Αφηρημένο

Το

KRAS

πρωτο-ογκογονίδιο διαδραματίζει καίριο ρόλο στην ανάπτυξη πολλών ανθρώπινων όγκων και συνήθως ενεργοποιείται με σωματική μετάλλαξη ή σηματοδότηση μέσω ειδικών υποδοχέων αυξητικού παράγοντα. Ωστόσο, η αλληλεπίδραση μεταξύ του μικρο-περιβάλλον και δραστικότητα K-ras δεν έχει οριστεί. Υποξία αναπτύσσεται σταθερά ως όγκοι ξεπεράσει τον εφοδιασμό τους σε οξυγόνο. Μια σειρά από καλά ενορχηστρωμένη κυτταρική προσαρμογές προκύψει ότι διεγείρει την αγγειογένεση και να ενισχύσει την επιβίωση του όγκου σε συνθήκες υποξίας. προηγούμενες μελέτες μας απέδειξαν ότι μεταλλαγμένα

KRAS

αλληλόμορφα μπορεί να αλληλεπιδράσει με υποξία να προκαλέσει αγγειακό ενδοθηλιακού αυξητικού παράγοντα (VEGF) στον καρκίνο του παχέος εντέρου. Επιδιώξαμε να διαπιστωθεί αν παρόμοια υποξική απαντήσεις είναι επίσης παρούσα σε όγκους χωρίς

KRAS

μετάλλαξη. Η υποξία αυξάνονταν σταθερά τα επίπεδα των ενεργοποιημένων, GTP-δεσμευμένη K-ras σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του κόλου με ένα άγριου-τύπου

KRAS

γονίδιο, και αυτό εξαρτιόταν από την ενεργοποίηση του c-Src. Αναστολή της c-Src με κατεργασία ΡΡ2 ή siRNA knockdown μπλοκάρει την υποξική ενεργοποίηση του Κ-ras. Αυτή η ενεργοποίηση του Κ-ras δεν εξαρτάται από EGFR και είχε ως αποτέλεσμα την φωσφορυλίωση της Akt και επαγωγή της έκφρασης του VEGF. Επιπλέον, η ενεργοποίηση του Κ-ras μπλοκαριστεί σημαντικά απόπτωση σε συνθήκες υποξίας. Αυτές οι μελέτες αποκαλύπτουν ένα μοναδικό προσαρμοστικό μηχανισμό σε υποξία που ενεργοποιεί K-ras σηματοδότησης στην απουσία ενός μεταλλαγμένου

KRAS

ογκογονίδιο

Παράθεση:. Zeng Μ, Kikuchi Η, Pino MS, Chung DC ( 2010) υποξία Ενεργοποιεί το K-Ras πρωτο-ογκογονιδίου να διεγείρει την αγγειογένεση και αναστέλλουν την απόπτωση σε καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου. PLoS ONE 5 (6): e10966. doi: 10.1371 /journal.pone.0010966

Επιμέλεια: Syed A. Αζίζ, Health Canada, Καναδάς

Ελήφθη: 27η Απριλίου 2010? Αποδεκτές: 12 Μαΐου του 2010? Δημοσιεύθηκε: 4 Ιούν 2010

Copyright: © 2010 Zeng et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο χρηματοδοτήθηκε από το Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας CA92594 επιχορήγησης? Kate J. και Dorothy L. Ταμείο Clapp. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Η ανάπτυξη της υποξίας των ιστών είναι χαρακτηριστικά που παρατηρούνται ως κακοήθεις όγκοι αυξάνονται ταχέως σε μέγεθος. Τέτοιες συνθήκες υποξίας εξασκούν επιλεκτική πίεση σε καρκινικά κύτταρα, και η ικανότητα των καρκινικών κυττάρων να επιβιώσουν σε μια υποξική μικροπεριβάλλον έχει συσχετισθεί με κακή πρόγνωση και την αντίσταση στη θεραπεία [1]. Ένα από τα πιο κρίσιμα και καλύτερα χαρακτηρισμένο αποκρίσεις σε υποξία είναι η επαγωγή του αγγειακού ενδοθηλιακού αυξητικού παράγοντα (VEGF), και υποξία παράγοντα-1 (HIF-1) είναι μια καθιερωμένη μεσολαβητής αυτής της διαδικασίας. Ωστόσο, προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι HIF-ανεξάρτητοι μηχανισμοί μπορούν επίσης να προκαλέσουν VEGF σε υποξία, και ογκογόνο Κ-ras παίζει βασικό ρόλο σε αυτή τη διαδικασία [2], [3], [4].

K- ras είναι ένα μικρό ΘΤΡάσης ότι κύκλων μεταξύ ανενεργών γουανοσίνη διφωσφορική (ΑΕΠ) το δεσμευμένο και δραστική τριφωσφορική γουανοσίνη (GTP) το δεσμευμένο διαμορφώσεων (Ras-ΑΕΠ και το Ras-GTP, αντίστοιχα) [5]. Χρησιμεύει ως ένα μόριο διακόπτης σήμα ότι η ενεργοποίηση του υποδοχέα ζευγάρια από ειδικούς παράγοντες ανάπτυξης με καθοδικών πορειών τελεστή συμπεριλαμβανομένης της Ras-ΜΕΚ-ΕΚΚ και φωσφατιδυλινοσιτόλη 3-κινάση (ΡΙ3Κ) -Akt καταρράκτες που ελέγχουν πολλαπλές κυτταρικές αποκρίσεις. Ογκογόνους μεταλλάξεις στο

KRAS

να επηρεάσει την ικανότητα του K-Ras να υδρολύουν δεσμευμένο GTP σε αυξητικού παράγοντα-ανεξάρτητο τρόπο, και συστατικές σηματοδότηση μέσω αυτών των αποτελεσμάτων οδών δράστη. Το μικροπεριβάλλον του όγκου μπορεί να έχει βαθιά επίδραση επί της κυτταρικής συμπεριφοράς, και υποξία έχει δειχθεί ότι αλληλεπιδρά με πολλές ογκογόνο μονοπάτια σηματοδότησης. Ειδικότερα, υποξική ενεργοποίηση της ΡΙ3Κ-Akt, ΜΕΚ-ΕΚΚ, ΝΡ-κΒ, και υποξία παράγοντα (HIF) οδούς σηματοδότησης έχει περιγραφεί [6], [7]. Αν και K-ras είναι ένα κεντρικό ρυθμιστή σε όλες αυτές τις πορείες, είναι άγνωστο αν η ίδια K-ras ενεργοποιείται ειδικά από υποξία. Προηγούμενες μελέτες έχουν αποδείξει μια ισχυρή συνεργιστική αλληλεπίδραση μεταξύ υποξία και μεταλλαγμένων K-ras στη ρύθμιση πολλαπλών γονιδίων στόχων περιλαμβανομένων αγγειακού ενδοθηλιακού αυξητικού παράγοντα (VEGF), IL-8, και οστεοποντίνη [2], [8], [9]. Ωστόσο, λιγότεροι από το 50% των όγκων του παχέος εντέρου λιμάνι

KRAS

μεταλλάξεις, και η σχέση μεταξύ Ras σηματοδότησης και υποξία σε όγκους με άγριου τύπου

KRAS

παραμένει απροσδιόριστη.

