Αφηρημένο

Ιστορικό

Εκτός του ότι είναι υπεύθυνη για την παραγωγή ενέργειας στο κύτταρο, μιτοχόνδρια διαδραματίζουν κεντρικό ρόλο στην απόπτωση, καθώς και η κύρια πηγή των επιβλαβών δραστικών μορφών οξυγόνου. Ως εκ τούτου, μπορεί να υποτεθεί ότι η παραλλαγή αλληλουχίας στο μιτοχονδριακό γονιδίωμα είναι ένας παράγοντας που συμβάλλει στην αιτιολογία των ασθενειών που σχετίζονται με αυτά τα διαφορετικά κυτταρικά γεγονότα, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου. Ο σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν να αξιολογηθεί η συχνότητα των απλοομάδων και πολυμορφισμών στην περιοχή ελέγχου (CR) του μιτοχονδριακού DNA του μονοπύρηνα κύτταρα περιφερικού αίματος από ασθενείς με καρκίνωμα προστάτη (n = 304) έναντι των ασθενών που εξετάζονται για τη νόσο του προστάτη, αλλά βρέθηκε να είναι αρνητικό για τον καρκίνο στη βιοψία (n = 278) σε μια Μέση ευρωπαϊκού πληθυσμού.

Μεθοδολογία /Κύρια Ευρήματα

οι εννέα μεγάλες ευρωπαϊκές haplogroups και οι πολυμορφισμοί CR εντοπίστηκαν μέσω ανάλυσης επέκτασης του εκκινητή και της αλληλουχίας του DNA, αντίστοιχα. Βρήκαμε ότι η μιτοχονδριακή συχνότητες απλοομάδα και πολυμορφισμούς CR δεν διαφέρουν σημαντικά μεταξύ των ασθενών με ή χωρίς καρκίνο του προστάτη, γεγονός που συνεπάγεται καμία επίπτωση του κληρονόμησε μιτοχονδριακού DNA παραλλαγής σε προδιάθεση για καρκίνο του προστάτη σε ένα Μέση ευρωπαϊκού πληθυσμού.

Συμπεράσματα /Σημασία

Τα αποτελέσματά μας έρχονται σε αντίθεση με μια πρόσφατη έκθεση υποστηρίζει τη σύνδεση μεταξύ του mtDNA απλοομάδα U και του καρκίνου του προστάτη σε έναν Βόρειας Αμερικής πληθυσμού του Καυκάσου καταγωγή

Παράθεση:. Mueller EE, Eder W, Mayr JA, Paulweber Β , Sperl W, Horninger W, et al. (2009) Μιτοχονδριακή haplogroups και Ελέγχου Περιφέρεια πολυμορφισμοί Είναι που δεν συνδέονται με τον καρκίνο του προστάτη στην Μέση Ευρωπαϊκή Καυκάσιους. PLoS ONE 4 (7): e6370. doi: 10.1371 /journal.pone.0006370

Συντάκτης: Andrew Vickers, Memorial Sloan-Kettering,, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 24 Απριλίου, 2009? Αποδεκτές: 24 Ιουνίου του 2009? Δημοσιεύθηκε: 28 Ιουλίου, 2009

Copyright: © 2009 Mueller et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις από το «Oesterreichische Krebshilfe – Krebsgesellschaft Tirol» και το Παράκελσος Ιατρικό Πανεπιστήμιο του Σάλτσμπουργκ (07/05/027). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ο καρκίνος του προστάτη είναι μια σημαντική αιτία θανάτου στον ανεπτυγμένο κόσμο. Είναι η συχνότερη μορφή καρκίνου μεταξύ των ανδρών στις Ηνωμένες Πολιτείες και η δεύτερη πιο συχνή στην Ευρωπαϊκή Ένωση [1], [2].

