Αφηρημένο

Ιστορικό

microRNA-34α (miR-34a) είναι ένας μεταγραφικός στόχος των p53 και ρυθμίζεται προς τα κάτω σε καρκίνο του παγκρέατος. Αυτή η μελέτη είχε ως στόχο να διερευνήσει τη λειτουργική σημασία του miR-34a σε παγκρεατικά εξέλιξης του καρκίνου μέσω επιγενετικών αποκατάστασή του με ρυθμιστές της χρωματίνης, παράγοντας απομεθυλίωση 5-Aza-2′-δεοξυκυτιδίνης (5-Aza-dC) και ο αναστολέας HDAC Vorinostat (SAHA).

Μεθοδολογία /Principal Εκτίμηση

επανέκφραση του miR-34a σε ανθρώπινα παγκρεατικά καρκινικά βλαστικά κύτταρα (ΚΕΠ) και σε ανθρώπινα παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές κατά την αγωγή με 5-Αζα-dC και SAHA ανέστειλε ισχυρά το κύτταρο πολλαπλασιασμός, εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου, αυτο-ανανέωση, επιθηλιακά μεσεγχυματικά να μετάβασης (ΕΜΤ) και εισβολή. Σε παγκρέατος ΚΕΠ, η διαφοροποίηση των miR-34a απόπτωση που επάγεται από την ενεργοποίηση της κασπάσης-07.03. Θεραπεία της παγκρεατικής ΚΕΠ με τους παράγοντες χρωματίνη διαμόρφωσης είχε σαν αποτέλεσμα την αναστολή της Bcl-2, CDK6 και SIRT1, που είναι οι στόχοι του υποτιθέμενου miR-34a. MiR-34α προς τα πάνω ρύθμιση από αυτούς τους παράγοντες που προκαλείται επίσης ακετυλιωμένο p53, p21

WAF1, p27

KIP1 και PUMA σε παγκρεατικά ΚΕΠ. Αναστολή της miR-34a από antagomiR καταργεί τα αποτελέσματα της 5-Aza-DC και SAHA, γεγονός που υποδηλώνει ότι το 5-Aza-DC και SAHA ρυθμίζουν τα χαρακτηριστικά των βλαστικών κυττάρων μέσω του miR-34a. Σε ΚΕΠ, SAHA ανέστειλε μονοπάτι Notch, υποδεικνύοντας την καταστολή της μπορεί να συμβάλλει στην αναστολή της ικανότητας αυτο-ανανέωση και επαγωγή απόπτωσης. Είναι ενδιαφέρον ότι, η θεραπεία των παγκρεατικών ΚΕΠ με SAHA είχε ως αποτέλεσμα την αναστολή της ΕΜΤ με τη μεταγραφική ρύθμιση προς τα πάνω του Ε-καδερίνης και προς τα κάτω ρύθμιση Ν-cadherin. Έκφραση των επαγωγέων EMT (Zeb-1, σαλιγκάρι και γυμνοσάλιαγκας) ανεστάλη σε ΚΕΠ κατά την αγωγή με SAHA. 5-Αζα-DC και SAHA επίσης επιβραδύνουν

in vitro

μετανάστευση και την εισβολή των ΚΕΠ.

Συμπεράσματα

Η παρούσα μελέτη αποδεικνύει έτσι το ρόλο του miR-34a ως κρίσιμη ρυθμιστής του παγκρέατος εξέλιξης του καρκίνου από τις ρυθμίζουν χαρακτηριστικά CSC. Η αποκατάσταση της έκφρασης της από 5-Aza-DC και SAHA στο ΚΕΠ θα παρέχει όχι μόνο μηχανιστική αντίληψη και θεραπευτικών στόχων για καρκίνο του παγκρέατος, αλλά και πολλά υποσχόμενη αντιδραστήρια για την ενίσχυση της απόκρισης του ασθενούς σε υπάρχουσες χημειοθεραπείες ή ως αυτόνομο φάρμακο για τον καρκίνο, εξαλείφοντας τα χαρακτηριστικά CSC.

Παράθεση: Nalls D, Tang SN, Rodova Μ, Srivastava RK, Shankar S (2011) Στόχευση Επιγενετική κανονισμού του miR-34a για την θεραπεία του καρκίνου του παγκρέατος με αναστολή του καρκίνου του παγκρέατος βλαστικών κυττάρων. PLoS ONE 6 (8): e24099. doi: 10.1371 /journal.pone.0024099

Επιμέλεια: Σ Κ Batra, Πανεπιστήμιο της Νεμπράσκα Ιατρικό Κέντρο, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 29 Ιουνίου 2011? Αποδεκτές: 31 Ιουλ 2011? Δημοσιεύθηκε: 31 Αυγούστου, 2011

Copyright: © 2011 Nalls et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε εν μέρει με επιχορηγήσεις από το Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας (R01CA125262, RO1CA114469, 3R01CA114469-05S1, και 3R01CA125262-03S1), Κάνσας Bioscience Αρχή, και η Susan G. Komen Breast Cancer Foundation. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος του παγκρέατος είναι η τέταρτη κύρια αιτία θανάτου από καρκίνο στις Ηνωμένες Πολιτείες και είναι μια καταστροφική διεισδυτικής νόσου και μία από τις πιο επιθετικών καρκίνων [1]. Η κακή πρόγνωση του παγκρεατικό αδενοκαρκίνωμα αποδίδεται στην καθυστερημένη υποβολή της, έλλειψη ακριβών βιοδεικτών για την έγκαιρη διάγνωση για τη δυνατότητα θεραπευτικής εκτομής, καθώς και η τάση της πρόωρης μετάστασης. Ως εκ τούτου, νέες διαγνωστικές μέθοδοι για την έγκαιρη διάγνωση και νέες θεραπευτικές στρατηγικές απαιτούνται επειγόντως.

Τα microRNAs (miRNAs) είναι ενδογενή, μη-κωδικοποίησης μικρά RNAs 19-25 νουκλεοτίδια σε μήκος, που σήμερα αναγνωρίζεται ως ζωτικής σημασίας θέση μεταγραφικής ρυθμιστές της γονιδιακής έκφραση [2], [3], [4]. Η ικανότητα των miRNAs να ρυθμίζουν πολλαπλά γονίδια αυτές να συνάδουν με παίζουν σημαντικούς ρόλους στις βιολογικές διαδικασίες που εξέλιξης επίδραση του όγκου συμπεριλαμβανομένης της μετανάστευσης, εισβολή, επιθηλιακά να μεσεγχυματικά μετάβασης (ΕΜΤ) και μετάσταση [5], [6], [7], [8] , [9], [10]. MiRNAs είναι πολύ ελπιδοφόρα ήδη βιοδείκτες, προγνωστικούς δείκτες και ο μηχανισμός με βάση θεραπευτικοί στόχοι για αντικαρκινικές θεραπείες [11], [12], [13], [14], [15], επειδή οι παρεκκλίνουσα εκφράσεις τους που συνδέονται με τον καρκίνο βλαστικών κυττάρων (CSC) απορρύθμιση και έτσι ογκογένεση [16].

