Abstract

ανάπτυξη του όγκου συνοδεύεται από ένα συγκρότημα υποδοχής συστημική απόκριση, η οποία περιλαμβάνει φλεγμονώδεις και αγγειογόνων αντιδράσεις. Και οι δύο πρωτεΐνες που προέρχονται από όγκους και συστημική απόκριση ανιχνεύθηκε στο πλάσμα από ασθενείς με καρκίνο. Ωστόσο, δεδομένης της μη ειδικής φύσης τους, οι πρωτεΐνες συστημική απάντηση μπορεί να συγχύσει την ανίχνευση ή τη διάγνωση της νεοπλασίας. Εδώ, έχουμε εφαρμόσει μια διεξοδική ποσοτική πρωτεομική προσέγγιση να αναλύσει τις αλλαγές στις πρωτεΐνες του πλάσματος σε μοντέλα ποντικών υποξείας ερεθιστικό με γνώμονα την φλεγμονή, αυτοαντιδραστικών φλεγμονή, και της μήτρας που σχετίζονται αγγειογένεση και σε σύγκριση με τα αποτελέσματα να περιγράφηκε προηγουμένως ευρήματα από μοντέλα ποντικών του πολυώματος μέση T-οδηγείται καρκίνο του μαστού και Pdx1-Cre Kras

G12D ΙΝΚ4 & /ΤΑΠ

LOX /LOX επαγόμενη από καρκίνο του παγκρέατος. Μεταξύ των σύγχυσης μοντέλα, περίπου το 1/3 του συνόλου των πρωτεϊνών του πλάσματος ποσοτικοποιείται εμφάνισαν μια σημαντική αλλαγή στην αφθονία σε σύγκριση με τους ποντικούς ελέγχου. Των πρωτεϊνών που άλλαξαν σε αφθονία, η πλειοψηφία ήταν μοναδική για κάθε μοντέλο. Altered πρωτεΐνες συμπεριλαμβάνονται εκείνοι που εμπλέκονται στην απόκριση οξείας φάσης, φλεγμονή, εξωκυττάρια μήτρα αναδιαμόρφωση, αγγειογένεση, και σηματοδότηση ΤΟΡβ. Σύγκριση των μεταβολών στις πρωτεΐνες του πλάσματος μεταξύ των μοντέλων παράγοντας σύγχυσης και των δύο μοντέλων καρκίνο αποκάλυψε πρωτεΐνες που περιορίζονται στα ποντίκια που φέρουν καρκίνο, αντανακλώντας τη γνωστή βιολογία των όγκων αυτών. Αυτή η προσέγγιση παρέχει μια βάση για τη διάκριση μεταξύ της πρωτεΐνης αλλαγές στο πλάσμα που είναι καρκίνος-σχετικές και αυτά που αποτελούν μέρος ενός μη-ειδική απόκριση του ξενιστή

Παράθεση:. Kelly-Spratt KS, Pitteri SJ, Gurley ΚΕ, Liggitt D, Chin Α, Κένεντι J, et al. (2011) Plasma Proteome προφίλ που σχετίζονται με τη φλεγμονή, αγγειογένεση, και ο καρκίνος. PLoS ONE 6 (5): e19721. doi: 10.1371 /journal.pone.0019721

Επιμέλεια: Pierre Bobe, Institut Jacques Monod, Γαλλία

Ελήφθη: 11 Δεκέμβρη του 2010? Αποδεκτές: 14, Απριλίου 2011? Δημοσιεύθηκε: May 12, 2011

Copyright: © 2011 Kelly-Spratt et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο χρηματοδοτήθηκε από το Γ Ίδρυμα Paul Allen Οικογένεια, τα μοντέλα NCI ποντίκι του Human Cancer Consortium πρόγραμμα (MMHCC) και των Καναρίων Ιδρύματος. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Η αποτελεσματική θεραπεία του καρκίνου βασίζεται σε μια ακριβή διάγνωση σε πρώιμο στάδιο της νόσου και την πρόγνωση βελτιώνεται σημαντικά εάν ο καρκίνος ανιχνεύεται νωρίς [1]. Οι εξετάσεις αίματος που βασίζεται για την έγκαιρη διάγνωση του καρκίνου είναι το ιδανικό, δεδομένου ότι το αίμα ισοπαλίες είναι φθηνά, ελάχιστα επεμβατικές, και τη ρουτίνα στην κλινική πράξη. Ενώ η έννοια της δοκιμής του καρκίνου με βάση το αίμα είναι απλή, η εφαρμογή της έχει προκλητικό, σε σημείο που πολύ λίγες νέες βιοδείκτες του καρκίνου έχουν FDA ενέκρινε πρόσφατα [2] ετών. Επιπλέον, εκείνοι που χρησιμοποιούνται σήμερα, όπως CA125 και PSA για τον καρκίνο των ωοθηκών και του προστάτη αντίστοιχα, περιορίζονται ουσιαστικά από τα υψηλά ποσοστά ψευδώς θετικών και υπερ-διάγνωση [3], [4]. Ένα σημαντικό εμπόδιο για την ανάπτυξη νέων βιολογικών δεικτών με βάση το αίμα ήταν η τεχνική πρόκληση της ανακρίνει τον proteome πλάσμα [5]. Ένα άλλο εμπόδιο ήταν η επιλογή των συγκρίσεων υπόθεση /έλεγχος στην ανακάλυψη βιοδεικτών [6]. Επίπεδα των υποψήφιων βιοσημειωτών από τους ασθενείς με καρκίνο συχνά σε σύγκριση με υγιή άτομα. Σε αυτές τις μελέτες, είναι δύσκολο να ελεγχθεί για γενετικές ή περιβαλλοντικές μεταβλητές, όπως επίσης και μη-καρκινικές «σύγχυσης» συνθήκες. Για παράδειγμα, η φλεγμονή και αγγειογένεση είναι το σήμα κατατεθέν του καρκίνου, αλλά επίσης κατά τη διάρκεια λοιμώξεων, χρόνιας φλεγμονής, αυτο-αντιδραστικά ασθένειες και άλλες καταστάσεις που δεν είναι ειδικά για τον καρκίνο [7]. Ενώ μερικές μελέτες βιοδεικτών έχουν χρησιμοποιηθεί φλεγμονώδεις καταστάσεις, όπως οι έλεγχοι [8], [9], αυτό δεν αίρει την ανάγκη να προσδιοριστεί το εύρος των πρωτεϊνών που συμβαίνουν με φλεγμονώδεις καταστάσεις. Πράγματι, το γεγονός ότι πολλές βιοδείκτες υποψήφιος καρκίνο στερούνται επαρκή ειδικότητα για να είναι χρήσιμος υποστηρίζει μια νέα προσέγγιση [1], [6].

