Οι

Abstract

miRNAs προβλέπεται να ελέγχει τη δραστηριότητα του περίπου 60% όλων των γονιδίων που κωδικοποιούν πρωτεΐνες που συμμετέχουν στη ρύθμιση πολλών κυτταρικών διαδικασιών και ασθενειών, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου. Πρόσφατα, έχουμε αποδείξει ότι το miR-187 είναι σημαντικά προς τα κάτω σε καρκίνο του προστάτη (PCA) και εδώ έχουμε προτείνει μια πρωτεομική προσέγγιση για τον εντοπισμό πιθανών στόχων του. Για το σκοπό αυτό, PC-3 κύτταρα επιμολύνθηκαν παροδικά με miR-187 πρόδρομος και miRNA μιμούνται αρνητικό έλεγχο. Οι πρωτεΐνες αναλύθηκαν με ηλεκτροφόρηση δύο διαστάσεων διαφορά γέλη (2D-ΨΗΦΟ) και ορίζονται ως διαφορικά ρυθμιζόμενη εάν η παρατηρούμενη φορές αλλαγή ήταν ± 1,06. Στη συνέχεια, η ανάλυση MALDI-TOF MS διεξήχθη μετά την πέψη των πρωτεϊνών και πρωτεΐνες χαμηλής αφθονίας ταυτοποιήθηκαν με LC-MS /MS. Πεπτίδια που προσδιορίζονται από την αναζήτηση στη βάση δεδομένων ExPASy SWISS PROT, και την επικύρωση στόχος έγινε τόσο in vitro από κηλίδα western και qRT-PCR και σε κλινικά δείγματα από qRT-PCR, ανοσοϊστοχημεία και ELISA. ανάλυση έδειξε ΨΗΦΟ 9 εκφράζονται διαφορικά κηλίδες (ρ & lt? 0,05) και 7 έδειξαν μια κάτω-ρυθμιζόμενη έκφραση κατόπιν miR-187 επανεισαγωγής. Μεταξύ αυτών των στόχων που προσδιορίζονται αφυδρογονάση αλδεΰδη 1Α3 (ALDH1A3). ALDH1A3 έκφραση ήταν σημαντικά προς τα κάτω σε PC3, LNCaP και DU-145 κύτταρα μετά από miR-187 επανεισαγωγή. Στήριξη αυτά τα δεδομένα, η έκφραση της ALDH1A3 βρέθηκε σημαντικά (p & lt? 0,0001) πάνω ρυθμισμένα σε δείγματα προστάτη και αντιστρόφως συσχετίζονται (p & lt? 0,0001) με miR-187 έκφρασης, η έκφραση του να συνδέεται άμεσα με το σκορ Gleason (p = 0.05). Η έκφραση του ALDH1A3 μετρήθηκε σε δείγματα ούρων για να αξιολογηθεί η ικανότητα πρόβλεψης αυτού του βιοδείκτη για την παρουσία του προστάτη και, σε ένα επίπεδο σημασία του 10%, PSA και επίσης ALDH1A3 συσχετίζονταν σημαντικά με μια θετική βιοψία του προστάτη. Συμπερασματικά, τα δεδομένα μας δείχνουν για πρώτη φορά το ρόλο του ALDH1A3 ως στόχο miR-187 στην ΣΕΣΣ και παρέχει γνώσεις στην χρησιμότητα της χρήσης αυτής της πρωτεΐνης ως νέο βιοδείκτη για την PCA

Παράθεση:. Casanova-Salas εγώ, Masiá Ε, Armiñán Α, Καλατράβα Α, Mancarella C, Ρούμπιο-Briones J, et al. (2015) MiR-187 Στόχοι του ανδρογόνων-ρυθμιζόμενο γονίδιο

ALDH1A3

στον καρκίνο του προστάτη. PLoS ONE 10 (5): e0125576. doi: 10.1371 /journal.pone.0125576

Ακαδημαϊκό Επιμέλεια: Zoran Culig, Innsbruck Medical University, ΑΥΣΤΡΙΑ

Ελήφθη: 20 Οκτωβρίου, 2014? Αποδεκτές: 25 Μαρτίου, 2015? Δημοσιεύθηκε: May 13, 2015

Copyright: © 2015 Casanova-Salas et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Στοιχεία από μικροσυστοιχιών ανάλυση είναι προσβάσιμα σε NCBI Gene Expression Omnibus αριθμό προσχώρησης της βάσης δεδομένων GSE45604

