Αφηρημένο

ηπαρινάσης είναι μια ενδογλυκοσιδάση ένζυμο που υπάρχει σε ενεργοποιημένα λευκοκύτταρα, μαστοκύτταρα, πλακούντα ιστών, ουδετερόφιλα και μακροφάγα, και συμμετέχει σε μετάσταση όγκου και εισβολή ιστού. Παρουσιάζει ένα πιθανός στόχος για θεραπείες καρκίνου και διαφόρων μορίων έχουν αναπτυχθεί σε μια προσπάθεια να αναστέλλουν την ενζυματική δράση της ηπαρινάσης. Σε μία προσπάθεια να αναπτυχθεί μια νέα θεραπευτική με ένα σχετικό διαγνωστικό προσδιορισμό, έχουμε περιγράψει προηγουμένως απταμερή υψηλή συγγένεια επιλέγονται έναντι ηπαρινάσης. Σε αυτήν την εργασία, αποδείξαμε ότι αυτά τα αντι-ηπαρινάσης απταμερή είναι ικανά να αναστέλλουν την εισβολή ιστών από καρκινικά κύτταρα που σχετίζονται με τον καρκίνο του στόματος και επαλήθευσε ότι τέτοια αναστολή οφείλεται στην αναστολή του ενζύμου και δεν οφείλεται σε άλλους δυνητικά κυτταροτοξικά αποτελέσματα των απταμερών. Επιπλέον, έχουμε εντοπίσει μια σύντομη 30 βάσεις απταμερούς ως πιθανό υποψήφιο για περαιτέρω μελέτες, όπως αυτό έδειξε μια υψηλότερη ικανότητα να αναστέλλουν την εισβολή ιστών από πλέον ομόλογό του, καθώς και ένα μειωμένο δυναμικό για σχηματισμό συμπλόκου με άλλες μη-ειδικές πρωτεΐνες ορού. Τέλος, το απταμερές βρέθηκε να είναι σταθερό και συνεπώς είναι κατάλληλο για χρήση στην ανθρώπινη μοντέλα, όπως έδειξε καμία αποικοδόμηση με την παρουσία ανθρώπινου ορού, καθιστώντας το ένα πιθανό υποψήφιο για τόσο διαγνωστική και θεραπευτική χρήση

Citation.: Simmons SC, Jämsä Η Silva D, Κορτέζ CM, McKenzie ΕΑ, Bitu CC, et al. (2014) Αντι-ηπαρινάσης απταμερή ως πιθανοί Διαγνωστικό και Θεραπευτικό παράγοντες για τον καρκίνο του στόματος. PLoS ONE 9 (10): e96846. doi: 10.1371 /journal.pone.0096846

Επιμέλεια: Σοφία Ν Καραγιάννης, King College του Λονδίνου, Ηνωμένο Βασίλειο

Ελήφθη: 27 του Σεπτεμβρίου 2013? Αποδεκτές: 11 Απρ 2014? Δημοσιεύθηκε: 8 Οκτ 2014

Copyright: © 2014 Simmons et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση: Δρ. Bonacossa υποστηρίχθηκε από μια μετα-διδακτορική υποτροφία από Conselho Nacional de Pesquisa Científica – CNPq, σχετικά με το πεδίο της επιστήμης προγράμματος χωρίς Σύνορα, MCTI, Βραζιλία. Ο Δρ Μισαηλίδης θα ήθελα να αναγνωρίσω την οικονομική στήριξη από Conselho Nacional de Pesquisa Científica – CNPq, σχετικά με το πεδίο εφαρμογής του ανώτερου πρόγραμμα επισκέψεων ερευνητής στο Fiocruz για μέρος αυτού του έργου. Η ερευνητική ομάδα του καθηγητή Salo υποστηρίχθηκε από την Ακαδημία της Φινλανδίας, της φινλανδικής Οργανώσεις Καρκίνου, φινλανδική Οδοντιατρικής Εταιρείας Απολλωνία και τη χορήγηση Πανεπιστήμιο του Oulu Νοσοκομείο KEVO. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ηπαρινάσης είναι ένα ένζυμο β-1,4-ενδογλυκοσιδάση [1], που συμμετέχει στην εξωκυττάρια μήτρα (ECM) υποβάθμιση και την αναδιαμόρφωση [1]. Το γονίδιο ηπαρινάσης κλωνοποιήθηκε για πρώτη φορά το 1999 από τις ομάδες Vlodavsky και Ενοριακά στο σπερματικό πλάτη με πλάτη έγγραφα ιατρικής φύσης [2], [3].

Η εκκολαπτόμενη πολυπεπτίδιο είναι ένα προ-προ-ένζυμο 543 αμινοξέων, η οποία μετά την απομάκρυνση της αλληλουχίας πεπτιδίου σήματος στο ενδοπλασμικό δίκτυο, υφίσταται πρωτεολυτική επεξεργασία στα τέλη ενδοσώματα /λυσοσώματα από την καθεψίνη-L πρωτεασών [4] σε θέσεις Glu109-Ser110 και Gln157-Lys158, αποδίδοντας ένα Ν-τερματικό 8 πολυπεπτίδιο kDa, ένα C τερματική 50 πολυπεπτίδιο kDa και μεταξύ αυτών ένα 6 kDa συνδέτης πολυπεπτιδίου [3]. Τα πολυπεπτίδια 50 και 8 kDa συνδέουν για να σχηματίσουν ένα ετεροδιμερικό ενεργό ένζυμο, ενώ ο συνδετήρας 6 kDa αποκόπτεται και αποικοδομείται [5], [6].

δραστικότητα ηπαρινάσης σχετίζεται με ενεργοποιημένα λευκοκύτταρα, μαστοκύτταρα, ιστό πλακούντα και τα μακροφάγα και το ένζυμο εκκρίνεται από ενεργοποιημένα CD4 + Τ κύτταρα [7], [8], [9], τα αιμοπετάλια [3], ουδετερόφιλα και μεταστατικά κύτταρα [10]. Μετά την έκκριση του ηπαρινάσης από μεταστατικά κύτταρα όγκου, το ένζυμο υδρολύει τις γλυκοσιδικούς δεσμούς του ηπαράνης αλυσίδων θειικής συνδέεται με πρωτεογλυκάνες σε ένα προϊόν του 10-20 μονάδες σακχάρου στο μήκος [11], που οδηγεί στην διείσδυση των ενδοθηλιακών κυττάρων των αιμοφόρων αγγείων και οργάνων-στόχων από το κύτταρο του όγκου. Απελευθέρωση της δεσμευμένης κυτοκινών και αυξητικών παραγόντων απομονωμένος από ηπαράνης αλυσίδες θειικής σε ιστούς [12] διευκολύνει περαιτέρω ανάπτυξη του όγκου και προάγει την αγγειογένεση και τον πολλαπλασιασμό των δευτερογενών όγκων [13]. Τα επίπεδα της έκφρασης ηπαρινάσης σε καρκινικά κύτταρα συσχετίζεται με μεταστατικό δυναμικό τους? έχουν αυξημένα επίπεδα του mRNA και της πρωτεΐνης ηπαρινάσης έχουν βρεθεί σε ασθενείς με καρκίνο οι οποίοι εμφανίζουν σημαντικά μικρότερη μετεγχειρητική φορές επιβίωση από τους ασθενείς των οποίων τα επίπεδα ηπαρινάσης είναι φυσιολογικά [13], [14].