Φλεγμονή και αγγειογένεση παίζουν σημαντικούς ρόλους σε όλα τα στάδια της εξέλιξης του καρκίνου, συμπεριλαμβανομένης της έναρξης του όγκου , την ανάπτυξη και τη διάδοση μεταστατικό. Πράγματι, χρόνιες φλεγμονώδεις καταστάσεις αποτελούν ισχυρούς παράγοντες κινδύνου για τον καρκίνο [10]. Φλεγμονή υποκινεί και προάγει την καρκινογένεση προκαλώντας κυττάρων και βλάβη του γονιδιώματος, διεγείροντας την κυτταρική κύκλου εργασιών μέσω των κυτοκινών και την απελευθέρωση αυξητικών παραγόντων, και δημιουργώντας ένα μικροπεριβάλλον των ιστών που μπορούν να ενισχύσουν την εισβολή, τη μετανάστευση και την αγγειογένεση. Τέλος, το ανοσοποιητικό σύστημα ελέγχει επίσης την εξέλιξη του καρκίνου μέσω της ανοσολογικής και ανοσοδιαμόρφωσης [11]. Η φλεγμονή είναι μια πολύπλοκη διαδικασία που θεσπίστηκε από τον ξενιστή για τον έλεγχο βλάβη των ιστών έναντι παθογόνων, τραυματικές, ή τοξική βλάβη και είναι γενικά κατηγοριοποιούνται σε οξεία, ταχεία αντίδραση, ένα υπο-οξεία φάση της μετάβασης, και μια επίμονη αλλά σιγά-σιγά εξελίσσεται χρόνια πάθηση. Η οξεία φλεγμονώδης απόκριση περιλαμβάνει μια ταχεία παράδοση των συστατικών του αίματος, το πλάσμα, τα ουδετερόφιλα, και τα λευκοκύτταρα στη θέση της μόλυνσης ή τραυματισμού, που ακολουθείται από μια εισροή των μακροφάγων για την επίλυση και την επισκευή του τραυματισμού [12]. Οι οξείες πρωτεΐνες φάση που βρίσκονται στο πλάσμα ορίζεται ως θετικά ή αρνητικά ανάλογα με το αν αυξηθεί ή να μειωθεί κατά τη διάρκεια μιας φλεγμονώδους διαταραχής. Αν μια οξεία φλεγμονώδη απόκριση αποτύχει να επιλύσει τη ζημιά, η μετάβαση γίνεται με ένα εξελισσόμενο στάδιο υποξεία, στη συνέχεια, σε μια χρόνια φλεγμονώδης κατάσταση. Η χρόνια φλεγμονή, όπως αυτή που παρατηρείται σε ορισμένες αυτοαντιδραστικών συνθήκες, μπορεί να είναι «ενεργό». Αυτό χαρακτηρίζεται από την αναδιαμόρφωση του ιστού, μακροφάγα, Τ και Β κύτταρα, αγγειογόνες και άλλους παράγοντες. Η χρόνια φλεγμονή μπορεί, με τη σειρά της, να οδηγήσει σε υπερβολική βλάβη των ιστών, το ανοσοποιητικό απορρύθμιση, και αυτοανοσία [10], [13].

Η αγγειογένεση, η βλάστηση των νέων αιμοφόρων αγγείων από προϋπάρχον αγγειακό σύστημα, υποχρεούται να παρέχει οξυγόνο και άλλα θρεπτικά συστατικά για την υποστήριξη της ανάπτυξης του όγκου? και ο βαθμός της αγγείωσης είναι ένας προγνωστικός παράγοντας που συσχετίζεται με την επιθετικότητα του όγκου [14]. Ωστόσο, η αγγειογένεση συνδέεται επίσης με μη καρκινικές καταστάσεις, όπως η επούλωση των πληγών, την επισκευή ιστού, ρευματοειδή αρθρίτιδα, και άλλες χρόνιες φλεγμονώδεις ασθένειες [15]. Ετσι, η φλεγμονή και αγγειογένεση εμπλέκονται στενά στον καρκίνο, καθώς και άλλες κοινές παθολογίες. Οι όροι αυτοί ενεργοποιούν σύνθετο και δυναμικό συστημικές αποκρίσεις, αλλά ο βαθμός επικάλυψης μεταξύ του συστημική απόκριση σε καρκίνο και σε μη καρκινικές καταστάσεις είναι σε μεγάλο βαθμό άγνωστη.

Για να χαρακτηριστεί η συστημική απόκριση σε καρκίνο και τη φλεγμονή, εφαρμόσαμε πρωτεομική πλάσμα για μοντέλα ποντικών υποξείας φλεγμονής, χρόνια φλεγμονή, και την αγγειογένεση. μοντέλα ποντικών ξεπεραστούν ορισμένα βασικά εμπόδια για την ανακάλυψη βιοδεικτών, συμπεριλαμβανομένης της ανάπτυξης της τεχνολογίας [16]? ακριβέστερη αντιστοίχιση των περιπτώσεων και ελέγχων για τη μείωση της γενετικής, την ηλικία, και περιβαλλοντικές μεταβλητές? ανακρίνει τις δυναμικές αλλαγές στο proteome πλάσμα μέσω της εξέλιξης της νόσου? και την ένταξη των αποτελεσμάτων με τις εκτεταμένες βιολογικές βάσεις της γνώσης [17]. ενέσεις καραγενάνη χρησιμοποιήθηκαν για το μοντέλο υποξείας φλεγμονής [18]. Αυτό το μοντέλο αντιπροσωπεύει μια υποδερμική απόκριση των εξελισσόμενων τοπικού ερεθισμού και νέκρωση παρόμοιο με αυτό που θα μπορούσε να φανεί παρακάτω νέκρωσης όγκου. Για χρόνια φλεγμονή, χρησιμοποιήσαμε μια επαγόμενη από κολλαγόνο μοντέλο αρθρίτιδας [19]. Αυτό το μοντέλο σχετίζεται με συμπλέγματα αντιγόνου-αντισώματος, σύμφωνα με μια αυτο-αντιδραστικά αλλοίωση, με διήθηση των μονοπύρηνων κυττάρων, την ανάπλαση του οστού, ινοπλασία και αγγειακή ανάπτυξη που περιβάλλουν την άρθρωση. ενέσεις FGF χρησιμοποιήθηκαν για να διεγείρουν την αγγειογένεση, με αποτέλεσμα την ταχεία in-ανάπτυξη των αιμοφόρων αγγείων και των υποστηρικτικών στοιχείων στρωματικά [20].

