Αφηρημένο

Ιστορικό

Η χημειοθεραπεία που προκαλείται από τη μείωση του φορτίου του όγκου είναι συνάρτηση της αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο, ενορχηστρωμένη από ενδοκυτταρική κασπάσες. Ωστόσο, η αποτελεσματικότητα αυτών των θεραπειών είναι σε κίνδυνο από μεταλλάξεις που επηρεάζουν ειδικά γονίδια, τον έλεγχο και /ή ρύθμιση της αποπτωτικής σηματοδότησης. Ως εκ τούτου, είναι επιθυμητό για την ταυτοποίηση νέων οδών κυτταρικού θανάτου, το οποίο θα μπορούσε να λειτουργήσει σε συνδυασμό με ή απουσία αποτελεσματικών αποπτωτικών μηχανημάτων. Από αυτή την άποψη, οι πρόσφατες ενδείξεις υποστηρίζουν την ύπαρξη ενός νέου μονοπατιού κυτταρικού θανάτου που ονομάζεται αυτοφαγία, η οποία ενεργοποιείται μετά από παράγοντα ανάπτυξης στέρηση ή έκθεση σε γονιδιοτοξικά ενώσεις. Η λειτουργική σημασία αυτής της οδού όσον αφορά την ικανότητά της να χρησιμεύσει ως αντίδραση στο στρες ή μια πραγματικά θάνατος μηχανισμός τελεστή είναι ακόμα εν λόγω? Ωστόσο, οι εκθέσεις δείχνουν ότι η αυτοφαγία είναι μια εξειδικευμένη μορφή κυτταρικού θανάτου υπό ορισμένες προϋποθέσεις.

Μεθοδολογία /Κύρια Ευρήματα

Αναφέρουμε εδώ την ταυτόχρονη διέγερση των μη κανονικών αυτοφαγία και την απόπτωση στα ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα κατά την έκθεση σε ένα μικρό μόριο ένωσης που ενεργοποιεί ενδοκυττάρια υπεροξείδιο του υδρογόνου (H

2O

2) Η παραγωγή. Ότι, αποσιώπηση των beclin1 ούτε ανέστειλε τη σφραγίδα της αυτοφαγία ούτε την επαγωγή κυτταρικού θανάτου, η ATG 7 ή Ulk1 νοκ ντάουν καταργηθεί σημαντικά φάρμακο που προκαλείται H

2O

2 μεσολάβηση αυτοφαγία. Επιπλέον, παρέχουν αποδεικτικά στοιχεία που ενεργοποιούνται εξωκυττάρια ρυθμιζόμενη κινάσης (ERK) και c-Jun Ν-τερματικής κινάσης (JNK) είναι ανάντη τελεστές έλεγχο τόσο αυτοφαγία και απόπτωση σε απόκριση σε αυξημένα ενδοκυτταρικά H

2O

2. Είναι ενδιαφέρον ότι, η αναστολή της δραστικότητας JNK ανέστρεψε την αύξηση στην έκφραση ATG7 σε αυτό το σύστημα, υποδεικνύοντας έτσι ότι ΙΝΚ μπορεί να ρυθμίζει autophagy ενεργοποιώντας ATG7. Αξίζει να σημειωθεί ότι το μικρό μόριο ένωση ενεργοποιείται αυτοφαγία και απόπτωση σε πρωτογενή κύτταρα που λαμβάνονται από ασθενείς με λέμφωμα, αλλά όχι σε μη μετασχηματισμένα κύτταρα.

Συμπεράσματα /σημαντικότητα

Θεωρώντας ότι η απώλεια ογκοκατασταλτικών Beclin 1 συνδέεται με νεοπλασία, η ικανότητα αυτού του μικρού ένωσης μορίου να συμμετάσχουν τόσο αυτοφαγικά και αποπτωτικών μηχανήματα μέσω της παραγωγής των ROS και την επακόλουθη ενεργοποίηση της ERK και JNK θα μπορούσε να έχει πιθανές επιπτώσεις μεταγραφική

Παράθεση:. Wong CH, Iskandar KB, Yadav SK, Hirpara JL, Loh Τ, Pervaiz S (2010) η ταυτόχρονη επαγωγή της μη Canonical Autophagy και απόπτωσης σε καρκινικά κύτταρα με ROS-εξαρτημένων ERK και JNK ενεργοποίηση. PLoS ONE 5 (4): e9996. doi: 10.1371 /journal.pone.0009996

Επιμέλεια: Gian Maria Fimia, INMI, Ιταλία

Ελήφθη: 3 του Δεκέμβρη 2009? Δεκτές: 7 Μαρτίου 2010? Δημοσιεύθηκε: 2 Απρίλη 2010

Copyright: © 2010 Wong et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίζεται από επιχορηγήσεις σε SP από το Εθνικό Συμβούλιο Ιατρικής έρευνας, τη Σιγκαπούρη, το Συμβούλιο Ιατροβιολογικών Ερευνών, τη Σιγκαπούρη, το Υπουργείο Παιδείας (MOE-Tier 2), τη Σιγκαπούρη, και ερευνητικά κονδύλια από τον Δούκα-NUS Πτυχιούχος Ιατρικής Σχολής, Σιγκαπούρη. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

είναι πλέον καλά τεκμηριωμένο ότι η χημειοθεραπεία που προκαλείται από τη μείωση του φορτίου του όγκου είναι συνάρτηση της αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο, ενορχηστρωμένη από ενδοκυτταρικές πρωτεάσες κασπάσης. Ωστόσο, η αποτελεσματικότητα ορισμένων από αυτές τις θεραπείες αμβλύνεται από μεταλλάξεις που επηρεάζουν συγκεκριμένους τελεστές γονιδίων που ελέγχουν ή /και ρύθμισης αποπτωτικά σηματοδότηση, όπως επιγενετική αποσιώπηση της κασπάσης 8, προς τα κάτω ρύθμιση των προ-αποπτωτικών πρωτεϊνών Bax και Apaf-1, καθώς και προς τα πάνω ρύθμιση του οι αντι-αποπτωτικών πρωτεϊνών της οικογένειας Bcl-2 και ΙΑΡ. Ως εκ τούτου, υπήρξε μια απότομη αύξηση της δραστηριότητας γύρω ταυτοποίηση νέων οδών κυτταρικού θανάτου, το οποίο θα μπορούσε να λειτουργήσει σε συνδυασμό με ή απουσία αποτελεσματικών αποπτωτικών μηχανημάτων. Στο πλαίσιο αυτό, πρόσφατα στοιχεία ανέδειξε την ύπαρξη ενός νέου, κασπάσης-ανεξάρτητο μονοπάτι, που ονομάζεται αυτοφαγία, η οποία ενεργοποιείται σε απόκριση σε παράγοντα ανάπτυξης στέρηση ή κατά την έκθεση σε γονιδιοτοξικά ενώσεις [1]. Ότι, η κριτική επιτροπή είναι ακόμα έξω από τη λειτουργική σημασία αυτής της πορείας όσον αφορά την ικανότητά της να χρησιμεύσει ως αντίδραση στο στρες ή ένα μηχανισμό πραγματικά τελεστή θάνατο, πρόσφατα στοιχεία φαίνεται να υποστηρίζει ότι η αυτοφαγία είναι μια εξειδικευμένη μορφή κυτταρικού θανάτου υπό ορισμένες προϋποθέσεις [ ,,,0],2], [3], [4].

