την χημειοθεραπεία πυρίμαχων όγκων. Αυτό θα μπορούσε να εξηγήσει γιατί είναι δύσκολο να εξαλειφθεί εντελώς καρκίνου και γιατί η επανάληψη είναι μια πανταχού παρούσα απειλή.

Αν και είναι ευρέως πιστεύεται ότι τα καρκινικά βλαστικά κύτταρα προέρχονται από φυσιολογικά βλαστικά ή προγονικά κύτταρα με τη μετάλλαξη [24], ένα καλύτερη κατανόηση των μοριακών και βιοχημικών αλλαγών που συνδέονται με τον καρκίνο βλαστικών κυττάρων είναι απαραίτητη για την ανάπτυξη στοχευμένων θεραπειών. Έχουμε αναφέρει ότι CR καρκινικά κύτταρα κόλου, που είναι εμπλουτισμένα σε ΚΕΠ /CSLCs, σχηματίζουν εύκολα σφαιροειδή και παρουσιάζουν αυξημένη έκφραση του miR-21, που έχει δειχθεί ότι ρυθμίζεται προς τα πάνω σε πολλές κακοήθειες, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του παχέος εντέρου [12], [25] . Η έκφραση του miR-21 στο βλεννογόνο του κόλου έχει επίσης βρεθεί ότι αυξάνει κατά τη διάρκεια της γήρανσης, όταν η συχνότητα εμφάνισης καρκίνου του παχέος εντέρου αυξάνεται κατακόρυφα [26]. Αν και ο ακριβής ρόλος του miR-21 στην εξέλιξη της καρκινογένεσης του παχέος εντέρου δεν έχει πλήρως κατανοηθεί, αναφέραμε miR-21 για να επάγει βλαστική ικανότητα σε καρκινικά κύτταρα κόλου με προς τα κάτω ρύθμιση ΤΟΡβ-υποδοχέα [26].

Αποτελέσματα των σημερινών μας έρευνα αποδεικνύει ότι τα colonospheres, που είναι εντόνως εμπλουτισμένα σε ΚΕΠ /CSLCs με αυξημένη έκφραση του miR-21 [12], [22], εμφανίζουν μειωμένη έκφραση του καταστολέα όγκων πρωτεΐνης ΡΤΕΝ, ένας στόχος miR-21. τρέχοντα δεδομένα μας δείχνουν επίσης μια αντίστροφη σχέση μεταξύ του miR-21 και PTEN και υποστηρίζει την άποψη ότι το miR-21 ρυθμίζει την έκφραση ΡΤΕΝ. Η απώλεια του ΡΤΕΝ, παρατηρήθηκε σε miR-21 υπερεκφράζουν καρκινικά κύτταρα κόλου θα μπορούσε εν μέρει να είναι υπεύθυνη για την ενεργοποίηση της Akt, όπως αποδεικνύεται από τα αυξημένα επίπεδα pAkt σε colonospheres. Αυξημένη ενεργοποίηση του Akt μονοπατιού σηματοδότησης θα μπορούσε να παίξει έναν κεντρικό ρόλο στην επιτάχυνση της αύξησης του ξενομοσχεύματος του miR-21 υπερεκφράζει κύτταρα καρκίνου κόλου σε SCID ποντίκια, τα οποία αναφέραμε νωρίτερα [12] και θα μπορούσε να προσδώσει αντίσταση στο φάρμακο σε διαφορετικές κακοήθειες συμπεριλαμβανομένης ορθοκολικό καρκίνο [5 ], [6], [7], [8].

