Abstract

στρωματικά στοιχεία μέσα σε ένα όγκο αλληλεπιδρούν με καρκινικά κύτταρα για να δημιουργήσουν ένα μικροπεριβάλλον που υποστηρίζει την ανάπτυξη του όγκου και την επιβίωση. Αδρενομεδουλλίνη (ADM) είναι ένας αυτοκρινής /παρακρινής παράγοντας που παράγεται από τα δύο στρωματικά κύτταρα και τα καρκινικά κύτταρα για να δημιουργήσει ένα τέτοιο μικροπεριβάλλον. Κατά τη διάρκεια της διαφοροποίησης των μακροφάγων, η ADM παράγεται σε απόκριση προς προ-φλεγμονώδη ερεθίσματα και υποξία. Σε αυτή τη μελέτη διερευνήσαμε το ρόλο της ADM ως αυξητικός παράγοντας για τα καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών και ως ρυθμιστής των μακροφάγων. Αναλύσαμε επίσης τα επίπεδα έκφρασης ADM σε μία αναδρομική κλινική μελέτη χρησιμοποιώντας nanofluidic τεχνολογία και την αξιολόγηση του ADM σε επίπεδο γονιδίου σε 220 ασθενείς με καρκίνο των ωοθηκών. Για τη μελέτη των επιπτώσεων της ADM, κυτταρικές σειρές καρκίνου ωοθήκης Α2780, OVCAR-3, και ΗΕΥ και των ομολόγων τους ανθεκτικών στα φάρμακα χρησιμοποιήθηκαν για δοκιμασίες πολλαπλασιασμού, ενώ μονοκύτταρα από υγιείς δότες διαφοροποιούνται in vitro. ADM ήταν ένα αδύναμο παράγοντα ανάπτυξης, όπως αποκαλύπτεται από προσδιορισμούς πολλαπλασιασμού και ανάλυση του κυτταρικού κύκλου. Μετά την καλλιέργεια καρκινικών κυττάρων υπό συνθήκες τονίζοντας, όπως ασιτία ορού και /ή υποξία, η ADM βρέθηκε να είναι ένας παράγοντας επιβίωσης σε ΗΕΥ, αλλά όχι σε άλλες κυτταρικές σειρές. Σε μακροφάγα, η ADM έδειξαν δραστικότητα επί του πολλαπλασιασμού /διαφοροποίησης, κυρίως σε τύπου 2 μακροφάγα (Μ2). Απροσδόκητα, η κλινική μελέτη έδειξε ότι η υψηλή έκφραση της ADM συνδέθηκε με θετικό αποτέλεσμα και σε καρκίνο με χαμηλή CA125. Εν κατακλείδι, αν και in vitro η ADM ήταν ένας πιθανός παράγοντας στην βιολογική επιθετικότητα, η δυνατότητα αυτή δεν έχει επιβεβαιωθεί σε ασθενείς. Ως εκ τούτου, η χρήση ενός ανταγωνιστή της ADM θα ήταν ακατάλληλη για τη διαχείριση των ασθενών με καρκίνο των ωοθηκών

Παράθεση:. Baranello C, Mariani M, Andreoli Μ, Fanelli Μ, Martinelli Ε, Ferrandina G, et al. (2012) Adrenomedullin στον καρκίνο των ωοθηκών: Εχθρός In Vitro και φίλο In Vivo; PLoS ONE 7 (7): e40678. doi: 10.1371 /journal.pone.0040678

Επιμέλεια: Konradin Metze, Πανεπιστήμιο της Campinas, Βραζιλία

Ελήφθη: 19 του Μάρτη, 2012? Αποδεκτές: 12, Ιούν 2012? Δημοσιεύθηκε: 30 του Ιούλη του 2012

Copyright: © Baranello et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε εν μέρει από μια επιχορήγηση από Associazione Oppo e le μηνύσει Stanze ONLUS (www.oppostanze.it), από την Ruth C. Donovan Καρκίνου του Προγράμματος Έρευνας και από μια γενναιόδωρη δωρεά από το κύριο και την κυρία Ruggles. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

μικροπεριβάλλον του καρκίνου είναι ένα θέμα που έχει πρόσφατα αρχίσει να ερευνητές ενδιαφέρον. Για χρόνια η έρευνα επικεντρώθηκε στην ίδια καρκινικό κύτταρο, αλλά ένας συμπαγής όγκος περιέχει επίσης μη κακοήθη στρωματικά στοιχεία, συμπεριλαμβανομένων των μακροφάγων, λεμφοκυττάρων, ιστιοκυττάρων, ενδοθηλιακά κύτταρα, ινοβλάστες, μυοϊνοβλάστες, περικύτταρα, και μεσεγχυματικών βλαστικών κυττάρων, τα οποία αλληλεπιδρούν με τα καρκινικά κύτταρα να δημιουργήσει ένα μικροπεριβάλλον που υποστηρίζει την ανάπτυξη του όγκου και της επιβίωσης [1], [2]. Κατανοώντας την ακριβή σύνθεση του μικροπεριβάλλοντος του όγκου θα μπορούσε να είναι χρήσιμη για την ανάπτυξη της ορθολογικής θεραπευτικές προσεγγίσεις.

επιθηλιακού καρκίνου των ωοθηκών εμφανίζει ένα πολύπλοκο δίκτυο κυτοκινών-χημοκίνη [3]. Οι υποδοχείς για χημειοκίνες που εκφράζονται σε μία ποικιλία διηθητικά κύτταρα, συμπεριλαμβανομένων μακροφάγων, τα οποία προσλαμβάνονται από χημειοκίνες [4]. Αυτή η αλληλεπίδραση είναι μία διαδικασία 2-way: ωοθηκών καρκινικά κύτταρα είναι επίσης ικανά να διαμορφώνουν την μακροφάγων φαινότυπο, δεδομένου ότι οι κυτοκίνες και υποδοχείς της κυτταρικής επιφάνειας που επάγονται στην συν-καλλιεργημένα μακροφάγα in vitro ανιχνεύονται επίσης σε ανθρώπινο καρκίνο των ωοθηκών [5]. ADM είναι ικανός να προωθήσει την αγγειογένεση και μελάνωμα ανάπτυξη [6] και μέσω του παρακρινή επίδραση, που προκαλείται από την ενδοθηλιακή μονοπάτι σηματοδότησης συνθάσης νιτρικού οξειδίου, και από την αυτοκρινή επίδραση, η οποία διεγείρει την πόλωση των μακροφάγων προς μια εναλλακτικώς ενεργοποιημένα φαινότυπο (Μ2).

