Αφηρημένο

BORIS (CTCFL) είναι το παράλογο της CTCF (συντελεστής CCCTC δεσμευτική? NM_006565), ένα εκφράζεται παντού δέσμευσης του DNA-πρωτεΐνης με διαφορετικούς ρόλους στην έκφραση γονιδίων και την οργάνωση της χρωματίνης. BORIS και CTCF έχουν σχεδόν ταυτόσημες περιοχές δακτύλου ψευδαργύρου, αλλά εμφανίζουν σημαντικές διαφορές στις αντίστοιχες C- και Ν-τελικές περιοχές. Σε αντίθεση με CTCF, έκφραση BORIS έχει αναφερθεί μόνο στους όρχεις και ορισμένες κακοήθειες, που οδηγεί στην κατάταξη της ως αντιγόνο «καρκίνο των όρχεων». Ωστόσο, το πρότυπο έκφρασης του BORIS είναι τόσο σημαντική και ανεπίλυτο ζήτημα στον τομέα των πρωτεϊνών που δεσμεύονται με DNA. Εδώ, έχουμε εντοπίσει BORIS στο κυτταρόπλασμα και τον πυρήνα της ένα ευρύ φάσμα των φυσιολογικών και καρκινικών κυττάρων. Συγκρίνουμε την εντόπιση της CTCF και BORIS στον πυρήνα και επιδεικνύουν τον εμπλουτισμό του BORIS εντός του πυρηνίσκο, στο εσωτερικό της νουκλεολίνης δομή πυρήνα και πλησίον fibrillarin στο πυκνό συστατικό ινιδικό. Σε αντίθεση, CTCF δεν είναι εμπλουτισμένο στο πυρηνίσκο. Ζωντανή απεικόνιση των κυττάρων παροδικά επιμολυσμένα με GFP ετικέτα BORIS επιβεβαίωσε την πυρηνισκικό συσσώρευση BORIS. Ενώ τα επίπεδα μεταγραφής BORIS είναι χαμηλά σε σύγκριση με CTCF, τα επίπεδα της πρωτεΐνης του είναι εύκολα ανιχνεύσιμες. Τα ευρήματα αυτά δείχνουν ότι η έκφραση BORIS είναι πιο διαδεδομένη από ό, τι πιστευόταν παλαιότερα, και προτείνουν ένα ρόλο για BORIS σε πυρηνισκικό λειτουργία

Παράθεση:. Jones TA, Ogunkolade BW, Szary J, Aarum J, Mumin ΜΑ, Patel S, et al. (2011) Ευρεία Έκφραση της BORIS /CTCFL σε φυσιολογικά και καρκινικά κύτταρα. PLoS ONE 6 (7): e22399. doi: 10.1371 /journal.pone.0022399

Επιμέλεια: Pierre-Antoine Defossez, Université Paris-Diderot, Γαλλία

Ελήφθη: 18, Μαρτίου 2011? Αποδεκτές: 21 του Ιουνίου του 2011? Δημοσιεύθηκε: 19, Ιούλ, 2011

Copyright: © 2011 Jones et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο χρηματοδοτήθηκε από το Cancer Research UK επιχορήγηση πρόγραμμα C5321 /A8318. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

CTCFL ή BORIS (αδελφός του ρυθμιστή της Τυπωμένες τοποθεσίες), ένα παράλογο της CTCF, έχει χαρακτηριστεί ως ένα αντιγόνο καρκίνου των όρχεων, όπως η κατανομή του φέρεται να περιορίζεται στις όρχεις και ορισμένων μορφών καρκίνου [1] . Ασυνήθιστα υψηλά επίπεδα BORIS μεταγραφές είναι παρούσες σε μία ποικιλία ανθρώπινων όγκων και του καρκίνου που προέρχεται από κυτταρικές σειρές και, σε ορισμένες, αυξημένη έκφραση έχει συνδεθεί με προαγωγού-ειδικών απομεθυλίωση και απο-καταστολή του συν-εκφρασμένων γονιδίων καρκίνου όρχεων [2] , [3], [4], [5], [6], [7], [8], [9], [10], [11], [12]. Διάφορες μελέτες έχουν αναφέρει αντιφατικά ευρήματα της έκφρασης BORIS σε ορισμένους τύπους καρκίνου. Για παράδειγμα, ένας ανέφεραν αυξημένη έκφραση σε αρκετές κυτταρικές σειρές καρκίνου του μαστού και στην πλειοψηφία των πρωτογενών όγκων του μαστού εξετάστηκαν σε μία μελέτη δεν επιβεβαιώθηκε από ένα άλλο [3], [13]. Επιπλέον, τα αυξημένα επίπεδα μεταγραφής του BORIS έχουν βρεθεί σε κυτταρικές σειρές μελανώματος, αλλά όχι στην πρωτογενή μελανώματα [7]. Παρ ‘όλα αυτά, η σημασία της BORIS στον καρκίνο προτείνεται από τη διαπίστωση υψηλών επιπέδων σε προχωρημένο επιθηλιακό καρκίνο των ωοθηκών [14].

BORIS

και

CTCF

γονίδια πιστεύεται ότι έχουν εξελιχθεί κατά τη διάρκεια των σπονδυλωτών ανάπτυξης από μια εκδήλωση γονίδιο επικάλυψη [15]. Ενώ οι περιοχές δακτύλου ψευδαργύρου που προσδένουν DNA στις αντίστοιχες πρωτεΐνες είναι πολύ παρόμοια, οι C- και Ν-τερματικά πεδία του BORIS εμφανίζουν καμία σημαντική ομολογία με CTCF ή οποιεσδήποτε άλλες πρωτεΐνες [16]. BORIS δεν περιέχει τις modular υποστρώματα για ειδικές μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις που είναι κρίσιμες για τη λειτουργία CTCF και στερείται τη συντηρημένη Ο-τερματικό φωσφορυλίωση μοτίβο που απαιτούνται για CTCF μεσολάβηση καταστολή της ανάπτυξης. Αυτό θα προτείνουν διαφορετικές λειτουργίες για τις δύο πρωτεΐνες.

Αρκετές γραμμές του σημείου στοιχεία για έναν ρόλο για BORIS στην επιγενετική ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης. Κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης αρσενικά γεννητικά-line ποντίκι, BORIS παρατηρείται σε πρωτογενή σπερματοκύτταρα, αλλά σταδιακά αντικαθίστανται από CTCF στην μετα-μειωτικά γεννητικά κύτταρα-line [17]. Αυτός ο διακόπτης στην έκφραση από ΜΠΟΡΕΙΣ να CTCF συμπίπτει με την αποκατάσταση των προτύπων DNA-μεθυλίωσης site-specific κατά τη διάρκεια αρσενικό διαφοροποίησης των γεννητικών κυττάρων [17]. Επιπλέον, σε καρκινικές κυτταρικές σειρές όπου CTCF σίγαση γονιδίων με DNA μεθυλίωση, υπό όρους έκφραση της BORIS οδηγεί σε αντικατάσταση των CTCF από τον Boris σε αυτά τα γονίδια, με αποτέλεσμα τοπική ενεργοποίηση απομεθυλίωση και γονίδιο [6], [10], [11], [18 ].