Ένας μεγάλος αριθμός των πρωτεϊνών του πλάσματος άλλαξε σε αφθονία σε κάθε μοντέλο, αντανακλώντας την πολύπλοκη βιολογία του καθενός κατάσταση. Αυτά τα προφίλ πλάσματος σε σύγκριση με εκείνες που είχαν διαπιστωθεί σε δύο καλά χαρακτηρισμένες μοντέλα ποντικών της παγκρεατικής [21] και του καρκίνου του μαστού [22]. Στο μοντέλο καρκίνου του μαστού, ο ογκοπρωτεΐνη πολυώματος Μεσαίο Τ αντιγόνο (PyMT) οδηγείται από το ΜΜΤν LTR και περιορίζεται στο μαστικό επιθήλιο. Αυτά τα ποντίκια αναπτύσσουν καρκινώματα που μοιάζουν με ανθρώπινο καρκίνο του μαστού και ότι συνδέονται με διήθηση λευκοκυττάρων και την επακόλουθη πνευμονική μετάσταση [23]. Ανάπτυξη του καρκίνου του παγκρέατος στην Pdx1-Cre Kras

G12D ΙΝΚ4 & /ΤΑΠ

μοντέλο LOX /LOX αφορά την εξέλιξη από τα παγκρεατικά ενδοεπιθηλιακή νεοπλασία (PanINs) για να παγκρεατικού πόρου αδενοκαρκίνωμα (PDAC), πιστά ανακεφαλαιώνοντας την ανθρώπινη ασθένεια [24]. Εδώ μπορούμε να δείξουμε ότι η πλειοψηφία των μεταβολών των πρωτεϊνών του πλάσματος προσδιορίζονται σε αυτά τα μοντέλα όγκων ήταν μοναδικά για κάθε μοντέλο και δεν έχει παρατηρηθεί στα μοντέλα παράγοντας σύγχυσης. Επιπλέον, πολλές από αυτές τις πρωτεΐνες έχουν γνωστές ρόλους στην εξέλιξη του καρκίνου. Η ταυτοποίηση και ο χαρακτηρισμός των προφίλ πρωτεΐνης που σχετίζεται με τον καρκίνο έναντι μη καρκινικές παθολογίες μπορούν να χρησιμοποιηθούν για να κατανοήσουν την πολύπλοκη βιολογία της απόκρισης ξενιστή σε καρκίνο και να δοθεί προτεραιότητα υποψήφιος βιοδεικτών που σχετίζονται με τον καρκίνο.

Υλικά και Μέθοδοι

μελέτες σε ζώα

οι μελέτες σε ζώα πραγματοποιήθηκαν σύμφωνα με τους κανονισμούς IACUC όπως εγκρίθηκε από την επιτροπή χρήση ζώων FHCRC (πρωτόκολλο # 1311). Δέκα θηλυκά FVB ποντικοί χρησιμοποιήθηκαν για κάθε κατάσταση συνδυάζεται με δέκα χωρίς θεραπεία ελέγχους της ίδιας γέννας. Για το μοντέλο οξείας φλεγμονής που μεταβαίνει σε υποξεία φλεγμονή, χρησιμοποιήσαμε ένα καλά γνωστό προ-φλεγμονώδη ερεθιστικό, καραγενάνη, έναν υδατάνθρακα που προέρχονται από φύκια [18]. Αυτή παραδόθηκε μέσω ενός εμφυτεύματος σφουγγάρι το οποίο συντηρεί την απελευθέρωση καρραγενάνης και συμβάλλει μια κλασική απόκριση ξένου σώματος. 10 x 10 mm χειρουργικοί σπόγγοι εγχύθηκαν με 1% carrageenan (Sigma C1867-5G) και εμφυτεύεται υποδορίως στο δεξιό πλευρό. Πλάσμα συλλέχθηκε με καρδιακή παρακέντηση 3 εβδομάδες αργότερα. Οι πρωτεΐνες του πλάσματος προσδιορίζονται από αυτούς τους ποντικούς θα πρέπει να αντιστοιχεί σε μια καθυστερημένη απόκριση στάδιο υποξεία στην καρραγενάνη και συναφών επιπτώσεων σφουγγάρι, παρά την έναρξη της οξείας φλεγμονώδους απόκρισης η οποία λαμβάνει χώρα εντός 72 ωρών. Για να αξιολογηθεί το προφίλ πρωτεΐνης που σχετίζεται με χρόνια φλεγμονή, χρησιμοποιήσαμε ένα επαγόμενης από κολλαγόνο μοντέλο αρθρίτιδας ποντικού [19]. Βόειο κολλαγόνο τύπου II (CII) (BD Biosciences, San Jose, CA) γαλακτωματοποιήθηκαν με πλήρες επικουρικό του Freund (Pierce, Rockford, IL) σε τελική συγκέντρωση 4 mg /ml και ένα σύνολο 0.1 ml ενέθηκε ενδοδερμικά κοντά στη βάση της ουράς. Αυτό έχει ως αποτέλεσμα την ανάπτυξη της χρόνιας αρθρίτιδας στα οπίσθια πέλματα εντός 14-21 ημερών. Οι ποντικοί παρακολουθήθηκαν κάθε 2-3 ημέρες για την ανάπτυξη και την εξέλιξη της αρθρίτιδας και πλάσματος που συλλέγονται κατά την ανάπτυξη του πρησμένο οπίσθια πέλματα στις 4 εβδομάδες. Για το μοντέλο αγγειογένεσης, matrigel (BD Biosciences, San Jose, CA) συν FGF (500 ng /ml) (Invitrogen, Carlsbad, CA) εγχύθηκε υποδορίως στην δεξιά πλευρά με αποτέλεσμα την ταχεία in-ανάπτυξη των αιμοφόρων αγγείων και την υποστήριξη στρωματικά στοιχεία αλλά με λίγο συνδέονται φλεγμονής [20]. Πλάσμα συλλέχθηκε 3 εβδομάδες αργότερα. Για τα μοντέλα αυτά, το αίμα από την πειραματική και ελέγχου ποντικών που συλλέγονται από καρδιακή παρακέντηση, με χρήση 1 cm

3 σύριγγας και 23 g βελόνα, και τοποθετήθηκε σε ένα σωλήνα K3-EDTA (Webster Κτηνιατρικής Προμήθεια, Sterling, ΜΑ) [17 ]. Το πλάσμα απομονώθηκε με φυγοκέντρηση στα 2000 χ g για 5 λεπτά και κλάσματα μεταφέρθηκαν σε κρυοφιαλίδια και καταψύχθηκε στους -80 ° C.