Χρηματοδότηση:. η μελέτη αυτή χρηματοδοτήθηκε από το Instituto de Salud Carlos III PI10 /01206, FPI11 /00505, Μαδρίτη, FPI (CTQ2007-60601? CTQ2011-18195) από ισπανικό Υπουργείο Επιστημών και Παιδείας, καθώς και από το ιταλικό Υπουργείο Έρευνας και διδασκαλία (FIRB αριθμός έργου: RBAP11884 M_005), του Συνδέσμου ιταλική Έρευνας για τον Καρκίνο (Κάτια Scotlandi-AIRC έργου N.14049). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος του προστάτη (PCA) είναι η πιο κοινή μορφή καρκίνου και η δεύτερη κύρια αιτία θανάτου από καρκίνο στους άνδρες [1]. Περίπου ένας στους τρεις άνδρες ηλικίας άνω των 50 ετών δείχνει ιστολογική ένδειξη προστάτη. Ωστόσο, μόνο το 10% από αυτούς θα διαγνωστούν σωστά με κλινικά σημαντική προστάτη [2]. τα επίπεδα του PSA σε συνδυασμό με δακτυλική εξέταση (DRE) είναι τα κύρια κριτήρια για την PCA διάγνωση, αλλά συχνά οδηγούν σε πάνω διάγνωση και υπερθεραπεία [3]. Κατά συνέπεια, ο προσδιορισμός των νέων βιοδεικτών, είναι σε θέση να βελτιώσει τη διάγνωση και την ανίχνευση των δυνητικά επιθετική προστάτη, είναι απαραίτητες για την καλύτερη υποστήριξη κλινικών αποφάσεων.

miRNAs είναι μια κατηγορία των μικρών μορίων RNA μη-κωδικοποίησης που αποτελείται από 19-22 νουκλεοτίδια? εμπλέκονται σε μία ποικιλία βιολογικών διεργασιών, συμπεριλαμβανομένης της ανάπτυξης, της διαφοροποίησης, της απόπτωσης και του πολλαπλασιασμού των κυττάρων. miRNAs ρυθμίζουν την γονιδιακή έκφραση μέσω μεταφραστικής καταστολής και mRNA διάσπαση περισσότερο από το 60% των γονιδίων που κωδικοποιούν πρωτεΐνες [4, 5]. Αρκετές μελέτες προτείνουν ότι ένα άτομο miRNA μπορεί να ρυθμίσει εκατοντάδες στόχων [6] και μπορεί να λειτουργήσει είτε ως καταστολέας όγκου ή ογκογονιδίου, ανάλογα με τα γονίδια-στόχους [7], καθώς επίσης και συμβάλλουν στην έναρξη και την ανάπτυξη των διαφόρων τύπων καρκίνου, συμπεριλαμβανομένου του προστάτη [5].

Χρησιμοποιώντας ανάλυση μικροσυστοιχιών miRNA (NCBI Gene Expression Omnibus αριθμό προσχώρησης της βάσης δεδομένων GSE45604), η ομάδα μας προσδιορίζονται miR-187 ως καταστολέας των όγκων miRNA στον προστάτη [8]. Αν και η χρησιμότητά της έχει αποδειχθεί στη διαγνωστική ρύθμιση, μέχρι σήμερα επιβεβαιωθεί κανένα πειραματικά στόχους για το miR-187 έχουν εντοπιστεί στη ΣΕΣΣ. Οι περισσότεροι υπολογιστικοί αλγόριθμοι προβλέπουν στόχους miRNA βασίζεται κυρίως σχετικά με τη συμπληρωματικότητα αλληλουχίας μεταξύ το 5 ‘άκρο του ώριμου miRNA και 3′-μη μεταφραζόμενη περιοχή (3’-UTR) του mRNA που στόχου? Ωστόσο, αυτοί οι αλγόριθμοι αποδώσει σχετικά υψηλά ποσοστά και των δύο ψευδώς θετικών και λανθασμένων αρνητικών [6]. Επιπλέον, είναι γνωστό ότι περισσότερο από το 25% του πειραματικά επικυρωμένων στόχων δεν μπορεί να προβλεφθεί με οποιοδήποτε από τα πιο κοινά λογισμικό πρόβλεψης στόχος miRNA [9]. Ως εκ τούτου, η έκφραση των γονιδίων και πρωτεομική διαλογής προσεγγίσεις χρειάζονται επειγόντως να προσδιορίσουν πειραματικά στόχους των miRNAs.

Αυτή η μελέτη χρησιμοποίησε μια πρωτεομική προσέγγιση που βασίζεται σε δύο διαστάσεων ηλεκτροφόρηση γέλης (2D-ΨΗΦΟ) που ακολουθείται από μήτρα με τη βοήθεια λέιζερ εκρόφησης-ιονισμού χρόνο-πτήσης φασματομετρίας μάζας ανάλυση (MALDI-TOF MS) και, για πρώτη φορά, τα οποία προσδιορίζονται

ALDH1A3

ως στόχος miR-187 σε PCa. Επιπλέον, η δυνητική χρησιμότητα του ALDH1A3 ως βιοδείκτη όγκου αξιολογήθηκε.