Καρκίνος βλαστικά κύτταρα δημιουργούν το μεγαλύτερο μέρος του όγκου μέσω της συνεχούς αυτο-ανανέωσης και της διαφοροποίησης [17]. Παγκρέατος ΚΕΠ είναι πολύ ογκογόνο και αυτο ανανέωση υπο-πληθυσμού που εκφράζουν τα CD133 δείκτη κυτταρικής επιφάνειας + /CD44 + /CD24 + /ESA + [17], [18], [19]. Οι στρατηγικές που αναπτύσσονται προς τη στοχευμένη καταστροφή αυτών των βλαστικών καρκινικών κυττάρων ενώ διαφυλάσσει τα φυσιολογικά βλαστικά κύτταρα, τα οποία μπορεί να οδηγήσει σε σημαντική βελτίωση στην έκβαση των ασθενών. Μεταβάλλοντας την έκφραση συγκεκριμένων miRNAs που μπορεί να παίζουν σημαντικό ρόλο σε παγκρεατικά ανανέωση CSC και μπορούν έτσι να συμβάλουν στην ανάπτυξη του παγκρεατικού καρκινώματος, θα βοηθήσουν στην επίτευξη μια επιλεκτική και στοχευμένη εξάλειψη των παγκρεατικών ΚΕΠ. Ως εκ τούτου, η κατανόηση των μηχανισμών που ρυθμίζουν την αυτο-ανανέωση έχει μεγάλη σημασία για την ανακάλυψη αντικαρκινικών φαρμάκων που στοχεύουν ΚΕΠ.

ΤΡ53 είναι μία σημαντική ογκοκατασταλτικό γονίδιο του οποίου η βιολογικά αποτελέσματα οφείλονται στην λειτουργία του ως μεταγραφικός ρυθμιστής [20 σε μεγάλο βαθμό ]. ΤΡ53 μεταλλάξεις είναι σχετικά συχνές και συμβαίνουν σε μέχρι 70% των περιπτώσεων με παγκρεατικό αδενοκαρκίνωμα και πιο συχνά εμφανίζονται σε πτωχά διαφοροποιημένο όγκους [21], [22], [23], [24], [25]. Το ογκοκατασταλτικό ΤΡ53 έχει ταυτοποιηθεί ως ένας μεταγραφικός ρυθμιστής του miR-34a και αρκετές πρόσφατες μελέτες έχουν εμπλέξει την miR-34 οικογένεια των miRNAs στο δίκτυο καταστολέα όγκων ρ53 [20], [26]. miR-34a εκφράζεται έντονα σε φυσιολογικούς ιστούς, όπως όρχεις, πνεύμονα, επινεφρίδια και τη σπλήνα, αν και φυσιολογική λειτουργία του είναι άγνωστη. miR-34a εντοπίζεται στο ανθρώπινο χρωμόσωμα 1ρ36, η οποία είναι μια περιοχή που σχετίζεται με μία ποικιλία καρκίνων, και έχει δειχθεί ότι είναι προς τα κάτω ρυθμισμένη σε παγκρεατικού καρκίνου [20]. Μειωμένη έκφραση του miR-34a σε καρκίνο του παγκρέατος θα μπορούσε να είναι μια συνισταμένη είτε μεταγραφικής ρύθμισης οφείλεται σε μεταλλάξεις p53, όπως αυτές είναι πολύ συχνές [22] ή μέσω επιγενετική αποσιώπηση. Ως εκ τούτου, η κατανόηση των εισφορών των μηχανισμών αυτών στη ρύθμιση προς τα κάτω του miR-34a στον καρκίνο του παγκρέατος, η οποία μπορεί να συμβάλει στην κακοήθεια του παγκρέατος, θα μπορούσε να είναι ενδιαφέρον.

MiR-34a δρα ως καταστολέας της νευροβλάστωμα ογκογένεση με στόχευση του mRNA που κωδικοποιεί E2F3 και τη μείωση των επιπέδων της πρωτεΐνης E2F3 [27]. Επίσης, έχει αποδειχθεί ότι είναι υπερ-μεθυλιώνεται μαστού, των ωοθηκών, του παχέος εντέρου, του πνεύμονα και αιματολογικές κακοήθειες και ρυθμίζουν προς τα κάτω μετάφραση CDK6 καταδεικνύοντας έτσι το ογκοκατασταλτικό ρόλος του miR-34a [28], [29], [30]. Οι γονιδίων που αποκρίνονται miR-34a είναι εντόνως εμπλουτισμένα για εκείνους που ρυθμίζουν την πρόοδο του κυτταρικού κύκλου, τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, την απόπτωση, την επιδιόρθωση του DNA, και η αγγειογένεση παρέχοντας έτσι μία λειτουργική βάση για την επιγενετική αδρανοποίηση αυτού του miRNA σε παγκρεατικού καρκίνου [31].

είναι καλά τεκμηριωμένο ότι πολλοί ογκοκατασταλτικών γονιδίων σε ανθρώπινους καρκίνους σιγήσει με μεθυλίωση προαγωγού συνοδεύεται από μεταβολές της χρωματίνης λόγω της πρόσληψης deactylases ιστόνης με πρωτεΐνες δέσμευσης σε μετουσιωμένο CpG-υπολείμματα. Αυτές επιγενετικών δεικτών που συνδέονται με την αποσιώπηση των ογκοκατασταλτικών γονιδίων μπορεί να συνεισφέρουν στην πρόοδο του όγκου και μπορεί να είναι θεραπευτικά αναστρέψιμη, που χρησιμεύει ως στόχοι για παγκρεατικό θεραπεία του καρκίνου. Με βάση αυτό το σκεπτικό, έχουμε ποσοτικά την έκφραση του miR-34a σε ανθρώπινα παγκρεατικά ΚΕΠ και παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές σειρές ανεξάρτητα από την κατάσταση μετάλλαξης p53, σε σύγκριση με φυσιολογικά επιθηλιακά κύτταρα παγκρεατικού πόρου χρησιμοποιώντας δοκιμασίες TaqMan miRNA.