συλλογή δείγματος για τη παγκρεατική [21] και του μαστού [22] μοντέλα ποντικών καρκίνος έχει προηγουμένως περιγραφεί. Εν συντομία, τα ποντίκια για τον καρκίνο του παγκρέατος πρωτεομική ανάλυση ελήφθησαν από την εκτροφή Pdx1-Cre

ΙΝΚ4 & /ΤΑΠ

LOX /LOX και

Kras

G12D

ΙΝΚ4 & /ΤΑΠ

LOX /LOX. Πειραματική Pdx1-Cre

Kras

G12D

ΙΝΚ4 & /ΤΑΠ

LOX /ποντίκια LOX και ελέγχου

Kras

G12D

ΙΝΚ4 & /ΤΑΠ

LOX /LOX και Pdx1-Cre

ΙΝΚ4 & /ΤΑΠ

LOX /ποντίκια LOX θυσιάστηκαν στις 5,5 και 7 εβδομάδων. Και για τα δύο ποντίκια περίπτωση και ελέγχου, θανατηφόρα comas προκλήθηκαν με έγχυση ποντικών ε.π. με 0,6-0,8 mL 5% Avertin (2,2,2-τριβρωμοαιθανόλη, Sigma). Αυτή η διαφορά στη μέθοδο της ευθανασίας εισάγει μια πιθανή, αν και πιθανότατα ήσσονος σημασίας, προειδοποίηση κατά τη σύγκριση των μοντέλων πάγκρεας με τα άλλα μοντέλα. Μία σύριγγα 1-mL με 22 g βελόνα χρησιμοποιήθηκε για καρδιακή παρακέντηση για τη λήψη αίματος. Το αίμα τοποθετήθηκε σε K3-EDTA σωλήνες (Fisher) και φυγοκεντρήθηκε στους 4 ° C για 5 λεπτά στις 3000 rpm. Το πλάσμα απομακρύνθηκε και αποθηκεύθηκε στους -80 ° C.

Για το μοντέλο ποντικού καρκίνου του μαστού, διαγονιδιακά FVB /N-Tg (MMTV-PyVT) 634Mul /J (PyMT) ποντίκια ελήφθησαν από το Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου και εκτρέφονται in-house για την απόκτηση δειγμάτων πλάσματος από ποντικούς που φέρουν όγκο και κουτάβια αναφοράς σε δύο χρονικά σημεία της ανάπτυξης του καρκίνου του μαστού. PyMT άνδρες ετεροζυγώτες διασταυρώθηκαν με FVB θηλυκά άγριου τύπου για να δημιουργήσει την ομάδα της PyMT ετεροζυγώτες και άγριου τύπου θηλυκά για τη μελέτη. Για να αποφευχθεί η προκατάληψη, PyMT διαγονιδιακών και ελέγχου ποντίκια ζεύγη κατά τον απογαλακτισμό και αντιστοιχήθηκαν σε σχέση με την ηλικία, σκουπίδια, και κλουβί. Όλα τα ποντίκια ταΐστηκαν τυπική τροφή (Harland Tekland, 8664) και οξινισμένο νερό

κατά βούληση

και διατηρούνται σε έναν κύκλο φωτός-σκότους 12 h. Ξεκινώντας στις 5 εβδομάδες ηλικίας, οι ποντικοί ψηλαφείται κάθε δεύτερη ημέρα για να ανιχνεύσει την ανάπτυξη του όγκου του μαστού. όγκους του μαστού αφέθηκαν να αναπτυχθούν είτε 0,5 ή 1 cm σε διάμετρο, μετά την οποία το κάθε ποντίκι που φέρει όγκο και ένας έλεγχος υποβλήθηκαν σε ευθανασία back-to-back την ίδια μέρα με CO

2 εισπνοή. Ελήφθη αίμα με καρδιακή παρακέντηση και το πλάσμα απομονώθηκε και αποθηκεύθηκε όπως περιγράφηκε για τα μοντέλα ποντικού φλεγμονή και αγγειογένεση.

ανοσοεξάντληση του άφθονες πρωτεΐνες και ισοτοπική επισήμανση

50 μΙ πλάσματος από 5 ποντικούς ομαδοποιήθηκαν για κάθε σετ δειγμάτων περιπτώσεων και ελέγχου. Πισίνες ήταν ανοσολογικά από τις τρεις πρώτες πιο άφθονες πρωτεΐνες (αλβουμίνη, IgG, και τρανσφερίνη) χρησιμοποιώντας μία στήλη MS-3 (4,6 χ 10 mm, Agilent). Η στήλη ανοσοεξάντληση εξισορροπήθηκε με ρυθμιστικό Α σε (0,5 ml /min) για 13 λεπτά και υποπολλαπλάσια συγκεντρωμένων ορών εγχύθηκαν μετά από διήθηση μέσω ηθμού σύριγγας 0.22 μm. Τα κλάσματα ροής συλλέχθηκαν για 10 λεπτά σε ένα ρυθμό ροής του ρυθμιστικού διαλύματος Α 0.5 mL /min, σε συνδυασμό και αποθηκεύτηκε στους -80 ° C. Το δεσμευμένο υλικό στήλη ανακτήθηκε με έκλουση για 8 λεπτά με ρυθμιστικό Β σε 1 ml /min. Ακολούθως, ανοσολογικά δείγματα συμπυκνώθηκαν χρησιμοποιώντας Centricon ΥΜ-3 συσκευών (Millipore Corp, Bedford, ΜΑ) και επανα-αραιωμένο σε 8 Μ ουρία, 100 mM Tris ρΗ 8,5, 0,5% OG (οκτυλ-βήτα-ϋ-γλυκοπυρανοσίδη, Roche). Μετά την εξάντληση και ανταλλαγή ρυθμιστικού διαλύματος, οι συγκεντρώσεις πρωτεΐνης προσδιορίστηκαν με δοκιμασίες Bradford: αγγειογένεση 2,5 mg (υπόθεση) και 3,8 mg (έλεγχος), η χρόνια φλεγμονή 4,3 mg (υπόθεση) και 3,8 mg (έλεγχος), και οξεία φλεγμονή 2,8 mg (υπόθεση) και 3,1 mg (έλεγχος), και ολόκληρη η ποσότητα της πρωτεΐνης για κάθε δείγμα χρησιμοποιήθηκε για επακόλουθη επισήμανση ακρυλαμιδίου. Τα δείγματα ανάχθηκαν με DTT (0,66 mg DTT /mg πρωτεΐνης), και ισοτοπική επισήμανση των υπολειμμάτων κυστεΐνης σε άθικτες πρωτεΐνες διεξήχθη. Τα δείγματα ελέγχου σημάνθηκαν με ισότοπο φως 12C ακρυλαμίδιο (7.1 mg /mg πρωτεΐνης) (& gt? καθαρότητα 99,5%, Fluka), και πειραματικά δείγματα σημάνθηκαν με το βαρύ 13C-ακρυλαμίδιο ισότοπο (Cambridge Isotope Laboratories, 7.4 mg /mg πρωτεΐνης) για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Πισίνες ελέγχου και πειραματικών δειγμάτων μετά συνδυάστηκαν για ανέπαφη διαχωρισμό των πρωτεϊνών.