Το DNA δεσμευτική και επιγενετικών λειτουργίες που δόθηκε στη BORIS θα πρότεινα ένα πυρηνικό εντοπισμό. Ωστόσο, πρόσφατες εκθέσεις δείχνουν BORIS παρουσιάζουν κυρίως στο κυτταρόπλασμα των επιθηλίων προστάτη, όρχεις και προστάτη κυτταρικές γραμμές [1], ενώ πυρηνικού εντοπισμού εντοπίζεται μόνο σε συγκεκριμένα στάδια της σπερματογένεσης και σε ορισμένες 5-αζα-dexoxycytidine αγωγή καρκίνου του προστάτη κυτταρικές γραμμές [ ,,,0],5]. Εδώ, δείχνουμε κυρίαρχο εντοπισμό του BORIS εντός της πυρηνίσκο σε αρκετές καρκινικές κυτταρικές σειρές και πρωτογενή κύτταρα, με εμπλουτισμό εντός της νουκλεολίνης δομή πυρήνα και πλησίον fibrillarin στο πυκνό συστατικό ινιδικό.

Αποτελέσματα και Συζήτηση

έκφραση BORIS σε φυσιολογικά και καρκινικά κύτταρα και ιστούς

Για να προσδιοριστεί το επίπεδο της έκφρασης BORIS σε φυσιολογικούς ανθρώπινους ιστούς, ολικό RNA ελήφθη από ανθρώπινο λιπώδη, της ουροδόχου κύστης, του εγκεφάλου, του τραχήλου, του παχέος εντέρου, του οισοφάγου, των νεφρών, του ήπατος , ωοθήκη, πλακούντας, προστάτη, σκελετικούς μύες, λεπτό έντερο, σπλήνα, όρχεις, θύμο, θυρεοειδή και τραχεία (Ambion). Real-time RT-PCR έδειξε τα υψηλότερα επίπεδα μεταγραφής BORIS στους όρχεις (10

10 /μεταγραφές μg ολικού RNA), ενώ χαμηλότερα επίπεδα ανιχνεύθηκαν σε άλλους ιστούς (10

5-10

8 μεταγραφές /μα ολικού RNA) σε συμφωνία με άλλες αναφορές [7] (Σχ. 1). Δεν ανιχνεύθηκαν BORIS στην καρδιά ή στους πνεύμονες, αν και αυτό μπορεί να οφείλεται σε έναν περιορισμό στην ευαισθησία της δοκιμασίας μας. επίπεδα μεταγραφής CTCF ήταν σχετικά σταθερός σε όλους τους ιστούς (10

9-10

10 /μεταγραφές μg ολικού RNA) (Εικόνα 1).

επίπεδα μεταγραφής BORIS σε φυσιολογικούς ανθρώπινους ιστούς (πρώτο Βραβείο Ανθρωπίνων Ολικό RNA έρευνα τύπου πάνελ, Ambion, UK). Οι ράβδοι σφάλματος αντιπροσωπεύουν την τυπική απόκλιση.

Η

Στη συνέχεια, συγκρίναμε τα επίπεδα μεταγραφής του BORIS και CTCF σε μια ποικιλία φυσιολογικών και καρκινικών κυτταρικών σειρών. Σε πραγματικό χρόνο ανάλυση RT-PCR έδειξε παρόμοια επίπεδα BORIS και CTCF mRNA σε ινοβλάστες, εμβρυονικά κύτταρα νεφρού, νευρικά βλαστικά κύτταρα, τους νευρώνες, του παχέος εντέρου, του προστάτη, μυελοβλάστωμα, γλοιοβλάστωμα, το μελάνωμα και κυτταρικές σειρές νευροβλαστώματος με εκείνες που παρατηρούνται σε ανθρώπινους ιστούς. έκφραση BORIS ήταν χαμηλότερη (10

6-10

7 μεταγραφές /μg ολικού RNA), σε σύγκριση με την πιο άφθονη CTCF (10

9-10

10 μεταγραφές /μg ολικού RNA) (Εικ. 2Α). Ως εκ τούτου, BORIS και CTCF υπάρχουν σε αμφότερες τις κανονικές και καρκινικών κυττάρων, με την έκφραση του CTCF συχνά 1000 φορές μεγαλύτερη.

Α, τα επίπεδα μεταγραφής BORIS σε επιλεγμένες κυτταρικές σειρές. Β, κηλίδωση Western για BORIS δείχνει μεγάλες μπάντες (*) σε περίπου 76 kDa (BORIS θεωρητικό μέγεθος), 60 KDa και 45 KDa. Οι μικρότερες ζώνες μπορεί να αντιπροσωπεύουν BORIS ισοπρωτεΐνες όπως περιγράφηκε πρόσφατα [19]. C, κηλίδωση Western για CTCF δείχνει κύριες ζώνες (*) σε περίπου 130 kDa, 60 KDa και 48 KDa. Αυτές οι διαφορετικές ζώνες μπορεί να αντιπροσωπεύει διαφορικά εκφρασμένων ισομορφών CTCF όπως περιγράφηκε πρόσφατα [36]. BORIS και CTCF υπάρχουν σε φυσιολογικά κύτταρα (νευρώνες, νευρικά βλαστικά κύτταρα (NSC) και MRC5 εμβρύου ινοβλάστες πνεύμονα), νευροβλάστωμα κυτταρικές γραμμές (ACN, IMR32 και LAN-1), κυτταρικές σειρές μελανώματος (26258M, Α375Μ και WM983B), γλοιοβλάστωμα κύτταρο γραμμές (CRL-2365, U87MG, CRL-2610, CRL-1620, U138MG και U251) και του παχέος κυτταρικές σειρές (HCT55, HCT116, HCT15 και LoVo). D, GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος για τις διαφορές φόρτωσης. Invitrogen Novex®Sharp Προ-Βιτρώ Πρωτεΐνη Πρότυπο, LC5800, χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό του μεγέθους μπάντας. Οι ράβδοι σφάλματος στο (Α) αντιπροσωπεύουν την τυπική απόκλιση.