επιδίωξε να προσδιορίσει το ρόλο του K-ras στην υποξική μικρο-περιβάλλον στον καρκίνο του παχέος εντέρου, ένα είδος όγκου που φιλοξενεί συχνά

KRAS

μεταλλάξεις. Άγριου-τύπου K-ras ήταν έντονα ενεργοποιείται από υποξία, και c-Src ήταν αναγκαία για αυτό το υποξικό ενεργοποίηση του Κ-ras. Αυτό είχε ως αποτέλεσμα την φωσφορυλίωση της Akt και επαγωγή της έκφρασης του VEGF. Επιπλέον, υποξικές ενεργοποίηση της άγριου τύπου K-ras μπλοκάρει την απόπτωση. Συλλογικά, τα ευρήματα αυτά αναδεικνύουν ένα νέο μηχανισμό για την υποξική ενεργοποίηση των οδών ογκογόνων επιβίωσης σε περίπτωση απουσίας ενός ογκογόνο μετάλλαξη.

Αποτελέσματα

ενεργοποίηση Υποξική της K-Ras στον καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα

Για να προσδιοριστεί αν η υποξία ενεργοποιεί το Ras, μετρήσαμε GTP-δεσμευμένη Ras σε νορμοξικά και υποξικές συνθήκες σε ένα πάνελ κυτταρικών γραμμών καρκίνου του παχέος εντέρου. Επίπεδα GTP-δεσμευμένη Ras ήταν μόλις ανιχνεύσιμη σε κύτταρα Caco2, ΗΤ29, ΟοΙο320ϋΜ και ΟοΙο205 σε νορμοξικά συνθήκες (Εικ. 1Α). Όλες αυτές οι γραμμές έχουν ένα άγριου τύπου

KRAS

γονίδιο. Ωστόσο, όταν αυτά τα κύτταρα επωάστηκαν σε υποξικές συνθήκες (1% O

2), υπήρξε μια δραματική αύξηση (από 3 έως 6,8 φορές) στα επίπεδα των ενεργοποιημένων Ras (Εικ. 1Α). Σε αντίθεση, οι βασικές δραστηριότητες της Ras στην DLD1, HCT116 (τόσο ετερόζυγο για την D13

KRAS

μετάλλαξη), και SW480 (ομόζυγο για το

KRAS

V12

μετάλλαξη) κυττάρων σε φυσιολογική οξυγόνωση ήταν υψηλές, και δεν υπήρχε επακόλουθη αύξηση στην υποξία (σχ. 1Α, δεξί πάνελ). κύτταρα SW480 είχαν τα ισχυρότερα επίπεδα ενεργοποίησης Ras σε νορμοξικά συνθήκες. Η υποξία είναι έτσι ένα ισχυρό ενεργοποιητή του Ras στα καρκινικά κύτταρα κόλου, αλλά αυτή η επαγωγή παρατηρήθηκε μόνο σε αυτά τα κύτταρα με έναν άγριου-τύπου

KRAS

γονίδιο.

Τα επίπεδα του GTP-δεσμευμένη Ras ( Α) και GTP-δεσμευμένη K-ras (Β) αξιολογήθηκαν σε άγριου τύπου (αριστερό πάνελ) και μεταλλαγμένων (δεξί πάνελ)

KRAS

κυτταρικές σειρές που καλλιεργούνται είτε σε νορμοξικά (Ν) ή υποξικές () H συνθήκες για 4 ώρες. Δύο χιλιοστόγραμμα κυτταρικών εκχυλισμάτων χρησιμοποιήθηκαν για μία ανίχνευση ενεργοποίηση της Ras, που ακολουθείται από κηλίδωση Western με τα υποδεικνυόμενα αντισώματα. Οι τιμές εκφράζονται ως Πυκνότητας φορές μεταβολής σε σχέση με τις τιμές ελέγχου κανονικοποιημένη σε 1. C, τα κύτταρα Caco2 καλλιεργήθηκαν σε ϋΜΕΜ με ρΗ ρυθμισμένο στο 7.5 ή 6.5 για 4 ώρες. Τα κυτταρολύματα χρησιμοποιήθηκαν για την δοκιμασία ενεργοποίησης Ras που ακολουθείται από κηλίδωση Western με ένα ειδικό αντίσωμα Ras-GTP. Οι τιμές πυκνότητας εκφράζονται ως φορές μεταβολής σε σχέση με τις τιμές ελέγχου ρυθμίζεται σύμφωνα με 1.

Η

Για να βεβαιωθείτε ότι η ισομορφή K-ras ενεργοποιήθηκε από την υποξία, Κ-ras ειδικό αντίσωμα χρησιμοποιήθηκε. Όπως απεικονίζεται στο Σχήμα 1Β, τα επίπεδα του GTP δεσμεύονται-K-ras προκλήθηκαν από υποξία σε κύτταρα καρκίνου του παχέος εντέρου με άγριου τύπου

KRAS

(Caco2, ΗΤ29), ενώ δεν υπήρχαν αλλαγές σε κυτταρικές σειρές με μεταλλαγμένο

KRAS

ογκογονίδιο (DLD1, HCT116, SW480). Ένας ρόλος για Ν-ras στη ρύθμιση της απόπτωσης έχει προταθεί σε καρκίνο του παχέος εντέρου, αλλά ένα Ν-ras ειδικό αντίσωμα απέτυχε να ανιχνεύσει GTP-δεσμευμένη-Ν-ras σε Caco2, DLD1 και HCT116 κυτταρικές γραμμές είτε ορθοξικές ή υποξικές συνθήκες (Εικ. S1) [10].

όγκων υποξία συχνά συνοδεύεται από ένα διακόπτη για την αναερόβια γλυκόλυση και χαμηλότερο pH, έτσι ώστε να διερευνηθεί κατά πόσον η υποξική ρύθμιση της δραστικότητας του Ras έγινε με τη μεσολάβηση αλλαγές στο pH. Η επώαση των κυττάρων Caco2 σε όξινες συνθήκες (ρΗ 6,5) επί 4 ώρες δεν αύξησε την δραστικότητα του Ras, υποδεικνύοντας ότι οι αλλαγές στο ρΗ δεν ρυθμίζουν τα επίπεδα του GTP-δεσμευμένη Ras (Εικ. 1 C).