Ακέραια διαχωρισμού πρωτεΐνης

Τα συνδυασμένα ισοτοπικώς επισημασμένου δείγματα διαχωρίστηκαν με ένα αυτοματοποιημένο σύστημα απευθείας 2D-HPLC που ελέγχονται από Workstation Class-VP 7.4 (Shimadzu Corporation). Τα συνδυασμένα επισημασμένα δείγματα πλάσματος διαχωρίστηκαν στην πρώτη διάσταση σε μία στήλη ανταλλαγής ανιόντων (Poros HQ /10, 10mmlD χ 100 mL, Applied Biosystems) χρησιμοποιώντας μια 8 βήμα-έκλουσης (από 0 mM NaCl έως 1000 mM NaCl) σε 0.8 mL /λεπτό. Κλάσματα από κάθε μία από τις ανταλλαγής ανιόντων τα βήματα 8 διαχωρισμού έκλουσης αυτομάτως μεταφέρθηκαν πάνω σε μία στήλη ανάστροφης φάσης (PorosR2 /10, 4,6 χλστ ΕΔ χ 100 mL, Applied Biosystems) για μια δεύτερη διάσταση του διαχωρισμού. Μια βαθμιδωτή έκλουση 25 λεπτά (από 5% έως 95% κινητή φάση Β) χρησιμοποιήθηκε σε 2,4 mL /min. 3 κλάσματα συλλέχθηκαν ανά λεπτό, με κάθε κλάσμα που περιέχει 800 uL. 576 κλάσματα αντίστροφης φάσης συλλέχθηκαν συνολικά (κλάσματα ανταλλαγής ανιόντων 8 κάθε διαχωρίζεται σε 72 κλάσματα ανάστροφη φάση). Κινητή φάση Α για τη χρωματογραφία ανταλλαγής ανιόντων αποτελούνταν από 20 mM Tris (Sigma), 6% ισοπροπανόλη (Fisher), 4 Μ ουρία, ρΗ 8.5 και κινητή φάση Β ήταν η ίδια σύνθεση και ρΗ όπως Α με 1 Μ NaCl (Fisher) προστέθηκε . Κινητή φάση Α για τη χρωματογραφία αντίστροφης φάσης αποτελούνταν από 95% νερό, 5% ακετονιτρίλιο, 0.1% TFA (Supelco) και κινητή φάση Β συνίσταται από 90% ακετονιτρίλιο, 10% νερό, 0,1% TFA.

Μάζα ανάλυση φασματομετρίας

-διάλυμα πέψης διεξήχθη με λυοφιλοποιημένη κλάσματα από το στάδιο κλασματοποίησης αντίστροφης φάσης (δεύτερη διάσταση). Πρωτεΐνες σε επιμέρους κλάσματα επανεναιωρήθηκαν σε 0,25 Μ ουρία (Fisher) που περιέχει 50 mM διττανθρακικού αμμωνίου και 4% ακετονιτρίλιο και στη συνέχεια υπέστη πέψη όλη τη νύκτα με 200 ng τροποποιημένου θρυψίνη (Promega) στους 37 ° C. Τα προκύπτοντα μίγματα πεπτιδίων οξινίστηκαν με 5 μΐ 1% μυρμηκικό οξύ. Δείγματα υποβλήθηκαν σε ανάλυση φασματομετρία μάζας κυνηγετικό όπλο μετά τη συγκέντρωση πολλών συνεχών κλασμάτων (συγκέντρωση πρωτεΐνης εκτιμήθηκε με UV ίχνος). 12 πισίνες των επιμέρους κλασμάτων αντίστροφης φάσης για καθένα από τα στάδια ανταλλαγής ανιόντων 8 δημιουργήθηκαν συνδυάζοντας τα ακόλουθα διαδοχικά κλάσματα: 1-22, 23-24, 25-26, 27-28, 29-30, 31-32, 33 -34, 35-36, 37-38, 39-40, 41-42 και 43-72. 96 κλάσματα αναλύθηκαν για κάθε πείραμα από ένα φασματόμετρο μάζας LTQ-Orbitrap (Thermo) σε συνδυασμό με ένα nanoLC-1D (Eksigent). Το υγρό διαχωρισμού χρωματογραφία εκτελέστηκε σε μία στήλη 25 cm (Picofrit 75 μm id, νέους στόχους, συσκευασμένο σε-σπίτι με MagicC18 ρητίνη) με τη χρήση 90 λεπτά γραμμική βαθμίδα από 5 έως 40% ακετονιτρίλιο σε 0.1% μυρμηκικό οξύ στα 300 NL /min για ανάλυση κυνηγετικό όπλο. Περίπου 10 μg πρωτεΐνης εγχύθηκε ανά κλάσμα. Φάσματα που αποκτήθηκαν σε μία λειτουργία εξαρτώμενη από τα δεδομένα στο

m

/

z

φάσμα 400-1800, συμπεριλαμβανομένης της επιλογής των 5 πιο άφθονα +2 ή +3 ιόντα του κάθε φάσματος MS για MS /MS ανάλυση. Μάζα παράμετροι φασματόμετρο ήταν τριχοειδή τάση 2,0 KV, τριχοειδή θερμοκρασία 200 ° C, ανάλυση των 60.000, και τιμή-στόχο των 1.000.000.

Η επεξεργασία δεδομένων

Κεκτημένα δεδομένα αυτόματα επεξεργασία από τις Υπολογιστική Πρωτεϊνωματική Σύστημα ανάλυσης (CPAS) [25] αγωγό χρησιμοποιώντας το Χ! αλγόριθμος αναζήτησης Tandem [26] έχει ρυθμιστεί με τον κομήτη μονάδα βαθμολογία plug-in. PeptideProphet [27] και ProteinProphet [28] χρησιμοποιήθηκαν για την επικύρωση των αποτελεσμάτων αναζήτησης και των πρωτεϊνών συμπέρασμα. Η ποσοτικοποίηση πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του εργαλείου Q3 ποσοτικοποίηση [29]. Τα φάσματα μάζας παράλληλα αναζητήθηκαν κατά την έκδοση 3.48 της βάσης δεδομένων του ποντικιού IPI [30]. Όλες οι ταυτίσεις με πιθανότητα PeptideProphet μεγαλύτερη από 0,2 υποβλήθηκαν ProteinProphet, και οι επόμενες ταυτίσεις πρωτεΐνη διηθούνται σε ένα ελάχιστο ποσοστό σφάλματος 5%. Για τον ποσοτικό προσδιορισμό, οι αναλογίες για τις πρωτεΐνες υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας μόνο τα πεπτίδια επίτευξη PeptideProphet πιθανότητα τουλάχιστον 0,75. ομάδες πρωτεϊνών ανατεθεί από ProteinProphet συνδυάστηκαν με κοινή σύμβολο του γονιδίου και στο εξής αναφέρεται ως «πρωτεΐνη». αναλογίες περίπτωση /ελέγχου για κάθε πρωτεΐνη υπολογίστηκαν από το μέσο όρο αναλογίες log2 σε όλες τις πεπτίδια εκχωρηθεί στην πρωτεΐνη. Πάνω από 1.000.000 MS /MS φάσματα συλλέχθηκαν και πρωτεΐνες με 2.289 μοναδικά ονόματα γονίδιο ταυτοποιήθηκαν σε όλες τις 3 πειραματικά μοντέλα.