ADM είναι ένα 52-αμινο-οξύ διαλυτό πεπτίδιο το οποίο καθαρίστηκε για πρώτη φορά από φαιοχρωμοκύττωμα [7] και πιστεύεται ότι παράγονται κυρίως από το μυελό των επινεφριδίων. Σήμερα, ωστόσο, είναι γνωστό ότι η ADM είναι σχεδόν πανταχού παρούσα, με ευρεία κατανομή στους ιστούς που είναι ενδεικτικό της πολλαπλές βιολογικές δραστηριότητες του [8]. ADM παράγεται τόσο από στρωματικά (δηλαδή, ενδοθηλιακά, αγγειακού λείου μυός, του εμφράγματος, και το κεντρικό νευρικό σύστημα) και καρκινικά κύτταρα ως /παρακρινής παράγοντας αυτοκρινής. Είναι επίσης παράγεται κατά τη διάρκεια της διαφοροποίησης των μακροφάγων σε απόκριση προς προ-φλεγμονώδη ερεθίσματα και υποξία, και έχει κυρίως αντιφλεγμονώδη δράση, αφού η ADM αναστέλλει ΤΝΡ-α παραγωγή από ενεργοποιημένους μακροφάγους, μειώνει την αγγειακή διαπερατότητα, και ρυθμίζει προς τα κάτω Th1 αυτοάνοσης απόκρισης [ ,,,0],9].

Α2780, TC1, TC3, OVCAR-3, OVCAR-και EPO10 κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή με ADM 1, 10, και 100 ηΜ για 72 ώρες και μετρήθηκαν. Οι αριθμοί κυττάρων παρουσιάζονται ως απόλυτος αριθμός των κυττάρων. Μια μέτρια επίδραση στην κυτταρική ανάπτυξη παρατηρήθηκε σε ορισμένες κυτταρικές σειρές, όπως Α2780 (Α), TC1 (Β), και τα κύτταρα OVCAR-3 (D).

Η

Δομικά, η ADM χαρακτηρίζεται από ένα τυπικός δακτύλιος 6-αμινο-οξέος, λόγω μιας δισουλφιδικής γέφυρας μεταξύ κυστεϊνών 16 και 21, και είναι αμιδιωμένο στο καρβοξυτελικό άκρο. Τόσο ο δισουλφιδικός δεσμός και αμιδίωση είναι απαραίτητα για τη δράση του. ADM είναι ομόλογη με πεπτίδιο καλσιτονίνης σχετιζόμενο με γονίδιο (CGRP) και αμυλίνη, και τα δύο μέλη της καλσιτονίνης /CGRP /αμυλίνης υπεροικογένεια [10]. Αυτή η ομολογία επιτρέπει σημαντική διασταυρούμενη αντιδραστικότητα με τους υποδοχείς αυτών των άλλων πεπτιδίων, καθώς επίσης και με τον εαυτό της καλσιτονίνης. Οι δύο υποδοχείς έχουν ταυτοποιηθεί για την ADM: ADM-R1 και ADM-R2, τόσο σχηματίζεται από μια κοινή κύρια υπομονάδα και μία βοηθητική πρωτεΐνη. Η κύρια υπομονάδα είναι ο υποδοχέας καλσιτονίνη σαν υποδοχέα (CRLR)? η πρωτεΐνη εξάρτημα είναι ο υποδοχέας δραστηριότητα τροποποιητικά της πρωτεΐνης 2 (RAMP2) σε ADM-R1 και RAMP3 σε ADM-R2 [11].

Δεδομένου ότι ο καρκίνος των ωοθηκών είναι μια ασθένεια που εξαπλώνεται σε ένα περιβάλλον πλούσιο σε μακροφάγα, τα οποία πιστεύεται ότι είναι η κύρια πηγή παραγωγής ADM, σε αυτή τη μελέτη διερευνήσαμε το ρόλο της ADM ως αυξητικός παράγοντας για τα καρκινικά κύτταρα και ως παράγοντας διαμόρφωσης στα μακροφάγα. Αν και in vitro έχουμε παρατηρήσει μερική δραστηριότητά της ως παράγοντα προώθησης της ανάπτυξης των καρκινικών κυττάρων, σε μία αναδρομική κλινική μελέτη παρατηρήσαμε ότι τα υψηλά επίπεδα της ADM που συνδέονται με ένα θετικό αποτέλεσμα και σε καρκίνο με χαμηλή έκφραση του CA125.

τα κύτταρα στερήθηκαν για 36 ώρες με ή χωρίς προσθήκη ADM 100 ηΜ, συλλέχθηκαν μετά από 0 (Τ1), 4 (Τ2), 8 (Τ3), και 24 ώρες (Τ4), σταθερές, χρωματίστηκαν με ιωδιούχο προπίδιο και απέκτησε χρησιμοποιώντας ένα κυτταροφθορισμόμετρο . Τα δεδομένα αναλύθηκαν ως οικόπεδα ιστόγραμμα. Σχεδιάζοντας τον αριθμό των κυττάρων έναντι ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ) φθορισμό, το ποσοστό των κυττάρων σε κάθε φάση αξιολογήθηκε. Τα δεδομένα από Α2780 και τα κύτταρα OVCAR-3 μόνη εμφανίζεται ως ποσοστό της συνολικής G1 + G2 + S (Α-Β). Ο κυτταρικός θάνατος εκτιμήθηκε επίσης με ανάλυση του κατακερματισμού του DNA περιλαμβάνονται στην υπο-G

0/1 κορυφή (C-D). Η επίδραση της ADM επί του κυτταρικού κύκλου και σε κυτταρικό θάνατο δεν είναι ανιχνεύσιμη. Αυτό το πείραμα επαναλήφθηκε δύο φορές με παρόμοια αποτελέσματα.

Η

Αποτελέσματα

Η ADM είναι ένα ασθενές αυξητικός παράγοντας για τον καρκίνο των ωοθηκών κυττάρων Γραμμές

Για να αξιολογηθούν τα αποτελέσματα της ADM επί της ανάπτυξης καρκινικών κυτταρικών γραμμών ωοθηκών, OVCAR-3, OVCAR-EPO10, και Α2780 και πακλιταξέλη ανθεκτικά ομολόγους TC1 και TC3 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ανασυνδυασμένη ανθρώπινη ADM στις 1, 10, και 100 ηΜ συγκέντρωση για 72 ώρες. Μετά τη συγκομιδή, τα κύτταρα μετρήθηκαν. Μια μέτρια επίδραση στην κυτταρική ανάπτυξη παρατηρήθηκε σε ορισμένες κυτταρικές σειρές, όπως Α2780, TC1 και κύτταρα OVCAR-3 (Εικ. 1). Στη συνέχεια, η επίδραση επί του κυτταρικού κύκλου αναλύθηκε κατά την συμπλήρωση με εξωγενή ADM και ταυτόχρονη στέρηση ορού. Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 24 φρεατίων και στερήθηκαν ορού για 36 ώρες με ή χωρίς προσθήκη ADM 100 ηΜ. Μετά από 36 ώρες (Τ1), 5 × 10