Προς τα πάνω ρύθμιση δραστηριότητα ras από υποξία απαιτεί c-Src

c-Src βρίσκεται ανάντη του K-ras, και είμαστε δίπλα προσπάθησε να διερευνήσει κατά πόσον c-Src ενεργοποιείται επίσης από την υποξία. Μια χρονο-εξαρτώμενη ενεργοποίηση του c-Src, όπως μετρήθηκε με φωσφορυλίωση σε Tyr

416, παρατηρήθηκε και στα δύο κύτταρα Caco2 και ΗΤ29 μετά από επώαση σε υποξικές συνθήκες (Εικ. 2Α). Για να προσδιοριστεί εάν δραστικότητα c-Src συνέβαλε στην ενεργοποίηση της Ras από υποξία, εμείς προεπεξεργασμένα κύτταρα Caco2 με ΡΡ2, ένας ισχυρός και εκλεκτικός αναστολέας της τυροσινικής κινάσης Src. Μια μείωση κατά 50% του υποξική διέγερση της Ras ανιχνεύθηκε σε κύτταρα Caco2, ενώ δεν υπήρξε καμία επίδραση στα επίπεδα της ολικής Ras (Εικ. 2Β, αριστερό πάνελ). Αυτή η επίδραση ήταν δοσοεξαρτώμενη, με μέγιστο αποτέλεσμα παρατηρήθηκε σε 20 μΜ (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Α, Caco2 και ΗΤ29 κύτταρα επωάστηκαν σε υποξικές συνθήκες για τους υποδεικνυόμενους χρόνους, και Western blotting για φωσφο-Src

416 και το συνολικό Src έγινε. β-ακτίνης επιβεβαίωσε ίση φόρτωση. Οι τιμές εκφράζονται ως Πυκνότητας φορές μεταβολής σε σχέση με τις τιμές ελέγχου κανονικοποιημένη προς 1. Β, κύτταρα Caco2 προκατεργάστηκαν με τον αναστολέα ΡΡ2 Src (20 μΜ) ή DMSO για 1 ώρα (αριστερό πλαίσιο), ή παροδικά επιμολυσμένα με c-Src κατασκευάσματα ειδικό siRNA ή ένας έλεγχος μη στόχευσης (δεξί πάνελ), πριν από την επώαση σε υποξικές ή νορμοξικές συνθήκες για 4 ώρες. Η ενεργοποιημένη Ras κατεδαφίστηκε και SDS-PAGE εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας ένα ειδικό αντίσωμα Ras-GTP. Σύνολο Ras επιβεβαίωσε ίση φόρτωση. Οι τιμές πυκνότητας εκφράζονται ως φορές μεταβολής σε σχέση με τις τιμές ελέγχου ομαλοποιηθεί προς 1. C, Προϊόντα λύσης των κυττάρων Caco2pEVX και Caco2SrcY527F ανοσοχρωματίστηκαν p-Src

416 και το συνολικό Src και χρησιμοποιείται επίσης για μια δοκιμασία ενεργοποίηση Ras. Οι τιμές Πυκνότητας για Ras-GTP εκφράζονται ως φορές μεταβολής σε σχέση με τις τιμές ελέγχου κανονικοποιημένη σε 1. Δ, αριστερό πάνελ, τα κύτταρα ελέγχου και τα κύτταρα προκατεργάστηκαν με NAC (20 mM) για 20 λεπτά εκτέθηκαν για 10 λεπτά για να H

2O

2 (5 mM). Προϊόντα λύσης στη συνέχεια ανοσοστυπώθηκαν για p-Src

416 και το συνολικό Src. β-ακτίνης επιβεβαίωσε ίση φόρτωση. Μέση και δεξιά πάνελ, τα κύτταρα ελέγχου και τα κύτταρα Caco2 προκατεργάστηκαν με NAC (20 mM) για 1 ώρα επωάζονται σε υποξία για 4 ώρες. Western blotting για φωσφο-Src

416 (μεσαίο πλαίσιο) και Ras ενεργοποίηση δοκιμασία (δεξί πάνελ) διεξήχθησαν στη συνέχεια. Οι τιμές εκφράζονται ως Πυκνότητας φορές μεταβολής σε σχέση με τις τιμές ελέγχου κανονικοποιήθηκαν προς 1. Ε, λύματα κυττάρων Caco2 ελέγχου και τα κύτταρα επωάζονται σε υποξία για τους υποδεικνυόμενους χρόνους υποβλήθηκαν σε κηλίδωση Western για την ανίχνευση ρ-EGFR (Tyr

1068) και οι συνολικές επίπεδα πρωτεΐνης EGFR. Η θεραπεία με EGF (100 ng /mL) χρησίμευσε ως θετικός έλεγχος.

Η

Για να εκτιμηθεί πιο άμεσα ο ρόλος της c-Src, έχουμε χτυπηθεί κάτω ενδογενές c-Src σε κύτταρα Caco2 μέσω παρεμβολή RNA. Νοκ-κάτω της c-Src οδήγησε σε μείωση 33% στην υποξική ενεργοποίηση του GTP-δεσμεύεται Ras (Εικ. 2Β, δεξί πάνελ). Περαιτέρω, τα κύτταρα Caco2 εκφράζουν ένα ουσιαστικά δραστική διάνυσμα c-Src (SrcY527F) εμφάνισαν μια αύξηση 70% στο επίπεδο της GTP-δεσμευμένη Ras (Σχ. 2C), σε σύγκριση με κενό φορέα (pEVX). Κηλίδωση Western επαλήθευσε την ισομορφή K-ras ενεργοποιήθηκε με έκφραση του Src (Εικ. S2).

Αντιδραστικά είδη οξυγόνου (ROS) που παράγεται από την υποξία έχουν προηγουμένως δειχθεί ότι ενεργοποιούν Src. Εξωγενής χορήγηση H

2O

2 (5 mM) ισχυρώς επαγόμενη φωσφορυλίωση της Src σε Tyr

416 σε κύτταρα Caco2 (Σχ. 2D, αριστερό πάνελ). Αυτή η επίδραση ήταν σημαντικά μειωμένη από την NAC (20 mM), ένα αντιοξειδωτικό που αναστέλλει ROS. Στη συνέχεια προσπάθησε να καθορίσει αν NAC θα μπορούσε να εμποδίσει την υποξική ενεργοποίηση του ενδογενούς Src και Ras. θεραπεία NAC μείωσε την επαγωγή του ρ-Src

416 σε υποξία κατά περίπου 30% με ταυτόχρονη μείωση 17% του GTP-δεσμευμένη Ras (Σχ. 2D). Τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν ότι η παραγωγή του ROS μπορεί να συμβάλλει μερικώς στην υποξική ενεργοποίηση της c-Src στον καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα.