Μεταξύ των διαφόρων μηχανισμών τελεστών που εμπλέκονται στον έλεγχο και τη ρύθμιση των οδών κυτταρικού θανάτου, συμπεριλαμβανομένων απόπτωση και αυτοφαγία, είναι η κατάσταση κυτταρική οξειδοαναγωγής. Η κατάσταση οξειδοαναγωγής του κυττάρου προσδιορίζεται από την ισορροπία μεταξύ των ρυθμών παραγωγής και την κατανομή των δραστικού οξυγόνου και /ή είδη αζώτου (ROS? RNS) [5], όπως το ανιόν υπεροξειδίου (O

2

-) , υπεροξείδιο του υδρογόνου (H

2O

2), ρίζα υδροξυλίου (ΟΗ), το μονοξείδιο του αζώτου (ΝΟ) και υποχλωριώδες οξύ (ΗΟΟΙ) [6]. Έχουμε δείξει προηγουμένως ότι καρκινικού κυττάρου απόκριση σε ερεθίσματα θάνατος είναι μία συνάρτηση της κατάστασης κυτταρικής οξειδοαναγωγής, και ερεθίσματα, συγκεκριμένα ενώσεις που επάγει θάνατο, ότι επάγουν μια σημαντική αύξηση στην ενδοκυτταρική H

2O

2 διευκολύνει την εκτέλεση θάνατο [7 ], [8], [9], [10] [11], [12], [13], [14], [15].

Είναι ενδιαφέρον, ROS έχουν επίσης δειχθεί ως ισχυρά σήματα για η ενεργοποίηση των ενεργοποιημένων από μιτογόνο κινάσης πρωτεΐνης (ΜΑΡΚ) οικογένεια πρωτεϊνών που αποτελείται από C-Jun Ν-τερματικής κινάσης (JNK) σηματοδότησης, ρ38 και ERK [16]. Τα μέλη της οικογένειας ΜΑΡΚ ενεργοποιούνται σε έναν καταρράκτη κινάσης 3 βαθμίδων που αποτελείται από ΜΑΡΚ κινάσης κινάσης (ΜΑΡΚΚΚ), ΜΑΡΚ κινάσης (ΜΑΡΚΚ) και ΜΑΡΚ [17]. Παρατεταμένη ενεργοποίηση της JNK έχει συνδεθεί άμεσα σε αύξηση της ενδοκυτταρικής παραγωγής ROS [18], και ένας πιθανός μηχανισμός θα μπορούσε να είναι μέσω αδρανοποίηση της ΜΑΡΚ Φωσφατάσες (ΜΚΡ) [6]. Αξίζει να σημειωθεί ότι, σε αύξηση της ενδοκυτταρικής ROS καθώς και την ενεργοποίηση της ΜΑΡΚ έχει αποδειχθεί κατά τη διάρκεια αυτοφαγικά εκτέλεσης [19], [20].

Autophagy έχει επίσης αναγνωριστεί ως η διάθεση απορριμμάτων του κυττάρου, που εμπλέκονται κατά κύριο λόγο στην παγίδευση της μεμβράνης πλάσματος και μακρόβια οργανίδια σε αυτοφαγοσώματα, που τελικά ενώνονται με τα λυσοσώματα για την υποβάθμιση και την ανακύκλωση των θρεπτικών ουσιών [21], [22]. Το πιο σημαντικό, επίμονη αυτοφαγία σε απόκριση σε κυτταρικές καταστάσεις στρες χρησιμεύει ως ένα σήμα ισχυρός θανάτου [23], [24], [25], όπως στην περίπτωση της θεραπείας που προκαλείται από αυτοφαγία, μια συγκεκριμένη μη-αποπτωτικό μονοπάτι θάνατος πυροδοτείται κατά την έκθεση σε χημειοθεραπευτικών ενώσεων [26]. Οι συνθήκες αυτές αποτελούν τη βάση για την ταυτοποίηση των κυτταρικό θάνατο τύπου ΙΙ, η οποία χαρακτηρίζεται από υπερβολική σχηματισμό autophagosome [27], [28]. Παραδόξως, το βασικό επίπεδο της αυτοφαγία που προκαλείται από στρες, όπως η υποξία και αυξητικού παράγοντα συμβουλές απόσυρση της κυτταρικής τύχης προς επιβίωσης [29], [30], [31].

Η ενεργοποίηση της κανονικής οδού αυτοφαγία είναι αυστηρά στο πλαίσιο ο έλεγχος της πρωτεΐνης που αλληλεπιδρά BH-3 μόνο Bcl-2, Beclin1 [32]. Αξίζει να σημειωθεί ότι, πρόσφατα στοιχεία κατέρρευσε ένα μυθιστόρημα αυτοφαγικά μονοπάτι κυτταρικού θανάτου όπου Beclin1 είναι εντελώς περιττό [33]. Αυτό θα μπορούσε να είναι υψίστης σημασίας, όπως την εκτέλεση των μη κανονικών αυτοφαγία στα καρκινικά κύτταρα που φέρουν ένα φαινότυπο νοκ-άουτ Beclin1, θα μπορούσε να αποτελέσει μια νέα και αποτελεσματική στρατηγική για να προκαλέσει θάνατο των καρκινικών κυττάρων [34].