Η

Απροσδόκητα, κηλίδωση Western έδειξαν παρόμοια επίπεδα έκφρασης BORIS σε φυσιολογικά και καρκινικά κυτταρικές σειρές (Σχ. 2Β). Εντοπίσαμε ισχυρή μεγάλες ζώνες 60-70 kDa σε συμφωνία με το θεωρητικό μοριακό βάρος του BORIS [19]. Διαπιστώσαμε επίσης ορισμένες χαμηλότερες και υψηλότερες ζώνες μοριακού βάρους. Δεν είναι ακόμα σαφές ποια από αυτές τις ζώνες αντιστοιχεί στις περιγράφηκε πρόσφατα ισομορφές BORIS [19] ή που είναι BORIS με μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις. Ωστόσο, επώαση του αντισώματος BORIS με πεπτίδιο BORIS μπλοκάρει τελείως όλα τα συγκροτήματα (Εικ. S1). Καμία από αυτές τις BORIS αντιδραστικών ζώνες ανιχνεύτηκαν όταν οι μεμβράνες ανιχνεύθηκαν με αντισώματα CTCF (Εικ. 2C).

Για να επιβεβαιωθεί η ειδικότητα του αντισώματος BORIS, κύτταρα ΗΕΚ293Τ επιμολύνθηκαν με GFP-tagged BORIS, ή GFP- ετικέτα κατασκευάσματα CTCF. Ανάλυση Western επιβεβαίωσε την παρουσία BORIS πρωτεΐνης σε κύτταρα επιμολυσμένα με GFP-tagged BORIS, ενώ μόνο ενδογενή BORIS ανιχνεύθηκε στα μη επιμολυσμένα κύτταρα ή κύτταρα επιμολυσμένα με GFP-CTCF ή κενό φορέα (Εικ. S2).

τότε μεταχειρισμένα πραγματικού χρόνου RT-PCR για τον προσδιορισμό των επιπέδων έκφρασης BORIS σε φυσιολογικούς ιστούς ποντικού συμπεριλαμβανομένης της παρεγκεφαλίδας, του εντέρου, των νεφρών, του ήπατος, των ωοθηκών, του σπλήνα και όρχεις. Όπως και σε ανθρώπινους ιστούς, βρήκαμε ένα πολύ χαμηλότερο επίπεδο σε σύγκριση με BORIS CTCF σε ιστούς ποντικού με την εξαίρεση του όρχεως (Εικ. 3Α). Κηλίδωση Western σε μια επιλογή από ιστούς ποντικού απεκάλυψε διάφορες ζώνες, το πλέον άφθονο από τις οποίες ήταν στο 60-70 kDa (Σχ. 3Β). Διαπιστώσαμε επίσης μία ζώνη περίπου 48 kDa στο νεφρό, τον ιππόκαμπο, το έντερο και το φλοιό, ενώ άλλες λιγότερο έντονες ζώνες άνω των 200 kDa ήταν παρούσες στους όρχεις, σπλήνα, τους πνεύμονες και το ήπαρ (Εικ. 3Β). Αυτές οι υψηλότερες ζώνες μοριακού βάρους μπορεί να αντιστοιχεί σε homo /ετεροδιμερές της BORIS, ή πολυ (ADP) -ribosylation όπως έχει περιγραφεί για CTCF [20]. Και πάλι, δεν ανιχνεύτηκαν ζώνες όταν μεμβράνες ανιχνεύθηκαν με αντισώματα που BORIS προ-επωάστηκαν με ελεύθερα πεπτίδια BORIS (Εικ. S3), ούτε κάναμε ανιχνεύει τις ίδιες ζώνες όταν μεμβράνες ανιχνεύθηκαν με αντισώματα CTCF (Σχ. 3C). Αν και BORIS πρωτεΐνη είναι σαφώς ανιχνεύσιμη, εντοπίζουμε μόνο χαμηλά επίπεδα BORIS μεταγραφές, τόσο σε κύτταρα και ιστούς (Σχήμα 1, Σχήμα 2Α και το Σχήμα 3Α). Ωστόσο, ασυμφωνία μεταξύ του επιπέδου του mRNA και της πρωτεΐνης αφθονία έχει αναφερθεί ότι είναι κακή για ορισμένα άλλα γονίδια [21], [22], [23].

Α, τα επίπεδα BORIS και CTCF mRNA σε επιλεγμένους φυσιολογικούς ιστούς ποντικού. Β, κηλίδωση Western για BORIS δείχνει μεγάλες μπάντες (*) σε 60-70 KDa και 45 kDa σε ιστούς ποντικού. C, κηλίδωση Western για CTCF δείχνει λωρίδες (*) μεταξύ 70-100 kDa σε ιστούς ποντικού. D, GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος για τις διαφορές φόρτωσης. GE Healthcare Πλήρης Σειρά Rainbow Marker, RPN800E, χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό του μεγέθους μπάντας. γραμμές σφάλματος στο (Α) αντιπροσωπεύουν την τυπική απόκλιση

Η

Λόγω της ομοιότητας σε τομείς τους δακτύλου ψευδαργύρου, BORIS έχει προταθεί να είναι ένας ανταγωνιστής, ανταγωνιστή ή ρυθμιστή της CTCF στα γεννητικά κύτταρα και ανθρώπινους καρκίνους [17]. Πράγματι, BORIS και CTCF ανταγωνίζονται για δέσμευση με κοινούς στόχους DNA. Για παράδειγμα, CTCF πληρότητα κατά τη

MAGE-A1

υποστηρικτής εμφανίζεται μόνο εάν τα επίπεδα έκφρασης BORIS είναι χαμηλή [11]. Καθώς οι Ν- και Ο-τερματικά άκρα των BORIS και CTCF είναι διαφορετικά, είναι πιθανό να είναι υπεύθυνη για διαφορετικές λειτουργικές εκβάσεις, όπως μεσολάβηση DNA απομεθυλίωση, μετά τη σύνδεση με το DNA. Τα σχετικά επίπεδα BORIS και CTCF είναι επομένως πιθανό να είναι ζωτικής σημασίας για τη διατήρηση της σταθερότητας στην κανονική προφίλ γονιδιακής έκφρασης.