Πρόσφατες αναφορές έχουν προτείνει ότι η υποξία μπορεί να αυξήσει τα επίπεδα του EGFR και ότι η φωσφορυλίωση του EGFR μπορεί να είναι ένα ενδιάμεσο στάδιο στη σηματοδότηση από την Src σε RAS [11], [12]. Για να προσδιορίσετε αν EGFR μπορεί να παίξει ένα τέτοιο ρόλο, μετρήσαμε συνολικού EGFR και φωσφο-EGFR επίπεδα στα κύτταρα Caco2 επωάζονται σε υποξία. Υπήρξε μια μικρή αύξηση του συνολικού EGFR στην υποξία. Ωστόσο, δεν υπήρξε καμία αύξηση στη φωσφορυλίωση του EGFR σε Tyr

1068 (Σχ. 2Ε). Συνολικά, τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι τα πάνω ρύθμιση της δραστικότητας c-Src από υποξία διαμεσολαβείται εν μέρει μέσω ROS αλλά ότι η ενεργοποίηση του Κ-Ras με c-Src σε υποξία δεν εξαρτάται από EGFR.

Η ενεργοποίηση του Akt από την υποξία είναι κατάντη του c-Src και Κ-ras

δίπλα προσπάθησε να προσδιορίσει ποια καθοδικών πορειών τελεστή ενεργοποιήθηκαν με c-Src και K-ras σε υποξία. Η έκθεση σε συνθήκες υποξίας που επάγεται φωσφορυλίωση της Akt σε Ser

473 στα δύο κύτταρα Caco2 και ΗΤ29, ενώ η μη ενεργοποίηση της ERK ανιχνεύθηκε υπό τις ίδιες συνθήκες (Σχ. 3Α). Akt ενεργοποιήθηκε σε ένα χρονο-εξαρτώμενο τρόπο και έφθασε ένα μέγιστο επίπεδο σε 12 ώρες. Για να καθοριστεί εάν Src συμμετείχε στην υποξική ενεργοποίηση της Akt, εμείς προεπεξεργασμένα κύτταρα Caco2 με το συγκεκριμένο αναστολέα Src ΡΡ2 για 12 ώρες πριν από την έκθεση σε υποξία. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3Β, η υποξική ενεργοποίηση της Akt μειώθηκε με κατεργασία ΡΡ2 σε μια δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. Σε συμφωνία με αυτά τα ευρήματα, γκρεμίζω του c-Src επίσης μπλοκάρει τελείως την υποξική ενεργοποίηση της Akt σε σύγκριση με κύτταρα επιμολυσμένα με ένα μάρτυρα siRNA (Σχ. 3C).

Α, εκχυλισμάτων πρωτεΐνης από Caco2 και τα κύτταρα ΗΤ29 καλλιεργούνται σε νορμοξικά ή υποξικές συνθήκες για τους υποδεικνυόμενους χρόνους υποβλήθηκαν σε ανοσοκηλίδωση για φωσφο-Ακί και φωσφο-ERK1 /2. Οι κηλίδες στη συνέχεια απογυμνώνεται και ξαναϊχνηθετούνται με αντισώματα έναντι συνολικού Akt και ERK σύνολο. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Οι τιμές Πυκνότητας για ρ-Akt εκφράζονται ως φορές μεταβολής σε σχέση με τις τιμές ελέγχου κανονικοποιήθηκαν προς 1. Β, κύτταρα Caco2 επωάστηκαν για 1 ώρα με ΡΡ2 στις συγκεντρώσεις που υποδεικνύονται, πριν μεταφερθούν σε νορμοξικές ή υποξικές συνθήκες επί 12 ώρες. Κηλίδωση Western πραγματοποιήθηκε για να προσδιοριστούν τα επίπεδα της φωσφο-Ακί, ολική Akt, φωσφο-Src

416, και το συνολικό Src. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Οι τιμές πυκνότητας εκφράζονται ως φορές μεταβολής σε σχέση με τις τιμές ελέγχου ομαλοποιηθεί προς 1. C, τα κύτταρα Caco2 επιμολύνονται με έλεγχο siRNA, K-ras siRNA ή c-Src siRNA ολίγο (η κάθε μία 20 nM) πριν από την έκθεση σε ορθοξικές (Ν) ή υποξικό (H) συνθήκες για 12 ώρες. Ανοσοστύπωμα με τα υποδεικνυόμενα αντισώματα στη συνέχεια διεξήχθη. Οι τιμές Πυκνότητας για ρ-Akt εκφράζονται ως φορές μεταβολής σε σχέση με τις τιμές ελέγχου κανονικοποιήθηκαν προς 1. D, κύτταρα Caco2 υπερεκφράζουν σταθερά Κ-RASV12 (Caco2pCSGWK-ras V12) επιμολύνθηκαν με c-Src siRNA ολίγο. Σαράντα οκτώ ώρες αργότερα, τα κύτταρα επωάστηκαν σε υποξία ή νορμοξία για 12 ώρες και κηλίδωση Western με τα υποδεικνυόμενα αντισώματα στη συνέχεια διεξήχθη. Οι τιμές πυκνότητας για την p-ΑΚΤ εκφράζονται ως φορές μεταβολής σε σχέση με τις τιμές ελέγχου ρυθμίζεται σύμφωνα με 1.

Η

Επειδή Akt είναι γνωστό ότι είναι κατάντη του K-ras, ελέγξαμε εάν Akt είναι επίσης ένα συγκεκριμένο στόχο της K-ras υπό υποξικές συνθήκες με τη χρήση Κ-ras ολίγο siRNA. Αποσιώπηση του K-ras μείωσε τα επίπεδα της Akt σε υποξία, σε σύγκριση με κύτταρα επιμολυσμένα με έλεγχο siRNA (Σχ. 3C). Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι υποξική ενεργοποίηση της Akt προκαλείται μέσω τόσο Src και K-ras. Δεν υπάρχουν αλλαγές σε φωσφο-Src

416 και τα συνολικά επίπεδα πρωτεΐνης Src παρατηρήθηκαν όταν Κ-ras σίγησε (Σχ. 3C), υποδεικνύοντας ότι η Src είναι πράγματι ανάντη του K-ras σε αυτό το υποξικό οδό σηματοδότησης.

να ανεξάρτητα επαληθεύουν ότι K-ras ήταν κατάντη Src σε αυτή την υποξία-επαγόμενη φωσφορυλίωση της Akt, εκτελέσαμε πειράματα σε μια κυτταρική γραμμή που εκφράζει σταθερά Caco2 το μεταλλαγμένο ογκογονίδιο

KRAS

V12

(Caco2 /pCSGWK- RASV12). Η υποξική διέγερση του ρ-Ακί δεν εμποδίστηκε από την αποσιώπηση του c-Src με siRNA (Σχ. 3D). Αυτά τα ευρήματα δείχνουν ότι λειτουργίες c-Src ανάντη του K-ras στο υποξικό ενεργοποίηση της Akt.