σήματα Notch είναι είναι γνωστό ότι επηρεάζουν βλαστικών κυττάρων selfrenewal και διαφοροποίησης, και έχουν προταθεί ότι παίζουν ένα ρόλο κατά τη διάρκεια του παγκρέατος καρκινογένεση [32], [33]. Τα Αρκετά μέλη της οδού σηματοδότησης Notch εκφράζεται στο πάγκρεας [32]. Οι υποδοχείς Notch ενεργοποιούνται από Delta και Serrate /Jagged συνδετήρες [34], οι οποίες προωθούν πρωτεολυτική διάσπαση και την απελευθέρωση του Notch ενδοκυττάρια περιοχή (ICD). Το ενεργοποιημένο Notch-ICD μετατοπίζεται στον πυρήνα και αλληλεπιδρά με τον παράγοντα μεταγραφής CSL /ΠΕΠ-Ικ και ο συν-ενεργοποιητής Mastermind (ΜΑΜ) να ενεργοποιήσει τα γονίδια-στόχους, όπως Hes1 και Hes5 [35], [36], και την έκφραση Hes μπορεί ως εκ τούτου, να χρησιμοποιηθούν ως ένας διαβαστούν για δραστικότητα Notch [37].

παρούσες μελέτες μας έχουν δείξει ότι τα επίπεδα έκφρασης του miR-34a ήταν σημαντικά μειωμένες σε παγκρεατικά ΚΕΠ και τα κύτταρα του παγκρέατος καρκινικών όγκων ανεξάρτητα από την κατάσταση ρ53 μεταλλάξεων τους, σε σύγκριση με την κανονική παγκρεατικού πόρου επιθηλιακά κύτταρα. Αυτό μας οδηγεί να υποθέσουμε ότι miR-34a, έτσι μπορεί να σιγήσει επιγενετικώς στον καρκίνο του παγκρέατος. Μείωση του γονιδίου miR-34a μεθυλίωση και αλλοιωμένη μοτίβο ακετυλίωση με τη χρήση των παραγόντων της χρωματίνης τροποποίησης οδήγησε σε ταυτόχρονη επανενεργοποίηση της έκφρασης miR-34a. Η έκφραση του miR-34a σε παγκρεατικά ΚΕΠ και κυτταρικές σειρές ήταν σημαντικά επάγεται κατά την επεξεργασία με τροποποιητές χρωματίνη, παράγοντα απομεθυλίωσης 5-αζα-2′-δεοξυκυτιδίνη (5-Αζα-dC) ή τον αναστολέα αποακετυλάσης ιστόνης, SAHA (vorionostat). 5-Αζα-DC και SAHA ανέστειλε επίσης την ανάπτυξη και την απόπτωση που επάγεται σε παγκρεατικά ΚΕΠ. Περαιτέρω, για να κατανοήσουν το λειτουργικό ρόλο του miR-34a στη ρύθμιση του παγκρεατικού εξέλιξης του καρκίνου εξετάστηκε η επίδραση του 5-Αζα-DC και SAHA επί της πρωτεΐνης έκφρασης του υποτιθέμενου στόχων του miR-34a σε παγκρεατικά ΚΕΠ. 5-Αζα-άΟ ανέστειλε την έκφραση της κυκλίνης D1 και CDK4 και αντίθετα προκάλεσε την έκφραση του p27

/KIP1, και οι επιδράσεις αυτές καταργήθηκαν με την παρουσία του ανταγωνιστή miR34a. Παρομοίως, SAHA κάτω ρυθμισμένη η έκφραση του SIRT1, D1 κυκλίνης, survivin, Bcl-2, VEGF και CDK6, και επάνω ρυθμισμένη την έκφραση της ρ21 και PUMA με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. Περαιτέρω, η θεραπεία του παγκρεατικού ΚΕΠ με τις τροποποιητές χρωματίνη είχε ως αποτέλεσμα την αναστολή της αυτο-ανανέωσης, ΕΜΤ, τη μετανάστευση και την εισβολή των παγκρεατικών ΚΕΠ

in vitro

. Η διαμόρφωση της έκφρασης του miR-34a με SAHA ανέστειλε την έκφραση mRNA των διαφόρων συνιστωσών της οδού Notch, υποδεικνύοντας έτσι ότι miR-34a μπορεί να εμπλέκεται σε παγκρεατικά CSC αυτο-ανανέωση. Zeb-1, σαλιγκάρι και γυμνοσάλιαγκα μεταγραφική έκφραση ήταν σημαντικά μειωμένη σε ανθρώπινο παγκρεατικό ΚΕΠ και παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές μετά από επεξεργασία με SAHA. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι miR-34a θα μπορούσε να διαδραματίσει ένα σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση της παγκρεατικής ογκογένεσης. Αυτό είναι μέχρι στιγμής, η πρώτη επίδειξη της αναστολής του παγκρέατος χαρακτηριστικά CSC από επιγενετική ρύθμιση της miR-34a από θεραπευτική παρέμβαση με τη χρήση 5-Aza-DC και SAHA. Ως εκ τούτου, η αποκατάσταση της έκφρασης miR-34a από 5-Aza-DC και SAHA σε παγκρεατικά ΚΕΠ θα παρέχει όχι μόνο μοναδικά εργαλεία για τη διερεύνηση της λειτουργίας miRNA, αλλά και πολλά υποσχόμενη αντιδραστήριο για την ενίσχυση της απόκρισης του ασθενούς σε υπάρχουσες χημειοθεραπείες ή ως αυτόνομο φάρμακο για τον καρκίνο.

Αποτελέσματα

έκφραση και αποκατάσταση του miR-34a σε παγκρεατικά ΚΕΠ και κυτταρικές σειρές

Εμείς μετριέται πρώτα την έκφραση του miR-34a σε ανθρώπινο παγκρεατικό ΚΕΠ προέρχονται από πρωτογενή όγκων και του καρκίνου του παγκρέατος κυτταρικές σειρές [ASPC-1 (p53wt) και MiaPaCa-2 (p53mutant)] και συγκρίθηκαν με φυσιολογικά επιθηλιακά κύτταρα παγκρεατικού πόρου χρησιμοποιώντας ποσοτική αλυσίδα μεταγραφάσης αντίδραση πολυμεράσης αντίστροφης (RT-PCR Taqman-) και Taqman πραγματικού χρόνου δοκιμασίες. Η συγκριτική μέθοδος Ct (ΔΔCt) χρησιμοποιήθηκε για να προσδιοριστεί η μεταβολή φορές έκφραση του miR-34a σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα σε σύγκριση με φυσιολογικά επιθηλιακά κύτταρα του παγκρέατος. Σύνολο εισροών RNA ομαλοποιήθηκε με βάση τις τιμές Ct λαμβάνονται για RNU48 χρησιμοποιηθούν ως ενδογενή έλεγχο. Σε συμφωνία με προηγούμενες μελέτες σε καρκίνο του παγκρέατος [20], παρατηρήσαμε μια συνολική μείωση στην έκφραση του miR-34a σε παγκρεατικά ΚΕΠ και κυτταρικές σειρές ανεξάρτητη της ρ53 τους κατάσταση μεταλλακτική σε σχέση με μη νεοπλασματικά παγκρεατικά επιθηλιακά κύτταρα (Εικ. 1Α).