Πυρηνικός εντοπισμός του BORIS

χρώση ανοσοφθορισμού έδειξε ότι BORIS βρίσκεται μέσα στο κυτταρόπλασμα και η πυρήνας διαφόρων τύπων ανθρωπίνων κυττάρων, συμπεριλαμβανομένων των ινοβλαστών MRC5, κύτταρα νεφρού embyonic ΗΕΚ293Τ, νευρικά βλαστικά κύτταρα, ορθοκολικό, νευροβλάστωμα, το μελάνωμα, τον προστάτη και κυτταρικές γραμμές γλοιοβλαστώματος. Σε όλους τους τύπους κυττάρων που εξετάστηκαν, BORIS ανοσοαντιδραστικότητα εμπλουτισμένο στο πυρηνίσκο (Εικ. 4 και το Σχ. S4). Ολονύκτια επώαση BORIS αντισώματος με το πεπτίδιο μπλοκάρει εντελώς το σήμα ανοσοφθορισμού περαιτέρω επιβεβαιώνοντας την ειδικότητα των αντισωμάτων BORIS (Εικ. S5). Δεν ανοσοαντιδραστικότητα ανιχνεύθηκε όταν κύτταρα χρωματίστηκαν με μη ειδικά αντισώματα IgG. Συν-χρώση των κυττάρων για BORIS ή CTCF και fibrillarin, μια ιδιαίτερα διατηρημένη πρωτεΐνη που σχετίζεται με τις μικρές πυρηνισκικός RNAs [24], επιβεβαίωσε εμπλουτισμό BORIS αλλά όχι CTCF στον πυρηνίσκο (Σχ. 4Α, Β). Περαιτέρω συν-χρώση έδειξε BORIS εντός του πυρηνισκικός χώρου που καταλαμβάνεται από νουκλεολίνη, μία άφθονη μη ριβοσωμική πυρηνισκικός πρωτεΐνη [25] (Εικ. 4C). Συνεστιακή μικροσκοπία και 3D ανακατασκευή επιβεβαίωσε ότι BORIS ήταν εντός του πυρηνίσκο, δίπλα στο fibrillarin σε φυσιολογικά και καρκινικά κύτταρα (Σχ. 5Α, Β και Ταινίες S1, S2, S3 και S4).

Α, Β ανοσοφθορισμού απεικόνισης του BORIS ή χρώση CTCF στο πράσινο (Alexa 488) μαζί με χρώση fibrillarin στο κόκκινο (Alexa 594) σε MRC5 και του παχέος HCT116 κυτταρική γραμμή που δείχνει τον εμπλουτισμό της BORIS, αλλά δεν CTCF, εντός του πυρηνίσκου. Τα κύτταρα αντίθετα με 4 ‘, 6-διαμιδινο-2-φαινυλινδόλη (ϋΑΡΙ) εμφανίζεται σε μπλε χρώμα. BORIS και fibrillarin είναι κοντά τους γείτονες με το άλλο και το πυκνό συστατικό ινιδικό (DFC) του πυρηνίσκου. Οι εικόνες που παρουσιάζονται σε μεγέθυνση 100Χ. C Διπλό ανοσοχρώση δείχνει χρώση BORIS στο πράσινο (Alexa 488) εντός της περιοχής Νουκλεολίνης (κόκκινο, Alexa 594) σε ανθρώπινα νευρικά βλαστικά κύτταρα και γλοιοβλαστώματος κυτταρική γραμμή CRL2365. Τα κύτταρα αντίθετα με 4 ‘, 6-διαμιδινο-2-φαινυλινδόλη (ϋΑΡΙ) εμφανίζεται σε μπλε χρώμα. Οι εικόνες που παρουσιάζονται σε μεγέθυνση 100Χ.

Η

Τρισδιάστατο συνεστιακή εικόνες που δείχνουν χρώση BORIS στο πράσινο (Alexa 488) και χρώση fibrillarin στο κόκκινο (Alexa 594). Τα κύτταρα αντίθετα με 4 ‘, 6-διαμιδινο-2-φαινυλινδόλιο (ϋΑΡΙ, μπλε). Α, MRC5 ινοβλάστες και Β, C99 ορθοκολικού κυτταρική γραμμή. Οι εικόνες που παρουσιάζονται στο 63x μεγέθυνση.

Η

Για να επιβεβαιώσουν αυτά τα ευρήματα, τα κύτταρα ΗΕΚ293Τ ήταν επιμολυσμένα με GFP-tagged BORIS ή GFP-ετικέτα κατασκευάσματα CTCF. Χρησιμοποιώντας την απεικόνιση ζωντανών κυττάρων, GFP βρέθηκε να συσσωρεύεται προοδευτικά πυρηνίσκους των κυττάρων επιμολυσμένων με GFP-BORIS. 71,3% +/- 1.7 του GFP-BORIS επιμολυσμένα κύτταρα έδειξαν σαφή πυρηνισκικό εντοπισμό (873 κύτταρα που αναλύθηκαν στο σύνολό τους από δύο ανεξάρτητα πειράματα). Αντιθέτως, κύτταρα επιμολυσμένα με GFP-CTCF έδειξε μια ομοιόμορφη κατανομή της GFP σε όλη τον πυρήνα, και εκείνα τα κύτταρα επιμολυσμένα με ένα άδειο φορέα GFP έδειξαν κυρίως GFP στο κυτταρόπλασμα (Εικ. 6). Επιπλέον, ανοσοχρώση των κυττάρων 72 ώρες μετά την επιμόλυνση των ΗΕΚ293Τ κυττάρων με συγκεκριμένες BORIS shRNA πλασμίδια, αλλά όχι κενό φορέα, σημαντικά (

ρ

& lt? 0,05) μείωσε την πυρηνισκικό ανοσοχρώση BORIS (Εικ. S6a, Β). Αυτό συνοδεύτηκε από αντίστοιχη μείωση των επιπέδων μεταγραφής BORIS (Σχ S7).

Ζωντανή απεικόνιση των κυττάρων των κυττάρων ΗΕΚ293Τ παροδικά επιμολυσμένα με GFP-tagged BORIS (πράσινο), GFP-tagged CTCF (πράσινο) ή κενό φορέα ( πράσινο), αντίθετα με Hoechst 333412 (μπλε). Οι εικόνες που παρουσιάζονται σε μεγέθυνση 40x.

Η

Υποθετικά Nucleolar Ακολουθίες Localization

Υπολογιστική ανάλυση της αλληλουχίας της πρωτεΐνης Q8NI51 BORIS, [26], αποκάλυψε 2 υποθετικές πυρηνισκικός αλληλουχιών εντοπισμού στον τομέα δακτύλου ψευδαργύρου :

LIQHQKTHKNEKRFKCKHCSYACKQ (μεταξύ των θέσεων 473 και 497) (ZF6 /7)

AKSAASGKGRRTRKRKQTILKEATKGQK (μεταξύ των θέσεων 573 και 600) (Zf9 /10)

Η

Πέντε υποθετικό πυρηνισκικός ακολουθίες εντοπισμού είχαν προβλεφθεί στην CTCF, τρεις εκ των οποίων βρίσκονται στο τερματικό Ν και συμπίπτουν με τις περιοχές ακετυλίωση CTCF K /R προβλέπεται από Klenová, et al. [17]. Οι προβλεπόμενες πυρηνισκικός ακολουθίες εντοπισμού σε CTCF έχουν ως εξής:

ESETFIKGKERKTYQRRREGGQEE (μεταξύ των θέσεων 12 και 35)

KDPDYQPPAKKTKKTKKSKLRYTEEGKDV (μεταξύ των θέσεων 193 και 221)

VGNMKPPKPTKIKKKGVKKTFQCEL (μεταξύ των θέσεων 246 και 270) (Ν τερματικό)

GENGGETKKSKRGRKRKMRSKKEDSSDSENA (μεταξύ των θέσεων 585 και 615) (ZF 9/10)

QPVTPAPPPAKKRRGRPPGRTNQPKQNQPTAI (μεταξύ των θέσεων 639 και 670).