K-ras και Src διαμεσολαβούν την αντίσταση στην απόπτωση σε υποξία

Akt διαδραματίζει κεντρικό ρόλο στη ρύθμιση απόπτωση και την πρόοδο του κυτταρικού κύκλου. Από Akt είναι μεταγενέστερος στόχος του K-ras σε αυτή την υποξία προκάλεσε μονοπάτι ενδοκυτταρικής σηματοδότησης, επιδιώξαμε να διαπιστωθεί αν αποσιώπηση του K-ras θα μπορούσε να επηρεάσει την επιβίωση των κυττάρων. Knock-down του K-ras μειωμένη βιωσιμότητα των κυττάρων, ακόμη και σε συνθήκες ορθοξικές κατά 20% σε κύτταρα HCT116, αλλά δεν υπήρχαν σημαντικές αλλαγές στα κύτταρα DLD1 ή Caco2. Σε αντίθεση, K-ras knockdown στο υποξικές συνθήκες μειωμένου αριθμού κυττάρων σε πολύ μεγαλύτερο βαθμό: μείωση 40% στις HCT116 (

P

& lt? 0,05) και 50% μειώσεις DLD1 και Caco2 κύτταρα (

παρατηρήθηκαν 0,01) (Σχ 4Α)? Ρ

& lt.. Αποσιώπηση του K-ras σε κύτταρα Caco2 οδήγησε σε ποσοστό επιβίωσης σε υποξία συγκρίσιμη με DLD1 και HCT116 κύτταρα που φιλοξενούν ένα μεταλλαγμένο

KRAS

γονίδιο, γεγονός που υποδηλώνει ότι η άγριου τύπου πρωτεΐνη K-ras παίζει επίσης σημαντικό ρόλο στην η προσαρμοστική μηχανισμός σε υποξία.

Α, DLD1, HCT116 και Caco2 κύτταρα επιμολύνθηκαν με έλεγχο siRNA ή Κ-ras siRNA, και στη συνέχεια επωάστηκαν σε υποξία για 48 ώρες. Οι αριθμοί των κυττάρων προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας ένα αιματοκυτταρόμετρο μετά από χρώση με trypan blue και τα αποτελέσματα εκφράζονται ως ποσοστά των βιώσιμων κυττάρων σε σύγκριση με τον έλεγχο siRNA επιμολυσμένα κύτταρα σε νορμοξία. Τα δεδομένα είναι από τρία ανεξάρτητα πειράματα και παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± SD. *, P & lt? 0,05? ** P & lt? 0,01. Β, ΟοΙο320ϋΜ κύτταρα αναπτύχθηκαν σε αποστειρωμένες καλυπτρίδες επιμολύνθηκαν με ολιγονουκλεοτίδια ελέγχου siRNA (που φαίνεται στο πάνω σειρές) ή siRNA ολιγονουκλεοτίδια στο K-ras (που φαίνεται στο κάτω μέρος σειρές) για 24 ώρες, ακολουθούμενο από επώαση σε υποξία για 48 ώρες. Πρώιμων αποπτωτικών (FITC + ΡΙ-) και αργά αποπτωτικών /νεκρωτικών κυττάρων (FITC + ΡΙ +) ανιχνεύθηκαν. Αριστερό πάνελ: αντίθεσης 20x φάση και 20x φθορισμού πράσινο και κόκκινο κανάλι συγχωνεύονται εικόνες. Δεξιά πάνελ: 20x και 40x φθορισμού πράσινο και κόκκινο κανάλι συγχωνεύονται εικόνες. C, τα κύτταρα Caco2 επιμολύνθηκαν με K-ras siRNA ή ελέγχουν siRNA, και στη συνέχεια επωάστηκαν σε νορμοξία ή υποξία για 48 ώρες. Ο κυτταρικός θάνατος προσδιορίσθηκε με FACS όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. D, πρώιμων αποπτωτικών (αννεξίνης V + ΡΙ-) και αργά αποπτωτικών /νεκρωτικών (αννεξίνης V + ΡΙ +) κύτταρα προσδιορίστηκαν με ανάλυση FACS. Μέση ± SD τριών ανεξάρτητων πειραμάτων παρουσιάζεται. *, P & lt? 0,05. ** P & lt? 0,01. Ε, DLD1, HCT116 και Caco2 κύτταρα επιμολύνθηκαν με έλεγχο siRNA ή c-Src siRNA ολίγο (20 ηΜ) για 24 ώρες και στη συνέχεια εκτίθενται σε υποξία για 48 ώρες. Κύτταρα με εξαίρεση κυανού τρυπανίου μετρήθηκαν και τα αποτελέσματα εκφράζονται ως εκατοστιαία αναλογία των βιώσιμων κυττάρων σε σύγκριση με τον έλεγχο siRNA επιμολυσμένα κύτταρα σε νορμοξία. Μέση ± SD τριών ανεξάρτητων πειραμάτων παρουσιάζεται. *, P & lt? 0,05. ** P & lt?. 0.01

Η

Στη συνέχεια σημασμένα κύτταρα με FITC-ανεξίνη V και ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ) για να μετρήσει τα ποσοστά απόπτωσης. Ένας άλλος άγριου τύπου