5 κύτταρα από κάθε κατάσταση συλλέχθηκαν και ανάλυση του DNA έγινε. Για να εκτιμηθεί η ανάκτηση των κυττάρων, στα άλλα φρεάτια μέσο αντικαταστάθηκε με μέσο που περιείχε FBS. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν μετά από 4 (Τ2), 8 (Τ3), και 24 ώρες (Τ4), και πάλι η ανάλυση του DNA πραγματοποιήθηκε. Ποσοστό των κυττάρων σε κάθε φάση αξιολογήθηκε και αντιπροσωπευτικά δεδομένα παρουσιάζονται για Α2780 και OVCAR-3 κύτταρα (Σχ. 2Α-Β) και για ανθεκτικά σε φάρμακο αντίστοιχά τους A2780CIS και OVCAR-ΕΡΟ (Σχ. 3 Α-Β), οι οποίες είναι ανθεκτικά σε σισπλατίνη και patupilone, αντίστοιχα. Μια μέτρια αύξηση στην S φάση παρατηρήθηκε στα δείγματα που έλαβαν θεραπεία με την ADM. κατάτμηση του DNA, συμπεριλαμβανομένου του υπο-G

0/1 αιχμής, αξιολογήθηκε επίσης ως δείκτης κυτταρικού θανάτου (Σχ. 2 C-D, 3C-D). Η επίδραση της ADM επί του κυτταρικού θανάτου δεν ήταν ανιχνεύσιμη. Στο σύνολό τους, τα ευρήματα αυτά δείχνουν ότι η ADM έχει μέτρια ρόλο ως ανάπτυξη και παράγοντας επιβίωσης στις κυτταρικές σειρές καρκίνου των ωοθηκών αναλύθηκαν.

Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία όπως περιγράφεται στο Σχήμα 2. Δεν σχετικές επιδράσεις παρατηρήθηκαν σε αυτά τα 2 κυτταρική γραμμές από την άποψη της διαμόρφωσης των κυτταρικού κύκλου και του θανάτου που επάγεται από την ADM. Αυτό το πείραμα επαναλήφθηκε δύο φορές με παρόμοια αποτελέσματα.

Η

Α2780 και τα κύτταρα OVCAR-3 καλλιεργήθηκαν υπό συνθήκες υποξίας για 72 ώρες με ή χωρίς την προσθήκη 100 ηΜ ADM. RNA που εκχυλίζεται από σφαιρίδια κυττάρων αναλύθηκε με qPCR. Στο Α2780 κύτταρα, τα οποία είναι ευαίσθητα σε υποξία, η ADM και η ADM υποδοχείς προς τα κάτω σε υποξικές συνθήκες. Σε OVCAR-3 κύτταρα, τα οποία είναι λιγότερο ευαίσθητα στην υποξία, η ADM και η ADM υποδοχείς ρυθμίζεται αυξητικά (Α). Α2780, TC1, TC3, OVCAR-3, OVCAR και ΕΡΟ 10 κύτταρα καλλιεργήθηκαν όπως περιγράφεται παραπάνω και απαριθμήθηκαν. Η θεραπεία με την ADM δεν ρυθμίζουν την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών είτε σε κανονικό ή υποξικές συνθήκες, με την εξαίρεση ότι στο OVCAR ΕΡΟ 10 γραμμή υπήρχε ένα 2,4-πλάσια αύξηση της ανάπτυξης υπό συνθήκες υποξίας. Γονικών κυττάρων OVCAR-3 ευαισθητοποιήθηκαν στην υποξία από την ADM. Σε σύγκριση με τον έλεγχο ορθοξικές, υποξία μείωσε τον αριθμό των κυττάρων κατά 50% περίπου. Μπαρ και οι ράβδοι σφάλματος αναφέρονται σε μέση και SD των 2 ανεξάρτητων πειραμάτων που πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν.

Η

Η ADM είναι ένας εκλεκτικός Survival Factor

Η επίδραση της υποξίας διερευνήθηκε σε Α2780 και OVCAR-3 κύτταρα (Σχ. 4Α). Στο Α2780 κύτταρα, τα οποία είναι ευαίσθητα σε υποξία, η ADM και η ADM υποδοχείς προς τα κάτω σε υποξικές συνθήκες. Σε OVCAR-3, τα οποία είναι πιο ανθεκτικά στην υποξία, η ADM και η ADM υποδοχείς αυξητικά. Α2780, TC1, TC3, OVCAR-3, OVCAR και ΕΡΟ 10 καλλιεργήθηκαν σε συνθήκες υποξίας με ή χωρίς συμπλήρωση του ADM 100 ηΜ (Εικ. 4Β). Μεταξύ των αναλύθηκαν κυτταρικές σειρές, παρατηρήσαμε ότι μόνο για OVCAR ΕΡΟ 10 υπήρχε ένα 2,4 φορές αύξηση στην υποξικές συνθήκες με την παρουσία της ADM, μια διαφορετική συμπεριφορά από την γονική κυτταρική σειρά OVCAR-3, η οποία ADM φάνηκε να ευαισθητοποιηθούν υποξία, αφού παρατηρήθηκε μόνο το ήμισυ του αριθμού των κυττάρων σε σύγκριση με τον αριθμό που βρέθηκε στο δείγμα εκτίθεται σε υποξία χωρίς ADM. Δεν σχετικές μεταβολές ήταν ανιχνεύσιμες στα άλλα μοντέλα.

OVCAR-3 (Α), κύτταρα OVCAR EPO10 (Β), HEY (C), και HEY-EPO8 (D) καλλιεργήθηκαν σε συνθήκες στέρησης ορού (χωρίς FBS) για ένα κατάλληλο χρονικό διάστημα (που επιτρέπει μόνο περίπου 50% των κυττάρων να πολλαπλασιάζονται), με ή χωρίς προσθήκη ADM 50 ηΜ, 100 ηΜ και 500 ηΜ. Οι αριθμοί κυττάρων παρουσιάζονται ως το συνολικό αριθμό των κυττάρων. Είναι αξιοσημείωτο ότι η παρουσία της ADM δεν επηρέασε αισθητά την ανάπτυξη των κυττάρων. Κάθε σημείο δεδομένων και το λάθος γραμμή αναφέρεται σε μέση και SD των 2 ανεξάρτητων πειραμάτων που πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν.