Εδώ αναφέρουμε τον μηχανισμό κυτταρικού θανάτου που επάγεται σε ανθρώπινα κύτταρα όγκου από μία νέα ένωση μικρού μορίου, 1,3-διβουτυλ-2-θειοξο-ιμιδαζολιδίνη-4,5-διόνη (C1). Η έκθεση του ανθρώπινου καρκινώματος του παχέος εντέρου και μια ποικιλία άλλων κυτταρικών γραμμών όγκου να C1 οδήγησε σε κυτταρικό θάνατο με μορφολογικά και βιοχημικά χαρακτηριστικά συνεπή με μη κανονικά αυτοφαγία και την απόπτωση. Επιπλέον, τονίζουμε το σπερματικό συμμετοχή της πρώιμης παραγωγής ROS και ERK και JNK ενεργοποίηση ανάντη του αυτοφαγικά και αποπτωτικά μονοπάτια. Αυτή είναι μια νέα έκθεση τονίζεται η ταυτόχρονη επαγωγή Beclin1 ανεξάρτητη αυτοφαγία και την απόπτωση στα καρκινικά κύτταρα από ένα μικρό μόριο ένωση, η οποία θα μπορούσε να έχει τεράστιες κλινικές επιπτώσεις, λαμβάνοντας υπόψη τη σχετικά υψηλή επίπτωση της απώλειας Beclin1 σε ανθρώπινους καρκίνους.

υλικά και Μέθοδοι

Αντιδραστήρια και Χημικών

ο αναστολέας παν-κασπάσης,-ίτηκ, και η κασπάσης 3 και 9 αναστολείς (DEVD-fmk και VEHD-fmk) ελήφθησαν από την Alexis Biochemicals ( Lausen, Ελβετία). Ο αναστολέας JNK (SP600125), ο αναστολέας της ERK (PD98059), βόεια καταλάση, Balanced Salt Solution του Earle (EBSS) μέσο, ​​ραπαμυκίνη, διαιθυλδιθειοκαρβαμικό (DDC), Ε64ϋ, πεπστατίνη-Α, 3-μεθυλαδενίνη, C2-Ceramide, Ν-ακετυλο -κυστεϊνη, κρυσταλλικό ιώδες, και ΜΤΤ αγοράστηκαν από την Sigma Aldrich (St. Louis, ΜΟ). Η υπεροξειδική δισμουτάση (SOD) αγοράστηκε από Calbichem (Merck KGaA, Darmstadt, Germany). παράγοντα-άλφα νέκρωσης όγκου (TNF-α) λήφθηκε από την Upstate (Millipore, ΜΑ).

Tumor Κυτταρικές Γραμμές

κύτταρα καρκινώματος HCT116 ορθοκολικού είχαν γενναιόδωρα από τον Dr. Bert Vogelstein (The Johns Hopkins University School of Medicine, Baltimore, MD) και διατηρήθηκαν σε McCoy 5Α (Gibco Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA) συμπληρωμένο με 10% εμβρυϊκό βόειο FBS ορού), 1% Ε-γλουταμίνη, και 1% S-πενικιλλίνη (Hyclone, Θέρμο Επιστημονική, Waltham, ΜΑ) σε 37 ° C επωαστή με 5% CO

2. HeLa τραχηλικό καρκίνωμα, Α549 μικροκυτταρικό καρκίνωμα του πνεύμονα, Μ14 μελάνωμα, κυτταρικές γραμμές SHEP1 και SHSY5Y νευροβλαστώματος ελήφθησαν από την ATCC και διατηρήθηκαν σε DMEM (Hyclone) συμπληρωμένο με 10% FBS. MCF-7, Τ47ϋ, και ΜΒ-MDA231 κυτταρικές σειρές καρκίνου του μαστού ήταν από την ATCC και καλλιεργήθηκαν σε RPMI (Hyclone) συμπληρωμένο με 10% FBS. HK-6, C666-1 κυτταρικές σειρές καρκινώματος του ρινοφάρυγγα, προικισμένος από τον Δρ Lo Kwok-wai (Η κινεζική Πανεπιστήμιο του Χονγκ Κονγκ) και ο Δρ Hsieh Wen-γιο (Johns Hopkins Σιγκαπούρη), διατηρήθηκαν σε RPMI συμπληρωμένο με 10% FBS .

Η επιμόλυνση με pGFP-rLC3 και siRNA

Για παροδική έκφραση, τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με 8 μα pGFP-LC3 ή pCINeoEV ή pCIneo + Cat πλασμίδια σε μέσο Optimem1 ™ (Invitrogen Corporation, Carlsbad , CA) με χρήση του αντιδραστηρίου επιμόλυνσης Superfect (Qiagen, Valencia, CA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Για knockdown της γονιδιακής έκφρασης, 50 ηΜ siRNA (beclin- 1 siRNA, ή JNK1 /2 siRNA, ή ERK1 /2 siRNA, ή siRNA ATG7, ή ULK-1 siRNA) διαμολύνθηκε σε κύτταρα σε μέσο Optimem1 ™ χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο Dharmafect1 ( Dharmacon) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

Κυτταρική βιωσιμότητα και αποικιών όγκων που σχηματίζουν δοκιμασίες

Κυτταρική βιωσιμότητα μετά την έκθεση του φαρμάκου προσδιορίστηκε με την δοκιμασία ΜΤΤ όπως περιγράφηκε προηγουμένως (14). Για δοκιμασίες σχηματισμού αποικίας, 10.000 κύτταρα τοποθετήθηκαν σε τρυβλία Petri και καλλιεργούνται για 2 εβδομάδες. Οι πλάκες στη συνέχεια χρωματίστηκαν με κρυσταλλικό ιώδες διάλυμα (Sigma Aldrich, St. Louis, ΜΟ) και οι αποικίες βαθμολογήθηκαν χειροκίνητα, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [35].

ιωδιούχου προπιδίου χρώση για τον κατακερματισμό του DNA

Cells υποβλήθηκαν σε θεραπεία με C1 για τα υποδεικνυόμενα χρονικά σημεία, όπως περιγράφεται στο σχήμα λεζάντες πριν ιωδιούχου προπιδίου χρώση για ανάλυση DNA περιεχόμενο όπως περιγράφηκε προηγουμένως (14). δεδομένα ιστογράμματος που δείχνει το ποσοστό των κυττάρων με υπο-διπλοειδείς DNA δείχνονται και είναι μέσες ± SD τριών ανεξάρτητες παρατηρήσεις.

Ανάλυση κυτταρομετρίας ροής της ενδοκυττάριας ROS

Τα κύτταρα φορτώθηκαν με 5 μmol /L η ευαίσθητη οξειδοαναγωγής βαφή 5- (και-6) -χλωρομεθυλο-2-, 7-dichlorofluorescin διοξεικό (Molecular Probes, Invitrogen Corporation) όπως περιγράφηκε προηγουμένως (14) και αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής (Coulter EPICS Elite ESP). Ανίχνευση της ενδο-μιτοχονδριακών O

2

– έγινε με τη φόρτωση των κυττάρων με MitoSox ™ RED MITOCHODNRIAL O

2

– ΔΕΙΚΤΗ (Molecular Probes, Invitrogen Corporation) όπως περιγράφηκε προηγουμένως και αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής ( Coulter EPICS Elite ESP). Τουλάχιστον 10.000 συμβάντα αναλύθηκαν.