Η στατιστική σημαντικότητα της πρωτεΐνης ποσοτικός προσδιορισμός με φασματομετρία μάζας προσδιορίστηκε με δύο μεθόδους. Για πρωτεΐνες με πολλαπλές ζεύγη MS γεγονότα της βαριάς και ελαφριάς ακρυλαμίδιο, ένα one-δείγμα t-test χρησιμοποιήθηκε για να υπολογίσει μια ρ-τιμή για την μέση αναλογία του συνόλου πρωτεΐνης σε όλους τους κλάσματα. Δεύτερον, η πιθανότητα για την αναλογία για κάθε εκδήλωση MS υπολογίσθηκε από την κατανομή των δεικτών σε ένα πείραμα ελέγχου ελέγχου με τον οποίο χωρίστηκε το ίδιο δείγμα και επισημαίνονται με βαριά και ελαφριά ακρυλαμίδιο. Εάν η p-τιμή για κάθε επιμέρους περίπτωση ήταν & lt? 0,05, η αναλογία πρωτεΐνης θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική

Δίκτυο ανάλυση

Οι αυξημένες και μειωμένες πρωτεΐνες ταυτοποιήθηκαν από την ανάλυση IPAS χρησιμοποιήθηκαν για biofunction. και η ανάλυση μονοπατιού χρησιμοποιώντας Ingenuity διαδρομή ανάλυση (IPA) Λογισμικό (Ingenuity Systems, Mountain View, CA). Η βάση δεδομένων αποτελείται από IPA ιδιόκτητο οντολογίας που αντιπροσωπεύουν 300.000 βιολογική γονίδια, πρωτεΐνες, και μοριακών και κυτταρικών διαδικασιών.

Ένζυμο συνδεδεμένη ανοσορροφητική δοκιμή (ELISA) δοκιμασίες

επίπεδα του PF4, IGF1, ΙΟΡΒΡ5, και Lcn2 Plasma μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας εμπορικά διαθέσιμα κιτ Duoset ποντικού που λαμβάνεται από R &? D Systems (Minneapolis, ΜΝ). Το πλάσμα αραιώνεται 1:1000, 1:400, 1:120, και 1:180 για PF4, IGF1, ΙΟΡΒΡ5, και Lcn2, αντίστοιχα, για τη δοκιμή. Δοκιμασίες διεξήχθησαν σύμφωνα με το πρωτόκολλο και τα δείγματα του κατασκευαστή αναλύθηκαν εις διπλούν.

Αποτελέσματα

Αναγνώριση των πρωτεϊνών του πλάσματος διακριτή σε ποντίκια που φέρουν όγκο

Για να προσδιορίσετε το πλάσμα του καρκίνου περιορίζεται πρωτεΐνες, συγκρίναμε τις των πρωτεϊνών των ποντικιών με καραγενάνης επαγόμενη φλεγμονή υποξεία, επαγόμενη από κολλαγόνο αρθρίτιδα, και FGF-επαγόμενη αγγειογένεση στους των πρωτεϊνών των ποντικιών με PyMT οδηγείται καρκίνο του μαστού και Pdx1-Cre Kras

G12D ΙΝΚ4 & /ΤΑΠ

LOX /LOX καρκίνο του παγκρέατος. Πλάσματος που λαμβάνονται από ποντικούς με φλεγμονή υποξεία, χρόνια φλεγμονή, και αγγειογένεση, μαζί με τα ποντίκια ελέγχου ηλικίας αντιστοίχισης υποβλήθηκαν σε εις βάθος πρωτεομική ανάλυση. Σε πρωτεομική συγκρίσεις των πλασμάτων από ποντικούς με σύγχυση προϋπόθεση για τον έλεγχο ποντίκια, μεταξύ 378 έως 511 πρωτεΐνες ποσοτικοποιήθηκαν με βάση την απόκλιση ισοτοπική επισήμανση σχετικά με τα κατάλοιπα κυστεΐνης (Πίνακας S1). Η μεταβλητότητα του αριθμού των ποσοτικοποιημένων πρωτεϊνών αντικατοπτρίζει τη μεταβλητότητα στις μετρήσεις των πρωτεϊνών και μάζας δειγματοληψίας φασματομετρία. Αξίζει να σημειωθεί ότι, περίπου το ένα τρίτο όλων των ποσοτικοποιείται πρωτεϊνών άλλαξε σε αφθονία από 1,25-πλάσια ή μεγαλύτερη σε σύγκριση με τα ποντίκια ελέγχου (ρ & lt? 0,05) και, από αυτά, δύο έως τρεις φορές όσες μειώθηκαν σε αντίθεση με αυξημένη σε τρία μοντέλα (Πίνακας 1, Σχήμα S1). Αν λάβουμε υπόψη μόνο τις πρωτεΐνες ποσοτικά και στα τρία μοντέλα ποντικών, συγκρίσεις προφίλ πλάσματος μεταξύ των μοντέλων αποκάλυψε μια επικάλυψη 35% σε τροποποιημένη πρωτεΐνες μεταξύ υποξεία και χρόνια μοντέλα φλεγμονής, σε σύγκριση με μόνο μια επικάλυψη 15% μεταξύ των μοντέλων φλεγμονή και το μοντέλο αγγειογένεσης ( Τραπέζι 1). Λόγω του περιορισμένου δειγματοληψία του φασματόμετρου μάζας, ένας αριθμός πρωτεϊνών δεν προσδιορίστηκαν ποσοτικά σε όλα τα τρία μοντέλα ποντικού. Όταν δεν απαιτείται πρωτεΐνες να ποσοτικοποιηθεί και στα τρία μοντέλα ποντικού, την επικάλυψη του επάνω και κάτω ρυθμισμένα πρωτεΐνες δείχνεται στο Σχήμα 1Α και 1Β, αντιστοίχως. Συγκρίσεις των μεταβολών στα επίπεδα πρωτεΐνης για κάθε μοντέλο αποκάλυψε μία ισχυρή συσχέτιση μεταξύ της υποξείας και χρόνιας φλεγμονής, με σκορ δοκιμή Pearson 0.67 (Εικόνα 1C), ενώ οι συγκρίσεις του κάθε μοντέλου φλεγμονής στο μοντέλο αγγειογένεσης αποκαλύπτεται λιγότερο από 50% συσχετίσεις (δοκιμή Pearson βαθμολογίες 0.49 και 0.31, αντίστοιχα). Έτσι, τα προφίλ στο πλάσμα ήταν περισσότερο όμοια μεταξύ των μοντέλων φλεγμονής από ό, τι μεταξύ αγγειογένεσης και είτε το μοντέλο της φλεγμονής, γεγονός που αντικατοπτρίζει την υποκείμενη βιολογία αυτών των καταστάσεων. Περαιτέρω, η πλειονότητα των πρωτεϊνών μεταβάλλεται ήταν μοναδικά για κάθε μοντέλο παράγοντας σύγχυσης, αποδεικνύοντας βιολογική εξειδίκευση. Οι σχετικές ποσότητες των μεμονωμένων πρωτεϊνών που προσδιορίζονται σε κάθε ένα από τα τρία μοντέλα που απαριθμούνται στον Πίνακα S1.