Η

OVCAR-3 (Α), OVCAR EPO10 (Β), HEY (C), και HEY-EPO8 ( D) κυτταρικά εναιωρήματα από το πείραμα ασιτία ορού αραιώθηκαν και επιστρώθηκαν σε τρυβλία Petri σε 3 διαφορετικές επόμενο τουρνουά κυττάρων ανά δίσκο. Η επίδραση της ADM επί κλωνογόνων ικανότητα μετά από 14 ημέρες φαίνεται ως ο αριθμός των αποικιών. Μόνο ΗΕΥ κύτταρα έδειξαν κανένα συνεπές αποτέλεσμα της προστασίας από την πείνα ορού μετά τη θεραπεία ADM σε αυτή τη δοκιμασία, ενώ η εποθιλόνη ανθεκτικά αντίστοιχά τους παρουσίασαν το αντίθετο αποτέλεσμα. Bar και μπάρες σφάλματος αναφέρονται σε μέση και SD 2 ανεξάρτητων πειραμάτων πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν.

Η

Για να μελετηθεί η επίδραση των θεραπειών ADM σε ένα διαφορετικό μοντέλο στρες, τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 6-φρεατίων και ορό πεινασμένο. Μια περίοδος επώασης καθορίστηκε μετά από προκαταρκτικές δοκιμασίες (36 ώρες για σανού και OVCAR EPO10, 48 ώρες για τα ΗΕΥ EPO8, και 60 ώρες για τα OVCAR-3). Ορός συνθήκες πείνας και μόνο, χωρίς ADM, επαγόμενη τουλάχιστον το 50% της αναστολής της ανάπτυξης. ADM προστέθηκε σε 3 διαφορετικές συγκεντρώσεις (50 ηΜ, 100 ηΜ, και 500 ηΜ). Τα δεδομένα από τις δοκιμασίες πολλαπλασιασμού σε συνθήκες στέρησης ορού φαίνεται στο Σχήμα 5Α-D. Κύτταρα από κάθε δοκιμασία στη συνέχεια επιστρώθηκαν σε τρυβλία Petri σε 3 διαφορετικές κυτταρικές πυκνότητες σποράς ανά δίσκο (90, 180, και 360 κύτταρα σπάρθηκαν σε κάθε τρυβλίο για ΗΕΥ ΕΡΟ 8, OVCAR-3, και OVCAR EPO10? 150, 300, και 600 κύτταρα /τρυβλίο για ΗΕΥ) και οι αποικίες μετρήθηκαν μετά από 14 ημέρες. Όπως και με την υποξία, στέρηση ορού ήταν αποτελεσματική στη μείωση του αριθμού των κυττάρων σε βραχυπρόθεσμες δοκιμασίες ανάπτυξης 3 ημερών. Μια μέτρια, όχι στατιστικά σημαντική αύξηση παρατηρήθηκε όταν ADM προστέθηκε στη χαμηλότερη συγκέντρωση. Προκειμένου να εκτιμηθεί η παρουσία ενός προστατευτικού αποτελέσματος της ADM στην κλωνογονική διαμέρισμα, μετά από έκθεση σε ορό ασιτίας, τα κύτταρα τοποθετήθηκαν σε περιοριστικές αραιώσεις και οι αποικίες μετρήθηκαν μετά από 10-14 ημέρες (Σχ. 6A-D). Σε αυτόν τον προσδιορισμό, μόνο στα κύτταρα ΗΕΥ μια σταθερά προστατευτική επίδραση του ασιτία ορού παρατηρήθηκε με τη θεραπεία με την ADM, ενώ στους άλλους τύπους κυττάρων καταγράφηκαν αλλαγές. Στο σύνολό τους, τα ευρήματα αυτά έδειξαν ότι μόνο σε ορισμένες κυτταρικές γραμμές ήταν ADM ικανές να μεσολαβούν ανάπτυξης ή επιβίωσης.

τύπου 1 (Α) και τύπου 2 (Β) τα μακροφάγα υποβλήθηκαν σε αγωγή με ADM 1 ηΜ, 10 ηΜ, και 100 ηΜ για 72 ώρες και μετρήθηκαν. Οι μετρήσεις των κυττάρων εμφανίζεται ως απόλυτος αριθμός των κυττάρων. 2 κύτταρα Τύπος καλλιεργούνται παρουσία της ADM κατέληξε σε μια σειρά μέχρι και 3,8 φορές υψηλότερη από την καταμέτρηση για μη κατεργασμένα κύτταρα, ενώ ένα μικρότερο αύξηση μπορεί να παρατηρηθεί σε τύπου 1 μακροφάγα (1,3 φορές υψηλότερη με ADM 10 ηΜ). Έκφραση των ενδογενών ADM, IL-1β, IL6, IL8, IL12, TNFa, IFNγR, CCL22, ΤΟΡβ, IL10, και IL13Rα αξιολογήθηκε από qPCR (C) μετά από θεραπεία του τύπου 1 και τύπου 2 μακροφάγα με rhADM 100 ηΜ για 24 ώρες. Σε αμφότερους τους τύπους κυττάρων, ενδογενούς ADM, IL-12, και ΤΝΡ-α είναι ρυθμισμένη προς τα πάνω. IL-1β και IL8 ρυθμίστηκαν προς τα κάτω ενώ CCL22 ρυθμίζεται αυξητικά σε τύπου 2 μακροφάγα έναντι τύπου 1. Κανένα άλλες σχετικές διαφορές στην έκφραση των άλλων κυτοκινών, χημειοκινών και υποδοχέων παρατηρήσει. Μπαρ και οι ράβδοι σφάλματος αναφέρονται σε μέση και SD των 2 ανεξάρτητων πειραμάτων που πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν.

Η

ανάλυση Kaplan-Meier των 220 ασθενών με καρκίνο των ωοθηκών (Α) αποκάλυψε ότι τα υψηλά επίπεδα έκφρασης της ADM είχαν σχέση με ένα θετικό αποτέλεσμα από την άποψη του λειτουργικού συστήματος, αν και η διαφορά δεν ήταν στατιστικά σημαντική (

σ

= 0,07). Η ίδια ανάλυση, με τελικό καταληκτικό σημείο του PFS, έδειξε την ίδια τάση (Β), δηλαδή, οι ασθενείς με χαμηλότερη έκφραση της ADM υποτροπιάζον νωρίτερα από ό, τι τα άτομα με υψηλότερα επίπεδα (

σ

= 0,01). Η πολυπαραγοντική ανάλυση έδειξε ότι η ηλικία, το κλινικό στάδιο, histotype και ταξινόμησης δεν σχετίζονταν σημαντικά με την έκφραση της ADM, ενώ υπήρχε μια ισχυρή σημαντική αντίστροφη συσχέτιση (

σ

& lt? 0.001) μεταξύ των επιπέδων του CA125 και της έκφρασης ADM (C ). Επίσης, τα επίπεδα του γονιδίου PLK1, η οποία σχετίζεται με τον αριθμό των κυττάρων στην φάση Μ, ήταν σημαντικά μειωμένες στην ομάδα με χαμηλή έκφραση ADM (D).