Η

Αυτές οι αλληλουχίες θα στηρίξει τη διαπίστωση του BORIS στον πυρηνίσκο, καθώς και την μετατόπιση του CTCF στον πυρήνα κατά τη διάρκεια της διαφοροποίησης των ανθρώπινων αιμοποιητικών κυττάρων [27].

UBF (ανάντη παράγοντας δέσμευσης) έχει πρόσφατα αναγνωριστεί ως ο πρώτη κοινή συνεργάτης αλληλεπίδρασης του BORIS και CTCF [28]. Αυτή η αλληλεπίδραση φαίνεται να είναι άμεση και να απαιτούν από τους τομείς δακτύλου ψευδαργύρου του BORIS και CTCF, η ομάδα υψηλής κινητικότητας (HMG) -κουτί 1, και την περιοχή διμερισμού της UBF. CTCF βρέθηκε να συνδέεται αμέσως ανάντη του ριβοσώματος υποκινητή αποστάτη σε μεθυλίωση ευαίσθητο τρόπο, όπου προτείνεται να φορτώσει UBF επάνω rDNA για να αποτελέσει μέρος ενός δικτύου που διατηρεί τα γονίδια rDNA έτοιμη για μεταγραφή. χρώση ανοσοφθορισμού μας δεν δείχνουν εμπλουτισμό του CTCF στην πυρηνίσκο, ωστόσο, τα χαμηλά επίπεδα του CTCF μπορεί να είναι παρόντες, αλλά κάτω από την ανίχνευση στον προσδιορισμό μας. Torrano et al., Έδειξαν ότι η μετατόπιση του CTCF στον πυρηνίσκο μετά την επαγωγή της διαφοροποίησης σε ανθρώπινη και αρουραίου κύτταρα ρυθμίζεται από πολυ (ADP-ριβοσυλ) ίωση [27]. UBF είναι πολύ άφθονη στον πυρηνίσκο και έχει αποδειχθεί ότι είναι ιδιαίτερα δυναμική [29]. Έτσι, η άμεση αλληλεπίδραση μεταξύ CTCF και UBF μπορεί να είναι παροδικές και, αφού BORIS αναγνωρίζει τις ίδιες θέσεις δέσμευσης του DNA [1], μπορεί να υπάρχει ανταγωνισμός μεταξύ CTCF και BORIS δεσμεύοντας UBF [22]. Σε συνδυασμό με τα ευρήματα που περιγράφονται εδώ, η άμεση αλληλεπίδραση των BORIS με UBF προτείνει BORIS παίζει σημαντικό ρόλο στην βιογένεση ριβοσωμάτων.

Τελικές παρατηρήσεις

Αυτή είναι η πρώτη έκθεση που δείχνει BORIS εντοπισμού κατά κύριο λόγο στην πυρηνίσκο σε πολλές διαφορετικές κακοήθεις και μη κακοήθεις κυτταρικούς τύπους. Το πυρηνίσκος είναι ένα πολυ-λειτουργικό υπο-πυρηνικό διαμέρισμα όπου για παράδειγμα, ριβοσωματικών RNA συντίθενται, επεξεργασία και συναρμολογείται με ριβοσωμικές πρωτεΐνες [30], [31], [32]. Ωστόσο, η εκτεταμένη πρωτεομική ανάλυση αποκάλυψε τη δυναμική φύση της πυρηνισκική proteome και δείχνει ότι η πυρηνίσκος μπορεί να εκτελέσει πολλές άλλες βιολογικές ρόλους εκτός από την ριβοσωμάτων βιογένεση όπως η ρύθμιση των ειδικών πτυχών της μίτωσης και της προόδου του κυτταρικού κύκλου [24], [33] , [34]. Εδώ αποδεικνύουμε ότι BORIS είναι σαφώς περισσότερο από ένα όρχι-ειδική πρωτεΐνη, και δείχνουν μια ξεχωριστή υποκυτταρικού εντοπισμού σε πολλαπλές κυτταρικές σειρές, καθώς και φυσιολογικά ανθρώπινα και ποντικού ιστούς. BORIS είναι εμπλουτισμένο στο πυρηνίσκο, στο εσωτερικό του πυρήνα νουκλεολίνης δομή και δίπλα στο fibrillarin. νέο εύρημα μας διαδεδομένη έκφραση BORIS μαζί με πυρηνισκικό εντοπισμό warrants της περαιτέρω έρευνα για να εξακριβώσει ακριβή λειτουργία του στο πλαίσιο αυτό.

Υλικά και Μέθοδοι

Cell Culture

κυττάρων του καρκίνου γραμμές διατηρήθηκαν σε RPMI ή DMEM συμπληρωμένο με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό (εκτός αν αναφέρεται διαφορετικά), 100 μονάδες /ml πενικιλίνη, 100 mg /ml στρεπτομυκίνη, και 0,29 mg /ml L-γλουταμίνη (Invitrogen). Οι κυτταρικές σειρές που χρησιμοποιήθηκαν ήταν ινοβλάστες ανθρώπινου πνεύμονα MRC5 (ECACC)? εμβρυϊκά ΗΕΚ293Τ νεφρού κυτταρική γραμμή? παχέος κυτταρικές σειρές C99, HCT55, HCT116, HCT15, LoVo και SW837? μυελοβλάστωμα ϋΑΟΥ κυτταρική γραμμή? κυτταρικές γραμμές καρκίνου του προστάτη και Du45 ΡΝΤ2? κυτταρικές σειρές μελανώματος Α375Μ, Mel 501, SBCL2, Ι ^, Mel 6, WM115, WM1158, M2629bM και WM278? νευροβλάστωμα κυτταρικές σειρές ACN, IMR-32 και LAN1 και κυττάρων γλοιοβλαστώματος γραμμές CRL-2365, CRL-2610 (LN-18), CRL-1620 (Α-172), CRL-2020, CRL-2611, U-118mg, U- 138 mg, U251 και U87 MG (ATCC). κύτταρα MRC5 αναπτύχθηκαν στις παραπάνω μέσα ενημέρωσης, συμπληρωμένο με 20% ορό εμβρύου μόσχου. Ανθρώπινα νευρικά βλαστικά κύτταρα που προέρχονται από την κυτταρική γραμμή Η9 (46, XX) (EnStem-A, Millipore) καλλιεργήθηκαν σε μέσο Neurobasal (Invitrogen, 21103-049) συμπληρωμένο με Β27 (Invitrogen, 12587-010), FGF-2 10 ng /ml (PeproTech), 1% πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη (Invitrogen) και 2 mM γλουταμίνη (Invitrogen). Το ήμισυ το μέσο αλλάχθηκε κάθε δεύτερη ημέρα. In vitro διαφοροποίηση προκλήθηκε με παραλείποντας FGF-2 από το μέσο.