KRAS

κυτταρική γραμμή, ΟοΙο320ϋΜ, μελετήθηκε επειδή το αναπτυξιακό της μοντέλο ως μεμονωμένα κύτταρα επιτρέπει την οπτικοποίηση των αποπτωτικών μεμβράνης αλλάζει με μεγαλύτερη σαφήνεια. Αποσιώπηση του K-ras είχαν ως αποτέλεσμα μεταβολές στην κυτταρική μορφολογία, συμπεριλαμβανομένων διόγκωση, συρρίκνωση, και πυρηνικών κατακερματισμό, καθώς και μειωμένη προσκόλληση στο τρυβλίο καλλιέργειας ιστού και την αύξηση κυμαινόμενο. Αποσιώπηση του K-ras αύξησαν επίσης τον αριθμό των αννεξίνης V θετικών κυττάρων σε σύγκριση με siRNA μάρτυρα (Σχ. 4Β). Για να ποσοτικοποιηθούν οι αντι-αποπτωτικά αποτελέσματα του K-ras σε υποξία, αναλύσαμε αποπτωτικών κυτταρικών πληθυσμών με κυτταρομετρία ροής (FACS). κύτταρα Caco2 επιμολυσμένα με είτε μη στόχευσης ελέγχου ή Κ-ras ολίγο siRNA επωάστηκαν σε νορμοξία ή υποξία για 48 ώρες. Κύτταρα χωρίς αγωγή χρησίμευσε ως αρνητικός έλεγχος, και τα κύτταρα εκτέθηκαν σε υπεριώδες φως επί 10 λεπτά και καλλιεργούνται με TNF-α και κυκλοεξιμίδιο (CHX) χρησίμευσε ως θετικός έλεγχος (Σχ. 4C, αριστερό πάνελ). Ένα ιστόγραμμα Annexin V-FITC θετικά κύτταρα αποκάλυψε ότι το knock-down του K-ras σε φυσιολογική οξυγόνωση δεν μετέβαλε σημαντικά τα ποσοστά της απόπτωσης. Ωστόσο, κάτω από υποξικές συνθήκες, η απώλεια του Κ-ras αύξησε σημαντικά τα ποσοστά κυτταρικού θανάτου από 22% έως 57% σε σύγκριση με θεραπεία ελέγχου siRNA (Σχ. 4C, μεσαίο και δεξιό πάνελ). Αναλύσαμε περαιτέρω τα αποπτωτικά κύτταρα ως δύο υποπληθυσμούς: πρώιμων αποπτωτικών κυττάρων (αννεξίνη V +, ΡΙ-) και αργά αποπτωτικών /νεκρωτικών κυττάρων (αννεξίνη V +, ΡΙ +). Μόνο όταν ήταν K-ras νοκ-κάτω υπό συνθήκες υποξίας ήταν μια σημαντική επαγωγή της απόπτωσης παρατηρήθηκε με ανάλυση FACS? υπήρχε ένα 1,3-πλάσια αύξηση στον αριθμό των πρώιμων αποπτωτικών κυττάρων (

P

& lt? 0,05) και 2,0-φορές αύξηση στον αριθμό των αποπτωτικών κυττάρων αργά (

P

& lt? 0,01) σε σύγκριση με τον έλεγχο της siRNA σε υποξία (σχ. 4D). Αυτές οι μελέτες δείχνουν ότι η K-ras μπορεί να αναστέλλει την απόπτωση σε υποξία.

Τα στοιχεία μας πρότεινε ότι Src μπορεί επίσης να ρυθμίζουν μονοπάτια επιβίωσης που μπλοκάρουν την απόπτωση σε υποξία. Ορίσαμε τη σχέση μεταξύ Src και κυτταρικής επιβίωσης άμεσα με μέτρηση βιώσιμων κυττάρων που εξαιρούνται trypan blue. Knock-down του Src στη DLD1 και τα κύτταρα HCT116 δεν μετέβαλε την επιβίωση των κυττάρων σε φυσιολογική οξυγόνωση (1% και 9% μειώσεις στον αριθμό των κυττάρων, αντίστοιχα), ενώ σε υποξία, αριθμός κυττάρων μειώθηκε κατά 36% και 45%, αντίστοιχα (Σχ. 4Ε ). Ομοίως, knockdown του c-Src σε κύτταρα Caco2 μειωμένο αριθμό των κυττάρων κατά 20% σε σύγκριση με τη φυσιολογική οξυγόνωση σε μια πιο σημαντική μείωση 58% σε υποξία. Ως εκ τούτου, η ενεργοποίηση του Κ-ras ή Src υπό συνθήκες υποξίας ενισχύει την επιβίωση των κυττάρων καρκίνου του παχέος εντέρου.

ρύθμιση Υποξικές του VEGF με K-ras

Η υποξία είναι επίσης ένας ισχυρός ερέθισμα για την αγγειογένεση μέσω η επαγωγή του VEGF. Έχουμε προηγουμένως αποδείξει ότι η υποξία και ογκογόνο Κ-ras μπορεί συνεργικά πλειορύθμιση VEGF [2]. Ενώ οι μελέτες αυτές παρέχουν πολύτιμες γνώσεις σχετικά με ογκογόνο λειτουργία K-ras, δεν παρέχουν γνώσεις σχετικά με τους μηχανισμούς που τον καρκίνο του παχέος εντέρου κυττάρων με άγριου τύπου

KRAS

μπορούν να χρησιμοποιήσουν. Ως εκ τούτου, ανέστειλε την ενδογενή άγριου τύπου

κύτταρα KRAS

σε Caco2 με siRNA ολίγο να καθορίσει τη σχέση μεταξύ της ενεργοποίησης K-ras και την παραγωγή VEGF. Σε κύτταρα Caco2 επιμολυνθεί με ένα siRNA ελέγχου, υποξία αυξημένα επίπεδα VEGF mRNA 4,9 φορές. Knockdown του K-ras οδήγησε σε μείωση της έκφρασης του VEGF mRNA κατά 60% και 76% σε νορμοξικά και υποξικές συνθήκες, αντίστοιχα, σε σύγκριση με κύτταρα επιμολυσμένα με ένα μάρτυρα siRNA (Σχ. 5Α). Χρησιμοποιήσαμε την επόμενη ένα κατασκεύασμα ανταποκριτή VEGF υποκινητή (Εικ. 5Β). Συνθήκες υποξίας που προκαλείται δράση του υποκινητή του VEGF κατά 2,2 φορές. Σε συμφωνία με τα αποτελέσματα qRT-PCR μας, αποσιώπηση του K-ras μείωσε δραματικά τη υποξική επαγωγή της δραστικότητας υποκινητή του VEGF κατά 72%. Σε φυσιολογική οξυγόνωση, υπήρξε μια μείωση 38% στη δραστηριότητα υποκινητή του VEGF μετά K-ras σίγηση. Αυτή η μείωση στη δραστικότητα του VEGF υποκινητή συσχετίζονται με τις αλλαγές παρατηρήθηκαν σε ενεργοποίηση K-ras. Τέλος, ένας προσδιορισμός ELISA έδειξε ότι τα επίπεδα της πρωτεΐνης VEGF εκκρινόμενη ρυθμίστηκαν προς τα πάνω 2,6 φορές από την υποξία. Knockdown του άγριου τύπου

KRAS

σε κύτταρα Caco2 μειωμένα επίπεδα της πρωτεΐνης VEGF μόνο κατά 8% σε νορμοξία αλλά μειωμένα επίπεδα της πρωτεΐνης VEGF περισσότερο σημαντικά σε υποξία κατά 51% (Σχ. 5C). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι ένας άγριου τύπου

KRAS

γονίδιο είναι επίσης ένα κρίσιμο ρυθμιστή του VEGF σε συνθήκες υποξίας.