Απομόνωση μιτοχονδρίων

κύτταρα HCT116 σε επεξεργασία με C1 για 6, 12 και 24 ώρες υποβλήθηκαν σε μιτοχονδριακή εκχύλιση όπως περιγράφεται αλλού (14). Το μιτοχονδριακό σφαιρίδια λύθηκαν σε πρότυπο ρυθμιστικό 1xRIPA λύσης και τα υπερκείμενα χρησιμοποιήθηκαν ως κυτοσολικά κλάσματα.

ανάλυση ανοσοφθορισμού των pGFP-rLC3 και πορτοκαλί της ακριδίνης

Ανάλυση της LC3 διεξήχθη χρησιμοποιώντας pGFP-rLC3 επιμολυσμένα κύτταρα με μικροσκοπία ανοσοφθορισμού. Μετά την επιμόλυνση με pGFP κενό φορέα ή pGFP-rLC3, τα κύτταρα επωάστηκαν με C1 για 6 έως 24 ώρες και παρατηρήθηκαν με ένα μικροσκόπιο φθορισμού (Eclipse TE2000-S, Nikon) χρησιμοποιώντας μήκος κύματος διέγερσης 488 nm και μήκος κύματος εκπομπής 525 nm. Για την οπτικοποίηση των λυσοσώματα, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε θεραπεία για 6 ώρες και στη συνέχεια χρωματίστηκαν με 2,5 μg /ml ακριδίνη πορτοκαλί (Molecular Probes, Invitrogen Corporation) για 10 λεπτά στους 37 ° C, και αναλύθηκαν για τα δύο, πράσινο και κόκκινο flurorescence, χρησιμοποιώντας μικροσκοπία φθορισμού όπως αναφέρθηκε παραπάνω.

Ηλεκτρονική μικροσκοπία

τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν επί μία νύκτα σε 2,5% glutaraldelhyde σε 0.1 Μ φωσφορικό ρυθμιστικό (ρΗ 7.2), πριν να μετα-σταθεροποιήθηκαν σε 1% OsO4 για 1 ώρα. Στη συνέχεια, τα κύτταρα αφυδατώθηκαν σε σειρά αιθανόλης και ενσωματώνονται σε ρητίνη Spurr του. Εξαιρετικά λεπτές τομές χρωματίστηκαν με οξικό ουρανύλιο και κιτρικό μόλυβδο και παρατηρήθηκαν κάτω από ένα JEOL JEM-1230 ηλεκτρονικό μικροσκόπιο.

Δοκιμασία κυτταροτοξικότητας για πρωτογενή κύτταρα από ιστούς λεμφώματος

Πρωτογενής ιστό όγκου από ασθενείς με T ή Β κυτταρικό λέμφωμα ελήφθησαν από συναινούντων ασθενών στο Εθνικό Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο σύμφωνα με το εγκεκριμένο IRB πρωτόκολλο. Ιστοί κιμά και τεταμένες μέσω του φίλτρου διαχωρισμού MACS (Miltenyi Biotec) για να ληφθεί εναιωρήματα μονών κυττάρων. Τα λεμφοκύτταρα ελήφθησαν μετά από φυγοκέντρηση βαθμίδωσης Ficoll Hypaque. Κυτταρική βιωσιμότητα του πρωτογενούς λεμφώματος /200 μl /φρεάτιο σε πλάκες 96 φρεατίων προσδιορίστηκε με ανάλυση ΜΤΤ μετά από έκθεση σε 25 και 50 μg /ml του C1 για 24 ώρες. ΜΤΤ δοκιμασία αξιολογήθηκε όπως περιγράφεται στο προηγούμενο τμήμα.

Western ανάλυση κηλίδος

ολόκληρου εκχυλίσματα κυτταρικής πρωτεΐνης απομονώθηκαν χρησιμοποιώντας 1Χ RIPA ρυθμιστικό λύσης (50 mM Tris-HCl, ρΗ 7.4, 150 mM NaCl , 0,25% δεσοξυχολικό οξύ, 1% ΝΡ-40, 1 mM EDTA και αναστολείς πρωτεάσης (Calbiochem, San Diego, CA). Ίσες ποσότητες πρωτεΐνης από τα συνολικά κυτταρολύματα (30 έως 120 μg /λωρίδα) διαχωρίστηκαν με δωδεκυλοθειικό νάτριο (10%, 12% ή 15%) γέλες πολυακρυλαμιδίου (SDS-PAGE? BioRad Laboratories), μεταφέρθηκαν σε μεμβράνη PVDF (BioRad Laboratories) χρησιμοποιώντας υγρό μεταφοράς (BioRad Laboratories) και στυπώθηκαν με πρωτογενή αντισώματα ειδικά για Βαχ, ρ62, LC3 , κασπάση 9, β-ακτίνη, GAPDH, ULK1 (Santa Cruz Biotechnology), Beclin1, ATG7, ATG12, ATG5, κυτόχρωμα C, JNK, π-JNK, c-Jun, pc-JUN, Bid (Cell Signaling Technology), κασπάση 3 (Upstate, Millipore Corporation), κασπάση 8, Smac, αντι-πολυ (ΑΟΡ-ριβόζη) πολυμεράσης (BD Pharmingen) και η καταλάση (Calbiochem) και ανιχνεύθηκαν με τα αντίστοιχα αντισώματα ειδικά δευτερογενή ισότυπου με ετικέτα με υπεροξειδάση (Thermo Scientific Pierce, Rockford, IL). Δεσμεύεται ανοσο-συμπλέγματα ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας WEST PICO Χημειοφωταύγειας υπόστρωμα (Thermo Scientific Pierce, Rockford, IL).