Υλικά και Μέθοδοι

2.1. Κλινικά δείγματα προστάτη

φορμόλη-σταθερές και εμπεδωθεί με παραφίνη (FFPE) τμήματα που αντιστοιχούν σε 195 ασθενείς προστάτη ανασύρθηκαν από τα αρχεία της βιοτράπεζας του

Fundación Instituto Valenciano de Oncología

πραγματοποιώντας την ακόλουθη καταχώριση κριτήρια: τα δείγματα που λαμβάνονται από ριζική οπισθοηβική προστατεκτομών μεταξύ 1996 και 2002, και χωρίς ιστορικό προηγούμενο θεραπεία για προστάτη (συμπεριλαμβανομένης της θεραπείας στέρησης ανδρογόνων ή χημειοθεραπεία πριν από τη χειρουργική επέμβαση). Όλοι οι ασθενείς έδωσαν γραπτή συγκατάθεση για τη δωρεά ιστών για ερευνητικούς σκοπούς πριν από τη συλλογή των ιστών και η μελέτη εγκρίθηκε από την επιτροπή δεοντολογίας του Fundación Instituto Valenciano de Oncología (ref. Αριθμός. 2010-19). Τα κριτήρια αποκλεισμού που περιλαμβάνονται οποιαδήποτε προηγούμενη θεραπεία ή παρουσία άλλων όγκων σε συνδυασμό με την unacceptance της συναίνεσης δωρεά. Τα κλινικά δεδομένα εξετάστηκαν από τα κλινικά αρχεία και αποθηκεύονται σε ένα προστάτη-ειδική βάση δεδομένων. Τα χαρακτηριστικά των ασθενών και τα δημογραφικά στοιχεία φαίνονται στον Πίνακα 1. Gleason σκορ ομοιόμορφα αξιολογήθηκε με τον ίδιο παθολόγο (AC). Για τη συγκριτική και βαθμονόμησης σκοπούς, 8 δείγματα φυσιολογικού ιστού του προστάτη που λαμβάνεται από ασθενείς που υποβάλλονται σε ριζική cystectomies χωρίς παθολογική ένδειξη της νόσου του προστάτη αναλύθηκαν επίσης.

Η

Δέκα φρέσκα δείγματα ιστού από ιστολογικά επιβεβαιωμένη προστάτη ανασύρθηκαν από τα αρχεία της βιοτράπεζας από το Νοσοκομείο Clínico Universitario de Valencia (INCLIVA) για σκοπούς επικύρωσης. Σύνολο δείγματα ούρων ελήφθησαν μετά από DRE και αμέσως πριν από τη διαγνωστική βιοψία με βελόνα από μια ανεξάρτητη ομάδα από 123 άνδρες με την υποψία της προστάτη, από τους οποίους 63 οδηγούν σε μια θετική βιοψία.

2.2. Οι κυτταρικές σειρές και miRNA διαμόλυνση

PC-3, LNCaP, DU-145, και 22RV1 καλλιεργήθηκαν σε RPMI 1640 (GIBCO, Invitrogen, Life Technologies, CA, USA), ενώ VCAP PCA-προερχόμενα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε DMEM (ATCC, Middlesex, UK) μέσο, ​​με 10% ορό εμβρύου μόσχου, 100 U /ml Penincillin και 0.1ug /ml στρεπτομυκίνη σε πρότυπες συνθήκες καλλιέργειας κυττάρων (37 ° C σε 5% CO

2 σε υγροποιημένο επωαστή). miR-187, το οποίο έχει προηγουμένως βρεθεί να ρυθμίζεται προς τα κάτω σε PCa [8], αναλύθηκε σε αυτές τις κυτταρικές σειρές από qRT-PCR όπως περιγράφεται παρακάτω.

PC-3, LNCaP και DU-145 κύτταρα ήταν παροδικά επιμολυσμένα, χρησιμοποιώντας siPORT NeoFX η επιμόλυνση Agent (Applied Biosystems, Life Technologies, California, USA), με πρόδρομες ουσίες 40ηΜ του miR-187 (HSA-miR-187-3p miRNA μιμούνται) και miRNA μιμούνται αρνητικού ελέγχου 1 #, σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή (Applied Biosystems, Life Technologies, California, USA). Τα κύτταρα συλλέχθηκαν 72 ώρες μετά την επιμόλυνση και η κυτταρική βιωσιμότητα μετρήθηκε για να αξιολογηθεί η τοξικότητα του χρησιμοποιώντας το υδατικό δοκιμασία μη ραδιενεργό κυτταρικού πολλαπλασιασμού CellTiter 96 (Promega, Wisconsin, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