ηπαρινάσης προς τα πάνω ρύθμιση σε καρκινικά κύτταρα από μυέλωμα, λεμφοβλαστοειδή και του καρκίνου του μαστού αντικατοπτρίζει αύξηση της έκκρισης εξωσωμάτων με αυξημένη περιεκτικότητα του syndecan-1, VEGF και HGF των οποίων οι ρόλοι είναι στενά συνδεδεμένα με την επιθετικότητα του όγκου [15]. Εκτός από τη λειτουργία του στην εξέλιξη του καρκίνου, ηπαρινάσης ένζυμο παίζει επίσης σημαντικό ρόλο στη φλεγμονή

per se

και καρκινογένεση που σχετίζονται με την φλεγμονώδη διαδικασία [16]. Το ένζυμο έχει ανιχνευθεί σε μία ποικιλία κυττάρων του ανοσοποιητικού συμπεριλαμβανομένων των Τ και Β κύτταρα, μακροφάγα, ουδετερόφιλα και ιστιοκύτταρα. Έχει δειχθεί ότι μεσολαβεί εξαγγείωση διαμέσου του ενδοθηλιακού φραγμού μέσω της αναδιαμόρφωσης της θειικής ηπαράνης ECM, η οποία επιτρέπει στη συνέχεια την εμπορία στις θέσεις φλεγμονής [10], [17], [18]. έκφραση ηπαρινάσης έχει συνδεθεί με ογκογένεση σε έναν αριθμό διαφορετικών καρκίνων, για παράδειγμα, οξεία μυελογενή λευχαιμία [19], της ουροδόχου κύστης, του εγκεφάλου [20], του μαστού [21], του παχέος εντέρου [22], γαστρικό [23], του οισοφάγου [24] , από του στόματος [25], παγκρεατικό [14], και του καρκίνου του τραχήλου [26], υποδηλώνοντας ότι μπορεί να είναι ένας κατάλληλος στόχος για φαρμακευτική θεραπεία. Επί του παρόντος διαθέσιμοι αναστολείς της ηπαρινάσης περιλαμβάνουν αντισώματα εξουδετέρωσης [27], τα πεπτίδια [28] και μικρά μόρια [29], [30].

Ένας αριθμός τροποποιημένων ηπαρινών και θειωμένα ολιγοσακχαρίτες έχουν επίσης δειχθεί ότι είναι ισχυροί αναστολείς ηπαρανάσης με πολλά υποσχόμενες δραστηριότητες αντι-όγκου και έχουν πλέον προχωρήσει σε όλα τα στάδια των κλινικών δοκιμών. Παραδείγματα αυτών περιλαμβάνουν SST0001, M402, PI-88 και PG545. SST0001 είναι ένα πλήρως Ν-ακετυλιωμένη τροποποιημένη ηπαρίνη που στερείται αντι-πηκτική δραστικότητα και φαίνεται ότι είναι ένας εκλεκτικός αναστολέας ηπαρινάσης. Είναι επί του παρόντος στη Φάση Ι /ΙΙ κλινικές δοκιμές για τη θεραπεία των ασθενών με μυέλωμα. M402 είναι ένας Ν-θειωμένη τροποποιημένη ηπαρίνη που δεσμεύει ένα ευρύτερο φάσμα των αυξητικών παραγόντων σε σύγκριση με SST0001. Αυτό έχει προχωρήσει σε Φάσης Ι /ΙΙ κλινικές δοκιμές ως θεραπεία συνδυασμού με την γεμσιταβίνη χημειοθεραπευτικό παράγοντα για τη θεραπεία του μεταστατικού καρκίνου του παγκρέατος. PI-88 είναι ένα θειωμένα πολυσακχαρίτη με ισχυρή αντι-αγγειογενετική και αντι-μεταστατική δραστηριότητα και με μειωμένη ανεπιθύμητα αντιπηκτική δράση. Έχει φτάσει Φάσης III κλινικές δοκιμές για ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα μετα-εκτομή. PG545 είναι μια τετρασακχαρίτη που έχει ανώτερες φαρμακοκινητικές ιδιότητες λόγω του υψηλού βαθμού της λιποφιλικότητας. Έχει δείξει ισχυρή δράση κατά των όγκων σε ανθεκτικούς PI88 μοντέλα, ωστόσο, Φάση Ι των κλινικών δοκιμών στα τέλη του 2010 εγκαταλείφθηκαν εξαιτίας απρόσμενων αντιδράσεων στο σημείο της ένεσης [31].

Τα απταμερή αναπτύσσονται σύντομο DNA ή RNA ολιγονουκλεοτίδια για διαγνωστικούς και θεραπευτική χρήση που εμφανίζουν υψηλή συγγένεια σύνδεσης και ειδικότητα για τα μόρια-στόχους [32] – [34]. Η συγγένεια των απταμερών έχει συγκριθεί με εκείνη των αντισωμάτων (δηλαδή στην κλίμακα nanomolar), αλλά ως απταμερή είναι μικρότερα (8-25 kDa σε σχέση με το μέγεθος των 150 kDa αντισωμάτων), μπορούν και οι δύο να διεισδύσει ιστούς και να καθαριστούν από το πλάσμα μέσα σε λίγα λεπτά από την ενδοφλέβια χορήγηση, χωρίς την πυροδότηση ανοσοαπάντησης, η οποία μπορεί να είναι χρήσιμα κατά τη χρήση τους ως διαγνωστικοί παράγοντες [35]. Για θεραπευτική χρήση, είναι σε θέση να διατηρήσουν τη λειτουργία τους και τα χαρακτηριστικά δέσμευσης κατά την τροποποίησή τους με άλλες χαρακτηριστικές ομάδες για τη βελτίωση της σταθερότητας και της διαλυτότητας τους, μειώνοντας ταυτόχρονα την τοξικότητα και πλάσματος κάθαρση τους [35] – [38], [39] – [41]. Τυπικά, απταμερή είναι από το 22 να 100 βάσεις σε μήκος, και περιέχουν μία περιοχή μεταβλητής αλληλουχίας, πλαισιωμένη από γνωστές ακολουθίες, τα οποία χρησιμοποιούνται για σκοπούς ενίσχυσης και ταυτοποίησης. Ένα μεγάλο ρεπερτόριο διαφορετικών συνδυασμών αλληλουχίας (τυπικά στην περιοχή 10

15) στο κεντρικό πεδίο δημιουργεί πολλές διαφορετικές ρυθμίσεις αναδίπλωση, την ειδικότητα και συγγένεια δέσμευσης για διαφορετικά μόρια. Τα απταμερή τυπικά παράγονται με βάση το SELEX (συστηματική εξέλιξη προσδεμάτων δι ‘εκθετικού εμπλουτισμού) διαδικασία [42], αν και ένας αριθμός άλλων μεθοδολογιών επιλογής είναι διαθέσιμα σήμερα [43] – [45].