(Α) σχετική έκφραση του miR-34a ποσοτικοποιήθηκε σε ανθρώπινη παγκρεατική καρκινικές κυτταρικές σειρές ASPC-1 (p53wt), MIAPaCa-2 (p53mutant), ανθρώπινου παγκρεατικού καρκίνου του βλαστικά κύτταρα (PanCSC) και ανθρώπινη παγκρεατική φυσιολογική πόρου επιθηλιακά κύτταρα (HPNE). (Β) Αποκατάσταση των miR34a από SAHA και Aza-5dC. Ο καρκίνος του παγκρέατος κυτταρικές γραμμές ASPC-1 (p53wt), MIAPaCa-2 (p53mutant) και τα παγκρεατικά καρκινικά βλαστικά κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με SAHA (3 μΜ) ή Αζα-5dC (4 μΜ) για 24 ώρες. Η έκφραση του miR-34a ποσοτικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ποσοτική αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης μεταγραφάσης ανάστροφης (RT-PCR Taqman-) και Taqman Real Time Δοκιμασίες, και ομαλοποιήθηκε ως προς RNU48 έκφρασης. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν μέση τιμή ± SD. * = Σημαντικά διαφορετικό από τον έλεγχο, η P & lt? 0,05. (C), Anti-miR34a αναστέλλει την ικανότητα των SAHA και Aza-5dC για την αποκατάσταση της miR34a. Παγκρέατος ΚΕΠ επιμολύνθηκαν παροδικά είτε με αρνητικό έλεγχο (κωδικοποιημένο) ή αντι-miR34a ολιγονουκλεοτίδιο, και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με SAHA (3 μΜ) ή Αζα-5dC (4 μΜ) για 24 ώρες. RNA εκχυλίστηκε για να μετρηθεί η έκφραση του miR34a Q-RT-PCR, όπως περιγράφεται παραπάνω. NC = αρνητικός μάρτυρας. (D), δραστηριότητα δημοσιογράφος miR34a-λουσιφεράσης. Παγκρέατος ΚΕΠ επιμολύνθηκαν είτε με αρνητικό έλεγχο (κωδικοποιημένο) ή αντι-miR34a ολιγονουκλεοτίδια μαζί με κατασκεύασμα miR34a-Luc, και αγωγή είτε με SAHA (1 μΜ) ή Αζα-5dC (2 μΜ) για 24 ώρες. Η δραστικότητα λουσιφεράσης μετρήθηκε σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Promega). Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν μέση τιμή ± SD. * = Σημαντικά διαφορετικό από τον έλεγχο, η P & lt?. 0.05

Η

Mir-34α συνδέεται στενά με ένα μεγάλο νησί CpG γεγονός που υποδηλώνει ότι μπορεί να σιγήσει επιγενετικώς στον καρκίνο του παγκρέατος. Για να αποδειχθεί αυτή η υπόθεση, εξετάσαμε εάν η μειωμένη έκφραση του miR-34a σε καρκίνο του παγκρέατος θα μπορούσε να αποκατασταθεί κατά την κατεργασία με έναν αναστολέα μεθυλίωσης του DNA, 5-Αζα-dc και /ή έναν αναστολέα αποακετυλάσης ιστόνης, SAHA. Είναι ενδιαφέρον ότι, η έκφραση του miR-34a σε παγκρεατικά ΚΕΠ και παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές [ASPC-1 και MiaPaCa-2] αυξήθηκε σημαντικά μετά από θεραπεία με αυτά τα χρωματίνη-τροποποιητές σε σύγκριση με τους μάρτυρες που έλαβαν ψευδο, όπως μετράται με qRT-PCR (Σχ. 1 Β) χρησιμοποιώντας Taqman Real Time Αναλύσεις με τη μέθοδο συγκριτικής Ct (ΔΔCt). Σύνολο εισροών RNA ομαλοποιήθηκε με βάση τις τιμές Ct λαμβάνονται για RNU48. Αυτά τα αποτελέσματα καταδεικνύουν ότι η 5-Αζα-DC και SAHA διεγείρει την αποκατάσταση του miR-34a σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα. Τα στοιχεία δείχνουν επίσης ότι η επιγενετική τροποποίηση των ρυθμιστικών αλληλουχιών σε νησίδες CpG και αποακετυλίωση των ιστονών μπορεί να συμβάλει στην miR-34a αποσιώπηση στον καρκίνο του παγκρέατος. Περαιτέρω αναστολή της miR-34a από antgomiR καταργεί τα αποτελέσματα της 5-Aza-DC και SAHA στην αποκατάσταση της έκφρασης του miR-34a σε παγκρεατικά ΚΕΠ που υποδηλώνει ότι το 5-Aza-DC και SAHA ρυθμίζει το χαρακτηριστικό των βλαστικών κυττάρων μέσω του miR-34a ( Εικ. 1Γ).

στη συνέχεια εξετάσαμε την μεταγραφική ρύθμιση του miR-34a σε ΚΕΠ με τη δοκιμασία ρεπόρτερ miR-34a-λουσιφεράσης (Σχ. 1D). SAHA και 5-Αζα-επαγόμενο από DC δραστικότητα miR-34a-λουσιφεράση, υποδηλώνοντας έναν λειτουργικό ρόλο του miR34a σε παγκρεατικά ΚΕΠ.