Μια στροφή στην παραγωγή κυτταρικής ενέργειας από την οξειδωτική φωσφορυλίωση σε μιτοχόνδρια σε αναερόβια γλυκόλυση, ονομάζεται το φαινόμενο Warburg, είναι μια θεμελιώδης ιδιότητα των καρκινικών κυττάρων. Λόγω του ουσιώδους ρόλου των ενζύμων που κωδικοποιούνται από το μιτοχονδριακό DNA (mtDNA) στον ενεργειακό μεταβολισμό, έχουν τροποποιήσεις στο μιτοχονδριακό γονιδίωμα έχουν υπόνοιες ότι είναι σε θέση να προκαλέσει μια μεταβολική μετατόπιση σε όγκους [3]. Επιπλέον, μιτοχονδριακής αναπνευστικής δραστηριότητας που σχετίζεται με την παραγωγή δραστικών ειδών οξυγόνου (ROS), που μπορεί να συμβάλλει στην αιτιολογία και εξέλιξη του καρκίνου [4]. Επειδή τα μιτοχόνδρια παίζουν σημαντικό ρόλο τόσο στην παραγωγή όσο και την απόπτωση ROS, το συμπέρασμα που θα μπορούσε να επηρεάσει την εμφάνιση του καρκίνου είναι εύκολα συντάσσεται.

Τα περισσότερα ευκαρυωτικά κύτταρα περιέχουν εκατοντάδες μιτοχόνδρια που φιλοξενούν πολλά αντίγραφα του μιτοχονδριακού DNA [5], [ ,,,0],6]. Η κυκλική και δίκλωνο μιτοχονδριακό γονιδίωμα έχει μήκος περίπου 16 χιλιάδες ζεύγη βάσεων και μπορεί να διαιρεθεί περαιτέρω σε δύο κύριες περιοχές: την περιοχή κωδικοποίησης και της περιοχής ελέγχου. Η περιοχή κωδικοποίησης αποτελείται από 37 γονίδια, 24 κωδικοποιούν συστατικά του μιτοχονδριακού μεταφραστικό μηχανισμό και 13 γονίδια που παρέχουν βασικές υπομονάδες των ενζύμων της οδού οξειδωτική φωσφορυλίωση (OXPHOS) παραγωγής ενέργειας [5], [7]. Η περιοχή ελέγχου (CR), η οποία είναι μη-κωδικοποίησης, περιέχει δύο υπερμεταβλητές περιοχές (HVI και HVII) και μια μετατόπιση (D-loop) περιοχή, και συμμετέχει στην αντιγραφή του mtDNA και μεταγραφή [8].

ο ανθρώπινος πληθυσμός έχει συσσωρεύσει ένα μεγάλο αριθμό υποκαταστάσεις βάσεων mtDNA μαζί ακτινοβολεί μητέρας καταγωγές, από τις οποίες συγκεκριμένοι συνδυασμοί αποτελούν τα λεγόμενα μιτοχονδριακών απλοομάδων [7], [9]. Εννέα διακριτή ευρωπαϊκή απλοομάδες mtDNA (H, U, J, T, K, W, Ι, V, X) ορίστηκαν από Torroni et al. [10], [11]. Παρά το γεγονός ότι οι περισσότερες μιτοχονδριακές πολυμορφισμοί που πιστεύεται ότι είναι ουδέτερη, ο πληθυσμός ειδικά mtDNAs μπορεί να είναι λειτουργικά διαφορετικές και ασκούν ποικίλες επιρροές σχετικά με τα αποτελέσματα των ασθενειών [7], [12] – [14].

μιτοχονδριακού haplogroups και πολυμορφισμοί έχουν έχει βρεθεί ότι συνδέεται με την καρκινογένεση. Για παράδειγμα, ο πολυμορφισμός mtDNA 10398A εμπλέκεται στην ενισχυμένη παραγωγή ROS, και βρέθηκε να είναι ένας παράγοντας κινδύνου για καρκίνο του μαστού και καρκίνο του οισοφάγου σε ινδική ασθενείς, όσο και για διηθητικό καρκίνο του μαστού σε γυναίκες αφρικανικής καταγωγής [4], [15]. Επιπλέον, ασιατικές απλοομάδα D βρέθηκε να σχετίζεται με υψηλότερο κίνδυνο ανάπτυξης καρκίνου του ενδομητρίου στην Κίνα [16]. Σε Καυκάσιους πληθυσμούς, απλοομάδα K συσχετίστηκε με σημαντική αύξηση, και απλοομάδα U σημαντική μείωση, σε κίνδυνο του καρκίνου του μαστού [17].