2.3. Ταυτοποίηση των γονιδίων στόχων για miR-187

Οι πρωτεΐνες από το miR-187 μιμητικό έναντι miRNA μιμούνται αρνητικό μάρτυρα 1 # επιμολυσμένα κύτταρα PC-3 αναλύθηκαν με ηλεκτροφόρηση δύο διαστάσεων διαφορά γέλη (2D-ΨΗΦΟ). Εν συντομία, οι πρωτεΐνες των δύο ομάδων σε σχέση καταβυθίστηκαν χρησιμοποιώντας το Clean-Up Kit 2-D (GE Healthcare, Piscatawey, NJ, USA). Τα δείγματα στη συνέχεια επαναιωρήθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα χρώσης ΨΗΦΟ ΨΗΦΟ (7Μ ουρία, 2 Μ tiourea, 4% CHAPS, 20 mM Tris) και ποσοτικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας προσδιορισμό πρωτεΐνης Bradford (BioRad, Hercules, CA, USA). Τα δείγματα σημάνθηκαν με 400 pmol /50 μg πρωτεΐνης με τη CyDye ΨΗΦΟ Fluor fluorophors Cy3 και Cy5 (GE Healthcare, Piscatawey, NJ, USA), όπως συνιστάται από τον κατασκευαστή. Μια πισίνα που περιέχει ίσες ποσότητες από όλα τα δείγματα ήταν επίσης παρασκευάστηκε και επισημάνθηκε με Cy2 για να χρησιμοποιηθεί ως εσωτερικό πρότυπο για όλες τις γέλες στις ενισχύσεις που να ταιριάζουν εικόνα και cross-gel στατιστική ανάλυση. Έξι βιολογική επαναλήψεις εκάστου δείγματος επιμολυσμένα διεξήχθησαν έξι γέλες παρήχθησαν συνολικά. διαχωρισμός πρωτεΐνης πραγματοποιήθηκε με δισδιάστατη ηλεκτροφόρηση. Στην πρώτη διάσταση, οι πρωτεΐνες διαχωρίστηκαν ανάλογα με το ισοηλεκτρικό τους σημείο σε ακινητοποιημένη 24 cm ρΗ γραμμικής κλίσης (IPG) λωρίδες (GE Healthcare, Piscatawey, NJ, USA), επανυδατώθηκαν σε ρυθμιστικό επανυδάτωση (7 Μ ουρία, 2 Μ θειουρία, 4% CHAPS, 0,5% IPG ρυθμιστικό, 50 mM DTT) για όλη τη νύχτα. Στη δεύτερη διάσταση, οι πρωτεΐνες διαχωρίστηκαν ανάλογα με το μοριακό βάρος 25 cm χ 21 cm χ 1 cm 12,5% γέλες ακρυλαμιδίου. Τα πηκτώματα σαρώθηκαν με ένα Typhoon 9400 Μεταβλητό Λειτουργία Imager (GE Healthcare, Piscatawey, NJ, USA) και τις επόμενες εικόνες τζελ εισήχθησαν Λογισμικού DeCyder Διαφορικής Ανάλυσης. Πρωτεΐνες ορίστηκαν ως διαφορετικά νομοθετικά, αν η παρατηρούμενη φορές αλλαγή ήταν ± 1,06 (

σ

& lt? 0,05) μεταξύ miRNA μιμούνται αρνητικού ελέγχου 1 # επιμολυσμένα PC-3 και miRNA-187 μιμούνται επιμολυσμένα PC-3. χώνευση πρωτεΐνης διεξήχθη με τάξη αλληλούχιση θρυψίνη (Promega, Wisconsin, USA) όπως περιγράφεται αλλού [10]. ανάλυση MALDI-TOF MS διεξήχθη στη συνέχεια χρησιμοποιώντας 0.5 μΙ μείγματος πέψης κηλιδώνονται στην MALDI πλάκα στόχο. Μετά αέρα ξήρανση των σταγονιδίων σε θερμοκρασία δωματίου, 0,5 μί μήτρας [5 mg /mL CHCA (Sigma, St.Louis, ΜΟ, USA) σε 0.1% ΤΡΑ-ΑΟΝ /Η2Ο (1: 1, ν /ν)] ήταν προστίθενται και αφήνονται να στεγνώσουν στον αέρα σε θερμοκρασία δωματίου. Μία γνωστή δείγμα υποβλήθηκε σε επεξεργασία με τον ίδιο τρόπο όπως τον έλεγχο της ποιότητας. Τα προκύπτοντα κλάσματα αναλύθηκαν σε ένα αναλυτή Πρωτεομική 4700 (ABSciex, Framingham, ΜΑ, USA) σε τρόπο θετικού ανακλαστήρα (2000 βολές κάθε θέση). Χαμηλή πρωτεΐνες αφθονία ταυτοποιήθηκαν με LC-MS /MS χρησιμοποιώντας μία στήλη παγίδα (nanoLC Στήλη, 3μ C18-CL, 75 μ mx 15 εκατοστά, Eksigen, Dublin, CA, USA) μέσω ενός ισοκρατικό ροή 0.1% TFA σε 2 μ L /min κατά τη διάρκεια 10 λεπτών. Μόλις τα πεπτίδια συγκεντρώθηκαν σε προ-στήλη που εκλούονται στην αναλυτική στήλη (LC Στήλη, 3 μ C18-CL, 75um χ 25 cm, Eksigen, Dublin, CA, USA) για το διαχωρισμό. Τα πεπτίδια τελικά εκλούστηκε χρησιμοποιώντας μια 5α 40% κλίση Β επί 30 λεπτά, σε ένα φασματόμετρο μάζας nanoESI QqTOF (5600 TripleTOF, ABSciex, Framingham, ΜΑ, USA). Οι πληροφορίες από το MS και MS /MS αναλύθηκε με τον αλγόριθμο Paragon, Πρωτεΐνη Pilot Λογισμικού (ABSciex, Framingham, ΜΑ, USA). Τα πεπτίδια ταυτοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας τις πληροφορίες στα φάσματα μάζας παράλληλα με την αναζήτηση στη βάση δεδομένων ExPASy SWISS PROT.