Η

ADM Εμφανής μονοκυττάρων /μακροφάγων και Διάδοσης Διαφοροποίηση

Επειδή τα μακροφάγα είναι κεντρικής σημασίας για την παραγωγή του ADM στο στρώμα, τύπου 1 (Μ1) και τύπου 2 (Μ2) μακροφάγα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 3 διαφορετικές συγκεντρώσεις της ADM (1 ηΜ, 10 ηΜ και 100 ηΜ ) για 72 ώρες. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν με θρυψινοποίηση και μετρήθηκαν. Μ2 καλλιεργήθηκαν παρουσία της ADM κατέληξε σε καταμέτρηση μέχρι και 3,8 φορές υψηλότερη από την καταμέτρηση για μη κατεργασμένα κύτταρα, ενώ παρατηρήθηκε μικρότερη αύξηση στο Μ1 (1,3 με την ADM 10 ηΜ), υποδεικνύοντας ότι κατά κάποιο τρόπο η ADM ήταν σε θέση να διαμορφώνουν τη διαφοροποίηση μακροφάγων και πολλαπλασιασμό (Σχ. 7Α). Ως επιβεβαίωση της ικανότητας της ADM να διαμορφώνουν τη διαφοροποίηση μακροφάγων, Μ1 και Μ2 υποβλήθηκαν σε αγωγή με ADM 100 ηΜ για 24 ώρες. Γονιδιακή έκφραση της ADM, IL-1β, IL-6, IL-8, IL-12, TNFα, IFNR, CCL22, TGFβ, IL10, και IL13R αξιολογήθηκε μέσω qPCR. Προς τα πάνω ρύθμιση ενδογενούς ADM παρατηρήθηκε σε Μ1 και Μ2, όπως επίσης και προς τα πάνω ρύθμιση της IL-12 και ΤΝΡ-α (Εικ. 7Β), υποδεικνύοντας ότι η ADM ήταν σε θέση να ρυθμίζουν την έκφραση του σε μακροφάγα με αυτοκρινή τρόπο. Οι μόνες διαφορές που παρατηρούνται στην κυτοκίνη έκφραση /χημειοκινών σε απάντηση της ADM ήταν αρνητική ρύθμιση της IL-1β και IL-8 και προς τα πάνω ρύθμιση CCL22 στο Μ2 εναντίον M1.

Η

υψηλή έκφραση επίπεδα της ADM ήταν μια θετική Προγνωστικοί παράγοντα για καρκίνο των ωοθηκών ασθενείς

για να αποκτήσουν εικόνα για το ρόλο της ADM στον καρκίνο των ωοθηκών, μια κλινική ομάδα 220 ασθενών με καρκίνο των ωοθηκών αναλύθηκε αναδρομικά χρησιμοποιώντας ένα nanofluidic γενετικό αναλυτή και 48,48 τσιπ. ανάλυση CA125 και τα δείγματα των ασθενών συλλέχθηκαν κατά την πρώτη επέμβαση, πριν από κάθε θεραπεία. GAPDH χρησίμευσε ως γονίδιο οικοκυρική και τα αποτελέσματα κανονικοποιήθηκαν για τα επίπεδα έκφρασης ανιχνεύθηκαν σε OVCAR-3 κύτταρα. Η περιγραφή των ασθενών που συμμετείχαν σε αυτή τη μελέτη συνοψίζονται στον Πίνακα 1. Μια προκαταρκτική ανάλυση αποτελεσμάτων έγινε χρησιμοποιώντας τη μέθοδο Kaplan-Meier. Υψηλά επίπεδα έκφρασης της ADM φαίνεται να συνδέεται με την καλύτερη επιβίωση, αν και η διαφορά δεν ήταν στατιστικά σημαντική (

σ

= 0,07) (Εικ. 8Α). Η ίδια ανάλυση, με τελική απόληξη επιβίωση χωρίς εξέλιξη της νόσου (PFS), αποκάλυψε την ίδια τάση (Εικ. 8Β), με τους ασθενείς που έχουν χαμηλότερη έκφραση της ADM υποτροπιάζουσας νωρίτερα από ό, τι τα άτομα με υψηλότερα επίπεδα (

σ

= 0,01 ). Προκειμένου να αποκτήσουν γνώσεις σε αυτά τα ευρήματα, που απασχολούνται πολυπαραγοντική ανάλυση για την αξιολόγηση αυτών των κλινικών παραμέτρων που σχετίζονται με την ADM έκφρασης. Spearmans συσχέτιση χρησιμοποιήθηκε για την εκτίμηση των σχέσεων μεταξύ της ADM, CA125, και την ηλικία λαμβάνεται ως συνεχείς μεταβλητές. Δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές συσχετίσεις παρατηρήθηκαν μεταξύ της ADM και την ηλικία (

ρ

= -0,008,

σ

= 0,91) και CA125 και την ηλικία

(ρ

= -0,139,

p

= 0.17), ενώ μια σημαντική αντίστροφη συσχέτιση βρέθηκε μεταξύ CA125 και ADM (

ρ

= -0,23,

σ

= 0,003). τιμές ADM αναλύθηκαν επίσης με ιστολογικό τύπο και το στάδιο της νόσου με τη χρήση του τεστ Kruskal-Wallis. έκφραση ADM δεν άλλαξε σε σύγκριση μεταξύ histotypes (χ

2 = 5.14,

σ

= 0,39) ή το κλινικό στάδιο (χ

2 = 3,94,

σ

= 0,14) . Όταν οι ασθενείς κατανεμήθηκαν σε υψηλά και χαμηλά επίπεδα έκφρασης, υπήρχε και πάλι μια σημαντική αντίστροφη συσχέτιση (χ

2 = 10,7,

σ

& lt? 0,01) μεταξύ των επιπέδων του CA125 και της έκφρασης ADM (Εικ. 8C) . Αυτά τα δεδομένα προτείνουν ότι οι όγκοι με χαμηλότερη έκφραση του ADM έχουν μεγαλύτερη μάζα από εκείνους με υψηλότερη έκφραση ADM. Σύμφωνα με αυτή την υπόθεση, τα επίπεδα της PLK1-παράγοντα σχετίζεται με τον αριθμό των κυττάρων σε Μ φάση-μειώθηκαν επίσης σημαντικά (χ