Booker et al. [18] ανέφεραν μια αυξημένη συχνότητα απλοομάδα U σε ασθενείς με καρκίνωμα του προστάτη σε μια μελέτη της Βόρειας Αμερικής λευκούς. Αυτό Καυκάσου απλοομάδα συσχετίστηκε με 2 φορές τον κίνδυνο ανάπτυξης της νόσου [18].

Εμείς ως στόχο να αναπαράγουν την τελευταία μελέτη σε Μέση ευρωπαϊκού πληθυσμού. Επειδή οι ενώσεις των ασθενειών που σχετίζονται με την ηλικία αποδεικνύεται όχι μόνο με μιτοχονδριακές απλοομάδες, αλλά και με πολυμορφισμούς μονών νουκλεοτιδίων (SNPs) στο CR [19], πρέπει επίσης να διερευνηθεί παραλλαγές αλληλουχίας σε HVI και HVII σε ομάδες μας.

Αποτελέσματα

Είμαστε αξιολόγησε τις εννέα μεγάλες ευρωπαϊκές απλοομάδων καθώς και πολυμορφισμοί CR σε μονοπύρηνα κύτταρα περιφερικού αίματος από 582 Καυκάσιοι άνδρες, 304 εκ των οποίων είχαν διαγνωστεί με καρκίνο του προστάτη? το υπόλοιπο 278 ταυτοποιήθηκαν με αυξημένα επίπεδα PSA στον ορό αλλά ήταν ιστολογικά αρνητικά για τον καρκίνο του προστάτη κατά τη βιοψία και χρησίμευσαν ως ομάδα ελέγχου. Τα κλινικά χαρακτηριστικά των ασθενών με καρκίνο και των ελέγχων παρουσιάζονται στον Πίνακα 1. Όλα τα εννέα ευρωπαϊκές haplogroups παρατηρήθηκαν σε ομάδα μας. Οι συχνότητες των μιτοχονδριακών απλοομάδων δεν διέφερε σημαντικά μεταξύ των ασθενών με καρκίνο του προστάτη και την ομάδα ελέγχου (Πίνακας 2). Όταν συγκρίθηκαν μιτοχονδριακό συχνότητες απλοομάδα μεταξύ των ασθενών με καρκίνο με βιοψία Gleason σκορ ≤6 σε ασθενείς με καρκίνο με βιοψία Gleason σκορ ≥7 επίσης δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές διαφορές (Πίνακας 3).

Η

Η

Το μιτοχονδριακό CR αλληλουχήθηκε και αναλύθηκε μεταξύ των θέσεων νουκλεοτιδίου 16145 και 530. διακόσια δεκαεννέα πολυμορφισμοί βρέθηκαν μεταξύ των 582 ατόμων, με 197 ομοπλασμικά ενιαία ανταλλαγές ζεύγους βάσεων, 10 διαγραφές μονού ζεύγους βάσεων και 5 εισαγωγές μονού ζεύγους βάσεων όταν συγκρίνεται στην αναθεωρημένη Cambridge ακολουθία αναφοράς. Δύο δείγματα παρουσίασαν την ίδια 6 ζευγών βάσεων διαγραφή των νουκλεοτιδίων 106 έως 111. Μια CA-διαγραφής στις θέσεις 514 και 515 εμφανίστηκαν 40 φορές, και CA-παρεμβολές και CACA-ενθέσεις βρέθηκαν επίσης σε αυτό το site 64 φορές. CC-ενθέσεις συνέβη στις θέσεις 302 και 310, και ετεροπλασμία βρέθηκε σε ένα δείγμα (Α 16280 Α /G). Από αυτά τα 219 πολυμορφισμούς, 16 δεν είναι εισηγμένες στο MITOMAP ή Ανθρωπίνων μιτοχονδριακό γονιδίωμα βάση δεδομένων (www.mitomap.org? Www.genpat.uu.se/mtDB/). Όλες οι πολυμορφισμοί και οι συχνότητες τους στις ομάδες ελέγχου και τη μελέτη του καρκίνου που αναφέρονται στον συμπληρωματικό πίνακα S1