2.4. Κηλίδωση Western του ALDH1A3

Για σκοπούς in vitro επικύρωσης, επιμολυσμένα PC-3, LNCaP και DU-145 κυττάρων με miR-187 μιμούνται ή miRNA μιμούνται αρνητικό μάρτυρα (72 ώρες) συλλέχθηκαν, ξεπλύθηκαν με PBS και στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε λύση με παγωμένο ρυθμιστικό διάλυμα λύσης (50 mM TrisHCl ρΗ = 8, 150 mM NaCl, 0,02% NaN

3, 0,1%, νάτριο δωδεκυλ θειικό (SDS), 1% Nonidet Ρ-40 (ΝΡ40), 0,5% δεοξυχολικό οξύ (DOC), δισκία κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης (1 χ). τα κυτταρολύματα υποβλήθηκαν σε φυγοκέντρηση σε 10,000 rpm για 10 λεπτά στους 4 ° C, το υπερκείμενο στη συνέχεια αναμιγνύεται με 5 χ ρυθμιστικό διάλυμα δειγμάτων SDS, έβρασαν για 5 λεπτά και διαχωρίζονται μέσω 12% SDS .-PAGE πηκτές Μετά την ηλεκτροφόρηση, οι πρωτεΐνες μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες νιτροκυτταρίνης με ηλεκτροφορητική μεταφορά οι μεμβράνες μπλοκαρίστηκαν σε 5% αποβουτυρωμένο γάλα για 1 ώρα, ξεπλύθηκαν και επωάστηκαν όλη τη νύκτα στους 4 ° C με τα πρωτογενή αντισώματα:. ALDH1A3 (Novus Biologicals, Littleton , CO, USA? 1: 500 αραίωση) και β-ακτίνη (Millipore, Billerica, ΜΑ, USA? 1:. αραίωση 200.000) περίσσεια αντισώματος στη συνέχεια απομακρύνθηκε με πλύση της μεμβράνης σε PBS /0.1% Tween 20, και οι μεμβράνες ήσαν επωάστηκαν για 1 ώρα με δευτερογενή αντισώματα συζευγμένα με υπεροξειδάση αρμορακίας: κατσίκας αντι-ποντικού IgG ή IgG γαϊδάρου αντι-κουνελιού (1: 10.000) (GE Healthcare, Piscatawey, NJ, USA). Μετά πλύσεις σε PBS /0.1% Tween 20, ανοσο-ανίχνευση πραγματοποιήθηκε με τη χρήση της ενισχυμένης χημειοφωταύγειας (ECL) σύστημα ανίχνευσης κηλίδωση Western (EuroClone, Μιλάνο, Ιταλία), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

2.5. miRNA δημοσιογράφος στόχο δοκιμασία

PC-3 miR-187 μιμούνται ή αρνητικά κύτταρα ελέγχου επιμολύνθηκαν με 3’ΙΙΤΡ Go κλώνος Reporter (50 ng) (μεταγωγής Genomics, La Hulpe, Βέλγιο) που περιέχει την αλληλουχία 3’UTR της ALDH1A3 κλωνοποιημένα κατάντη της αναφοράς της λουσιφεράσης RenSP ή τον κενό φορέα που περιέχει μόνο τον ανταποκριτή λουσιφεράσης χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο Dharmafect 2 (Dharmacon, GE Healthcare, Piscatawey, NJ, USA). Τα κύτταρα λύθηκαν και η δραστικότητα ανταποκριτή μετρήθηκε 24 ώρες μετά την επιμόλυνση χρησιμοποιώντας Αντιδραστήριο Δοκιμής Λουσιφεράσης LightSwitch (μεταγωγής Genomics).