miR-21 το δυναμικό «oncomir» μας επίκληση για να ψάξετε παράγοντα (ες) που μπορούν να χρησιμοποιηθούν αποτελεσματικά για να ρυθμίζουν προς τα κάτω miR-21 σε καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα και έτσι μειώνοντας ογκογόνο δυναμικό τους. Το σκεπτικό για την επιδίωξη αυτή τη γραμμή έρευνας προέρχεται από την πρόσφατη παρατήρηση μας ότι προς τα κάτω ρύθμιση του miR-21 σε χημειο-ανθεκτικά κύτταρα καρκίνου κόλου προκαλεί διαφοροποίηση και καθιστώντας τα ευπαθή σε αντικαρκινικούς παράγοντες, ειδικά διφθοριώνεται κουρκουμίνη (CDF), ένα ανάλογο της διαιτητικής συστατικού κουρκουμίνη με μεγαλύτερη βιοδιαθεσιμότητα από τη μητρική ένωση [13], [14], [27]. Πρόσφατες μελέτες από το εργαστήριο αυτό έδειξαν επίσης ότι CDF αναστέλλει την ανάπτυξη του καρκίνου του παχέος εντέρου CR κύτταρα και ρυθμίζει προς τα πάνω επίσης την έκφραση του miR-34, η οποία ρυθμίζεται προς τα κάτω σε όγκους του παχέος εντέρου [20]. Επιπλέον, προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι CDF να ρυθμίζουν την έκφραση του miR-21 και ΡΤΕΝ σε παγκρεατικά καρκίνο [18]. Ως εκ τούτου, CDF θα μπορούσε να θεωρηθεί ως πιθανός θεραπευτικός παράγοντας για τις δύο του παγκρέατος και του παχέος εντέρου. Επιπλέον, η παρατήρηση μας ότι CDF διαμορφώνει miR-21-ΡΤΕΝ-Ακί άξονα σε αμφότερες ρ53-θετικών και p53-αρνητικά κύτταρα καρκίνου κόλου προτείνει ότι θα μπορούσε να είναι CDF θεραπευτικά αποτελεσματική σε ρ53-θετικών και αρνητικών κόλον όγκους. Είναι ενδιαφέρον CDF επίσης βρεθεί ότι είναι αποτελεσματική στην αποκατάσταση των επιπέδων ΡΤΕΝ στο μεταστατικό κυτταρική γραμμή καρκίνου του παχέος εντέρου SW620. Στο σύνολό τους, τα αποτελέσματα δείχνουν ότι CDF θα μπορούσε να είναι ένας αποτελεσματικός θεραπευτικός παράγοντας για τα διάφορα στάδια του καρκίνου του παχέος εντέρου. Addtionally, το γεγονός ότι CDF διαμόρφωση του miR-21-ΡΤΕΝ-Ακί άξονα θα μπορούσε να παρατηρηθεί σε χημειο-ανθεκτικά κύτταρα καρκίνου κόλου που είναι εντόνως εμπλουτισμένα σε ΚΕΠ /CSLCs υποδηλώνει ότι αυτή η νέα ανάλογο της κουρκουμίνης μπορούσε επίσης να είναι θεραπευτικά αποτελεσματική για την υποτροπιάζουσα καρκίνο, τα οποία είναι γνωστό ότι είναι ανθεκτικά στην συμβατική χημειοθεραπεία [14].

Συμπερασματικά τρέχοντα δεδομένα μας καταδεικνύουν ότι miR-21 και ΡΤΕΝ σχετίζονται αντίστροφα από το ότι μια αυξημένη έκφραση του miR-21 οδηγεί σε μείωση της ΡΤΕΝ που οδηγεί στην ενεργοποίηση της Akt σηματοδότησης. Αυτά τα γεγονότα μπορούν να παίξουν καθοριστικό ρόλο στην πρόοδο του όγκου. Επιπλέον, η παρατήρηση μας ότι το miR-21 μεσολάβηση PTEN-Ακί σηματοδότησης θα μπορούσε να ομαλοποιηθεί από CDF στην χημειο-ανθεκτικά κύτταρα καρκίνου του παχέος εντέρου δείχνουν ότι ΚΔΔ θα μπορούσε να είναι ένας πιθανός θεραπευτικός παράγοντας για υποτροπιάζοντα καρκίνο του παχέος εντέρου.

Ευχαριστίες

pGL3-Luc ήταν καλός δώρο από Prof Tushar Patel, το Ohio State University και ο καθηγητής Goutam Ghosh Choudhury, UTHSCSA.