Δύο από τα 219 πολυμορφισμούς -. Α 189 G, και T 310 C – βρέθηκαν να έχουν σημαντικά χαμηλότερη συχνότητα στην ασθενείς με καρκίνο σε σύγκριση με τον πληθυσμό ελέγχου (ρ & lt? 0,05) (Πίνακας 4, συμπληρωματικό πίνακα S1). Ωστόσο, η σημασία χάθηκε μετά από διόρθωση για πολλαπλές συγκρίσεις (ανάλυση Bonferroni), που οδηγεί σε ένα νέο απαιτούμενο επίπεδο σημαντικότητας & lt? 0,00023. Στον Πίνακα 4 παρατίθενται οι 35 πολυμορφισμοί με συχνότητα ≥5% είτε στην ομάδα μελέτης έλεγχο του καρκίνου ή του προστάτη.

Η

Συζήτηση

Ο σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν να αναπαράγουν την έρευνα της Booker et al. [18], ο οποίος πραγματοποίησε μια μελέτη ασθενών-μαρτύρων σε 221 λευκούς άνδρες με καρκίνο του προστάτη και 246 λευκά ελέγχους στη Βόρεια Αμερική και βρέθηκε μιτοχονδριακή απλοομάδα U να υπερεκπροσωπούνται στην ομάδα του καρκίνου σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου (OR: 1,95). Στη Μέση Ευρωπαϊκή Καυκάσιους δεν βρήκαμε σημαντικές διαφορές μεταξύ των κατανομών απλοομάδα σε ασθενείς με καρκίνο του προστάτη σε σύγκριση με τους μάρτυρες. Προσαρμογή για πολλαπλές συγκρίσεις εφαρμόζεται στην μελέτη της Booker et al. επίσης οδήγησε σε απώλεια της στατιστικής σημασίας [18]. Η κατανομή haplogroup της μελέτης της Βόρειας Αμερικής μοιάζει πολύ με τη διανομή σε ασθενείς με καρκίνο μας, ενώ η ομάδα ελέγχου στη μελέτη των Booker et al. [18] υποεκπροσωπείται για απλοομάδα U κατά περίπου 45% σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου μας (Πίνακας 5). Όταν συγκρίναμε την αμερικανική ομάδα υπόθεσης στην αυστριακή ομάδα ελέγχου καμία σημαντική συσχέτιση των απλοομάδων με τον καρκίνο του προστάτη εντοπίστηκε

Η

Για να αποκλείσει το ενδεχόμενο ότι έχουν προβλήματα του προστάτη σε γενικές γραμμές -. Υποδεικνύονται από αυξημένα επίπεδα του PSA στον ορό σε ομάδα των ασθενών και του ελέγχου μας – συνδέεται με υψηλότερο απλοομάδα U συχνότητα, εκτιμήσαμε περαιτέρω την απλοομάδα U συχνότητα μεταξύ των συμμετεχόντων στη μελέτη SAPHIR (Σάλτσμπουργκ αθηροσκλήρωση Πρόγραμμα Πρόληψης, όπως προγενέστερα είχαν δημοσιευθεί [14], [20]). Οι συχνότητες των απλοομάδα U στον έλεγχο και τον καρκίνο του προστάτη ομάδες μας δεν είναι σημαντικά διαφορετικές από αυτές αυτών των υγιών ατόμων SAPHIR. Μία υποομάδα αυτού του πληθυσμού, που αποτελείται μόνο από άνδρες (n = 988, μέση ηλικία 49 έτη), έχει επίσης μια συχνότητα haplogroup U παρόμοιο με την ομάδα του καρκίνου του προστάτη (δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Επιπλέον, η συχνότητα των απλοομάδα U μεταξύ 277 τυχαία Δυτικής Ευρώπης Καυκάσιους που μελετήθηκαν από Brandstätter et al. [21] επίσης δεν είναι σημαντικά διαφορετική από την συχνότητα στην ομάδα ελέγχου μας (Πίνακας 5). Τα θέματα της μελέτης ήταν εγγεγραμμένοι στο ίδιο Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο στην Αυστρία όπου recruted ομάδες ασθενών και τον έλεγχό μας.