2.6. Απομόνωση RNA και qRT-PCR

Απομόνωση RNA από αμφότερες τις κυτταρικές σειρές και τα κλινικά δείγματα διεξήχθη χρησιμοποιώντας κιτ απομόνωσης mirVana miRNA (Technologies Ambion, Life, CA, USA). Το συνολικό RNA μεταγράφηκε αντίστροφα χρησιμοποιώντας το TaqMan miRNA Reverse Transcription Kit και miRNA-ειδικούς εκκινητές στελέχους-βρόχου (Applied Biosystems, Life Technologies, CA, USA) και υψηλής χωρητικότητας cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, Life Technologies, CA, USA) σύμφωνα με με τις ενδείξεις του κατασκευαστή. Στη συνέχεια, 2 μΙ αυτού του cDNA, που αντιστοιχεί σε 96 δείγματα όγκου προστάτη, ενισχύθηκε με PCR πραγματικού χρόνου σε ένα τελικό όγκο 10 μΙ ανά αντίδραση σε έναν ΑΒΙ 7500-fast θερμοκυκλωτή χρησιμοποιώντας δοκιμασίες mRNA (Applied Biosystems, Life Technologies, CA, ΗΠΑ). Για την αξιολόγηση miRNA, 1,33 μΙ miRcDNA ενισχύθηκε σε ένα τελικό όγκο 20 μΙ. δοκιμασίες miRNA για RU44 (001.094), RU48 (001.006) και miR-187 (001.193), και δοκιμασία mRNA για

ALDH1A3

(Hs00167476_m1) χρησιμοποιήθηκαν (Applied Biosystems, Life Technologies, CA, USA). Όλες οι αντιδράσεις πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν. Η σχετική έκφραση των mRNAs ή miRNA προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας τη μέση τιμή των δειγμάτων ελέγχου ως βαθμονομητή και μετά την 2

-ΔΔCt μέθοδο [11]. Για τις αξιολογήσεις κυτταρική γραμμή, miR-187 έκφραση αναλύθηκε με qRT-PCR χρησιμοποιώντας έναν καθολικό πισίνα ανθρώπινο RNA (Cat # 740000 Stratagene, La Jolla, CA) ως ομαλοποίηση ελέγχου.

2.7. Ανοσοϊστοχημεία της ALDH1A3

Οι ίδιες μπλοκ FFPE προστάτη που χρησιμοποιούνται για την ανάλυση του RNA εντάχθηκαν σε 11 μικροσυστοιχίες ιστού (TMA). Επελέγησαν δύο ή τρεις αντιπροσωπευτικές περιοχές (1 mm σε διάμετρο) του κάθε όγκου για παραγωγή TMA πρώτα με την εξέταση της αιματοξυλίνη & amp? ηωσίνη-βάφονται slide προστατεκτομή όγκου και τότε το δείγμα του ιστού από τα αντίστοιχα μπλοκ παραφίνης. Ένα όργανο μικροσυστοιχίες ιστού (Beecher Instruments, η Sun Prairie, WI) χρησιμοποιήθηκε για τη συναρμολόγηση TMA. Από τα μπλοκ TMA, 3-μm πάχους τομές υποβλήθηκαν σε ανοσοϊστοχημική χρώση με τη χρήση κουνελιού αντι-ανθρώπινο πολυκλωνικό ALDH1A3-Ab (Novus Biologicals, Littleton, CO, USA? 1:50 αραίωση). Ανθρώπινος ιστός προστάτη χρησιμοποιήθηκε σαν θετικός έλεγχος, όπως συνιστάται από τον κατασκευαστή. Το ποσοστό των ALDH1A3-θετικών κυττάρων και η κυτταροπλασματική ένταση χρώσης βαθμολογήθηκαν ημιποσοτικά, σχηματίζοντας τέσσερις ομάδες (από 0 έως 3). Περιπτώσεις βαθμολογήθηκαν ως χαμηλού εκφραστές όταν η ένταση χρώσης ήταν μεταξύ 0 και 1, και η υψηλή εκφραστές όταν η ένταση ήταν 2 και άνω.

2.8. ALDH1A3 ELISA

Τα δείγματα ούρων από 123 ασθενείς με υποψία προστάτη υποβλήθηκαν σε φυγοκέντρηση στα 1000 χ g για να αφαιρέσετε τα υπολείμματα. Το υπερκείμενο ούρα χρησιμοποιήθηκε για να εκτιμηθεί το επίπεδο της πρωτεΐνης ALDH1A3 χρησιμοποιώντας μια ποσοτική ανθρώπινο σάντουιτς κιτ ELISA (Blue Gene Biotech Co Ltd, Shanghai, Κίνα). Το πρότυπο αναφοράς ήταν μεταξύ 0 και 50 ng /ml, με CV ενδο και δια-δοκιμασίας λιγότερο από 10%. Η οπτική πυκνότητα (O.D) προσδιορίστηκε στα 450 nm χρησιμοποιώντας ένα Plate Reader Victor Multilabel (PerkinElmer Life Sciences, Massachusetts, USA).