Σύνθεση και ανάλυση του μικρού μορίου ένωση C1

Το μικρό μόριο ένωσης 1,3- διβουτυλο-2-θειοξο-ιμιδαζολιδίνη-4,5-διόνη, που εδώ αναφέρεται ως C1, συντέθηκε ως εξής: Οξαλυλ χλωρίδιο προστέθηκε σε 1,3-διβουτυλ-2-θειουρία (10 mM) σε άνυδρο αιθέρα σε μία στρογγυλού πυθμένα φιάλη υπό ανάδευση. Το μίγμα της αντίδρασης αναδεύτηκε για 1 έως 2 ώρες σε θερμοκρασία περιβάλλοντος και στη συνέχεια χύνεται μέσα σε κορεσμένο NaHCO

3. Το προϊόν εκχυλίζεται με οξικό αιθυλεστέρα 3Χ. Η στιβάδα οξικού αιθυλεστέρα στη συνέχεια πλύθηκε με απεσταγμένο νερό και στη συνέχεια αλατόνερο νερό. οξικός αιθυλεστέρας στη συνέχεια ξηράνθηκε με άνυδρο Mg

2SO

4 και απομακρύνθηκε υπό ελαττωμένη πίεση. Ο καθαρισμός μέσω χρωματογραφίας flash (οξικό αιθύλιο: εξάνιο) έδωσε το κίτρινο ελαιώδες προϊόν. Το ελαιώδες προϊόν στερεοποιήθηκε σε ένα ψυγείο. Η ένωση στη συνέχεια αναλύθηκε με

1ΗΝΜΡ,

13C NMR και MS και τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως εξής:

Όνομα: 1,3-διβουτυλο-2-θειοξο-ιμιδαζολιδινο-4,5-διόνη? Χρώμα: Πορτοκαλί? FT-IR (σε CH

2Cl

2): 2875-2960 cm

– (Αλειφατικές CH), 1770 (C = O), 1410 (C = S)?

1HNMR (σε ΟϋΟ

3): δ = 0.95 9 (t, J = 7,3 Hz, 6Η, 4′-CH

3), 1,34 (εξαπλό, J = 7.7 Hz, 4Η, 3 ‘ -CH

2), 1.67 (πενταπλή, J = 7,2 Hz, 4Η, 2-CH

2) 3.93 (t, J = 7,5 Hz, 4Η, 1′-CH

2)?

13C NMR (σε ΟΗΟ

3): δ = 13,54 (C4 ‘), 19.90 (C-3’), 29.72 (C-2 ‘), 41.83 (C-1’), 155,35 (C- 4.5), 180.63 (C-2)? Μάζα m /z (%): 242 (100) [Μ

+], 209 (26) [Μ + -HS], 187 (22)? MF C

11

18Ν

2O

2S υπολογιστεί 242.34, 243.34 Βρέθηκαν

Η

. Απόδοση: 95%

Η

Στατιστικές Ανάλυση

Όλα τα πειράματα διεξήχθησαν τουλάχιστον 3 φορές εκτός αν αναφέρεται διαφορετικά. Πειραματικό διαφορές δοκιμάστηκαν για στατιστική σημαντικότητα χρησιμοποιώντας Φοιτητών

t-test

.

P

αξία των & lt? 0,05 θεωρήθηκε ως σημαντική

Αποτελέσματα

C1 προκαλεί κυτταρικό θάνατο και ΜΟΜΡ σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα

Η έκθεση των καρκινικών κυττάρων. σε αυξανόμενες συγκεντρώσεις (25-200 μg /ml) από C1 ως αποτέλεσμα μια εξαρτώμενη από τη δόση μείωση στη βιωσιμότητα των κυττάρων στις 24 ώρες με την LD50 του -100 μg /ml (Σχήμα 1Β). Επιπλέον, δοκιμασία σχηματισμού αποικίας έδειξαν μια σημαντική μείωση στην κλωνογονική ικανότητα στα 25 και 50 μg /ml και την πλήρη παύση του σχηματισμού αποικιών σε 100 μg /ml (Σχήμα 1 C). Τα αποτελέσματα έδειξαν επίσης ότι η επώαση των κυττάρων με C1 ενεργοποιείται μιτοχονδριακής διαπερατότητας της εξωτερικής μεμβράνης (ΜΟΜΡ), όπως αποδεικνύεται από την μετατόπιση του κυτοχρώματος c και Smac, και την αμοιβαία μετατόπιση των Βαχ και Bid στα μιτοχόνδρια (Εικόνα 1D). Επιπλέον, ως μάρτυρες για την αποτελεσματική επεξεργασία των κασπασών 3, 8 και 9, και η αποκοπή του κασπάσης 3 PARP υποστρώματος σε συνολικά κυτταρολύματα από κύτταρα μετά από θεραπεία C1, η οποία διασώθηκε με την παρουσία-ίτηκ (Σχήμα 1Ε, F ). Ανάλυση του κυτταρικού κύκλου αποκάλυψαν το 20% των κυττάρων με υπο-διπλοειδείς περιεχόμενο DNA (πληθυσμός υπο-G1) μετά από θεραπεία 24 ωρών, η οποία ήταν σημαντικά αυξημένη (52%) μετά από επώαση για 48 ώρες και μπλοκάρεται με την παρουσία του παν-κασπάσης αναστολέα (Σχήμα 1G). Περιέργως, zVAD εν μέρει μόνο υπό την προϋπόθεση μορφή προστασίας C1-επαγόμενη κυτταρικό θάνατο (Εικόνα 1). Αυτά τα δεδομένα έδειξαν ότι C1-επαγόμενο κυτταρικό θάνατο μπορεί να περιλαμβάνει κασπάσης-ανεξάρτητες οδούς. Για να διερευνηθεί αυτό, αξιολογήσαμε πρώτα την επίδραση του αναστολέα νέκρωση, necrostatin, επί C1-επαγόμενο κυτταρικό θάνατο. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι ενώ necrostatin μπορούσε αποτελεσματικά καταργεί Παράγοντα Νέκρωσης Ογκου-α που προκαλείται από κυτταρικό θάνατο (Συμπληρωματική Εικόνα S1A), δεν είχε καμία επίδραση στην C1-επαγόμενο κυτταρικό θάνατο, έτσι αποκλείοντας τη συμμετοχή των νέκρωσης σε αυτό το μοντέλο (Σχήμα 1Θ).

(Α) Χημική δομή και το μοριακό βάρος της ένωσης C1. (Β) Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με αυξανόμενες συγκεντρώσεις C1 (25 μg /ml έως 100 μg /ml) για 18 ώρες και η επιβίωση των κυττάρων αξιολογήθηκε με την δοκιμασία ΜΤΤ. (Γ) Μετά την έκθεση σε C1 όπως στο (Β), 10.000 κύτταρα σπάρθηκαν σε τριβλία petri 100 mm για την αξιολόγηση του σχηματισμού αποικιών. (D) Κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με C1 (100 μg /ml) για 6, 12 και 24 ώρες, και υπο-κυτταρικά κλάσματα υποβλήθηκαν σε ανάλυση κηλίδος Western. (Ε) Κυτταρολύματα από κύτταρα επεξεργασμένα με C1 (100 μg /ml) για ανιχνεύθηκε για την επεξεργασία των κασπασών 3, 9 και 8. (F, G, H) κύτταρα υποβάλλονται σε επεξεργασία με C1 (100 μg /ml για 18 ώρες) σε η παρουσία ή απουσία του-ίτηκ (50 μΜ) για 12 και 24 ώρες και (F) λύματα ανιχνεύθηκαν για διάσπαση PARP και (G) προφίλ κύκλου κυττάρου ελήφθησαν με χρώση ΡΙ και (H) επιβίωση αξιολογήθηκε με την δοκιμασία ΜΤΤ . (Ι) Τα κύτταρα προ-επωάστηκαν με Necrostatin-1 (50 μΜ για 1 ώρα) πριν από την έκθεση σε C1 (100 μg /ml για 18 ώρες) και η επιβίωση αξιολογήθηκε με την δοκιμασία ΜΤΤ.