Απομόνωση

πρωτεΐνη ιστών

ιστούς ποντικού απομονώθηκαν από 3-μηνών C57BL6 ή NOD ποντικούς και καταψύχθηκαν σε υγρό άζωτο. Όλα τα πειραματικά πρωτόκολλα που περιλαμβάνουν ιστούς του ποντικιού εγκρίθηκαν από την Επιτροπή Διαδικασιών του Υπουργείου Εσωτερικών των ζώων, σύμφωνα με τον αριθμό αδείας του έργου PPL 70/6693. Οι ιστοί διασπάστηκαν σε ρυθμιστικό λύσης Qiagen RLT για την εκχύλιση RNA, ή σε ρυθμιστικό 1Χ RIPA (50 mM Tris-HCl ρΗ 8,0, 150 mM NaCl, 1% ΝΡ-40, 0.5% δεοξυχολικό, 0.1% SDS) που περιείχε αναστολείς πρωτεάσης (πρωτεάση Inhibitor Cocktail Set III EDTA-free, Calbiochem) και αναστολείς φωσφατάσης (φωσφατάση Inhibitor Cocktail Set II, Calbiochem) για ανάλυση πρωτεΐνης. Η συνολική πρωτεΐνη προϊόντα λύσης παρασκευάστηκαν από 10

8 κύτταρα σε ρυθμιστικό διάλυμα 1Χ RIPA. Λυμένα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με υπερήχους για λίγο με ένα Bioruptor και συντρίμμια καθαρίστηκε με φυγοκέντρηση. Η περιεκτικότητα σε πρωτεΐνη των εκχυλισμάτων εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας κιτ BCA (Thermo Fisher Scientific) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή.

Απομόνωση RNA και αντίστροφη μεταγραφή

Το ολικό RNA απομονώθηκε χρησιμοποιώντας με βάση πυριτία spin-στήλη κιτ εκχύλισης (RNeasy κιτ mini, Qiagen) ακολουθώντας το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Ολικό RNA υποβλήθηκε σε επεξεργασία με RNase-free DNase1 (Ambion) για τη μείωση της μόλυνσης γονιδιωματικού DNA. ακεραιότητα του RNA αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας την Agilent Bioanalyzer. Δύο μικρογραμμάρια ολικού RNA μεταγράφηκε αντίστροφα με SuperScriptase III (Invitrogen) με τη χρήση ολιγο-dT εκκινητές ή τυχαίων εξαμερών σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Αρνητικό (-RT) ελέγχων που περιλαμβάνονται RNase-free νερό αντικατασταθεί ανάστροφης μεταγραφάσης.

ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR

Τόσο οι δημοσιεύονται εκκινητές [3] και το δικό μας έχουν σχεδιαστεί με Primer Express 2.0 χρησιμοποιήθηκαν σε αυτη τη ΜΕΛΕΤΗ. Μαζί αυτά τα εναύσματα ενισχύουν 19 από τις 23 ισομορφές του BORIS περιγράφηκε πρόσφατα [19]. Ανθρώπινα εκκινητών ήταν ως εξής:

BORIS εξόνιο 4-5 μπροστά:

5′-AAAACCTTCCGTACGGTCACTCT-3 ‘

και να αντιστραφεί: 5′-TGTTGCAGTCGTTACACTTGTAGG-3′

και ανιχνευτή: Fam-TAACACCCACACAGGAACCA-Ταμ

CTCF εξόνιο 5-6 μπροστά: 5′-GAGAAGCCATTCAAGTGTTCCAT-3 ‘

και να αντιστραφεί: 5′-CTCCAGTATGAGAGCGAATGTGA-3′

και ανιχνευτή:. Fam-ATTACGCCAGTGTAGAAGTCAGC-Ταμ

εκκινητών ποντίκι είχαν ως εξής:

BORIS εξόνιο 5-6 μπροστά:

5′-AGTGCTCCCTGTGCAAGTACG-3 «

και αντίστροφη 5′-GTAAGCACACTGGCAACACTGG-3 ‘

και ανιχνευτή: Fam-AAGCAAGATGAAGCGTCACAT-Ταμ

CTCF εξόνιο 5-6 μπροστά:

5 «-TCGTTATAAACACACTCATGAGAAACC-3 ‘

και να αντιστραφεί: 5′-TCTCCAGTATGAGAGCGAATGTG-3′

και ανιχνευτή:. Fam-AGTGTTCCATGTGTGATTGTCAG-Ταμ

επίπεδα mRNA ήταν ποσοτικά σε ABI7500 όργανο χρησιμοποιώντας κιτ SYBR Green JumpStart Taq Readymix (Sigma-Aldrich) ή κιτ πολυμεράσης Taq πλατίνα (Invitrogen) με 50-100 ng του cDNA (εκτός από BORIS εκκινητές όταν χρησιμοποιήθηκε 150-200 ng του cDNA) και 100-200 εκκινητές ηΜ. Χρησιμοποιήσαμε εκκινητές που καλύπτουν το εξόνιο 4/5 διασταύρωση του BORIS και τα ευρήματα επιβεβαιώθηκαν χρησιμοποιώντας δημοσιευμένες εκκινητές στο εξώνιο 6/7 [2], [3], και εξόνιο 9/10 [13] σε ένα qRT-PCR δοκιμασία με διάφορες συγκεντρώσεις ολικό κυτταρικό RNA. Απόλυτες συγκεντρώσεις εκτιμήθηκαν χρησιμοποιώντας πρότυπες καμπύλες δημιουργούνται από σειριακή αραίωση αμπλικονίων. Ο κύκλος κατωφλίου από διαδοχικές αραιώσεις μονόκλωνα ολιγονουκλεοτίδια σχεδιάστηκε έναντι του αριθμού αντιγράφων log των στοχευόμενων προϊόντων της PCR, και αναφέρονται ως αριθμοί αντιγραφή /μg ολικού RNA [35].