Τα απταμερή δημιουργούνται προηγουμένως κατά ενεργή ανθρώπινη ανασυνδυασμένη ηπαρινάση χρησιμοποιώντας ένα τροποποιημένο πρωτόκολλο και το αλάτι σειρά έκλουσης SELEX. Επιλογή απέδωσε τρία απταμερών, «1.5 Μ μικρή», ένα 30 βάσεων κολοβωμένη εκδοχή του «μήκους 1,5 m (73 βάσεις), και« 3.0 Μ »(55 βάσεις). ELISAs και τιτλοδοτήσεις φθορισμού χώρισε τα δύο πλέον απταμερών όπως δείχνουν υψηλότερη συγγένεια και την αναγνώριση της ηπαρινάσης σε κύτταρα πλακούντα, ενώ χρώση του πλακούντα ιστών ευνόησε »1.5 Μ καιρό». Αυτό επιβεβαιώθηκε σε μια δοκιμασία εισβολής Matrigel χρησιμοποιώντας κύτταρα καρκινώματος των ωοθηκών φαίνεται προηγουμένως να απαιτήσει ηπαρινάσης για την εισβολή [46]. Δύο επιπλέον απταμερών, που ονομάζεται «ροζ» και «κίτρινα» επιλέχθηκαν έναντι του πεπτιδίου συνδέτη αλληλουχία του προ-ηπαρινάσης, καθώς αυτές θα μπορούσαν να έχουν μια λειτουργία στην αναστολή του σχηματισμού του δραστικού ενζύμου ετεροδιμερές, αναστέλλοντας εκτομή πεπτίδιο πρωτεάσης.

σε αυτή τη μελέτη, έγιναν προσπάθειες να χαρακτηριστούν περαιτέρω οι προηγουμένως επιλεγμένων απταμερή και να αξιολογηθεί το δυναμικό τους ως διαγνωστικό ή θεραπευτικό παράγοντα. Η σταθερότητα του απταμερούς εκτιμήθηκε με επώαση επί διαφορετικά χρονικά σημεία με ανθρώπινο και ορό ποντικού, και ηλεκτροφόρηση πηκτής πολυακρυλαμιδίου που χρησιμοποιείται για τον προσδιορισμό της έκτασης της αποικοδόμησης του από νουκλεάσες που υπάρχουν στον ορό. Μια πρόσθετη δοκιμασία εισβολής, εκτός από την προηγούμενη ποντίκι EHS-όγκου προερχόμενα δοκιμασία εισβολή Matrigel, διεξήχθη χρησιμοποιώντας ανθρώπινα ιστό της μήτρας λειομυώματος και κύτταρα καρκινώματος ηπαρινάσης που εκφράζουν ανθρώπινη στοματική πλακωδών (HSC-3), όπως αυτό το πείραμα αντιπροσωπεύει μια πιο αυθεντική εικόνα του τι συμβαίνει στον ανθρώπινο ιστό. Επιπλέον, μια δοκιμασία κυτταρικού πολλαπλασιασμού κυτταροτοξικότητας /κύτταρο διεξήχθη για να επαληθεύει ότι οιαδήποτε αναστολή της εισβολής που παρατηρήθηκε δεν ήταν αποτέλεσμα της κυτταροτοξικότητας από την πλευρά των απταμερών. Τέλος, οι αλληλεπιδράσεις των απταμερών με πρωτεΐνες του ορού διερευνήθηκε τόσο επαληθεύσει την ειδικότητα των απταμερών και μελέτη δυναμικό μεταφορά τους από τέτοιες πρωτεΐνες στην κυκλοφορία του αίματος. Αύξηση βιβλιογραφία στον τομέα απταμερές DNA απέδειξε ότι αυτά τα μόρια έχουν τεράστια θεραπευτικές δυνατότητες στην αγωγή του καρκίνου και της θεραπείας έχουν ήδη χρησιμοποιηθεί ως λεγόμενα μόρια συνοδεία για την παροχή φαρμάκων σε καρκινικά κύτταρα (που επισκοπείται στο [47]). AS1411 είναι ένα παράδειγμα ενός απταμερούς DNA που έχει προχωρήσει σε κλινικές δοκιμές δοκιμές. Το απταμερές σε αυτή την περίπτωση στοχεύει ειδικά πρωτεΐνη νουκλεολίνης και να έχει δοκιμάζονται με μεταστατικό, σαφείς-κυττάρων, ασθενείς με καρκίνωμα νεφρών που έχουν ανθεκτικοί στην αναστολείς πριν κινάσης τυροσίνης [48].

Υλικά και Μέθοδοι

Κυτταρική καλλιέργεια

Ανθρώπινο γλώσσα κύτταρα πλακώδους καρκινώματος, HSC-3 (JCRB 0623? Οσάκα Εθνικό Ινστιτούτο Επιστημών Υγείας, Osaka, Japan), καλλιεργήθηκαν σε μέσο ανάπτυξης: 50% DMEM 50% Ham F-12 (Sigma Aldrich) και επιπροσθέτως συμπληρωμένο με 50 μg /ml ασκορβικό οξύ, 250 ng /ml αμφοτερικίνη Β, 5 μg /ml ινσουλίνη (βόεια πάγκρεας), 0,4 ng /ml υδροκορτιζόνη και 10% ορό εμβρύου μόσχου απενεργοποιημένο με θέρμανση. Το συμπλήρωμα του πολιτισμού αγοράστηκε από Sigma Aldrich. Όλες οι κυτταρικές καλλιέργειες διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας προθερμασμένο αντιδραστηρίων. Τα κύτταρα επωάστηκαν σε 95% αέρα /5% CO

2 στους 37 ° C. Τα κύτταρα περάστηκαν με απομάκρυνση των μέσων ενημέρωσης και έκπλυση με HBSS (Sigma Aldrich), στην συνέχεια προσθήκη 3 ml 1 χ θρυψίνης-ΕϋΤΑ (Sigma Aldrich) και επώαση για 5 λεπτά. Η θρυψίνη-ΕϋΤΑ αδρανοποιήθηκε με την προσθήκη 7 ml μέσο ανάπτυξης και την εξάλειψη τυχόν συσσωματώματα κυττάρων. 1 ml κυτταρικού εναιωρήματος (συν 24 ml φρέσκου μέσου ανάπτυξης) διατηρήθηκε στη φιάλη για τη συντήρηση των αποθεμάτων και των υπόλοιπων 9 ml μετρήθηκε και χρησιμοποιήθηκαν για πειράματα.