Α, τα σχετικά επίπεδα mRNA του VEGF, όπως αξιολογήθηκε με ποσοτική RT-PCR, σε κύτταρα Caco2 επιμολυσμένα με Κ-ras-ειδικό siRNA κατασκεύασμα, ή όργανα ελέγχου μη στόχευσης και εκτίθενται σε φυσιολογική οξυγόνωση ή υποξία. Τα δεδομένα εκφράζονται ως φορές μεταβολής σε σύγκριση με κύτταρα ελέγχου siRNA σε νορμοξία, κανονικοποιημένη προς 1. Στήλες, μέσος όρος τουλάχιστον τριών πειραμάτων? μπαρ, SEM. *, Ρ & lt? 0,05, σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου. Β, τα κύτταρα Caco2 επιμολύνθηκαν παροδικά είτε με siRNA που στοχεύει ενδογενείς K-ras ή μη έλεγχο στόχευση siRNA. Μετά από 24 ώρες, ένα κατασκεύασμα ανταποκριτή VEGF-λουσιφεράση 2.3 kb συν-επιμολυσμένα με pRL-CMV και τα κύτταρα επωάστηκαν σε νορμοξία ή υποξία για επιπλέον 24 ώρες. Τα δεδομένα εκφράζονται ως φορές μεταβολής σε σύγκριση με κύτταρα ελέγχου siRNA σε νορμοξία, κανονικοποιημένη προς 1. Στήλες, μέσος όρος τουλάχιστον τριών πειραμάτων? μπαρ, SEM. *, Ρ & lt? 0,05, σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου. C, το υπερκείμενο από κύτταρα στο (Α) συλλέχθηκε, και μία ELISA για τον VEGF διεξήχθη. Τα δεδομένα εκφράζονται ως φορές μεταβολής σε σύγκριση με κύτταρα ελέγχου siRNA σε νορμοξία, κανονικοποιημένη προς 1. Στήλες, μέσος όρος τουλάχιστον τριών πειραμάτων? μπαρ, SEM. *, Ρ & lt?. 0.05 σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου

Η

Υποξικές επαγωγή του VEGF είναι επίσης Src-εξαρτώμενη

Αν και προηγούμενες ενδείξεις έδειξε ότι το c-Src μονοπάτια μεταγωγής σήματος μπορεί να ρυθμίσει VEGF έκφραση, η σχέση μεταξύ της ενεργοποίησης του Src από υποξία και την παραγωγή του VEGF σε κύτταρα όγκου κόλου δεν έχει ακόμη αποσαφηνιστεί. Αντί να υπερεκφράζουν v-Src, έχουμε μπλοκάρει ενδογενούς c-Src με ΡΡ2. θεραπεία ΡΡ2 για 24 ώρες σε κύτταρα Caco2 κατέστειλε τα επίπεδα VEGF mRNA κατά 87% σε υποξία σε σύγκριση με μείωση 60% στις νορμοξία (Σχ. 6Α). ΡΡ2 κατέστειλε επίσης δραστηριότητα υποκινητή του VEGF κατά 85% σε υποξία σε σύγκριση με μείωση 50% σε νορμοξία (Σχ. 6Β).

, τα σχετικά επίπεδα mRNA Α και Γ του VEGF, όπως αξιολογήθηκε με ποσοτική RT-PCR, σε Caco2 και ΗΤ29 κύτταρα προκατεργάστηκαν με 10 μΜ ΡΡ2 (Α) ή παροδικά διαμολυσμένα με Src-ειδικό κατασκεύασμα siRNA (C), και εκτέθηκαν σε νορμοξία ή υποξία για 24 ώρες. Τα δεδομένα εκφράζονται ως φορές μεταβολής σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου σε νορμοξία, κανονικοποιημένη σε 1. *, Ρ & lt? 0.05. Β και D, VEGF ανιχνεύσεις αναφοράς της λουσιφεράσης της Caco2 και ΗΤ29 κύτταρα, προκατεργάστηκαν με 10 μΜ ΡΡ2 (Β) ή παροδικά διαμολυσμένα με Src-ειδικό κατασκεύασμα siRNA (D), και εκτέθηκαν σε νορμοξία ή υποξία για 24 ώρες. Τα αποτελέσματα είναι από τρία ανεξάρτητα πειράματα που πραγματοποιήθηκαν εις διπλούν και παρουσιάζονται ως φορές μεταβολής σε σχέση με τα κύτταρα ελέγχου σε νορμοξία κανονικοποιημένη σε 1. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SD. *, P & lt? 0,05. ** P & lt?. 0.01

Η

Για να επαληθεύσετε τον ειδικό ρόλο του c-Src στην υποξική διέγερση του VEGF, χρησιμοποιήσαμε Src siRNA ολίγο. Με την προσέγγιση αυτή, τα επίπεδα mRNA του VEGF παρέμειναν αμετάβλητες σε νορμοξικά συνθήκες αλλά μειωμένη κατά 39% σε υποξία (σχ. 6C), και η δραστικότητα VEGF υποκινητή μειώθηκε 56% σε σύγκριση με μείωση 33% σε νορμοξία (Εικ. 6D). Για να επιβεβαιωθεί αυτό το αποτέλεσμα δεν ήταν μοναδικό στα κύτταρα Caco2, ΗΤ29 κύτταρα αναλύθηκαν επίσης. Η θεραπεία με ΡΡ2 ή Src siRNA ολιγονουκλεοτίδια σε κύτταρα ΗΤ29 υπό νορμοξικές συνθήκες έχει αμελητέα αποτελέσματα επί του VEGF mRNA ή δραστηριότητα του υποκινητή. Αντίθετα, κάτω από υποξικές συνθήκες, ΡΡ2 κατέστειλε τα επίπεδα VEGF mRNA και της δραστηριότητας προαγωγού κατά 67% και 53%, αντίστοιχα (Σχήμα 6Α και 6Β, δεξιά πάνελ.)? Παρομοίως, c-Src siRNA ολίγο μειωμένα επίπεδα VEGF mRNA και της δραστηριότητας προαγωγού κατά 37% και 76% σε υποξία, αντίστοιχα (Εικ. 6C και 6D, δεξιά πάνελ). Συλλογικά, αυτά τα αποτελέσματα εμπλέκουν επίσης c-Src ως κρίσιμο ρυθμιστή του VEGF σε υποξία.