2 = 4,6,

σ

= 0,03) στην ομάδα με χαμηλή έκφραση ADM (Σχ. 8D). Τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν ότι η υψηλή έκφραση της ADM ασκεί ανάπτυξης κατασταλτική επίδραση σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών και συνδέεται με θετικό αποτέλεσμα. Για να εκτιμηθεί αυτή η υπόθεση, Cox μονοπαραγοντική ανάλυση, η οποία έλαβε υπόψη το κλινικό στάδιο, histotype, την ηλικία, το CA125, η ADM και PLK1 (τα τελευταία 4 παράμετροι ελήφθησαν ως συνεχείς μεταβλητές) πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας τόσο το λειτουργικό σύστημα και PFS ως μεταβλητές για το αποτέλεσμα (Πίνακας 2). επιλέχθηκαν οι μεταβλητές σε θέση να προβλέψει την έκβαση σε μονοπαραγοντική ανάλυση για να εκτελέσει Cox πολυπαραγοντική ανάλυση. Όπως αναφέρθηκε προηγουμένως [12], το κλινικό στάδιο ήταν η πιο σημαντική μεταβλητή για να προβλέψει τον κίνδυνο θανάτου σε ασθενείς με καρκίνο των ωοθηκών. Το γεγονός αυτό ήταν εμφανές τόσο OS και ανάλυση PFS στη μονοπαραγοντική και πολυπαραγοντική ανάλυση. Η ενδομητριοειδές histotype ήταν ένα χαρακτηριστικό των ασθενών με ένα καλύτερο λειτουργικό σύστημα και PFS στη μονοπαραγοντική ανάλυση, μια επίδραση που διατηρείται σε πολυπαραγοντική ανάλυση για το OS. Υψηλά επίπεδα έκφρασης της ADM είχαν σχέση με την καλύτερη OS και PFS. Αυτό το φαινόμενο, αν και μέτρια από άποψη κινδύνου, διατηρήθηκε σε τόσο μονοπαραγοντική και πολυπαραγοντική ανάλυση, υποστηρίζουν την υπόθεση ότι υψηλά επίπεδα έκφρασης της ADM είναι προγνωστικά της θετικής έκβασης σε ασθενείς με καρκίνο των ωοθηκών.

Η

Συζήτηση

Ισχυρή προκλινικές και μεταφραστική μελέτες υποστηρίζουν την υπόθεση ότι τα συστατικά στρωματικά διαδραματίζουν κεντρικό ρόλο στην προώθηση μια επιθετική φαινότυπο όγκου. Σε αυτό το πλαίσιο, η ADM είναι μια πανταχού παρούσα κανονιστική πεπτίδιο με πολλές βιολογικές λειτουργίες, όπως αγγειακή δράση, τα αποτελέσματα διεγέρσεως αναπτύξεως και η δραστηριότητα του ανοσοποιητικού-διαμόρφωσης. ADM εκφράζεται έντονα σε μια ποικιλία κακοηθειών όπως γλοιοβλάστωμα [13], σαφής-κυττάρων νεφρικού καρκινώματος [14] και τον καρκίνο του παγκρέατος [15]. Σε όλες αυτές τις ασθένειες ADM έχει θεωρηθεί ένας βιοδείκτης της κακής έκβασης. Αυτό το χαρακτηριστικό της ADM έχει αποδοθεί κυρίως στην μιτογονική ιδιότητες και την ικανότητά της να λειτουργήσει ως ένας παράγοντας επιβίωσης που προκαλείται από υποξία. Μαζί με άμεσες επιπτώσεις του στην επιβίωση των καρκινικών κυττάρων », ένας επιπλέον παράγοντας στην επιθετικότητα του όγκου συνίσταται στην ικανότητα της ADM να διεγείρουν την αγγειογένεση μέσα στον όγκο. Αυτός ο μηχανισμός φαίνεται ιδιαίτερα σημαντικό σε σαφή κυττάρων νεφρικού καρκινώματος, μια ασθένεια που χαρακτηρίζεται από ενταθεί αγγείωση εντός του όγκου [16]. Ελάχιστες αναφορές υπάρχουν για το αν αυτό το φαινόμενο συμβαίνει στον καρκίνο των ωοθηκών και για την ακριβή λειτουργία της ADM σε αυτή την ασθένεια. Σε μια μικρή κλινική ρύθμιση των 60 ασθενών με καρκίνο των ωοθηκών, χρησιμοποιώντας nonquantitative PCR ανάλυση, το 2000 Hata και οι συνεργάτες του ανέφεραν ότι η ADM ήταν ένας παράγοντας πρόβλεψης της κακής έκβασης [17]. Εκτός από την έκθεση αυτή, καμία άλλη μεταφραστική μελέτες ασχολήθηκε με το ρόλο της ADM στον καρκίνο των ωοθηκών. Οι επιδράσεις της ADM επί καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών σε καλλιέργειες in vitro είναι αμφιλεγόμενη. Giacalone και συνεργάτες ανέφεραν ότι η ADM δεν ήταν σε θέση να διεγείρει την ανάπτυξη των κυττάρων σε BG-1, PEO4 και PEO14 καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών [18]. Αντιστρόφως, μια πρόσφατη μελέτη ανέφερε ότι αποσιώπηση του γονιδίου ADM σε HO8910 ωοθηκών καρκινικά κύτταρα συνοδεύεται από αναστολή της ανάπτυξης και Χημειοευαισθητοποίηση μέσω μειορύθμιση της ERK και της έκφρασης bcl-2 [19]. Αυτά τα ευρήματα μας ώθησε να ερευνήσει εάν ADM είναι ένας μιτογόνος παράγοντας επιβίωσης σε ένα πάνελ καρκινικών κυττάρων που εμφανίζουν διάφορους βαθμούς ανθεκτικότητας στα φάρμακα. In vitro ανάλυση έδειξε ότι η ADM έδειξαν ελάχιστη δραστικότητα ως αυξητικός παράγοντας, μια επίδραση που ποικίλει ανάλογα με κυτταρική γραμμή, με μια μέτρια αύξηση κυττάρων στη φάση S του κυτταρικού κύκλου. Η δραστικότητα του ADM ως παράγοντας επιβίωσης ήταν σημαντικά διαφοροποιηθεί ανάλογα με την κυτταρική σειρά. Σε Hey κύτταρα, μετά ασιτία ορού υπήρξε μια συνεπής αύξηση στον αριθμό των κυττάρων που μπορούν να επιβιώσουν και να σχηματίζουν αποικίες, ενώ σε άλλες κυτταρικές μοντέλα ένα τέτοιο αποτέλεσμα ήταν μόλις ανιχνεύσιμη. Ακραία μεταβλητότητα παρατηρήθηκε επίσης σε σχέση με την απόκριση σε υποξία. Σε αυτή την απόκριση σημειώσαμε μία μείωση στην έκφραση της ADM και των υποδοχέων της σε κύτταρα ευαίσθητα σε υποξία, όπως Α2780, ενώ σε OVCAR-3 παρατηρήθηκαν οι αντίθετες τάσεις. Με το συνδυασμό των αποτελεσμάτων που αναφέρονται στη βιβλιογραφία και τα δικά μας συμπεράσματα καταλήξαμε στο συμπέρασμα ότι η ADM ασκεί μέτρια επίδραση ως ανάπτυξη και παράγοντα επιβίωσης στα καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών, με την ακραία μεταβλητότητα ανάλογα με το μοντέλο κυττάρων που αναλύθηκαν.