Προς τα πάνω ρύθμιση miR-34a αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, και επάγει την απόπτωση και κύκλου κυττάρου σε ανθρώπινα παγκρεατικά ΚΕΠ

Ερευνήσαμε την επίδραση της 5-Aza-dC και SAHA στον πολλαπλασιασμό των παγκρεατικών ΚΕΠ με βαφή κυανούν τρυπανίου. 5-Αζα-DC και SAHA ανέστειλε σημαντικά τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο σε παγκρεατικά ΚΕΠ (Εικ. 2Α). Περαιτέρω, εξετάσαμε τις επιδράσεις αυτών των ρυθμιστών χρωματίνης στην επαγωγή της απόπτωσης και της κασπάσης-3/7 δραστηριότητα στα παγκρεατικά ΚΕΠ με αννεξίνη-V και χρώση ΡΙ, και κιτ προσδιορισμού κασπάσης 3-/7 δραστηριότητα, αντίστοιχα. 5-Αζα-DC και SAHA επαγόμενη απόπτωση σε ΚΕΠ με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο ο οποίος συνδέεται με αυξημένη κασπάσης-3/7 Δράση (Σχ. 2Β και C).

(Α), του παγκρέατος ΚΕΠ υποβλήθηκαν σε αγωγή με SAHA (3 και 5 μΜ) και 5-Αζα-dC (2 και 4 μΜ) και η βιωσιμότητα των κυττάρων μετρήθηκε στις 48 ώρες με χρώση με trypan blue χρησιμοποιώντας αναλυτή Vi-CELL (Beckman Counter). (Β), του παγκρέατος ΚΕΠ ήταν χωρίς θεραπεία (α) ή σε επεξεργασία με SAHA (β) ή 5Aza-dC (γ) για 48 ώρες, και η απόπτωση μετρήθηκε με χρώση με αννεξίνη-ΡΙ χρησιμοποιώντας Accuri κυτταρομετρητή ροής. (C), Κασπάση-3/7 Δράση μετρήθηκε σε παγκρεατικά ΚΕΠ αγωγή με SAHA (0,5 και 2 μΜ) ή 5-Αζα-dC (1 και 3 μΜ) για 24 ώρες. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν μέση τιμή ± SD. * Και $ = σημαντικά διαφορετικό από τον έλεγχο, η P & lt?. 0.05

Η

Για να κατανοήσουμε καλύτερα την βιολογική σημασία της αποκατάστασης του miR-34a, κύτταρα ASPC-1 υποβλήθηκαν σε θεραπεία με ή χωρίς SAHA και τις επιπτώσεις της στην η κατανομή του κυτταρικού κύκλου εξετάστηκε με χρώση ΡΙ χρησιμοποιώντας κυτταρομετρία ροής (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). SAHA επαγόμενη διακοπή της ανάπτυξης στο G2 /M φάση του κυτταρικού κύκλου στις 24 ώρες στα κύτταρα AsPC-1. Επιπλέον, SAHA επάγεται G2 /M σύλληψη καταργήθηκε με την παρουσία του miR-34a ανταγωνιστής σχέση με τον αρνητικό ολιγονουκλεοτίδια ελέγχου υποδεικνύοντας έτσι τη συμμετοχή του miR-34a στην διακοπή του κυτταρικού κύκλου με SAHA (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Επίδραση της 5-Aza-dC και SAHA επί των υποθετικών στόχων του miR-34a σε παγκρεατικά ΚΕΠ

από το miR-34a εμπλέκεται στην αυτο ανανέωση ικανότητα και τη μετάσταση των παγκρεατικών ΚΕΠ, η έκφραση των υποθετικών στόχων του miR-34a σε παγκρεατικά ΚΕΠ σε θεραπεία με 5-Αζα-dC και SAHA εξετάστηκε με ανάλυση στυπώματος Western (Σχ. 3Α και Β). Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η 5-Αζα-DC και SAHA διαφοροποιούν τα επίπεδα έκφρασης πρωτεΐνης γνωστής άμεσης γονιδίων στόχων του miR-34a. Είναι ενδιαφέρον, SAHA ανέστειλε την έκφραση της κυκλίνης D1 και CDK6 και μέχρι ρυθμίζεται η έκφραση του p21 /Cip1 σε παγκρεατικά ΚΕΠ (Εικ. 3Α). SAHA ανέστειλε επίσης την έκφραση του SIRT1, survivin, Bcl-2, VEGF, και επαγόμενη την έκφραση ακετυλιωμένου p53 και PUMA με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. Παρομοίως, 5-Αζα-άΟ ανέστειλε την έκφραση του Notch3, CDK6, survivin και Bcl-2, και που προκαλείται από την έκφραση του p21 /Cip1 και PUMA με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. Από SAHA ανέστειλε την έκφραση του SIRT1 μέσω πάνω ρύθμιση του miR34a, εξετάσαμε την επόμενη τις επιδράσεις της SAHA επί της δραστικότητας ανταποκριτή SIRT1 3’UTR-λουσιφεράσης. SAHA ανέστειλε την δραστικότητα SIRT1 3’UTR-λουσιφεράσης με έναν δοσο-εξαρτώμενο τρόπο (Εικ. 3C). Συγκριτικά, SAHA είχε καμία επίδραση στην δραστικότητα SIRT1 μεταλλαγμένο 3’UTR-λουσιφεράσης (που δεν περιέχει λειτουργικές θέση δέσμευσης miR34a). Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι MiR-34a αναστέλλει την έκφραση SIRT1 μέσω μιας περιοχής miR-34a-δέσμευσης εντός της 3 ‘UTR του SIRT1.

(Α), του παγκρέατος ΚΕΠ υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ή χωρίς SAHA για 48 ώρες. Η έκφραση των ακετυλιωμένων-p53, p21, PUMA, SIRT1, CDK6, CyclinD1, survivin και Bcl-2 μετρήθηκε με ανάλυση κηλίδος Western. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. (Β), του παγκρέατος ΚΕΠ υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ή χωρίς 5Aza-DC για 48 ώρες. Η έκφραση του p21, PUMA, Notch 3, CDK6, survivin και Bcl-2 μετρήθηκε με ανάλυση κηλίδος Western. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. (C), δραστικότητα SIRT1 3’UTR-λουσιφεράσης. Παγκρέατος ΚΕΠ υπέστησαν μεταγωγή είτε με SIRT1 3’UTR-Luc κατασκευάσει ή SIRT1 μεταλλαγμένο 3’UTR-Luc κατασκεύασμα, και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με SAHA (0-3 μΜ) για 24 ώρες. Η δραστικότητα λουσιφεράσης μετρήθηκε σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Promega). Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν μέση τιμή ± SD. *, # Ή% = σημαντικά διαφορετική από έλεγχο, P & lt?. 0.05

Η

Επιπλέον, χειραγωγώντας την έκφραση του miR-34a χρησιμοποιώντας miR-34a antagomiR αλλάξει την πρωτεΐνη έκφραση των γονιδίων στόχων του (Εικ. 4Α και Β). 5-Αζα-DC και SAHA αναστέλλει την έκφραση των ρυθμιστικών πρωτεϊνών του κυτταρικού κύκλου (κυκλίνη D1 και CDK2) και VEGF, και μέχρι ρυθμίζει την έκφραση του p27 /KIP1 σε παγκρεατικά ΚΕΠ. Επιμόλυνση με antagomiR για miR-34a ήταν μόνη της αρκετή για να καταργήσει αυτό το αποτέλεσμα. Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν έναν σημαντικό και πρωτότυπο μηχανισμό με τον οποίο 5-Αζα-DC και SAHA μεσολαβούν επιδράσεις τους επί της κυτταρικής ανάπτυξης και απόπτωσης σε παγκρεατικά ΚΕΠ.