Συζήτηση

Η υποξία είναι μια αναπόφευκτη συνέπεια της ταχείας ανάπτυξης του όγκου που υπερβαίνει την υπάρχουσα προσφορά αίματος. Ένα προσεκτικά ενορχηστρωμένη σύνολο των προσαρμοστικών απαντήσεων εξασφαλίζει την επιβίωση του κυττάρου όγκου σε αυτές τις συνθήκες υποξίας. Ο παράγοντας μεταγραφής HIF-1 είναι γνωστό ότι παίζει ένα ρόλο σε αυτήν την υποξική απόκριση [13], [14], [15]. Επιδιώξαμε να διαπιστωθεί αν επιπλέον ογκογόνο πορείες μπορεί να ενισχύσει αυτές τις προσαρμοστικές αντιδράσεις. Στον καρκίνο του παχέος εντέρου, προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει μια συνεργική αλληλεπίδραση μεταξύ

KRAS

μεταλλάξεις και υποξία στη ρύθμιση πολλαπλών γονιδίων περιλαμβανομένων του VEGF [2], [8], [9]. Ωστόσο,

KRAS

μεταλλάξεις εντοπίζονται σε λιγότερο από το μισό του συνόλου των καρκίνων του παχέος εντέρου, και ο ρόλος του άγριου τύπου

KRAS

στην υποξική απόκριση είναι λιγότερο βέβαιο. Απ ‘όσο γνωρίζουμε, αυτή είναι η πρώτη απόδειξη της υποξικής ενεργοποίηση του Κ-ras στον καρκίνο του παχέος εντέρου.

Τα δεδομένα μας δείχνουν ότι η υποξία είναι ισχυρός ενεργοποιητής του άγριου τύπου K-Ras στα καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου. Η ενεργοποίηση του Κ-ras ως αποτέλεσμα την κατάντη ενεργοποίηση της Akt, επαγωγή του VEGF, και η αναστολή της απόπτωσης. Αυτές οι επιδράσεις στην αγγειογένεση καθώς και την απόπτωση είναι και οι δύο κρίσιμες για την επιβίωση του όγκου σε συνθήκες παρατεταμένης υποξίας. Η πρόσληψη του Akt μονοπάτι είναι συνεπής με προηγούμενες αναφορές της υποξικής σηματοδότησης από μεταλλαγμένο K-ras στη ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης ΟΡΝ [9]. K-ras μπορεί να ενεργοποιήσει υποξία παράγοντα-1 (HIF-1) μέσω φωσφορυλίωσης πρωτεΐνης, και ορισμένες από τις παρατηρούμενες επιδράσεις στην επαγωγή του VEGF μπορεί ενδεχομένως να προκαλούνται μέσω HIF-1 [16]. Ωστόσο, είναι απίθανο ότι HIF-1 είναι ο μόνος μεσολαβητής της διαδικασίας αυτής, ως K-ras μπορούν επίσης να ρυθμίζουν VEGF μέσω HIF-1 ανεξάρτητες οδούς σε υποξία [17].

Η ενεργοποίηση του K-ras σε υποξία εξαρτιόταν από την ανάντη ενεργοποίηση της c-Src. Υπάρχει ένα προηγούμενο για την υποξική ενεργοποίηση της Src, η οποία έχει καταδειχθεί τόσο

in vivo

και

in vitro

σε άλλους τύπους κυττάρων [18]. Υπάρχει μια σειρά ειδικών μεσολαβητών που συνδέουν Src έως Κ-ras, και ένας ρόλος για την ενεργοποίηση του EGFR είναι καλά περιγράφεται [11], [19], [20]. Παρά ιδρύθηκε σύνδεσή του με παχέος ογκογένεση, EGFR δεν παίζουν ρόλο στην υποξική ενεργοποίηση της K-ras.

Κινητά απαντήσεις σε υποξία επιδιώξουν να διατηρήσουν την επιβίωση σε ένα εχθρικό μικροπεριβάλλον. Η ενεργοποίηση του K-ras σε υποξικές συνθήκες συνεπάγεται βασικό ρόλο στην υποξική απόκριση, και οι μελέτες μας τονίζουν δύο σημαντικές λειτουργίες: αναστολή της απόπτωσης και τη διέγερση της αγγειογένεσης. Ο ρόλος του K-ras στη ρύθμιση της απόπτωσης εξαρτάται κατά πολύ από το πλαίσιο και τον τύπο κυττάρου. Σε ορισμένες περιπτώσεις, K-ras μπορεί να είναι προ-αποπτωτικών μέσω της ενεργοποίησης των RASSF1 ή Nore1, αλλά και σε άλλα σενάρια μπορεί να χρησιμεύσει αντι-αποπτωτικών λειτουργίες μέσω PI3K ή Tiam1 [21]. Οι μελέτες μας σε καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου επιδεικνύουν έναν βασικό ρόλο για την ενεργοποίηση του μονοπατιού Akt σε υποξία, το οποίο έχει προηγουμένως δειχθεί ότι μπλοκάρει την απόπτωση σε άλλα κυτταρικά συστήματα [22], [23], [24]. Είναι ενδιαφέρον, ERK δεν ενεργοποιήθηκε με υποξία στο σύστημά μας. Ο ρόλος της ενεργοποίησης ERK σε όγκους του παχέος εντέρου δεν είναι απλή. Αν και η έκφραση των ογκογόνων του K-ras σε φυσιολογικά επιθηλιακά κύτταρα του κόλου μπορεί να ενεργοποιήσει έντονα ERK

in vivo

, μόνο περιορισμένες σηματοδότηση ERK παρατηρήθηκε σε όγκους του παχέος εντέρου που αναπτύχθηκαν σε αυτά τα ζώα [10]. Επιπλέον, ο καρκίνος του παχέος εντέρου κύτταρα που φέρουν μια μετάλλαξη Κ-ras απέτυχαν να αποδείξουν σημαντική ενεργοποίηση της ERK, και καμία αξιόπιστη συσχέτιση μεταξύ

KRAS

κατάσταση μετάλλαξης και ενεργοποίηση ERK έχει παρατηρηθεί σε δείγματα ανθρώπινου καρκίνου του παχέος εντέρου [10], [ ,,,0],25]. Οι ειδικοί μηχανισμοί που καθορίζουν ποια μονοπάτια τελεστή ασχολούνται με K-ras σε υποξική έναντι παραμένουν ορθοξικές προϋποθέσεων που θα καθοριστούν και απεικονίζει την πλαστικότητα της λειτουργίας K-ras ανάλογα με συγκεκριμένες μικρο-περιβαλλοντικά ερεθίσματα.

συνθήκες υποξίας, επομένως, μπορεί να δημιουργήσει ένα περιβάλλον στο οποίο πρωτο-ογκογονίδια που δεν είναι μεταλλαγμένα μπορούν να μιμηθούν ενεργοποιημένα ογκογονίδια. Ακόμα κι αν άγριου τύπου K-ras μπορεί να ενεργοποιηθεί από την υποξία, είναι πιθανό ότι το φάσμα των δραστηριοτήτων της δεν επικαλύπτει πλήρως με εκείνη του μεταλλαγμένου του K-ras και υπάρχουν και άλλες ιδιότητες ειδικά για ογκογόνους

KRAS

αλληλόμορφα.