Σε mtDNA σχετίζονται με επιδημιολογικές μελέτες η σημασία των κατάλληλων ομάδων ελέγχου έχει τονίσει στο παρελθόν [22], [ ,,,0],23]. Υπάρχουν αρκετοί λόγοι που θα μπορούσαν να εξηγήσουν τα αντιφατικά αποτελέσματα. Για παράδειγμα, τοπικές ιδιομορφίες, την ηλικία ή το φύλο διαφορές θα μπορούσαν να επηρεάσουν την έκβαση της στατιστικούς υπολογισμούς. Booker et al. [18] δεν καθορίζουν κατά πόσο πληθυσμό ελέγχου τους αποτελούνταν αποκλειστικά από άνδρες ή περιλαμβάνεται επίσης γυναίκες. ομάδα ελέγχου τους αποτελούνταν από δωρητές οργάνων, ο οποίος στις Ηνωμένες Πολιτείες πρέπει να αναφέρουν ρητά την επιθυμία τους να γίνει δωρητής οργάνων? Έτσι, ανάλογα με τις τάσεις των διαφόρων εθνοτικών ομάδων να δωρίσουν τα όργανα, οι τράπεζες δωρητών οργάνων μπορεί να εμφανίζουν διαφορετικές διανομές απλοομάδα σε σύγκριση με το γενικό πληθυσμό. Η μέση ηλικία των ελέγχων τους ήταν μικρότερη από εκείνη των ασθενών με καρκίνο. Ηλικία θα μπορούσε να έχει αντίκτυπο στην περιφερειακή διαφοροποίηση του πληθυσμού, ειδικά σε μια χώρα όπως οι Ηνωμένες Πολιτείες με μεγάλο πληθυσμό μεταναστών. μοτίβα της μετανάστευσης μπορεί να έχει αλλάξει κατά τη διάρκεια μιας χρονικής περιόδου, οδηγώντας σε διαφορετικές διανομές απλοομάδα σε διαφορετικές ηλικιακές ομάδες του πληθυσμού.

Σε μια άλλη αμερικανική μελέτη που προσπάθησαν να αναπαράγουν τα ευρήματα της Booker et al. [18] σε σχέση με την ένωση ανάμεσα στην απλοομάδα U και του καρκίνου του προστάτη σε λευκή άνδρες, Canter et al. [24] ανέφεραν απλοομάδα U ποσοστά 26,7% για την ομάδα του καρκίνου του προστάτη τους (n = 71) και 11,7% για την ομάδα ελέγχου (n = 128). Ένας περιορισμός της μελέτης τους είναι η χαμηλή αριθμός των ασθενών με καρκίνο του προστάτη. Επιπλέον, συνοπτική έκθεση τους δεν δίνουν χαρακτηριστικά των συμμετεχόντων στη μελέτη ή πώς επιλέχθηκαν.

Δεν μπορεί να αποκλειστεί ότι η γεωγραφική διαφοροποίηση των συχνοτήτων απλοομάδα σε πληθυσμούς μελέτης ελέγχου υπάρχουν ανάμεσα στην Αυστρία και τις ΗΠΑ.

σύμφωνα με τα αποτελέσματά μας, μια κορεατική μελέτη δεν διαπίστωσε καμία συσχέτιση μεταξύ οποιωνδήποτε μιτοχονδριακές απλοομάδες και τον καρκίνο του προστάτη [25]. Το κοινό σύνολο 22 απλοομάδων Ανατολικής Ασίας εξετάστηκε και καμία στατιστικά σημαντική διαφορά στις κατανομές των συχνοτήτων απλοομάδα mtDNA δεν παρατηρήθηκε μεταξύ της περίπτωσης (n = 139) και των ομάδων ελέγχου (n = 122).