(Α), του παγκρέατος ΚΕΠ επιμολύνθηκαν παροδικά είτε με αρνητικό έλεγχο (ομελέτα ) ή αντι-miR34a ολιγονουκλεοτιδίου και επεξεργάστηκε με Αζα-5dC (4 μΜ) επί 48 ώρες. Η ανάλυση στυπώματος Western εκτελέστηκε για να μετρηθεί η έκφραση της κυκλίνης D1, CDK2, ρ27 και VEGF. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. (Β), του παγκρέατος ΚΕΠ επιμολύνθηκαν παροδικά είτε με αρνητικό έλεγχο (κωδικοποιημένο) ή αντι-miR34a ολιγονουκλεοτιδίου και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με SAHA (3 μΜ) για 48 ώρες. Η ανάλυση στυπώματος Western εκτελέστηκε για να μετρηθεί η έκφραση της κυκλίνης D1, CDK2, ρ27 και VEGF. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. (C), ο κανονισμός του VEGF Β-3’UTR-λουσιφεράσης δραστηριότητα Aza-5dC. Παγκρέατος ΚΕΠ επιμολύνθηκαν είτε με αρνητικό έλεγχο (κωδικοποιημένο) ή αντι-miR34a ολιγονουκλεοτίδια μαζί με κατασκεύασμα VEGF-B 3’UTR-LUC, και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με Αζα-5dC (0-3 μΜ) για 24 ώρες. Η δραστικότητα λουσιφεράσης μετρήθηκε σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Promega). Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν μέση τιμή ± SD. *, @ Ή # = σημαντικά διαφορετικό από τον έλεγχο, η P & lt? 0,05. (D), ρύθμιση της δραστικότητας του VEGF-B 3’UTR-λουσιφεράσης. Παγκρέατος ΚΕΠ επιμολύνθηκαν είτε με αρνητικό έλεγχο (κωδικοποιημένο) ή αντι-miR34a ολιγονουκλεοτίδια μαζί με κατασκεύασμα VEGF-B 3’UTR-LUC, και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με SAHA (0-3 μΜ) για 24 ώρες. Η δραστικότητα λουσιφεράσης μετρήθηκε σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Promega). Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν μέση τιμή ± SD. *, @, # = Σημαντικά διαφορετικό από τον έλεγχο, Ρ & lt?. 0.05

Η

Από 5-Αζα-άΟ ανέστειλε την έκφραση του VEGF μέσω πάνω ρύθμιση του miR34a, εξετάσαμε την επόμενη τις επιδράσεις της 5- Αζα-dC στην VEGF-B δραστηριότητα ανταποκριτή 3’UTR-λουσιφεράσης (Σχ. 4C). 5-Αζα-άΟ ανέστειλε VEGF-B δραστηριότητα ανταποκριτή 3’UTR-λουσιφεράσης με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. Συγκριτικά, αντι-miR34a μπλοκάρει τα ανασταλτικά αποτελέσματα της 5-Αζα-DC στο δραστικότητα λουσιφεράσης. Από SAHA ανέστειλε την έκφραση του VEGF μέσω πάνω ρύθμιση του miR34a, εξετάσαμε επίσης τα αποτελέσματα της SAHA επί της δραστικότητας ανταποκριτή VEGF-B 3’UTR-λουσιφεράσης. Όπως καταδεικνύεται στο Σχ. 4D, SAHA ανέστειλε την VEGF-B 3’UTR-δραστικότητα λουσιφεράσης σε ένα δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. Συγκριτικά, αντι-miR34a μπλοκάρει τα ανασταλτικά αποτελέσματα της SAHA επί της δραστικότητας λουσιφεράσης. Αυτά τα στοιχεία υποδηλώνουν ότι η ανοδική ρύθμιση των miR-34a από 5-Aza-DC και SAHA μπορεί να έχουν λειτουργική σημασία για τη ρύθμιση των Notch και αυτο-ανανέωση.

Επίδραση της αποκατάστασης miR-34a για την έκφραση των βλαστικών κυττάρων γονίδια ανανέωση

σηματοδότηση Notch έχει δειχθεί ότι παίζει ένα ρόλο στον καθορισμό ανανέωση των βλαστικών κυττάρων και κυττάρων μοίρα σε νευρωνικά, αιμοποιητικών και των αρχέγονων βλαστικών κυττάρων [38]. Jagged 1 έκφραση στα προγονικά κύτταρα επάγει αυτοανανέωσης των βλαστικών κυττάρων λόγω Notch σηματοδότηση ενεργοποίησης [39]. Οι υποδοχείς Notch, συνδετήρες καθώς και οι μεταγενέστεροι στόχοι έχουν εντοπιστεί να ρυθμίζεται προς τα πάνω σε προνεοπλαστικών βλαβών σε επεμβατικές παγκρεατικούς καρκίνους στον άνθρωπο και τα ποντίκια, υποδηλώνοντας ότι η σηματοδότηση Notch μπορεί να είναι ένα πρώιμο συμβάν που οδηγεί σε συσσώρευση των μη διαφοροποιημένων πρόδρομων κυττάρων σε καρκίνο του παγκρέατος. Έχουμε αποδείξει ότι η εκ νέου επιβολή έκφραση του miR-34a σε παγκρεατικά ΚΕΠ κατά την κατεργασία με SAHA, προκαλεί μια αναστολή στην έκφραση του mRNA όλων των συστατικών του μονοπατιού Notch, υποδοχέα Notch Notch 1, Notch 3 και συνδέτη Jagged1 της και κατάντη γονιδίου στόχου Notch Hes1 έκφραση (Εικ. 5Α). Του Notch μπορεί έτσι να συμβάλλει στην αναστολή της ανανέωσης των βλαστικών κυττάρων και την επεμβατική ικανότητα των παγκρεατικών ΚΕΠ.