Η

επαγωγή Beclin1-ανεξάρτητο αυτοφαγία από C1

Στη συνέχεια, ηλεκτρονίων μικροσκοπική ανάλυση της μορφολογίας των κυττάρων έγινε μετά από έκθεση σε C1. Περιέργως, η έκθεση των κυττάρων σε C1 (100 μg /ml για 24 ώρες) είχε ως αποτέλεσμα το σχηματισμό αυτοφαγοσώματα και αυτοφαγικά κενοτόπια (Σχήμα 2Α). Επιπλέον, η αυξημένη έκφραση του map1 LC3II (στο παρόν αναφέρεται ως LC3II) παρατηρήθηκε σε έναν χρονο-εξαρτώμενο τρόπο (Σχήμα 2Β). Από την ιδιαίτερη σημείωση, προσδιορίσαμε για πρώτη φορά LC3II εμπλουτισμού στα βαρέα μεμβράνη κλασμάτων μετά τη θεραπεία φαρμάκου (Σχήμα 2C). Αυτό μπορεί να υποδεικνύει την παρουσία των μιτοχονδριακών περικύκλωσης από τα χυμοτόπια αυτοφαγικά. Επιπλέον, κύτταρα διαμολυσμένα με LC3-GFP εμφανίζεται ένα διάχυτο πρότυπο, ενώ η έκθεση σε C1 οδήγησε σε μια χρώση πράσινη στικτή, ενδεικτική της συσσώρευσης LC3II μέσα στις μεμβράνες autophagosomal (Σχήμα 2D). Επιπλέον, μια σημαντική αύξηση στην έκφραση του ATG7 και Atg5 μαζί με αμοιβαία μείωση στην έκφραση Atg12 παρατηρήθηκε κατά την έκθεση (6-24 ώρες) των κυττάρων σε C1, υποδεικνύοντας Atg5-Atg12 σύζευξη (Σχήμα 2Ε).

(Α) κύτταρα HCT116 υποβλήθηκαν σε αγωγή με C1 (100 μg /ml) για 24 ώρες, σταθεροποιήθηκαν και παρατηρήθηκαν υπό μικροσκόπιο ηλεκτρονίου (μεγέθυνση χ 40.000). Τα βέλη δείχνουν την παρουσία αυτοφαγοσώματα. (Β) Κυτταρολύματα κύτταρα επεξεργασμένα με C1 (100 μg /ml) ανιχνεύθηκαν για LC3II. (C) Κηλίδωση Western ανάλυση LC3II εντός του κυτοσολίου και μιτοχονδριακή κλάσματα των κυττάρων μετά από έκθεση σε C1. (D) Κύτταρα διαμολύνθηκαν παροδικά με GFP-Vector ή LC3-GFP για 48 ώρες, εκτέθηκαν σε C1 για 24 ώρες και στη συνέχεια αναλύονται χρησιμοποιώντας ένα μικροσκόπιο φθορισμού. Βέλη δείχνουν προς την χρώση στικτή αναφέροντας LC3 συνάθροιση II σε αυτοφαγοσώματα. (Mag: 40,000 ×). (Ε) Μετά την έκθεση C1, λύματα κυττάρων ανιχνεύθηκαν για ATG7, Atg5 και Atg12.

Η

Στη συνέχεια θα εξεταστεί αν υπήρχε επαρκής αυτοφαγικά ροή κατά την έκθεση στο C1. Αυτοφαγικά ροή είναι ζωτικής σημασίας για να καθοριστεί αν η αυτοφαγικά φορτίου και το συγκρότημα φτάνει τελικά τα λυσοσώματα και στη συνέχεια υποβαθμισμένη. Ένας από τους τρόπους για τον προσδιορισμό αυτοφαγικά ροή είναι προ-θεραπεία με αναστολείς λυσοσωμικού, Ε64ϋ και πεπστατίνη Α, πριν από την προσθήκη του ερεθίσματος. Λυσοσωμική αναστολείς αυξάνουν LC3 σχηματισμό ΙΙ, εν μέρει, αναστέλλοντας τη autophagosomal-λυσοσωμική σύντηξης. Συνεπώς, διερευνήσαμε την επίδραση της αναστολής λυσοσωμικών επί του σχηματισμού LC3II C1-επαγόμενη. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι οι αναστολείς αύξηση του κύκλου εργασιών LC3II στα κύτταρα σε πρώιμα χρονικά σημεία (6 ώρες), ωστόσο, δεν υπήρξε περαιτέρω αύξηση κατά περισσότερο από επώαση (24 ώρες) με την ένωση (Συμπληρωματική Εικόνα S1E). Στη συνέχεια ελέγχονται για το επίπεδο έκφρασης της ρ62 /SQSTM1, δείκτης της αυτοφαγικά ροής [36]. Τα επίπεδα του ρ62 μειώθηκαν κατά την αγωγή C1 σε πρώιμα χρονικά σημεία ενδεικτικά της αποτελεσματικής αυτοφαγία, ωστόσο τα επίπεδα αυξήθηκαν στη συνέχεια (12-24 ώρες? Συμπληρωματική Εικόνα S1F), η οποία θα μπορούσε να συνεπάγεται το ενδεχόμενο ανώμαλης αυτοφαγικά ροής. Η τελευταία παρατήρηση υποστηρίχθηκε περαιτέρω από την απόδειξη της ρήξης λυσοσωματικής, προσδιορίστηκε με πορτοκαλί της ακριδίνης, το οποίο φθορίζει σε κόκκινο σε όξινα διαμερίσματα όπως τα λυσοσώματα και πράσινος σε ουδέτερο ρΗ. Μια αύξηση στο πράσινο flurorescence με αμοιβαία μείωση σε κόκκινο flurorescence παρατηρήθηκε στα κύτταρα κατά την έκθεση σε C1, υποδεικνύοντας ρήξη των λυσοσώματα (Συμπληρωματική Εικόνα S1F).