δοκιμασίας Οργανοτυπικές εισβολή και τις αναλύσεις των αναστολέων για εισβολή

η δοκιμασία οργανοτυπικές εισβολή και η ποσοτικοποίηση των αποτελεσμάτων διεξήχθησαν όπως περιγράφεται στο Nurmenniemi

κ.ά.

. (2009) [49]. Εν συντομία, 7 χ 10

5 HSC-3 κύτταρα αιωρούνται σε μέσα που περιέχουν το κατάλληλο απταμερές (Μη συνδεδεμένοι, 1.5 Μ ολίγοις, μήκους 1,5 m, 3 Μ, ροζ και κίτρινο) ή ένα αντίσωμα έναντι ηπαρινάσης (Ηρα Ab, 0.7 mM) . Επίσης (2- {4 – [(Ε) -3- (4-βρωμοφαινυλ) ακρυλοϋλάμινο] -3-φθοροφαινυλ} βενζοοξαζολ-5-υλ) οξικό οξύ, σε συντομογραφία BAFB, χρησιμοποιήθηκε, καθώς αυτό αποδείχθηκε ότι έχει ανασταλτικά αποτελέσματα κατόπιν ηπαρινάσης σε προηγούμενες μελέτες [29] (Πίνακας 1). Κάθε απταμερές ή αντίσωμα προστέθηκε σε 1 μΜ στην αναστολή HSC-3 κυττάρων στην αρχή της μελέτης και στο HSC-3 μέσα κυτταρικής καλλιέργειας όλο το πείραμα. δίσκοι Myoma χωρίς HSC-3 κύτταρα και HSC-3 κύτταρα χωρίς αναστολέα συμπεριλήφθηκαν επίσης στην ανάλυση ως έλεγχοι. Οι δίσκοι επωάστηκαν για 14 ημέρες στους 37 ° C με 5% CO

2, με τα μέσα που περιέχουν τα κατάλληλα αναστολέων. Τα μέσα συλλέχθηκαν, φυγοκεντρήθηκαν, και φρέσκα μέσα με αναστολείς αλλάχθηκαν στις ημέρες 4, 7, 10 και 14. Από τα υπερκείμενα συλλέχθηκαν μέσα ενημέρωσης, τα προϊόντα αποδόμησης του myoma τύπου ιστού III κολλαγόνου αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας ραδιοανοσοδοκιμασία SP99 (RIA) για C- τερματικό τελοπεπτίδιο (IIICTP) και Ν-τερματικό τελοπεπτίδιο (IIINTP) έμμεσες ενζυματικές ανοσοανιχνεύσεις (ΕΙΑ) για Ν-τερματικό τελοπεπτίδιο, ακολουθώντας τις μεθόδους που περιγράφονται στο Nurmenniemi

κ.ά.

. ([49] για τη RIA και [50] για την ΕΠΕ). Την ημέρα 14, οι δίσκοι myoma μονιμοποιήθηκαν σε 4% παραφορμαλδεΰδη και προετοιμάζονται για ανοσοϊστολογική ανάλυση. Έξι μm ιστολογικές τομές των δίσκων myoma χρωματίστηκαν με μονοκλωνικό αντίσωμα pancytokeratin (ϋΑΚΟ, την κλωνοποίηση ΑΕ1 /ΑΕ3 σε αραίωση 1:150) και παρατηρήθηκαν κάτω από το μικροσκόπιο σε 100 × μεγέθυνση. Εννέα αντιπροσωπευτικές εικόνες λήφθηκαν από κάθε μία από τις τρεις επαναλήψεις της κάθε θεραπείας. Οι εικόνες αναλύθηκαν όπως περιγράφεται στο Nurmenniemi

et al.

(2009) [49]. Διαφορές στην περιοχή εισβολή και το βάθος αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας δοκιμασία t του Student και Mann-Whitney test και ρ-τιμές μικρότερες από 0.05 θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές.

Η

Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων δοκιμασία

για να προσδιοριστεί η επίδραση του απταμερούς «1.5 Μ σύντομο» στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων HSC-3, χρησιμοποιήσαμε το CellTiter 96 υδατικού κυττάρου δοκιμασία πολλαπλασιασμού (Promega), μία δοκιμασία MTS. Περίπου 1 χ 10

4 κύτταρα σπάρθηκαν εις τριπλούν σε ένα 96-φρεατίων με 1 μΜ της μικρής απταμερούς. Μετά από 24, 48 και 72 ώρες, 20 ml CellTiter 96 Αντιδραστηρίου Υδατικό Ένα διάλυμα προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο και τα κύτταρα επωάστηκαν για 1 ώρα στους 37 ° C σε ένα 5% CO

2 θερμοκοιτίδα. Η απορρόφηση καταγράφηκε στα 490 nm σε αναγνώστη πλακός Fluostar Optima χρησιμοποιήθηκε ως αναπαράσταση του σχετικού αριθμού των ζωντανών κυττάρων σε καλλιέργεια.

Serum σταθερότητα δοκιμασία

Τα απταμερή «1.5 Μ μικρή ‘,’ 1.5 Μ μακρύς »και« 3.0 Μ ‘επωάστηκαν σε μια συγκέντρωση 5 μΜ με ανθρώπινο και ποντικού ορό για 30, 60, 120, 180, 240 και 300 λεπτά στους 37 ° C. Η αντίδραση στη συνέχεια διακόπηκε με την προσθήκη 100 mM EDTA και τα προϊόντα έτρεξαν σε ένα 12% πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου μητρική, παράλληλα με ένα 25 bp σκάλα δείκτη DNA. Τζελ σημάνθηκαν σύμφωνα με βρωμιούχο αιθίδιο και είδαν κάτω από υπεριώδες φως.