Συγκρίνοντας πολυμορφισμών CR των ασθενών με καρκίνο σε ελέγχους βρήκαμε δύο από 219 στατιστικά σημαντικές διαφορές, οι οποίες έχασαν τη σημασία τους μετά από διόρθωση για πολλαπλές συγκρίσεις.

Όπως αναλύσαμε μόνο μιτοχονδριακές απλοομάδες και πολυμορφισμοί περιοχή ελέγχου, δεν μπορούμε να αποκλείσουμε την πιθανότητα ότι οι πολυμορφισμοί στο η μιτοχονδριακή περιοχή κωδικοποίησης, που δεν περιλαμβάνεται στις προκαθορισμένες πολυμορφισμούς haplogroup, θα μπορούσε να συνδεθεί με τον καρκίνο του προστάτη. Ένας άλλος περιορισμός της ανάλυσής μας είναι η χαμηλή ισχύς μελέτη. Πολύ μεγάλα μεγέθη δείγματος θα απαιτούνταν για την αξιόπιστη ανίχνευση μια μέτρια διαφορά στις συχνότητες haplogroup μεταξύ δύο ομάδων [26].

έχουν Σωματικές μεταλλάξεις του mtDNA έχουν αναφερθεί σε μία ποικιλία καρκίνων, συμπεριλαμβανομένου του καρκινώματος του προστάτη [27], [ ,,,0],28]. Σε αυτή τη μελέτη, τα δείγματα DNA μόνο το αίμα γονιδιωματικής ήταν στη διάθεσή μας, και ως εκ τούτου δεν μπορούσε να καθοριστεί συσχετίσεις μεταξύ σωματικών μεταλλάξεων /πολυμορφισμών.

Εν κατακλείδι, δεν βρήκαμε κανένα μιτοχονδριακές απλοομάδες ή πολυμορφισμούς CR να σχετίζεται με καρκίνου του προστάτη σε ένα αυστριακό πληθυσμό.

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθική Δήλωση

Η μελέτη διεξήχθη σύμφωνα με τον αυστριακό νόμο Gene Τεχνολογίας και συμμορφώθηκε με τη Διακήρυξη του Ελσίνκι. Η μελέτη και η χρήση των δειγμάτων αρχειοθέτησης για τη μελέτη εγκρίθηκε από την επιτροπή δεοντολογίας του Innsbruck Medical University (μελέτη του ΟΗΕ 3174). Δείγματα αρχειοθετούνται 1995-2006 χρησιμοποιήθηκαν για τη μελέτη. Γραπτή συγκατάθεση λήφθηκε αρχίζοντας το 2001.

Ασθενείς και υποκείμενα ελέγχου

Ένα σύνολο 582 Καυκάσιους αναλύθηκαν? όλοι είχαν προσληφθεί από το Τμήμα Ουρολογίας του Innsbruck Medical University. Οι ασθενείς και οι έλεγχοι που εγγράφονται στο πρόγραμμα έγκαιρης ανίχνευσης του Τιρόλου για τον καρκίνο του προστάτη, η οποία βασίζεται στην τακτική PSA (ειδικό προστατικό αντιγόνο) δοκιμών [29], [30]. Η ομάδα περίπτωση περιλαμβάνει 304 άνδρες ηλικίας 51 έως 84 χρόνια, διαγνώστηκε με καρκίνο του προστάτη με ιστοπαθολογική αξιολόγηση σύμφωνα με τις συστάσεις του Παγκόσμιου Οργανισμού Υγείας. Ως ομάδα ελέγχου των ασθενειών, 278 άνδρες ηλικίας 46 έως 80 ετών με καλοήθεις αποτελέσματα της βιοψίας του προστάτη στρατολογήθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [29] (Πίνακας 1). Για την ομάδα ελέγχου της νόσου μια μέση παρακολούθηση 4,3 χρόνια μετά τη βιοψία είναι διαθέσιμο κυμαίνονται από μηδέν έως 12 ετών, όπου διαγνώστηκε καμία καρκίνο.