(Α), του παγκρέατος ΚΕΠ υποβλήθηκαν σε αγωγή με SAHA (1 και 3 μΜ) για 24 ώρες, και ο έκφραση του Notch1, Jagged1, NOTCH3 και HES1 μετρήθηκε με qRT-PCR. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν μέση τιμή ± SD. * Ή $ = σημαντικά διαφορετικό από τον έλεγχο, η P & lt? 0,05. (Β), δραστηριότητα δημοσιογράφος Π.Ε.Π.-Ικ. Παγκρέατος ΚΕΠ επιμολύνθηκαν είτε με αρνητικό έλεγχο (κωδικοποιημένο) ή αντι-miR34a ολιγονουκλεοτίδια μαζί με κατασκεύασμα RBP-Ικ-LUC, και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με SAHA (0-3 μΜ) για 24 ώρες. Η δραστικότητα λουσιφεράσης μετρήθηκε σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Promega). Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν μέση τιμή ± SD. *, # Ή @ = σημαντικά διαφορετική από έλεγχο, P & lt?. 0.05

Η

Από το SAHA ανέστειλε την έκφραση αρκετών συστατικών του μονοπατιού Notch, είμαστε δίπλα μετρήθηκε η δραστηριότητα δημοσιογράφος Π.Ε.Π.-Ικ με δοκιμασία λουσιφεράσης ( Σχ. 5Β). SAHA ανέστειλε την δραστικότητα RBP-ϋκ-λουσιφεράσης με έναν δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. Συγκριτικά, αντι-miR34a μπλοκάρει τα ανασταλτικά αποτελέσματα της SAHA επί της δραστικότητας RBP-ϋκ-λουσιφεράσης. Αυτά τα στοιχεία υποδηλώνουν ότι η ανοδική ρύθμιση των miR-34a από το SAHA μπορεί να έχουν λειτουργική σημασία για τη ρύθμιση των VEGF.

Επίδραση της αποκατάστασης miR-34a σε επιθηλιακά-μεσεγχυματικά μετάβαση του παγκρέατος ΚΕΠ

EMT επαγωγή στα καρκινικά κύτταρα έχει ως αποτέλεσμα την απόκτηση του επεμβατική και μεταστατικές ιδιότητες [40]. Ως εκ τούτου, διερευνήθηκε ο ρόλος της αποκατάστασης miR-34a στη ρύθμιση EMT σε παγκρεατικά ΚΕΠ. Zeb-1 είναι ένα κρίσιμο ενεργοποιητής ΕΜΤ και καταστέλλει την έκφραση των συστατικών βασικής μεμβράνης και παράγοντες κυτταρικής πολικότητας προάγοντας έτσι τη μετάσταση των καρκινικών κυττάρων. Zeb-1 μεταγραφή ανεστάλη σημαντικά σε παγκρεατικά ΚΕΠ και καρκινικές κυτταρικές γραμμές μετά από επεξεργασία με SAHA (Σχ. 6Α και Β). Στη συνέχεια ερευνήσαμε την επίδραση του SAHA επί της έκφρασης άλλων μεταγραφής ΕΜΤ παράγοντες σαλιγκάρι και γυμνοσάλιαγκα σε παγκρεατικά ΚΕΠ. Στο σύνολό τους, SAHA οδήγησε σε αναστολή του σαλιγκαριού, Slug και Zeb1 μεταγραφής (Σχ. 6Β), υποδηλώνοντας έτσι ένα ρόλο του miR-34a στην αναστροφή της μετάβασης EMT σε παγκρεατικά ΚΕΠ. Είναι ενδιαφέρον, 5-Αζα-άΟ επίσης ανέστειλε την μεταγραφή του γυμνοσάλιαγκα (τα δεδομένα δεν φαίνονται), οι οποίες πιθανώς παίζουν ρόλο στην αναστολή της εισβολής.

(Α), ο καρκίνος του παγκρέατος κυτταρικές γραμμές [ASPC-1 (p53wt ) και MIAPaCa-2 (p53mutant)] και παγκρεατικής ΚΕΠ υποβλήθηκαν σε αγωγή με SAHA (1 μΜ) για 24 ώρες, και η έκφραση του Zeb1 μετρήθηκε με qRT-PCR. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν μέση τιμή ± SD. * = Σημαντικά διαφορετικό από τον έλεγχο, η P & lt? 0,05. (Β), του παγκρέατος ΚΕΠ υποβλήθηκαν σε αγωγή με SAHA (1 μΜ) για 24 ώρες και η έκφραση του σαλιγκαριού, Slug και Zeb1 μετρήθηκε με qRT-PCR. HK-GAPD χρησιμοποιήθηκε ως το ενδογενές ελέγχου κανονικοποίηση. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν μέση τιμή ± SD. * = Σημαντικά διαφορετικό από τον έλεγχο, η P & lt? 0,05. (C), ο κανονισμός της Zeb-1 δραστηριότητα δημοσιογράφος 3’ΙΙΤΡ. Παγκρέατος ΚΕΠ επιμολύνθηκαν είτε με αρνητικό έλεγχο (κωδικοποιημένο) ή αντι-miR34a ολιγονουκλεοτίδια μαζί με Zeb1 3’UTR-λουσιφεράσης κατασκεύασμα, και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με SAHA (0-3 μΜ) για 24 ώρες. Η δραστικότητα λουσιφεράσης μετρήθηκε σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Promega). Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν μέση τιμή ± SD. *, #,% = Σημαντικά διαφορετικό από τον έλεγχο, η P & lt? 0,05. (D), του παγκρέατος ΚΕΠ υποβλήθηκαν σε αγωγή με SAHA (1 μΜ) ή 5-Αζα-dC (2 μΜ) για 24 ώρες και η έκφραση Ε-καδερίνης και Ν-καντερίνης μετρήθηκε με qRT-PCR. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν μέση τιμή ± SD. * = Σημαντικά διαφορετικό από τον έλεγχο, η P & lt?. 0.05

Η

Από το SAHA ανέστειλε την έκφραση του Zeb-1 μέσω up-ρύθμιση του miR34a, εξετάσαμε επίσης τα αποτελέσματα της SAHA για Zeb1 3’UTR-λουσιφεράσης δραστηριότητα δημοσιογράφος. Όπως καταδεικνύεται στο Σχ. 6C, SAHA ανέστειλε Zeb-1 δραστικότητα 3’UTR-λουσιφεράσης με έναν δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. Συγκριτικά, αντι-miR34a μπλοκάρει τα ανασταλτικά αποτελέσματα της SAHA επί Zeb-1 δραστικότητα 3’UTR-λουσιφεράσης. Αυτά τα στοιχεία υποδηλώνουν ότι η ανοδική ρύθμιση των miR-34a από το SAHA μπορεί να έχουν λειτουργική σημασία για τη ρύθμιση EMT αναστέλλοντας Zeb-1.