δεσμευτική

λευκωματίνη ορού

αλβουμίνη βόειου ορού (BSA) αγοράστηκε από την Sigma-Aldrich Ltd (Gillingham, Ηνωμένο Βασίλειο, τον κωδικό του προϊόντος A7030 10 g ). Πειράματα UV διεξήχθησαν σε Bio-Tek Uvikon XL με Peltier Thermosystem για τον έλεγχο της θερμοκρασίας και η ανάδευση εγκατάσταση, που συνδέεται με τον υπολογιστή χρησιμοποιώντας λογισμικό Lab Ισχύς Νέων για τη συλλογή και την ανάλυση των δεδομένων. Φθοριμέτρου που χρησιμοποιήθηκε ήταν ένα Horiba Jobin Yvon FluoroMax-P εξοπλισμένο με έναν μετρητή φωτονίων και σύστημα Peltier για τον έλεγχο της θερμοκρασίας και ανάδευση διευκόλυνση, σε συνδυασμό με ένα PC χρησιμοποιώντας λογισμικό Datamax για φασματική ανάλυση. Ελήφθησαν αρχικές μετρήσεις για την επαλήθευση της παρουσίας ή απουσίας του φθορίζουσας εκπομπής των δύο απταμερών για μήκος κύματος διέγερσης 290 nm (εκλεκτικό για τα κατάλοιπα τρυπτοφάνης) και μήκη κύματος εκπομπής μεταξύ 300 και 400 nm. Αμφότερα τα απταμερή τιτλοδοτήθηκαν σε νερό και 10 mM φωσφορικό ρυθμιστικά διαλύματα ρΗ 7,4, στους 37 ° C. Το 1,5 Μ μικρή συγκέντρωση απταμερούς κυμαινόταν από 0,3 να 8,0 μΜ, και το μήκους 1,5 m απταμερές κυμαινόταν από 0,5 να 8,0 μΜ, που δείχνει την ενδογενή φθορισμό αυτών των απταμερών. Και τα δύο απταμερή παρουσιάζονται φάσματα εκπομπής φθορισμού σε αυτό το εύρος. Νωρίτερα δοκιμές έδειξαν ότι οι συγκεντρώσεις απταμερούς κυμαινόμενες από 0,1 μg /ml έως 8 μg /ml δεν παρεμβαίνει στην αξιολόγηση της σβέσης αλβουμίνης [51]. Την απόσβεση μετρήσεις έγιναν σε 1 ml 6 μΜ λευκωματίνες σε φωσφορικό ρυθμιστικό διάλυμα ρΗ 7.4. Τα φάσματα εκπομπής καταγράφηκαν από 300 έως 400 nm μήκος κύματος, μετά από ένα χρόνο αντίδρασης 90 δευτερόλεπτα από κάθε προσθήκη απταμερές. Τόσο το εύρος ζώνης εκπομπής και διέγερσης τέθηκαν σε 3 nm. Το απταμερές προστέθηκε από ένα πυκνό διάλυμα στοκ, έτσι ώστε η αύξηση του όγκου ήταν αμελητέα. Τα πειράματα διεξήχθησαν στους 37 ° C, ρΗ 7.4.

Για να αξιολογεί τυχόν υπάρχοντα πρωτογενή και /ή δευτερογενή αποτελέσματα εσωτερικό φίλτρο (IFES), τις διαδικασίες διόρθωσης με βάση τις μετρήσεις της απορρόφησης των διαλυμάτων διεξήχθησαν κατά διέγερσης και εκπομπής μήκη κύματος της αλβουμίνης . Αυτή η επίδραση συνίσταται στην απορρόφηση της διέγερσης ή /και ακτινοβολία που εκπέμπεται από διαλυμένο είδος, συμπεριλαμβανομένης της ίδιας της φθοροφόρο [52]. μέτρηση της απορρόφησης των διαλυμάτων απταμερών /αλβουμίνης σε διέγερσης και εκπομπής μήκη κύματος της αλβουμίνης έδειξε ότι επίδραση εσωτερικού φίλτρου που προκαλείται από την απορρόφηση της εκπεμπόμενης ακτινοβολίας ήταν αμελητέα.

Αποτελέσματα

Τα αντι-ηπαρινάσης απταμερή αναστέλλουν την εισβολή των κυττάρων καρκινώματος

Η εισβολή των HSC-3 κυττάρων μελετήθηκε με ένα μοντέλο ανθρώπινου myoma οργανοτυπικό [49] έκθεση των καρκινικών κυττάρων σε διάφορες απταμερών (Μη συνδεδεμένοι, 1.5 Μ μικρή, μήκους 1,5 m, 3 M, ροζ και κίτρινο) ή ηπαρινάσης αντίσωμα (Ηρ Ab) (Σχ. 1Α). Τα αποτελέσματα αυτών των ενώσεων σε σύγκριση με το μάρτυρα (χωρίς αναστολέα) επί έκταση εισβολή (που υπολογίζεται με βάση την μm-περιοχή του διηθητικού κύτταρα) και το βάθος της εισβολής (την απόσταση από την κάτω επιφάνεια του μη επεμβατική κυτταρική στιβάδα στο βαθύτερο εισέβαλαν κυττάρου) ήταν αναλύθηκε (Σχ. 1 Β και C). Το απταμερές 1.5 Μ Σύντομη μείωσε σημαντικά την συνολική έκταση εισβολή (p = 0,0001) είναι παρόμοια με Ηρα Ab, το οποίο χρησιμοποιήθηκε ως θετικός έλεγχος αναστολέα εισβολή [27]. Αντιθέτως, καμία από τις άλλες ενώσεις είχαν επίπτωση στην HSC-3 εισβολή (Σχήμα 1). Το βάθος εισβολή μειώθηκε σημαντικά μόνο μετά τη θεραπεία Ηρ Ab (ρ = 0.0001) (Σχήμα 1 C). Με βάση τα προηγούμενα ευρήματα μας, η αποικοδόμηση του κολλαγόνου τύπου III με HSC-3 κύτταρα μετρήθηκαν με RIA κορυφές από τις ημέρες 7 έως 11 [49]. Ομοίως, τα μέσα αναλύθηκαν με RIA από την ημέρα 4 δεν έδειξε διαφορές μεταξύ οποιωνδήποτε από τις θεραπείες (δεν φαίνεται). Η αλλαγή μέσου κατά τη λήξη του πειράματος την ημέρα 14 έδειξαν μόνο στατιστική σημασία από την επεξεργασία χωρίς κύτταρα προστίθενται (p = 0.001? Δεν φαίνεται). Η αποδόμηση του κολλαγόνου τύπου III χωρίς αναστολείς ήταν υψηλότερη στις ημέρες 7 (δεν φαίνονται) και 10 (Σχήμα 2Α-D). Την ημέρα 10, η θεραπεία με αντίσωμα ηπαρινάσης ανέστειλε σημαντικά την υποβάθμιση σε σύγκριση με άσχετες ελέγχου (p = 0,07 σε RIA, και p = 0,03 σε ΕΠΕ). Την ημέρα 10 υπήρχε μία σημαντική αναστολή από 1,5 Μ Short (p = 0,004 σε RIA, και ρ = 0,007 σε ΕΙΑ) και μήκους 1,5 m (ρ = 0.02 σε RIA, και ρ = 0.03 σε ΕΙΑ) σε σύγκριση με τον έλεγχο HSC-3 . Ωστόσο, 3 Μ, ροζ, κίτρινο και απταμερή, καθώς και BAFB δεν έδειξαν σημαντική μείωση στην ποσότητα των προϊόντων αποδόμησης κολλαγόνου, δείχνοντας ότι δεν ήταν επιτυχείς αναστολείς της εισβολής