2.9. Η στατιστική ανάλυση

Για να μελετηθεί η προγνωστική αξία του

ALDH1A3

γονίδιο που χρησιμοποιούνται δυαδικές μεταβλητές που αντικατοπτρίζει τη θετική κατάσταση των μέτρων. Η συσχέτιση μεταξύ

ALDH1A3

έκφρασης και κλινικοπαθολογικών παραμέτρων (κατηγορηματική) αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας Spearman με σημασία θεωρούνται σε 5%. Η επίδραση των βιολογικών παραγόντων στην BPFS και κλινικές PFS προσδιορίστηκε από τη δοκιμή βαθμό ανάλογο log κίνδυνο Kaplan-Meier [12]. Βιοχημική εξέλιξη ορίστηκε ως PSA ορού μεγαλύτερη από 0,4 ng /ml κατά τη διάρκεια της παρακολούθησης και της κλινικής εξέλιξης ορίστηκε ως τοπικό (προστάτη βόθρου), περιφερειακό (λεμφαδένες) ή μακρινή (μετάσταση) εξέλιξη. BPFS και κλινικές PFS θεωρήθηκαν μεμονωμένα από την ημερομηνία της χειρουργικής επέμβασης για την ημερομηνία της εκδήλωσης. Η στατιστική ανάλυση έγινε με SPSS, έκδοση 20.0. t test aplying του μαθητή FDR, p-value, PCA και ιεραρχική ομαδοποίηση εφαρμόστηκαν στα δείγματα του πρωτεομική μελέτη. Όλα τα αποτελέσματα δίδονται ως μέση τιμή ± SEM (GraphPad Prism 4.0 Λογισμικό, Graph Pad Software, Inc.)

Αποτελέσματα

3.1. έκφραση miRNA σε κυτταρικές σειρές προστάτη

Ανάλυση των επιπέδων των miRNAs από qRT-PCR επιβεβαίωσε μειωμένη έκφραση του miR-187 σε κυτταρικές σειρές προστάτη: PC-3, LNCaP, DU-145 και 22RV1 (Σχήμα 1Α). Στο PC-3 το επίπεδο έκφρασης miR-187 ήταν ισοδύναμη με εκείνη που παρατηρήθηκε προηγουμένως σε ασθενείς PCa [8], και για το λόγο αυτό αυτή η κυτταρική γραμμή επελέγη για την επακόλουθη ανάλυση.

Α) Εκφραση του miR-187 αναλύθηκε με qRT-PCR χρησιμοποιώντας έναν καθολικό πισίνα ανθρώπινο RNA ως βαθμονομητής να ομαλοποιήσει τη σχετική έκφραση των αναλυθέντων miRNAs μετά την 2

-ΔΔCt μέθοδο. Όπως μπορεί να εκτιμηθεί, όλες τις κυτταρικές σειρές αλλά VCAP έδειξε τα κάτω ρύθμιση του miR-187. Β) miR-187 miRNA μιμούνται και miRNA μιμούνται αρνητικού ελέγχου επιμολύνθηκαν σε PC-3, LNCaP και DU-145 κύτταρα για 72 ώρες. Η επανεισαγωγή του miR-187 στο PC-3, LNCaP και DU-145 επιβεβαιώθηκε με PCR πραγματικού χρόνου. Το ιστόγραμμα δείχνει την αύξηση στο επίπεδο του mRNA miR-187 στα μιμούνται επιμολυσμένα κύτταρα miR-187 miRNA σε σύγκριση με κύτταρα επιμολυσμένα με το miRNA μιμούνται αρνητικό μάρτυρα και μη επιμολυσμένα κύτταρα.