Μια πρόσφατη έκθεση για το μελάνωμα πρότεινε ότι η κύρια πηγή της ADM είναι τα μακροφάγα [6]. Προκειμένου να επαληθεύσει μια τέτοια υπόθεση, εξετάσαμε την ικανότητα της ADM για την τόνωση της ανάπτυξης της πολωμένο Μ1 και Μ2 μακροφάγα. ADM ήταν σε θέση να ρυθμίζουν την παραγωγή τους με αυτοκρινή τρόπο και επιλεκτικά ενισχυμένη τον πολλαπλασιασμό των Μ2, η οποία έχει μια χαμηλή IL-12 /υψηλή IL-10 φαινότυπο, και η οποία εμφάνισε εξασθενημένη έκφραση των ενδιαμέσων αντιδραστικών άζωτο, κατώτερο παρουσίαση αντιγόνου και ογκοκτόνο ικανότητα, και υψηλή έκφραση αγγειογόνων παραγόντων όπως VEGF, EGF, και σημαφορίνης 4D [20]. Υψηλή έκφραση του Μ2 ως εκ τούτου γενικά συνδέεται με ένα ανοσοποιητικό περιβάλλον που καθιστά τον καρκίνο περισσότερο επιθετική.

Παρά αυτά τα in vitro ευρήματα, μεταφραστική μελέτη μας έδειξε, αναπάντεχα, ότι οι ασθενείς με υψηλότερη έκφραση του γονιδίου ADM έτειναν να έχουν μεγαλύτερο PFS και ένα καλύτερο αποτέλεσμα. Σημειώσαμε, ειδικότερα, ένας αντίστροφος συσχετισμός μεταξύ των επιπέδων έκφρασης του ADM και CA125 μετρήθηκε κατά το χρόνο της πρώτης χειρουργικής επέμβασης. Είναι κοινώς αποδεκτό ότι CA125 είναι ένας δείκτης για τον όγκο του όγκου. Στον καρκίνο των ωοθηκών που ανταποκρίνεται στη θεραπεία, η μείωση στην έκφραση του CA125 είναι αξιοσημείωτη. Οι όγκοι που χαρακτηρίζονται από χαμηλά επίπεδα της ADM εμφανίζουν επίσης υψηλότερη έκφραση του PLK1, δείκτης της μιτωτικής δραστηριότητας. Ως εκ τούτου, φαίνεται πιθανό ότι, σε ασθενείς, η ADM ασκεί, άμεσα ή έμμεσα, μια αύξηση-κατασταλτική επίδραση, με μείωση των κυττάρων στη φάση Μ του κυτταρικού κύκλου που προτείνεται από την έκφραση της PLK1. Σε ένα μεγάλο αριθμό μελετών, η κύρια επίδραση παρατηρήθηκε για τα κύτταρα in vivo ADM-διεγερμένα ήταν μια αύξηση στα οΑΜΡ (που επισκοπείται στο [8]). Παράγοντες που αυξάνουν cAMP στα καρκινικά κύτταρα έχουν συχνά σχετίζεται με την αναστολή του πολλαπλασιασμού των κυττάρων [21], και αρκετά φάρμακα ικανά να μιμούνται cAMP είναι σε κλινική ανάπτυξη ως αντικαρκινικών παραγόντων [22]. Μαζί με μια άμεση επίδραση σε καρκινικά κύτταρα μέσω cAMP, είναι επίσης πιθανό ότι οι ασθενείς με υψηλότερα επίπεδα ADM έκθεμα όγκων με καλύτερη αγγείωση, όπως καταδεικνύεται με σαφή-κυττάρων νεφρικού καρκινώματος [16]. Δεδομένου ότι ο καρκίνος των ωοθηκών είναι μια νόσο ευαίσθητη ασθένεια στους περισσότερους ασθενείς [12] μπορούμε να υποθέσουμε ότι η συγκέντρωση ιστού χημειοθεραπευτικών αυξάνεται όταν τα επίπεδα της ADM είναι αυξημένα, οδηγώντας σε καλύτερο έλεγχο της νόσου και ένα διάστημα μεγαλύτερο ελεύθερη νόσου.

συνοπτικά, αυτή η μελέτη έδειξε ότι αν και η ADM μπορούν να συμπεριφέρονται ως αυξητικός παράγοντας /επιβίωση in vitro, και ως ένας παράγοντας ικανός να διεγείρει εκλεκτικά Μ2 πόλωση, αυτές οι ιδιότητες δεν επιβεβαιώθηκαν σε ασθενείς. Ως εκ τούτου, αυτή η μελέτη δεν υποστηρίζει τη χρήση των ανταγωνιστών της ADM ως εργαλείο για τη βελτίωση της διαχείρισης των ασθενών με καρκίνο των ωοθηκών.

Υλικά και Μέθοδοι

Γραμμές κυττάρων και αντιδραστήρια

Α2780 και OVCAR-3 κύτταρα γραμμές ελήφθησαν από την ATCC. Α2780 είναι ένα ανθρώπινο κυτταρική σειρά καρκίνου των ωοθηκών που προέρχεται από τον ιστό του όγκου του με τη μη ασθενή. Α2780 TC1 και TC3 Α2780 είναι πακλιταξέλη ανθεκτικές κυτταρικές σειρές που προέρχονται από Α2780 μετά από παρατεταμένη θεραπεία με κυκλοσπορίνη και πακλιταξέλη (ευγενώς από Indena). OVCAR EPO10 και HEY EPO8 είναι ανθεκτικών κυτταρικών σειρών που λαμβάνονται από OVCAR-3 εποθιλόνη Β (ΕροΒ) και hey, αντίστοιχα, μετά από παρατεταμένη θεραπεία με ΕροΒ. Όλες αυτές οι κυτταρικές σειρές έχουν περιγραφεί προηγουμένως [23]. Οι κυτταρικές γραμμές καλλιεργήθηκαν υπό πρότυπες συνθήκες (37 ° C, 5% CO

2) σε RPMI 1640 με γλουταμίνη συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου βοός (FBS), 0,1 mM ΜΕΜ μη απαραίτητα αμινοξέα και 0,1 mg /ml καναμυκίνη. Όλα τα αντιδραστήρια αγοράστηκαν από την Sigma-Aldrich, εάν δεν έχουν καθοριστεί άλλους προμηθευτές. Πειράματα σε υποξία διεξήχθησαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [24].