Α:. Εγκλεισμένα σε παραφίνη 14- ημέρα myoma οργανοτυπικές τομές βάφτηκαν για pancytokeratin δείκτη ΑΕ1 /ΑΕ3 να αναλύσει HSC-3 εισβολή μετά από διάφορες επεξεργασίες: χωρίς αναστολέα, Ηρ & Ab, (το πολυκλωνικό ηπαρινάσης αντίσωμα ως θετικός έλεγχος), άσχετα απταμερές, (επιλεγμένο έναντι στόχου που εμπλέκονται στην Αλτσχάιμερ ασθένεια), αντι-ηπαρινάσης απταμερή 1,5 Μ Short, μήκους 1,5 m και 3 Μ? συνδετικό πεπτίδιο απταμερή ροζ και κίτρινο. μπαρ κλίμακας είναι 100 μm. Οι διαφορές στην περιοχή εισβολής (Β) και το βάθος εισβολή (C) μετά από διάφορες κατεργασίες (n = 27 /θεραπεία). Τα στατιστικά στοιχεία έγιναν ως δύο δειγμάτων

t-test

και Mann-Whitney test

Η

Α:. ΕΠΕ (IIINTP έμμεση ανοσοενζυμικών) ανίχνευση Ν-τερματικό τελοπεπτίδιο από κολλαγόνο τύπου ΙΙΙ προϊόντα αποικοδόμησης κατά την ημέρα 10 της αλλαγής των μέσων ενημέρωσης. Αύξηση της απορρόφησης σημαίνει λιγότερη υποβάθμιση του κολλαγόνου του παρόντος προϊόντος. Ηρ Ab (p = 0.03), 1.5 Μ Short (p = 0.007) και 1.5 Μ Long (p = 0.03) έδειξε σημαντική αύξηση στην απορρόφηση σε σύγκριση με το χωρίς αναστολέα, γεγονός που υποδηλώνει ότι έχουν ανέστειλε την εισβολή των HSC-3 κύτταρα. Β: Το γράφημα δείχνει προηγούμενες τιμές ΕΠΕ προσαρμοσμένο για αρνητικό έλεγχο κατά την ημέρα 10 της αλλαγής των μέσων ενημέρωσης. C: RIA (ραδιοανοσοπροσδιορισμό για κολλαγόνο τύπου III) την ανίχνευση C-τερματικού τελοπεπτιδίου την ημέρα 10 αλλαγή μέσου. Η αύξηση των επιπέδων σημαίνει λιγότερο προϊόν αποδόμησης του κολλαγόνου. Ηρ Ab (p = 0.07), 1.5 Μ Short (p = 0.004) και 1.5 Μ Long (p = 0.02). D: RIA έχει επιβεβαιώσει τις ΕΠΕ αναλύσεις δείχνουν σημαντικά χαμηλότερα των προϊόντων αποδόμησης του κολλαγόνου από ότι για τους ιστούς χωρίς αναστολέα πρόσθεσε, αναφέροντας ότι ήταν επιτυχείς αναστολείς της εισβολής

Η

Η σύντομη αντι-ηπαρινάσης απταμερούς δεν παρουσιάζει κανένα. κυτταροτοξικότητα

η κυτταροτοξικότητα των επιλεγμένων απταμερών επί HSC-3 κύτταρα μελετήθηκε, να εξακριβώσει ότι η αναστολή της εισβολής που παρατηρείται στο μοντέλο οργανοτυπικό ήταν αποτέλεσμα της αναστολής της ηπαρινάσης, όπως επαληθεύεται προηγουμένως [46] και δεν κυτταρική κυτταροτοξικότητα. Η δοκιμασία MTS διεξήχθη επί 72 ώρες, με ένα μόνο την προσθήκη του απταμερούς στην αρχή της δοκιμασίας, και οι μετρήσεις κατά τη διάρκεια των διαστημάτων της περιόδου των 24, 48 και 72 ώρες. Καμία αλλαγή στην βιωσιμότητα των κυττάρων και την ανάπτυξη των κυττάρων δεν παρατηρήθηκε μεταξύ των κυττάρων όπου προστέθηκε απταμερές και τον έλεγχο (βλέπε Σχήμα 3). Μόνο τα απταμερή που έδειξαν αναστολή της εισβολής ελέγχθηκαν για κυτταροτοξικότητα, να ερευνήσει εάν η ανασταλτική επίδραση που παρατηρείται οφείλεται σε κυτταροτοξικότητα ή αναστολή ηπαρινάσης. Τα απταμερή που δεν αναστέλλουν την κυτταρική διείσδυση προφανώς δεν έχουν καμία επίδραση επί των κυττάρων και ως εκ τούτου δεν υπήρχε λόγος να μελετηθούν περαιτέρω για κυτταροτοξικότητα.

Η παρουσία του απταμερούς σε συγκέντρωση 1 mM βρέθηκε να έχει καμία επίδραση στην κυτταρικής ανάπτυξης σε σύγκριση με τον έλεγχο.

Η

Η σύντομη αντι-ηπαρινάσης απταμερές δεν δεσμεύεται σημαντικά με τις πρωτεΐνες του ορού

μικρής και μεγάλης απταμερή 1,5 Μ αρχικά τιτλοποιείται σταδιακά μέσα σε νερό και φωσφορικό ρυθμιστικό διάλυμα, ρΗ 7,4 στους 37 ° C για να διερευνήσει την εγγενή φθορισμό τους. Και τα δύο απταμερή έχουν εγγενή φθορισμό με κορυφές στα 380 nm, η οποία αυξάνει σε ένταση φθορισμού σε μια αντίστοιχη αύξηση της συγκέντρωσης απταμερούς? η σύντομη δείχνει λιγότερο φθορισμό από το μακρύ απταμερές (Σχήμα 4Α και Β). Νερό χρησιμοποιήθηκε σαν ένα αραιωτικό για να δείξει ότι η απταμερές και όχι φωσφορικό ρυθμιστικό διάλυμα ήταν η αιτία του φθορισμού, αν και ο φθορισμός για το βραχυπρόθεσμο απταμερές αυξημένο μετά τη χρήση φωσφορικού ρυθμιστικού διαλύματος ως διαλύτη. Ωστόσο, αυτό ήταν πιθανόν να οφείλεται σε μία διαφορά στο ρΗ και στην φασματοσκοπία φθορισμού μεταβολές του ρΗ έχουν σημαντική επιρροή στα αποτελέσματα.