Διαγράμματα Venn συγκρίσεως (Α) αυξήθηκε και (Β) μειώθηκε πρωτεΐνες στο πλάσμα από την υποξεία και χρόνια φλεγμονή και αγγειογένεση μοντέλα σε σύγκριση με τους ποντικούς ελέγχου. Διαγράμματα δείχνουν οι αριθμοί των πρωτεϊνών, είτε αυξημένες ή μειωμένες σε κάθε μοντέλο, και τα οποία είναι μοναδικά ή να μοιραστεί μεταξύ καθενός από τα 3 μοντέλα. Η πλειοψηφία των είτε αυξάνεται ή μειώνεται πρωτεΐνες ήταν μοναδικά για κάθε μοντέλο. (C) οικόπεδα Συσχέτιση ποσοτικοποιημένους πρωτεΐνες. Υπόθεση /ελέγχου (log2) αναλογίες για κάθε ποσοτικοποιημένο πρωτεΐνης απεικονίζονται στο Χ και Υ άξονες. Τα οικόπεδα αντανακλούν διαφορές αφθονία των συγκεκριμένων πρωτεϊνών ανάμεσα σε δύο μοντέλα. Πρωτεομικής συγκρίσεις μεταξύ της χρόνιας έναντι σύγκριση υποξεία φλεγμονή είναι πιο παρόμοια (R = 0,67) από ό, τι είναι συγκρίσεις μεταξύ είτε μοντέλο φλεγμονής και του μοντέλου αγγειογένεσης (R = 0,49 και 0,31, αντίστοιχα).

Η

Στη συνέχεια συνέκριναν τα πρωτεομική προφίλ αυτών των συγχέοντας τα μοντέλα προηγουμένως ληφθεί προφίλ από νωρίς και αργά καρκίνο του μαστού σταδίου [22], καθώς και προφίλ από πρώιμο στάδιο (PanINs) και προχωρημένο στάδιο (PDAC) καρκίνο του παγκρέατος [21]. Σε αντίθεση με τα μοντέλα παράγοντας σύγχυσης, ένας περίπου ίσο αριθμό πρωτεϊνών αυξήθηκαν και μειώθηκαν σε ποντικούς που φέρουν όγκο σε σύγκριση με τα ποντίκια που δεν φέρουν όγκο (Πίνακας 2). Αυτών των τροποποιημένων πρωτεϊνών, η μεγάλη πλειοψηφία (& gt? 75%) δεν είχαν μεταβληθεί σε συγχυτικούς παράγοντες (Πίνακας 2). Παρατηρήθηκαν τρεις μορφές κατανομής πρωτεΐνης πλάσματος: αυξημένη τόσο στις συγχυτικούς και τα μοντέλα καρκίνου (Σχήμα 2Α), αυξημένη σε παράγοντες σύγχυσης, αλλά αμετάβλητη ή μειώθηκε σε καρκίνο (Σχήμα 2Β), και μειώθηκε σε παράγοντες σύγχυσης και αυξημένη σε καρκίνο (Σχήμα 2C). Μόνο το 27% των πρωτεϊνών με τροποποιημένα επίπεδα στη μελέτη ήταν αυξημένα σε αμφότερες συγχυτικούς και καρκίνου, ενώ η μεγαλύτερη κατηγορία, αντιπροσωπεύοντας το 55% του συνόλου, αποτελείτο από πρωτεΐνες που μειώθηκαν σε παράγοντες σύγχυσης αλλά αυξήθηκε σε ποντίκια που φέρουν όγκο. Τα σχετικά επίπεδα αντιπροσωπευτικών πρωτεϊνών που εμφανίζουν αυτά τα πρότυπα φαίνεται στο Σχήμα 3. Σημειώστε, λυσυλο οξειδάση όπως 1 (Loxl1) και πρωτεογλυκάνης 4 (Prg4) ανάγονται στο πλάσμα από παράγοντες σύγχυσης και αυξημένη τόσο του μαστού και του παγκρέατος ποντικών που φέρουν όγκο, ενώ λιπαρό οξύ συνθάσης (Fasn) και lipocalin2 (Lcn2) αυξάνονται σε δύο συγχυτικούς παράγοντες και τα μοντέλα του καρκίνου (Πίνακας S1)

(Α) Πρωτεΐνες αυξήθηκε και στις δύο η σύγχυση και τα μοντέλα καρκίνου σε σύγκριση με τους μάρτυρες (& gt?. 1,25 φορές, σ & lt? 0.05), (Β) πρωτεϊνών αυξήθηκε σε συγχυτικούς παράγοντες και μειώθηκε σε μοντέλα καρκίνου, και (Γ) πρωτεΐνες μειώθηκε σε συγχυτικούς παράγοντες και αυξήθηκε σε μοντέλα καρκίνου (κόκκινο = πάνω, πράσινο = κάτω, μαύρο = καμία αλλαγή, γκρι = όχι ποσοτικά).

Οικόπεδα δείχνουν φασματομετρία μάζας με βάση log2 αναλογίες περίπτωση /ελέγχου για ειδικές πρωτεΐνες σε κάθε μοντέλο παράγοντας σύγχυσης και του καρκίνου που εμφανίζουν απόκλιση μοτίβα αφθονία. Loxl1 αντιπροσωπεύει πρωτεΐνες που ανάγονται στα συγχυτικούς παράγοντες και αυξημένα στα μοντέλα καρκίνου. Fasn παρουσιάζει αύξηση σε όλα τα μοντέλα, αλλά πολύ περισσότερο στην PanIN. Prg4 είναι αυξημένη κυρίως στο μοντέλο καρκίνου του παγκρέατος. Lcn2 είναι αυξημένη σε φλεγμονή και σε μεγαλύτερο βαθμό στα μοντέλα καρκίνου, αλλά όχι το μοντέλο αγγειογένεσης.