Ανάλυση Western Blot

20-50 μα εκχυλίσματος πρωτεΐνης και 10 ul του προτύπου μοριακού βάρους (Invitrogen Novex®Sharp προχρωσμενος Protein πρότυπο, LC5800 ή GE Healthcare πλήρους εύρους Rainbow Marker, RPN800E) διαχωρίστηκαν σε κλίση NuPAGE γέλη πολυακρυλαμιδίου 4-12% (Invitrogen) και έπειτα κηλιδώθηκαν επί μεμβράνης νιτροκυτταρίνη (Invitrogen) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Η μεμβράνη νιτροκυτταρίνης επωάστηκε σε Tris-ρυθμισμένο αλατούχο διάλυμα δέσμευσης που περιέχει 5% αποβουτυρωμένο γάλα και 0.1% Tween-20. Η μεμβράνη στη συνέχεια διερευνήθηκε με πρωτογενές αντισώματα χρησιμοποιώντας πρότυπες συνθήκες. Έχουμε επιλέξει δύο αντισώματα έναντι BORIS? ένα ab18377 πολυκλωνικό αντίσωμα κουνελιού (Abcam), που εγείρεται έναντι ενός συνθετικού πεπτιδίου μέσα στα πρώτα 100 αμινοξέα, και μια HPA001472 πολυκλωνικό αντίσωμα κουνελιού (Sigma), που εγείρεται έναντι αμινοξέα 33-172. Αυτά τα εμπορικώς διαθέσιμα αντισώματα πρέπει να αναγνωρίζουν τα περισσότερα από τα 23 ισομορφές BORIS και έχουν χαρακτηριστεί προηγουμένως [13], [28]. ab18337 αντίσωμα BORIS (1:1000 αραίωση, Abcam) χρησιμοποιήθηκε για όλα τα δυτικά δεδομένα που παρουσιάζονται και HPA001472 αντίσωμα BORIS (1:200 αραίωση, Sigma) χρησιμοποιήθηκε για να επιβεβαιώσει τις ζώνες (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Για CTCF, χρησιμοποιήσαμε αντισώματος 07-729 (1:1000 αραίωση, Millipore) και για GAPDH χρησιμοποιήσαμε αντισωμάτων 14C10 (1:2000 αραίωση, Cell σηματοδότηση). Μετά από αρκετές πλύσεις, συγκροτήματα αποκαλύφθηκαν με την αντίστοιχη υπεροξειδάση κρένου συζευγμένο δευτερεύον αντίσωμα και ανιχνεύεται χρησιμοποιώντας το κιτ ανίχνευσης ECL (GE Healthcare) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή.

ανοσοφθορισμού

Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν επί καλυπτρίδων και στερεώθηκαν με 4% παραφορμαλδεϋδη (Electron Microscopy Sciences) σε αλατόνερο ρυθμισμένο με φωσφορικό, 0.14 Μ NaCl, 2.7 mM KCI, 8.1 mM Να2ΗΡΟ4, 1.5 mM ΚΗ2ΡΟ4, ρΗ 7,2-7,4 για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου, που ακολουθείται από διαπερατοποίηση σε ρυθμιστικό αποκλεισμού (αλατόνερο ρυθμισμένο με φωσφορικό που περιέχει 0.1% Triton Χ-100, 0,01% σαπωνίνη και 10% ορό κατσίκας) για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Τα κύτταρα στη συνέχεια επωάστηκαν με τα ειδικά αντισώματα σε ρυθμιστικό διάλυμα παρεμπόδισης όλη τη νύκτα στους 4 ° C. ab18337 αντισώματος BORIS (1:100 αραίωση, Abcam) χρησιμοποιήθηκε για όλες τις πρότυπο απεικόνισης. BORIS αντισώματος HPA001472 (αραίωση 1:25, Sigma) χρησιμοποιήθηκε για συνεστιακή απεικόνιση και ταινίες. Η χρώση με αμφότερα τα αντισώματα δεικνύει τα ίδια εντοπισμού. Χρησιμοποιήσαμε CTCF αντίσωμα (αραίωση 1:1000, Millipore) 07-729, Νουκλεολίνης (C23) αντίσωμα sc-8031 (1:1000 αραίωση, Santa Cruz Biotechnology) και ab18380 αντισώματος Fibrillarin (1:1000 αραίωση, Abcam). Τα κύτταρα πλύθηκαν σε PBS, και πρωτογενείς ανοσοαντιδράσεις οπτικοποιήθηκε μετά από επώαση για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου με το Alexa Fluor αντι-ποντικού 594 κοτόπουλο IgG, A-21201 και Alexa Fluor 488 κοτόπουλου IgG αντι-κουνελιού, Α-21441 (και τα δύο Invitrogen). Οι πυρήνες βάφτηκαν αντίθετα με 0,1 mg /ml 4 ‘, 6-διαμιδινο-2-φαινυλινδόλιο (ϋΑΡΙ, Molecular Probes) και καλυπτρίδες στερεώθηκαν σε Mowiol (Calbiochem). Για τις τυπικές 2 διαστάσεων δείγματα ανάλυση έγιναν ορατά χρησιμοποιώντας μικροσκόπιο Zeiss Axiophot εξοπλισμένο για επιφθορισμό χρησιμοποιώντας Zeiss σχέδιο-Neofluar 20χ, 40χ ή 100Χ στόχων. Ξεχωριστές εικόνες κλίμακας του γκρι καταγράφηκαν με ένα ψυχόμενο CCD-κάμερα (Hamamatsu, Welwyn Garden City, Ηνωμένο Βασίλειο). Η ανάλυση εικόνας πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του λογισμικού SmartCapture X (Digital Scientific, Cambridge, UK). Για 3 δείγματα διαστατική ανάλυση μελετήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα Zeiss Μέτα 510 LSM, χρησιμοποιώντας μια αντικειμενική 63x. Αποσυνέλιξη εικόνων πραγματοποιήθηκε με τη χρήση Huygens Essential λογισμικού και εικόνες, στη συνέχεια υποβάλλονται σε επεξεργασία σε Imaris x64 (v7.1.1).

Ανταγωνισμός Peptide

Το αντίσωμα εξειδίκευση αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας ένα ειδικό πεπτίδιο αποκλεισμού ab22203 (Abcam). 20 ug πεπτιδίου προστέθηκε σε 10 μg BORIS ab18337 αντισώματος (Abcam) σε ρυθμιστικό TBST 200 υΙ και επωάστηκαν στους 37 ° C όλη τη νύκτα. Τόσο αποκλεισμένων και μη αποκλεισμένων αντίσωμα αραιώθηκε 1:10 σε ρυθμιστικό αποκλεισμού για ανοσοφθορισμό. Όλες οι εικόνες για τις δύο αποκλεισμένων και μη αποκλεισμένων αντίσωμα συλλέχθηκαν χρησιμοποιώντας τις ίδιες χρόνους έκθεσης. ειδικότητα αντισώματος BORIS εκτιμήθηκε επίσης με την εκτέλεση κηλίδωση Western με το πεπτίδιο μπλοκάρει αντίσωμα αραιωμένο 1:100 σε διάλυμα αποκλεισμού που περιέχει 2 πεπτίδιο μg /ml αποκλεισμού. Έλεγχος μη αποκλεισμένο αντίσωμα επωάστηκε συγχρόνως σε κατάλληλο ρυθμιστικό αποκλεισμού χωρίς την προσθήκη αποκλεισμού πεπτιδίου.