φθορισμού αυξάνεται κατά την αύξηση της συγκέντρωσης του απταμερούς τόσο φωσφορικών και νερό, που δείχνει ότι αν και ο φθορισμός είναι υψηλότερη σε φωσφορικό, το απταμερές είναι στην πραγματικότητα η αιτία και η διαφορά του pH στο νερό και PBS είναι η πιο πιθανή αιτία για την αύξηση του φθορισμού του απταμερούς σε PBS.

η

η σύντομη απταμερές ήταν σε θέση να σβέση του φθορισμού HSA στους 37 ° C με 1,5% (± 0,03%) και 9% (± 1,2%) σε 1:100 και 1:10 μοριακές αναλογίες αντίστοιχα, με απόσβεση του 10% επιτυγχάνεται με μία μοριακή συγκέντρωση 9.1 φορές χαμηλότερη από HSA (Εικόνα 5). Long απταμερές είναι σε θέση να αποσβεστεί η φθορισμός του HSA κατά 10% σε μία συγκέντρωση 18,2 φορές μικρότερη από HSA, και κατά 2,4% (± 0,1%) και 16% (± 0,6%) σε 1:100 και 1:10 μοριακές αναλογίες. Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι και οι δύο απταμερή είναι σε θέση να αποσβεστεί η φθορισμό της HSA, αν και η μακρά απταμερές ήταν πιο αποτελεσματική. HSA σβέσης δείχνει ότι τα απταμερή φτάσουν υπο ΔΣ τομέα, όπου βρίσκεται μόνο τρυπτοφάνη του. Αυτή η τρυπτοφάνη υπόλειμμα βρίσκεται στη θέση 214 σε υποτομέα ΙΙΑ, εντός του οποίου υπάρχει ένας μεγάλος υδρόφοβη κοιλότητα με πολλά υπολείμματα αργινίνης κοντά στην επιφάνεια [53], τα οποία έχει αποδειχθεί σε διάφορες μελέτες για να χρησιμεύσουν ως σημεία αγκύρωσης για απταμερή [54].

μήκος κύματος διέγερσης 290 nm, [HSA] = 6 μΜ. Μήκος κύματος διέγερσης στα 290 mM σε διάλυμα φωσφορικού νατρίου. Τα δεδομένα είναι ο μέσος όρος των έξι τιμών που δεν δείχνει μεγαλύτερη τυπική απόκλιση από το 11%. Το αποτέλεσμα απόσβεσης είναι πιο σημαντικό για μεγάλες από μια σύντομη απταμερούς.

Η

Για να αποκτήσετε περισσότερες πληροφορίες σχετικά με το είδος της αλληλεπίδρασης που συμβαίνουν μεταξύ των απταμερών και HSA, ογκομετρήσεις φασματομετρία UV διεξήχθησαν με τιτλοδότηση αυξανόμενες συγκεντρώσεις των βραχυπρόθεσμων και μακρύ απταμερή και 6 μΜ HSA αραιώνεται σε φωσφορικό ρυθμιστικό διάλυμα ρΗ 7,4, όπως φαίνεται στο Σχήμα 5. η προσθήκη των δύο απταμερών σε φωσφορικό ρυθμιστικό διάλυμα και HSA αύξησε τη συνολική απορρόφηση, που δείχνουν ότι το απταμερές ήταν υπεύθυνη για την αύξηση αυτή, αντί HSA. Η αύξηση ήταν περισσότερο έντονη για τη μεγάλη απταμερές βραχυπρόθεσμα απταμερούς, και οι δύο παρήγαγε μια μετατόπιση της μέγιστης απορρόφησης στα αριστερά μετά την προσθήκη αυξανόμενων συγκεντρώσεων του απταμερούς.

Η μετατόπιση που παρατηρείται από τη σύντομη απταμερές (Σχήμα 6Α ) μετακινούνται 6 nm προς τα αριστερά, υποδεικνύοντας ότι μόνο μια μικρή αλλαγή διαμόρφωσης στην πρωτεΐνη συνέβαινε [55] και ως εκ τούτου, HSA απόσβεση από την παρούσα απταμερές οφείλεται πιθανότατα στη δυναμική απόσβεση. Ωστόσο, στην περίπτωση της μακράς απταμερούς (Σχήμα 6Β), όχι μόνο υπήρχε σημαντική μετατόπιση στην μέγιστη απορρόφηση από 20 nm προς τα αριστερά, αλλά παρατηρήθηκε μία πλήρης αλλαγή στο σχήμα της κορυφής, που ενσωματώνει την κορυφή στα 260 nm του απταμερούς, γεγονός που υποδηλώνει ότι ένα σύμπλεγμα σχηματίστηκε και ότι η απόσβεση οφειλόταν στο στατικό φαινόμενο απόσβεσης με μακρά απταμερή [55]. Έτσι, οι τιτλοδοτήσεις UV πρότεινε ότι η σύντομη απταμερές δεν σχηματίζουν ένα σύμπλοκο με HSA και ότι οι αλληλεπιδράσεις ήσαν λόγω της δυναμικής απόσβεση, ενώ η μακρά απταμερές προτάθηκε για να σχηματίσει ένα σύμπλοκο θεμελιώδη κατάσταση με HSA, σε αντίθεση με άλλες απταμερών προηγουμένως μελετήθηκαν, τα οποία δείχνουν, επίσης, την ειδικότητα και το σχηματισμό πολύπλοκων μόνο με την πρωτεΐνη-στόχο τους [56]. Το έργο αυτό έχει επεκταθεί και αλληλεπίδραση των απταμερών με πρωτεΐνες ορού και της ειδικής θέσης της αλληλεπίδρασής τους έχει υπολογιστεί και δημοσιεύονται ξεχωριστά, δεδομένου ότι δεν ήταν εντός του πεδίου εφαρμογής του άρθρου αυτού [57].