Για να αξιολογηθεί ο ρόλος της Beclin1 στο C1-επαγόμενη αυτοφαγία, μεσολάβηση RNAi αποσιώπηση των

Beclin1

εκτελέστηκε. Γκρεμίζω του

Beclin1

ούτε ανέστειλαν συσσώρευση LC3II επάγεται από C1 ούτε θα μπορούσε να διασώσει τα κύτταρα από τον θάνατο ενεργοποίηση δραστικότητα της μικρομοριακή ένωση (Σχήμα 3Α). Αξίζει να σημειωθεί ότι,

Beclin1

αποσιώπηση θα μπορούσε να καταργήσει αποτελεσματικά το σχηματισμό LC3II ορού πείνα που προκαλείται, αποδεικνύοντας το κλασικό ρόλο του Beclin1 στην πείνα που προκαλείται από αυτοφαγία (Συμπληρωματική Εικόνα S1c). Σε αντίθεση με

Beclin1

αποσιώπηση, si

ATG7

οδήγησε σε σημαντική μείωση της συσσώρευσης LC3II που προκαλείται μετά από έκθεση C1 ενώ το αποπτωτικό σήμα (διάσπαση PARP) παρέμεινε αμετάβλητη (Εικόνα 3Β). Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα δεδομένα παρέχουν ισχυρές ενδείξεις ότι η έκθεση των κυττάρων HCT116 σε C1 ενεργοποιεί μη κανονικά αυτοφαγία, αλλά περιλαμβάνει τη μεσολάβηση της ουβικιτίνης Ε1 ένζυμο που μοιάζει ATG7. Επιβεβαιωτικός αυτά τα ευρήματα, τα αποτελέσματα προκύπτουν με γονίδιο knockdown του UNC-51 σαν κινάση (ULK1? Ομόλογο θηλαστικών του ζυμομύκητα Atg1), η οποία παρομοίως παρεμπόδισε σχηματισμό LC3II σε αυτό το μοντέλο (Σχήμα 3C). Επιπλέον,

a priori

επεξεργασία των κυττάρων με 3-ΜΑ (5 ή 10 mM) δεν είχε σχεδόν καμία επίδραση στην συσσώρευση LC3 II που προκαλείται από C1 (Σχήμα 3D). Σημαντικά, προ-επεξεργασία των HCT116 κυττάρων με-ίτηκ, κασπάσης 3 αναστολέα ή αναστολέα κασπάσης 9 δεν τροποποίησε τη συσσώρευση LC3II Ι που επάγεται από C1, υποδεικνύοντας ότι τα σήματα που διέπουν την απόπτωση δεν επηρεάζουν τον αυτοφαγικά μονοπάτι σηματοδότησης (Σχήμα 3Ε). Το πιο σημαντικό, αποσιώπηση του ATG7 σημαντικά προστατεύονται HCT116 κυττάρων από C1-επαγόμενη μείωση στην βιωσιμότητα των κυττάρων, υποδεικνύοντας ότι το σήμα αυτοφαγικά θα μπορούσε να είναι ένας αποτελεσματικός σκανδάλη κυτταρικού θανάτου (Σχήμα 3F). Καθώς δεν συμμετείχε Beclin1 στο C1-που προκαλείται από αυτοφαγία, νοκ ντάουν της Beclin1 φυσικά δεν μετέβαλε την απόκριση κυτταρικού θανάτου (Σχήμα 3F). Ωστόσο, ULK αποσιώπηση είχε επίσης σημαντική επίδραση επί του κυτταρικού θανάτου (Σχήμα 3F), υποστηρίζοντας έτσι υπέρ των αντισταθμιστικών επιδράσεις που ασκούνται από άλλους εξέχοντες

Atg

γονίδια.

(Α), (Β) και (Γ) κύτταρα διαμολύνθηκαν παροδικά με siRNA κατά Beclin1, ή ATG7 ή ULK1 για 48 ώρες που ακολουθείται από έκθεση σε C1 (100 μg /ml) για 24 ώρες. Λύματα ολόκληρων κυττάρων στη συνέχεια ανιχνεύθηκαν για LC3II. (D) Τα κύτταρα προ-επωάστηκαν με 3-ΜΑ (5 ή 10 mM) για 1 ώρα πριν την έκθεση σε 100 μg /ml του C1 για 18 ώρες. Τα προϊόντα λύσης στη συνέχεια ανοσο-κηλιδώθηκαν με αντι-LC3. (Ε) Τα κύτταρα προ-αγωγή με-ίτηκ (50 μΜ), κασπάσης 3 αναστολέα (50 μΜ) ή κασπάσης αναστολέα 9 (50 μΜ) πριν από την προσθήκη 100 μg /ml του C1 για 18 ώρες. Τα προϊόντα λύσης στη συνέχεια ανοσο-κηλιδώθηκαν με αντι-PARP και αντίσωμα αντι-LC3. (F) Τα κύτταρα διαμολύνθηκαν με siRNA κατά Beclin-1 ή ATG7 ή ULK1 και στη συνέχεια εκτέθηκαν σε 100 μg /ml του C1 για 18 ώρες. Η βιωσιμότητα των κυττάρων εκτιμήθηκε με τη δοκιμασία ΜΤΤ όπως περιγράφεται στα Υλικά και Μέθοδοι.

Η

Για να παρέχουν αποδείξεις ότι η αυτοφαγία-επαγωγική δράση του αυτό το μικρό μόριο ένωσης δεν περιορίζεται σε ορθοκολικού καρκινώματος κυτταρική γραμμή, ο σχηματισμός LC3II ήταν εκτιμάται σε 9 άλλες ανθρώπινες καρκινικές κυτταρικές σειρές των ποικίλων προελεύσεων. Πράγματι, μια αύξηση στο σχηματισμό LC3II παρατηρήθηκε σε όλες τις κυτταρικές γραμμές που εξετάστηκαν, αν και σε διαφορετικές συγκεντρώσεις του φαρμάκου (Σχήμα 4Α). Θα πρέπει να σημειωθεί ότι, παρόμοια με τα κύτταρα HCT116, αυτές οι κυτταρικές σειρές ήταν επίσης ευαίσθητα σε επαγωγή απόπτωσης με C1 (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Για να διερευνηθεί περαιτέρω η μεταγραφική σχέση αυτών των δεδομένων που λαμβάνονται με τις καθιερωμένες κυτταρικές σειρές, Στη συνέχεια εξετάσαμε την επίδραση της C1 σε μη μετασχηματισμένα κύτταρα (ΜΟΡ-10Α και MRC γραμμές) καθώς και σε πρωτογενή κύτταρα που λαμβάνονται από ασθενείς με λεμφώματα. Σε αντίθεση με τα καρκινικά κύτταρα, μη μετασχηματισμένα κύτταρα δεν έδειξαν κανένα σημάδι αυτοφαγία σε απόκριση σε C1, σε σύγκριση με τα κύτταρα HCT116 και MDA-MB-231 κύτταρα (Σχήμα 4Β). Επιπλέον, ένα αντιπροσωπευτικό δείγμα από έναν ασθενή με κλινικά λέμφωμα προκάλεσε σαφώς έντονος σχηματισμός LC3II σε απόκριση σε έκθεση στο φάρμακο (Σχήμα 4Β). Το πιο σημαντικό, η έκθεση των πρωτογενών κυττάρων που προέρχονται από ασθενείς λέμφωμα (n = 12) έδειξε εξαρτώμενη από τη δόση της ευαισθησίας σε C1, ενώ κύτταρα από μη καρκινικές λεμφαδένες ήταν σχετικά ανθεκτικοί στην θεραπευτική αντιμετώπιση (Σχήμα 4C). Αυτά τα δεδομένα αποδεικνύεται σαφώς ότι το μικρό μόριο ένωση C1 ενεργοποιείται και θάνατο των κυττάρων σε μια ποικιλία καρκινικών κυτταρικών σειρών και σε πρωτογενή κύτταρα, ενώ διαφυλάσσει μη μετασχηματισμένα κύτταρα.