απομόνωσης DNA και mtDNA ανάλυση

DNA απομονώθηκε από κατεψυγμένα μονοπύρηνα κύτταρα περιφερικού αίματος (PBMCs) χρησιμοποιώντας το AllPrep DNA /RNA Mini Kit 50 (Qiagen, Hilden, Germany). Ένα ιεραρχικό σύστημα για mtDNA haplogrouping που συνδυάζει την ενίσχυση πολλαπλής PCR, multiplex επέκτασης του εκκινητή μονής βάσης, και των τριχοειδών που βασίζεται ηλεκτροφορητικού διαχωρισμού για την ανάλυση δέκα απλοομάδα-διαγνωστικά μιτοχονδριακό SNPs (mtSNPs) χρησιμοποιήθηκε για να προσδιοριστεί η κατανομή απλοομάδα από τις πιο κοινές ευρωπαϊκές απλοομάδες, H, U, J, Τ, Κ, Ι, V, W και Χ, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [20]

Ωστόσο, οι ακόλουθες αλλαγές έγιναν σε αυτό το πρωτόκολλο:. για να αφαιρέσετε εναύσματα και χωρίς νομική προσωπικότητα δεοξυνουκλεοτιδίων από το PCR προϊόντα, ένα ExoSAP-IT (USB, Cleveland, ΟΗ, USA) αφομοιώσει σε όγκο 4,5 μΙ που περιείχε 0.5 μλ ExoSAP και 2 μΐ του προϊόντος PCR εκτελέστηκε στους 37 ° C για 60 λεπτά που ακολουθείται από απενεργοποίηση του ενζύμου στους 80 ° C για 15 λεπτά. αντιδράσεις επέκτασης Multiplex εκκινητή διεξήχθησαν σε ένα συνολικό όγκο 5 μΐ που περιέχει 1 μl SNP Έναρξη Master Mix (GenomeLab ™ SNP Έναρξη Primer Extension Kit, Beckman Coulter, Fullerton, CA, USA), 1 μΐ του προϊόντος της PCR, και 1 μΐ του Primer mix. Δύο SNP εκκινητές άλλαξαν σε 8251r: (Α)

15GAGGGGGTGCTATAGGGTAAATACGGG και 16391r: (Α)

6TGATTTCACGGAGGATGGTGGTCAAGGGA. Ως εσωτερικό πρότυπο, σημασμένο με φθορισμό εκκινητών (Biomers, Ulm, Γερμανία) μήκους 15 και 60 βάσεις χρησιμοποιήθηκαν (15 βάσεις πρότυπο DY781: CACATGTCGGAGTCT, 60 βάσεις πρότυπο DY781: TACAGTTCGTGCACACCGGCATCAGCTGTGTGCGAGAGTACTTACTATTGGTTGGCCAGA).

απλοομάδες που δεν θα μπορούσε να είναι ανατεθεί σε ένα από τα εννέα μεγάλων ευρωπαϊκών απλοομάδων από το συνδυασμό SNP ορίστηκαν ως «άλλοι».

CR ακολουθίες αναλύθηκαν μεταξύ των θέσεων νουκλεοτιδίου 16145 και 530, από 1066-bp. Το θραύσμα ενισχύθηκε με εκκινητές 16098f: ACATTACTGCCAGCCACCATG και 638r: GGTGATGTGAGCCCGTCTAAAC. Η PCR πραγματοποιήθηκε σε έναν όγκο 30 μΙ που περιείχε 10 Χ PCR ρυθμιστικό διάλυμα Β (Solis Biodyne, Tartu, Εσθονία), 2.5 mM MgCl

2, 333,3 ρΜ προς τα εμπρός και αντίστροφο εκκινητή, 133,3 μΜ από κάθε τριφωσφορικό δεοξυνουκλεοτίδιο (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) και 0.083 υ φωτιά πολυμεράσης (Solis Biodyne, Tartu, Εσθονία). Θερμικές συνθήκες κύκλων ήταν 95 ° C για 15 λεπτά, 35 κύκλοι στους 95 ° C για 30 δευτερόλεπτα, 58 ° C για 30 δευτερόλεπτα και 72 ° C για 2 λεπτά, και τελικά 37 ° C για 2 λεπτά.