Η

Για να επαληθεύσετε τη διαφορά αφθονίας παρατηρήθηκε με φασματομετρία μάζας, οι δοκιμασίες ELISA πραγματοποιήθηκαν σε επιλεγμένα πρωτεΐνες με βάση εμπορική διαθεσιμότητα (PF4, IGF1, ΙΟΡΒΡ5, και Lcn2) (Σχήμα 4). Σημείωση, η ινσουλίνη αυξητικού παράγοντα 1 (IGF1) και ινσουλίνη, όπως πρωτεΐνη που δεσμεύεται με αυξητικό παράγοντα 5 (ΙΟΡΒΡ5) μειώθηκαν ή αμετάβλητο το η σύγχυση, αλλά αυξήθηκε σε ποντίκια που φέρουν όγκο του μαστού. Λιποκαλίνη 2 (Lcn2) αυξήθηκε σε όλα τα μοντέλα, αλλά σε υψηλότερο επίπεδο σε ποντίκια που φέρουν όγκο, ενώ παράγοντας αιμοπεταλίων 4 (PF4) μειώθηκε σε υποξεία φλεγμονή αλλά αυξήθηκε σε χρόνια φλεγμονή και τον καρκίνο. Άλλες πρωτεΐνες του πλάσματος που ήταν ειδικά αυξήθηκαν σε ποντίκια που φέρουν όγκο περιλαμβάνονται ακετυλο-CoA ακετυλοτρανσφεράση 1 και 3, λιπαρό οξύ πρωτεΐνες 1 και 4, fibulin, peroxiredoxins 1, 5 και 6, SPARC δεσμευτική, και thrombospondins 1 και 4.

ανάλυση ELISA του PF4, IGF1, ΙΟΡΒΡ5, και Lcn2 που δείχνει αυξημένη συγκέντρωση στο πλάσμα σε ποντικούς που φέρουν όγκο PyMT μαστού σε σύγκριση είτε με την υποξεία ή χρόνια φλεγμονή ποντίκια. Πλάσμα από ποντίκια χωρίς θεραπεία χρησιμοποιήθηκε ως μάρτυρας.

Η

αλλαγές πρωτεΐνες του πλάσματος παρατηρήθηκαν με τη φλεγμονή

επόμενο ανέλυσε τις τροποποιημένες πρωτεΐνες του πλάσματος από κάθε συνθήκη παράγοντας σύγχυσης. Στο μοντέλο υποξείας φλεγμονής, μεγαλύτερη από το 50% της αύξησης των πρωτεϊνών παίζουν ένα γνωστό ρόλο στη φλεγμονή, συμπεριλαμβανομένων των θετικών πρωτεϊνών οξείας φάσης [31], καθώς και οι χημειοκίνες Ccl8 και PF4 (επίσης γνωστή ως Cxcl4) (Πίνακας S1). Μεταξύ των μειώθηκαν πρωτεΐνες ήταν πέντε πρωτεΐνες του συμπληρώματος, καθώς και εκκρινόμενες πρωτεΐνες σηματοδότησης όπως RBP4, IGF1, IGF2, ΤΟΡβ, και Pdgfb. Ο καταρράκτης του συμπληρώματος είναι σημαντική στην απόκριση οξείας φάσης, ενώ IGF1 και Rb4 είναι αρνητικές πρωτείνες οξείας φάσης. ανάλυση δικτύου συνδέονται πολλές από τις πρωτεΐνες με αλλοιωμένη επίπεδα σε ενδοκυτταρική (NF-κΒ) και εκκρίνεται (IL-1 και ΤΟΡβ) ανοσοποιητικό σύστημα ρυθμιστών (Σχήμα 5Α, Β) [10]. ίδια ΤΟΡβ μειώθηκε, όπως και οι πολλαπλές πρωτεΐνες που εμπλέκονται στην σηματοδότηση ΤΟΡβ. Συλλογικά, πρωτεομική ανάλυση του πλάσματος εντοπίστηκαν γνωστές πρωτεΐνες οξείας φάσης, οι πρωτεΐνες που συνδέονται με φλεγμονώδεις ρυθμιστικές αρχές, όπως TGFβ, και επιπλέον πρωτεΐνες (π.χ. πρωτεΐνες του κυτταροσκελετού actins, cofilins, VASP, profilin και destrin) δεν είχαν προηγουμένως συνδέονται με τη φλεγμονή (Πίνακας S1).

Επάνω δίκτυα ανατεθεί από Ingenuity Pathway Ανάλυση για τόσο αυξάνεται και μειώνεται πρωτεϊνών από το υποξεία φλεγμονή (Α, Β), η χρόνια φλεγμονή (C, D) και τα μοντέλα αγγειογένεσης (E, F). Δίκτυα για τις άφθονες πρωτεΐνες ινωδογόνου και ECM υποξεία μοντέλο δείχνουν, το χρόνιο μοντέλο δίνει εξέχοντα παράγοντα ανάπτυξης και τα δίκτυα του κολλαγόνου, ενώ το δίκτυο της αγγειογένεσης δείχνει πρωτεΐνες χημειοκινών και πήξης. [Κόκκινο = αυξημένη, πράσινο = μειώθηκε, λευκό = καμία αλλαγή σε αφθονία σε περιπτώσεις vs ποντίκια ελέγχου, & gt? 1,25 φορές p & lt?. 0.05]

Η

Όπως και στο μοντέλο φλεγμονής υποξεία, ένας σημαντικός αριθμός. των πρωτεϊνών αυξήθηκε στο πλαίσιο χρόνιας φλεγμονής είχε γνωστό συνδέσεις με τη φλεγμονή. Αξιοσημείωτα, όμως, λιγότερες πρωτεΐνες απόκρισης οξείας φάσης εντοπίστηκαν από ότι με το μοντέλο υποξεία (Πίνακας S1). Μια άλλη σημαντική κατηγορία των πρωτεϊνών μεταβάλλεται με χρόνια φλεγμονή εμπλέκονται σε εξωκυτταρική μήτρα αναδιαμόρφωση (σχήμα 5C). Πολλές από αυτές μειώθηκαν και είναι στόχοι της πρωτεάσης ΜΜΡ2, η οποία αυξήθηκε η ίδια. Όπως και στο μοντέλο υποξείας, ΤΟΡβ και πρωτεΐνες που συνδέονται με την ρύθμιση της ή σηματοδότηση μειώθηκαν, συμπεριλαμβανομένων Ltbp1, Ltbp4, και Vasn (Σχήμα 5D).

πρωτεΐνη υπογραφή του πλάσματος για την αγγειογένεση

Ένας σημαντικός αριθμός των αλλοιωμένων πρωτεϊνών που εντοπίζονται στην αγγειογενετική μοντέλο γνωρίζουν μηχανιστική συνδέσεις με την αγγειογένεση και /ή εκφράζονται σε ενδοθηλιακά κύτταρα, όπως θρομβοσπονδίνη 1 και 4, ρενίνης 1 και 2, παράγοντας αιμοπεταλίων 4, τριφυλλοειδούς παράγοντα 1, και πρωτεΐνη δέσμευσης κολλαγόνου 2, καθώς επίσης και άλλες πρωτεΐνες που δεν έχουν προηγουμένως σχετίζονται με την αγγειογένεση. Επιπλέον, οι μεταβολές στις πρωτεΐνες του συμπληρώματος και παράγοντες πήξης, οι οποίες έχουν δεσμούς με αγγειογένεση, παρατηρήθηκαν (Σχήμα 5Ε) [32] [33].