Παρασκευή Μακροφάγων Primary Cultures

Lymphomonocytes απομονώθηκαν από το φλεγμονώδη πλακούντα ενός υγιούς δότη με φυγοκέντριση κλίσης πυκνότητας, χρησιμοποιώντας Histopaque-1077 (Sigma -Aldrich) και επαναιωρήθηκαν σε RPMI 1640 συμπληρωμένο με 10% ανθρώπινο ορό ΑΒ (Sigma-Aldrich), 100 IU /ml πενικιλλίνη και 100 μg /ml στρεπτομυκίνη (GIBCO). Περίπου 10

7 lymphomonocytes ανά φρεάτιο εμβολιάστηκαν σε 6-φρεατίων πρωτογενή πλάκες καλλιέργειας (BD Falcon) και επωάστηκαν στους 37 ° C 5% CO

2 επί 2 ώρες για να επιτραπεί μονοκύτταρα (10% έως 30%) για να προσκολληθούν στον πυθμένα των φρεατίων. Προστέθηκε για να επιτρέψει τα μονοκύτταρα να διαφοροποιηθούν προς τύπου 1 και τύπου 2 μακροφάγων, αντίστοιχα? φρέσκο ​​μέσο καλλιέργειας που περιέχει είτε 50 ng /ml ανασυνδυασμένου ανθρώπινου GM-CSF ή 50 ng /ml ανασυνδυασμένου ανθρώπινου M-CSF (D Systems Ρ &). Τύπου 1 και τύπου 2 μακροφάγα υποβάλλονται σε αγωγή με ανασυνδυασμένη ανθρώπινη ADM (Sigma-Aldrich), στη συνέχεια πλύθηκε δύο φορές με προθερμασμένο PBS. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν σε αποστειρωμένα σωληνάρια και φυγοκεντράται για εξαγωγή RNA ή υπολογίζονται για ανάλυση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού.

RNA Εκχύλιση και αντίστροφη μεταγραφή-αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR)

Ολικό RNA εξήχθη από 1-3 × 10

6 κύτταρα χρησιμοποιώντας το σύστημα BioRobot EZ1 (Qiagen) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Για αντίστροφη μεταγραφή, χρησιμοποιήθηκε η iScript

κιτ σύνθεσης cDNA TM (Biorad). ανάλυση qPCR διεξήχθη με τη χρήση του iQ ™ SYBR

® Πράσινο Supermix και το σύστημα ανίχνευσης DNA Engine Opticon 2 (Biorad). Γλυκεραλδεΰδη αφυδρογονάση 3-φωσφορικής (GAPDH) χρησιμοποιήθηκε ως γονίδιο καθαριότητας. Οι αλληλουχίες των ολιγονουκλεοτιδίων εκκινητή που παρατίθενται στον Πίνακα 3.

Κύκλου Κυττάρου Ανάλυση

Ο καρκίνος των ωοθηκών κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 24-φρεατίων σε 1-5 × 10

4 κύτταρα /φρεάτιο. Σε ορισμένες συνθήκες τα κύτταρα στερήθηκαν τροφής (στερηθεί εμβρυϊκό βόειο ορό, ή FBS) παρουσία της ADM 100 ηΜ. Οι έλεγχοι που αντιπροσωπεύεται από κύτταρα λιμοκτονούν, χωρίς την προσθήκη ADM (αρνητικός έλεγχος) και από κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε πλήρες μέσο (θετικός έλεγχος). Μετά από 36 ώρες (Τ1), 5 × 10

5 κυττάρων από κάθε συνθήκη συλλέχθηκαν με θρυψινοποίηση, συλλέγονται σε κυτταρομετρία ροής σωλήνες, και να επισημαίνονται όπως περιγράφηκε προηγουμένως [25]. Κάθε δείγμα αποκτήθηκε χρησιμοποιώντας το Κυτταρόμετρο Ροής Cytomics ™ (Beckman Coulter).

Κυτταρικού Πολλαπλασιασμού Δοκιμασίες

ωοθηκών καρκινικά κύτταρα σε μέσο καλλιέργειας εμβολιάστηκαν σε πλάκες 6-φρεατίων σε προκαθορισμένη βέλτιστη κυτταρικές πυκνότητες (HEY : 6 × 10

4 /καλά? Α2780, Α2780 TC1, Α2780 TC3 και OVCAR EPO10: 8 × 10

4 /καλά? OVCAR-3 και HEY EPO8: 10

5 /καλά). Η ανασυνδυασμένη ανθρώπινη ADM προστέθηκε στο μέσο μετά από προσκόλληση των κυττάρων στον πυθμένα των φρεατίων. Μετά από 72 ώρες, επιπλέοντα κύτταρα στο υπερκείμενο συλλέχθηκαν. Τα προσκολλημένα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με θρυψίνη-ΕϋΤΑ και συλλέγονται, μαζί με τα αντίστοιχα υπερκείμενα τους. Σύνολο μετρήσεις κυττάρων πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας αιμοκυτόμετρο (Burker θάλαμος, Nalgene). Υποξικές συνθήκες διεξήχθησαν με επώαση των κυττάρων σε ένα θάλαμο Billrop.

Σε μερικά πειράματα, Hey, Hey EPO8, κύτταρα OVCAR και OVCAR EPO10 καλλιεργήθηκαν υπό συνθήκες πείνας (χωρίς FBS) για προκαθορισμένους χρόνους, με ή χωρίς την προσθήκη ADM. Ο θετικός μάρτυρας αποτελείτο από κύτταρα που καλλιεργούνται σε πλήρες μέσο.

τύπου 1 και τύπου 2 μακροφάγα υποβλήθηκαν σε θεραπεία με rhADM για 72 ώρες, μετά συλλέχθηκαν μετά από αγωγή με θρυψίνη-ΕϋΤΑ και μετρήθηκαν σε ένα θάλαμο Burker.

κλωνογενείς δοκιμασίες

Μετά την καταμέτρηση OVCAR-3, τα κύτταρα OVCAR EPO10, HEY, HEY και EPO8 από πειράματα στέρηση ορού, κάθε κυτταρικό εναιώρημα αραιώνεται σε FBS που περιέχει μέτρια έως πολύ χαμηλές πυκνότητες κυττάρων. Για OVCAR-3, OVCAR EPO10, και ΗΕΥ EPO8, κάθε διάλυμα αραιώθηκε σε 36, 18, και 9 κύτταρα /ml, δείγματα από κάθε κυτταρικό εναιώρημα κατόπιν 10-ml τοποθετήθηκαν σε τρυβλία Petri, έτσι ώστε φρεάτια συμπληρωθεί με 360, 180