τα προϊόντα PCR καθαρίστηκαν με τον ίδιο τρόπο όπως περιγράφεται για την ανάλυση απλοομάδα (ExoSAP-IT, USB, Cleveland, ΟΗ, USA). Το θραύσμα αλληλουχίας χρησιμοποιώντας εκκινητές 16098f: ACATTACTGCCAGCCACCATG και 17f: CCCTATTAACCACTCACGGG. Αλληλουχίας διεξήχθη χρησιμοποιώντας GenomeLab ™ DTCS – Quick Start Kit (Beckman Coulter, Fullerton, CA, USA) σε έναν όγκο 10 μl που περιέχει 2 μl του Master Mix και 500 pm του κατάλληλου ασταριού. Θερμικές συνθήκες ποδηλασίας για αλληλούχιση πραγματοποιήθηκαν με: 30 κύκλους μετουσίωσης στους 96 ° C για 5 δευτερόλεπτα, ανόπτηση στους 50 ° C για 5 δευτερόλεπτα και επέκταση στους 60 ° C για 4 λεπτά, ακολουθούμενη από 25 ° C για 10 δευτερόλεπτα. Τα δείγματα καταβυθίστηκαν με αιθανόλη και διαχωρίστηκαν με τριχοειδή ηλεκτροφόρηση σε CEQ Beckman Coulter ™ 2000 Σύστημα Ανάλυσης Genetic.

Στατιστική ανάλυση

συχνοτήτων όλων των μιτοχονδριακών απλοομάδων και πολυμορφισμούς CR σε ασθενείς με καρκίνο του προστάτη και των ελέγχων ελέγχθηκαν για ανεξαρτησία χρησιμοποιώντας Pearson chi-square στατιστικά στοιχεία και η ακριβής δοκιμασία του Fisher ανάλογα με την περίπτωση. Επιπλέον, με τον ίδιο τρόπο, οι συχνότητες των μιτοχονδριακών απλοομάδων σε ασθενείς με καρκίνωμα του προστάτη και βιοψία Gleason Σχολίων ≤6 και ασθενών με καρκίνωμα του προστάτη και βιοψία Gleason Σχολίων ≥7 ελέγχθηκαν. Η τιμή p & lt? 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική. Για την ανάλυση των πολυμορφισμών CR ​​σημαντική p-τιμές διορθώθηκαν για πολλαπλές συγκρίσεις με ανάλυση Bonferroni (απαιτούμενο επίπεδο σημαντικότητας = 0,05 /αριθμός συγκρίσεων), οδηγώντας σε ένα νέο απαιτούμενο επίπεδο σημαντικότητας & lt? 0.00023 [αριθμός των συγκρίσεων = 219]. Όλες οι αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση του SPSS 15.0 έκδοση των φοιτητών (SPSS GmbH Λογισμικό, 80339 Μόναχο, Γερμανία).

Υποστήριξη Πληροφορίες

Πίνακα S1. πολυμορφισμών περιοχή

Ελέγχου

doi:. 10.1371 /journal.pone.0006370.s001

(0,21 MB DOC)

Ευχαριστίες

Σας ευχαριστούμε Michaela Oller για βοήθεια στο DNA απομόνωση, Adel Sakic για βοήθεια στην επιλογή του δείγματος και την απομόνωση του DNA, και Birgit Stenzel για την προετοιμασία της κλινικής σύνολο δεδομένων. Μπορούμε επίσης να ευχαριστήσω τον Neil Δ Jones για την κριτική ανάγνωση του χειρογράφου.