(Α) Πρωτογενείς καλλιέργειες λεμφώματος και καλοήθεις ιστούς ήταν αναπτύχθηκαν σε πλάκες 6 φρεατίων και εκτίθενται σε C1 στα 25 και 50 μg /ml για 24 ώρες και η επιβίωση των κυττάρων αξιολογήθηκε με την δοκιμασία ΜΤΤ. (Β) Πρωτογενή κύτταρα λεμφώματος, MDA-MB-231 κύτταρα καρκίνου του μαστού, ΜΟΡ10Α μαστικά επιθηλιακά κύτταρα, HCT116 ορθοκολικού κύτταρα και MRC-5 ινοβλάστες ανθρώπινου πνεύμονα είχαν υποβληθεί σε θεραπεία με C1 σε διάφορες δόσεις για 18 ώρες. Κυτταρολύματα στη συνέχεια να είναι ανοσο-κηλιδώθηκαν με αντι-LC3 με ΟΑΡϋΗ ως έλεγχος φόρτωσης. (C) καρκινικά κύτταρα από διαφορετικές καταγωγές υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διάφορες συγκεντρώσεις C1 για 24 ώρες και συνολική κυτταρολύματα ανιχνεύθηκαν για LC3 II και β-ακτίνης.

Η

Η ενδοκυτταρική ROS ελέγχει C1-επαγόμενη αυτοφαγία και την απόπτωση

Αφού διαπιστώθηκε σαφώς την ικανότητα του C1 να προκαλέσει ταυτόχρονα αυτοφαγία και την απόπτωση στα καρκινικά κύτταρα, που έθεσε ως στόχο να διερευνήσει το μοριακό μηχανισμό (ες) που διέπουν αυτή τη βιολογική δραστηριότητα. Πρώτον, εκτιμήσαμε την επίδραση στην ενδοκυτταρική παραγωγή ROS χρήση δύο διαφορετικών φθοριζόντων ανιχνευτών (MITOSOX ™ RED και CM-DCHF-DA). Πράγματι, η έκθεση των κυττάρων σε C1 ως αποτέλεσμα μια σημαντική αύξηση στην ενδοκυτταρική παραγωγή ROS όπως μετράται από το H

2O

2-ευαίσθητες ανιχνευτή CM-DCHF-DA καθώς και μια αύξηση στην ενδο-μιτοχονδριακή O

2

– παραγωγή (Σχήμα 5Α). Προ-επώαση των κυττάρων με το ROS σαρωτή Ν-ακετυλο κυστεϊνη (NAC? 200 μΜ) ή το H

2O

2 καθαριστή, καταλάση (7000 μονάδες /ml), μπλοκάρει πλήρως την αύξηση στο CM-DCHF-DA φθορισμό, υποδεικνύοντας έντονα ότι το είδος ROS εμπλέκονται είναι η

2O

2 (Σχήμα 5Β). Επιβεβαιωτικός αυτά τα ευρήματα, η υπερέκφραση του ανθρώπινου καταλάσης βρέθηκε να καταργήσει C1-επαγόμενη παραγωγή ROS, η οποία αξιολογείται με χρώση CM-DCHF-DA (Σχήμα 5Α). Είναι ενδιαφέρον ότι, καταλάση προ-επώαση, καθώς και παροδική υπερέκφραση του πλασμιδίου που περιέχει γονίδιο ανθρώπινης καταλάση αναστέλλεται επίσης C1-επαγόμενη διάσπαση PARP, ενός δείκτη της κασπάσης 3 ενεργοποίησης (Σχήμα 5Β). Μια παρόμοια ανασταλτική δράση της καταλάσης (εξωγενής προσθήκη καθώς και υπερέκφραση) και NAC παρατηρήθηκε σε συσσώρευση LC3II επάγεται από C1 (Σχήμα 5C). Τα δεδομένα αυτά εμπλέκουν έντονα ενδοκυτταρική H

2O

2, όπως το ανάντη ερέθισμα που ελέγχονται τόσο αυτοφαγία και την απόπτωση σε αυτό το μοντέλο.

Σε όλες, 1 × 10

6 κύτταρα επωάστηκαν με 100 μg /ml του C1 για 3 ώρες και (Ai) ενδο-μιτοχονδριακή O

2

– προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας την φθορίζουσα χρωστική MitoSox ™ RED μιτοχονδριακού O

2

– Δείκτης και ενδοκυτταρική H

2O

2 ανιχνεύθηκε με DCHF-DA φόρτωσης και αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής. (Ai) Τα κύτταρα προ-επωάστηκαν με καταλάση (7000 μονάδες /ml) ή NAC (200 μΜ) για 1 ώρα πριν από τη θεραπεία με C1 (100 μg /ml για 3 ώρες) και ενδοκυτταρική H

2O

2 ήταν αποφασισμένος. (ΑΙΙ) Κύτταρα διαμολύνθηκαν παροδικά με 8 μα pCINeoEV ή pCIneo + CAT για 48 ώρες (ΑΙΙΙ) και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με C1 (100 μg /ml επί 3 ώρες) και ενδοκυτταρική H

2O προσδιορίστηκε

2 (ΑΙΙ ). Τα κύτταρα προ-επωάστηκαν με καταλάση (7000 μονάδες /ml για 1 ώρα) ή διαμολύνθηκαν παροδικά με pCINeoEV ή pCIneo + CAT πριν από την έκθεση σε C1 (100 μg /ml για 24 ώρες), και το σύνολο των προϊόντων λύσης κυττάρου ανοσοστυπώθηκαν για (Β)