Διακόπτη

καδχερίνη έχει αποδειχθεί να συμβεί κατά τη διάρκεια της ρύθμισης EMT. Θεραπεία της παγκρεατικής ΚΕΠ με SAHA και 5-Αζα-άΟ και μόνο που προκαλείται από την έκφραση της Ε-καδερίνης και ανέστειλε την έκφραση του Ν-καδερίνη, δείχνοντας έτσι ότι miR-34a είναι ένας ισχυρός επαγωγέας ενός επιθηλιακού φαινοτύπου (Εικ. 6D).

5-Aza-dC και SAHA αναστέλλουν τη μετανάστευση, σχηματισμό αποικιών, την εισβολή και το σχηματισμό σφαιροειδές

για την περαιτέρω κατανόηση της επίδρασης της προς τα πάνω ρύθμιση της έκφρασης miR-34a στην επεμβατική δυναμικό του παγκρέατος ΚΕΠ, στη συνέχεια ερευνήσαμε την επίδραση της 5-Αζα-dC και SAHA επί των παγκρεατικών ΚΕΠ χρησιμοποιώντας μετανάστευση μηδέν, σχηματισμός αποικίας μαλακού άγαρ, και προσδιορισμούς εισβολής θαλάμου Boyden transwell. Εκπρόσωπος μικροφωτογραφίες των κυττάρων που εισβάλλουν μέσα από το μηδέν που δημιουργούνται για τον έλεγχο και την 5-Aza-DC και SAHA αντιμετωπίζονται παγκρέατος ΚΕΠ παρουσίασαν σημαντικά λιγότερη μετανάστευση στην αντιμετωπίζονται πίνακα ομίλου σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου (Εικ. 7Α).

(Α ), μικροφωτογραφίες αποδεικνύουν τα αποτελέσματα των in vitro μετανάστευση των παγκρεατικών ΚΕΠ χρησιμοποιώντας την απλή τεχνική μηδέν. Παγκρέατος CSCs αναπτύχθηκαν σε μονοστοιβάδα, γρατσουνιές και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με SAHA και 5-Αζα-DC για 24 ώρες. (Β), SAHA και 5-Αζα-άΟ αναστέλλουν το σχηματισμό αποικιών από ΚΕΠ. Παγκρέατος CSCs σπάρθηκαν σε μαλακό άγαρ και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με SAHA (1 και 3 μΜ) ή 5-Αζα-dC (2 και 4 μΜ) επί 21 ημέρες. Στο τέλος της περιόδου επώασης, οι αποικίες μετρήθηκαν. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν μέση τιμή ± SD. * Και $ = σημαντικά διαφορετικό από τον έλεγχο, η P & lt? 0,05. (C), ΚΕΠ απλώθηκαν πάνω στο Matrigel επικαλυμμένα μεμβράνη στην κορυφή θάλαμο του transwell και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με SAHA (1 και 3 μΜ) ή 5-Αζα-dC (2 και 4 μΜ) για 48 ώρες. Κύτταρα εισέβαλαν στο κατώτερο θάλαμο σταθεροποιήθηκαν με μεθανόλη, χρωματίστηκαν και φωτογραφήθηκαν. (D), του παγκρέατος ΚΕΠ σπάρθηκαν σε εναιώρημα και υπέστη κατεργασία με SAHA (1 και 3 μΜ) ή Αζα-5dC (2 και 4 μΜ) επί 7 ημέρες. Εικόνες από σφαιροειδή που σχηματίζονται σε εναιώρημα ελήφθησαν από ένα μικροσκόπιο

Η

& gt?. 5-Αζα-DC και SAHA μείωσε την ικανότητα των παγκρεατικών ΚΕΠ για να σχηματίσει μαλακό αποικίες άγαρ, σε σύγκριση με τον έλεγχο (Εικ. 7Β) και επιμόλυνση με αντι-miR-34a ακύρωσε τις επιδράσεις της 5-Αζα-dC και SAHA επί του σχηματισμού αποικίας (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Εισβολή των παγκρεατικών ΚΕΠ μέσω της Matrigel επικαλυμμένη μεμβράνη έδειξαν ότι ο αριθμός των εισβάλλοντα κύτταρα ανεστάλη σημαντικά σε 5-Αζα-DC και SAHA κατεργασμένα κύτταρα και ήταν περίπου 75% λιγότερο από τον αριθμό των κυττάρων που εισβάλλουν στην ομάδα ελέγχου (Εικ. 7C) . Περαιτέρω, 5-Αζα-DC και SAHA ανέστειλε την σφαιροειδές σχηματισμός σε παγκρεατικά CSCs όπως φαίνεται στο Σχ. 7D. Αυτά τα αποτελέσματα αποδεικνύουν ότι miR-34a μπορεί να διαδραματίσει σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση του παγκρέατος ογκογένεση αναστέλλοντας την ικανότητα αυτο-ανανέωσης του παγκρέατος ΚΕΠ, μετάσταση και εισβολή.

Συζήτηση

Τα microRNAs (miRNAs) είναι μικρά μη-κωδικοποιητική RNA που ρυθμίζουν την έκφραση άλλων γονιδίων με μεταγραφικές ή μεταφραστικές αναστολή καταστολής. Συσσωρευμένα στοιχεία δείχνουν ένα ρόλο για microRNAs στην ανθρώπινη καρκινογένεση ως νέων τύπων καταστολείς όγκων ή ογκογονίδια [41], [42]. Πρόσφατα, τα μέλη της οικογένειας miR-34a βρέθηκαν να ρυθμίζεται άμεσα από ΤΡ53, και η λειτουργική δραστηριότητα του miR-34a έδειξε έναν πιθανό ρόλο ως καταστολέας όγκου. Έχουμε αποδείξει σε αυτή τη μελέτη ότι η έκφραση του miR-34a ρυθμίζεται προς τα κάτω στο ανθρώπινο παγκρεατικό ΚΕΠ και του παγκρέατος που προέρχονται όγκου κυτταρικές γραμμές, ανεξάρτητα από το καθεστώς ρ53 μεταλλάξεων τους. 5Aza-DC και SAHA μπορεί επιγενετικώς αποκαταστήσει την έκφραση του miR-34a ανεξάρτητα από την κατάσταση ρ53 μεταλλάξεων στον καρκίνο του παγκρέατος.