Κλωνοποίηση και Μορφομετατροπή

ανασυνδυασμένα κατασκευάσματα GFP-BORIS ή GFP-CTCF, παρασκευάστηκαν εισάγοντας BORIS ή CTCF cDNA σε φορέα pEGFP-C3 (Clontech). Θραύσματα που κωδικοποιούν πλήρους μήκους BORIS (1-663aa) και CTCF (1-727) δημιουργήθηκαν με PCR χρησιμοποιώντας τους ακόλουθους εκκινητές:

BORIS-GFP προς τα εμπρός:

5′-CGGAATTCTGATGGCAGCCACTGAGATCTCTGTC-3 ‘

και να αντιστραφεί: 5′-GCGGGATCCTCACTTATCCATCGTGTTGAGGAGC-3 ‘

CTCF-GFP προς τα εμπρός:

5′-CGGAATTCTGATGGAAGGTGATGCAGTCGAAGCC-3′

και να αντιστραφεί: 5 εισάγεται η «-GCGGGATCCTCACCGGTCCATCATGCTGAGAGGATC-3 ‘

και pCMV6-XL5-BORIS ή πλασμίδια pCMV6-XL5-CTCF (ΟηΟεηε) ως πρότυπα, αντίστοιχα.

θραύσματα PCR υποβλήθηκαν σε πέψη με EcoRI /BamHI pEGFP-C3 MCS εντός πλαισίου της EGFP. Κάθε κατασκεύασμα επιβεβαιώθηκε με ανάλυση αλληλουχίας. Το προκύπτον GFP-BORIS, GFP-CTCF και ρΕΟΡΡ-C3 φορείς επιμολύνθηκαν σε κύτταρα ΗΕΚ293Τ χρησιμοποιώντας Fugene 6-HD (Roche) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Ζωντανά επιμολυσμένα κύτταρα τοποθετήθηκαν πάνω σε γυάλινες καλυπτρίδες χρώστηκαν με Hoechst 333412 (Invitrogen) και απεικονίστηκαν 48 ώρες μετά την επιμόλυνση. Για την ανάλυση Western, τρία εκατομμύρια κύτταρα μορφομετατράπηκαν χρησιμοποιώντας Fugene 6-HD (Roche) και τα κύτταρα συλλέγονται για εκχύλιση πρωτεΐνης 72 ώρες αργότερα.

shRNA μεσολάβηση knockdown του BORIS

κύτταρα ΗΕΚ293Τ επιμολύνθηκαν παροδικά χρησιμοποιώντας καθαρισμένη και αλληλουχία επαληθεύεται πλασμίδια: GI320730 (. στοχεύει σε μια συγκεκριμένη τοποθεσία BORIS που κωδικοποιείται από το εξόνιο 5 που περιλαμβάνεται στην 19/23 παραλλαγές ματίσματος που προσδιορίζονται από Pugacheva κ.ά., [19]), GI320731 (στοχευμένες σε μία ειδική θέση BORIS κωδικοποιείται από το εξόνιο 3, η οποία είναι παρούσα σε όλες τις 23 παραλλαγές), TR30007 (φορέας άδειο pGFP-V-RS) και TR30008 (29-μερές μη αποτελεσματική GFP (pGFP-V-RS)) από ΟηΟεηε (κατάλογος κιτ αριθμός TG305184). Εν συντομία, κύτταρα ΗΕΚ293Τ επιμολύνθηκαν με shRNA κλώνους GI320730, GI320731, TR30008 ή TR30007 χρησιμοποιώντας Fugene 6-HD (Roche). Τα κύτταρα αναλύθηκαν 72 ώρες μετά την επιμόλυνση. Τρεις βιολογική επαναληπτικές πειράματα shRNA διεξήχθησαν για κάθε κλώνο shRNA. Ποσοτικοποίηση των μεταγραφών mRNA διεξήχθη χρησιμοποιώντας RT-PCR και όλα τα δεδομένα κανονικοποιούνται σε GAPDH και άδειο φορέα οριστεί σε 1. Για τον ποσοτικό προσδιορισμό της χρώσης ανοσοφθορισμού BORIS, εικόνες των κυττάρων ΗΕΚ293Τ συλλέχθηκαν 72 ώρες μετά την επιμόλυνση χρησιμοποιώντας την ίδια ώρα έκθεσης. Εικόνες που συλλαμβάνονται από 5 τυχαία πεδία που περιέχουν τουλάχιστον 30 κύτταρα εισήχθησαν στην έκδοση του λογισμικού ImageJ 1,44 (Rasband, WS, ImageJ, US National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, https://imagej.nih.gov/ij/) . Περιοχές ενδιαφέροντος (ROI) δημιουργήθηκαν σαν μάσκα γύρω από DAPI χρωματισμένο πυρήνες (μπλε) και το όριο προσαρμόζεται για να αφαιρέσετε φόντο. ένταση φθορισμού υπολογίστηκε για BORIS Alexa 594 σήμα (κόκκινο) στο πλαίσιο αυτής της μάσκας και η μέση πυρηνική φθορισμού υπολογίστηκε διαιρώντας τη συνολική ένταση με την πυρηνική περιοχή σε κάθε εικόνα. Τα δεδομένα εξάγονται σε Excel και αξιολογήθηκε στατιστική σημαντικότητα με ανάλυση One-Way Anova.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Εικόνα S1.

Αντίσωμα πεπτιδίου ανταγωνισμό στις φυσιολογικές και καρκινικές κυτταρικές σειρές. Ανάλυση κηλίδας Western χρησιμοποιώντας ab18337 αντισώματος BORIS (Abcam) με και χωρίς ειδικό πεπτίδιο αποκλεισμού ab22203 (Abcam). Επωάζοντας πεπτίδιο 20 ug με 10 μg BORIS ab18337 αντισώματος (Abcam) σε ρυθμιστικό TBST 200 ul στους 37 ° C όλη τη νύκτα μπλοκάρει εντελώς τις ζώνες που λαμβάνονται χρησιμοποιώντας un-αποκλεισμένη αντίσωμα. magnification.

doi:10.1371/journal.pone.0022399.s011

(AVI)

Acknowledgments

Colorectal