Η

απταμερή είναι σταθερά σε ανθρώπινο

ορού

για την αξιολόγηση της καταλληλότητας των απταμερών »ως θεραπευτικοί παράγοντες, ήταν απαραίτητο να υπάρχει κατανόηση του τρόπου με τον σταθερό τα μη τροποποιημένα απταμερή θα είναι στο σώμα, όπως, στην κυκλοφορία του αίματος και μόνο, υπάρχουν πολλές νουκλεάσες ικανά αποικοδόμησης των απταμερών. Έτσι, για να ελέγξει τη σταθερότητα των απταμερών σε ανθρώπινο ορό, έχουμε χαρακτηριζόμενη οποιαδήποτε προϊόντα αποδόμησης με ηλεκτροφόρηση πηκτής. Σύγκριση των ζωνών στα πηκτώματα για 1,5 Μ σύντομο απταμερούς επωάστηκαν για διαφορετικά χρονικά σημεία με ανθρώπινο και ποντικού ορό, με εκείνη του απταμερούς έδειξε μόνο ότι 1,5 Μ σύντομο απταμερές δεν υπόκειται σε νουκλεάσης αποικοδόμηση από ανθρώπινο ορό ως οι ζώνες δεν έδειξε καμία πασάλειμμα ή μείωση στο μέγεθος ή την ένταση σε σύγκριση με μόνο απταμερούς, και ως εκ τούτου, δεν διάσπαση του απταμερούς σε μικρότερα θραύσματα παρατηρήθηκε (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα). Με ορό του ποντικιού, ωστόσο, υπήρξε μια μείωση στην πρωτοβάθμια ένταση της ζώνης κατά τον χρόνο επώασης πέντε ώρες », γεγονός που υποδηλώνει ότι νουκλεάσες έχουν υποβαθμιστεί το απταμερούς από εκείνη τη στιγμή.

Συζήτηση

Σε αυτή τη μελέτη έχουμε διερευνηθεί το δυναμικό των προηγουμένως επιλεγμένων απταμερή εναντίον ηπαρινάσης ως υποσχόμενη διαγνωστικών και θεραπευτικών παραγόντων κατά του καρκίνου του στόματος. Τα απταμερή είχαν προηγουμένως αποδειχθεί ότι έχουν υψηλή συγγένεια έναντι ηπαρινάσης και ήταν λειτουργικά σε μια δοκιμασία Matrigel. Σε αυτές τις αρχικές μελέτες, διαπιστώθηκε ότι τα πλέον απταμερή είχε υψηλότερη συγγένεια για ηπαρινάσης και είχαν καλές επιδόσεις κατά μικροσκοπία φθορισμού και προσδιορισμούς εισβολής Matrigel. Ωστόσο, όταν εξετάσαμε αυτά απταμερή για τη δοκιμασία οργανοτυπικές εισβολή και ανέλυσε το δυναμικό τους να μπλοκάρουν εισβολή, διαπιστώθηκε ότι η σύντομη απταμερές ήταν πολύ πιο ικανοί να κάνουν έτσι, σε σύγκριση με μακρά ομολόγους της. Αυτό επίσης επαληθεύεται από την ανάλυση με RIA και ΕΙΑ των προϊόντων αποικοδόμησης του ιστού myoma, δηλαδή τύπος III C- κολλαγόνου και το Ν-τερματικό τελοπεπτίδιο αντίστοιχα. Το 1,5 Μ Short και μήκους 1,5 m απταμερή αποτελούνται από το ίδιο μεταβλητής περιοχής και στην πραγματικότητα η πιο μικρή είναι μια περικομμένη εκδοχή της μακράς. Ωστόσο, φαίνεται ότι αν και η μακρά ένα έχει ένα ελαφρώς υψηλότερη συγγένεια, πιθανώς λόγω της αυξημένης αλληλεπιδράσεις μεταξύ της πρωτεΐνης και των εκκινητή τμήματα του απταμερούς, αυτές οδήγησαν σε μείωση της ικανότητας αυτών των απταμερών να αναστέλλουν την εισβολή των ιστών. Η παρουσία διαφόρων πρωτεϊνών στο πραγματικό ιστό, σε σύγκριση με το πείραμα Matrigel προηγουμένως πραγματοποιηθεί, μπορεί να είναι ο λόγος για αυτό, καθώς η μακρά απταμερές μπορεί να σχηματίσει άλλες αλληλεπιδράσεις με τέτοιες πρωτεΐνες, ή τα εκκινητή ουρές μπορεί να έχει στερεοχημική επίδραση εμπόδιο για την ιστού, η οποία δεν είναι εμφανής στο απλούστερο μοντέλο matrigel. Αυτό, στην πραγματικότητα, επιβεβαιώθηκε από την μελέτη των αλληλεπιδράσεων μεταξύ των δύο απταμερή και πρωτεϊνών ορού. Σε αυτές τις μελέτες βρέθηκε ότι η μακρά απταμερές σχηματίζεται ένα σύμπλοκο με ανθρώπινη λευκωματίνη ορού, ενώ η βραχεία απταμερές δεν σχηματίζουν ένα σύμπλοκο και έδειξε μόνο μια περιορισμένη δυναμική απόσβεση. Σε μια περαιτέρω μελέτη [57], έχουμε ως πρότυπο τις αλληλεπιδράσεις των βραχείας και μακράς απταμερή με HSA και έχουν προσδιορίσει ότι πράγματι η μακρά απταμερές σχηματίζει ένα σύμπλοκο με λευκωματίνες ορού σε μία μόνο θέση πρόσδεσης, κοντά στο Trp 214 της HSA ή 212 του BSA, στο υποτομέα ΔΣ αυτών των πρωτεϊνών, σε ένα θετικά φορτισμένο κοιλότητα επενδεδυμένα με λυσίνη και αργινίνη υπολείμματα [57]. Έχει αποδειχθεί ότι οι βραχύτερες είδος απταμερές στερείται την ικανότητα να σχηματίζουν σύμπλοκα με πρωτεΐνες του ορού και τα εκθέματα έτσι υψηλότερη ειδικότητα για το στόχο του, η οποία δικαιολογεί την επιλογή μας να το χρησιμοποιεί σε οποιαδήποτε περαιτέρω θεραπευτικό ή διαγνωστικό ανάπτυξης και είναι σε συμφωνία με τα δεδομένα myoma παρουσιάζονται σε αυτό το έργο. Ένα άλλο σημαντικό χαρακτηριστικό αυτής της μελέτης είναι η απόδειξη ότι μετά το SELEX τροποποιήσεις μπορεί να είναι πιο ευεργετικό για την επιλογή απταμερούς από τα πρώτα βήματα για την καταπολέμηση της επιλογής, όπου αυτό είναι δυνατό. Σε μια σειρά μελετών με διάφορες μεθοδολογίες ανίχνευσης, συγγένεια απταμερούς για το στόχο τους έχει συγκριθεί με εκείνη για λευκωματίνη.