Η

3.2. Προσδιορισμός των ALDH1A3 ως υποθετικό miR-187-στόχο

Για τον εντοπισμό πιθανών στόχων του miR-187 μια σειρά από πρωτεομική πειράματα ανάλυσης και επικύρωση εκτελέστηκε. miR-187 miRNA μιμούνται εισήχθη εκ νέου το PC-3, LNCaP και DU-145 και έδειξαν ότι η έκφραση του miR-187 ανακτήθηκε στο PC-3, LNCaP και DU-145 κύτταρα (Εικόνα 1Β). Μια παγκόσμια πρωτεομική προσέγγιση χρησιμοποιώντας ΨΗΦΟ και LC-MS /MS διεξήχθη με δείγματα από το PC-3 κύτταρα επιμολυσμένα με αρνητικό μάρτυρα και PC-3 επιμολυσμένα με miR-187 miRNA μιμούνται. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν 72 ώρες μετά την επιμόλυνση, υποβλήθηκαν σε λύση και διαχωρίστηκαν με δισδιάστατη ηλεκτροφόρηση. Μετά τον διαχωρισμό του πρωτεϊνικά εκχυλίσματα και φθορισμού σάρωσης, 9 εκφράζονται διαφορικά κηλίδες ανιχνεύθηκαν (Σχήμα 2Α). Αυτά τα 9 σημεία πρωτεΐνη (p & lt? 0,05) εμφανίζονται τουλάχιστον 1,06 ρύθμιση φορές πάνω από έξι ανεξάρτητα πειράματα. Επτά από τους 9 αυτούς κηλίδων έδειξε μια κάτω-ρυθμιζόμενη έκφραση κατόπιν miR-187 επανεισαγωγή, η οποία ήταν σύμφωνη με την αναμενόμενη ανασταλτική δράση της miRNA για τα περισσότερα από τους στόχους της (S1 πίνακα). Μεταξύ αυτών των στόχων αφυδρογονάση αλδεΰδη 1Α3 (ALDH1A3) αναγνωρίστηκε (Σχήμα 2Β).

PC-3 κύτταρα επιμολυσμένα είτε με miRNA μιμούνται αρνητικό μάρτυρα ή miR-187 miRNA μιμούνται, που συγκομίζονται μετά από 72 ώρες, και τα προϊόντα λύσης πρωτεΐνης σημάνθηκαν με Cy3 ή Cy5 (mIR-187 και ελέγχου) και Cy2 για το εσωτερικό πρότυπο. Α) 2D-ΨΗΦΟ gel εικόνα που λαμβάνονται σε pH 3-10 και 12,5% SDS-πολυακρυλαμιδίου. Οι αριθμοί αναφέρονται στον προσδιορισμό δίδεται στα σημεία εκφράζονται διαφορικά. Spot 655 περαιτέρω προσδιορίζονται από LC-MS /MS όπως ALDH1A3. Β) Σύγκριση της έκφρασης ενός από τα σημεία (655 ή ALDH1A3), στις έξι πηκτές αναλύθηκαν, μεταξύ των κυττάρων που επιμολύνθηκαν με miR-187 ή με τον αρνητικό μάρτυρα. Η μέση μεταβολή φορές μεταξύ των δύο προϋποθέσεις ήταν -1,06 με p-value 0,003. ALDH1A3, αλδεΰδη αφυδρογονάση μέλος της οικογένειας 1 Α3

Η

3.3. Επικύρωση

ALDH1A3

ως υποθετικό miR-187-στόχο

Για να αποδείξει ότι

ALDH1A3

είναι ο στόχος του miR-187, διαλογή στόχο βιοπληροφορική? χρησιμοποιώντας την πιο κοινή miRNA λογισμικό πρόβλεψης στόχου (Targetscan, Pictar και Μιράντα) διεξήχθη. Ωστόσο, κανένα από αυτά τα προγράμματα ταυτοποίησε την περιοχή 3′-UTR του

ALDH1A3

με την αλληλουχία miR-187. Παρ ‘όλα αυτά, εφαρμόζοντας το εργαλείο RNA22, η οποία δεν βασίζεται διατήρηση cross-ειδών, είναι ανθεκτική στο θόρυβο και επιτρέπει G: U αντιστοίχιση του mRNA στόχου με σειρά σπόρων miRNA [13], επιβεβαίωσε έναν αγώνα μεταξύ

ALDH1A3

και η ακολουθία miR-187 σπόρων (Σχήμα 3Α).

Α) RNA22 προέβλεψε mRNA-miRNA ετεροδίκλωνων. RNA22 λογισμικού v1.0 προέβλεψε τρεις διαφορετικές θέσεις πρόσδεσης miR-187 στην ακολουθία ALDH1A3 mRNA. Υποθετικές θέσεις πρόσδεσης miR-187 βρέθηκαν στην ALDH1A3 5’UTR περιοχή (i), κωδικεύουσα περιοχή (CDS) (ii και iii), και 3’UTR (iv). Όλοι τους εκπληρώσει τα κριτήρια ενός ζεύγους βάσεων ελάχιστη τιμή 14 και μέγιστη αναδίπλωση ενέργεια του -25. Β) Ανάλυση Western Blot δείχνει μία μείωση στην έκφραση της πρωτεΐνης ALDH1A3 από την εκ νέου εισαγωγή του miR-187 (MIR-187 miRNA μιμούνται επιμολυσμένα κύτταρα), επιβεβαιώνοντας την ανασταλτική δράση του miRNA μέσω υποθετικό στόχο του. Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με miR-187 miRNA μιμούνται ή αρνητικό μάρτυρα και συγκομίζονται μετά 72 ώρες. Σύνολο κυτταρικά εκχυλίσματα παρασκευάστηκαν και ηλεκτροφορήθηκαν με SDS-PAGE, ακολουθούμενη από ανοσοστύπωμα με αντίσωμα αντι-ALDH1A3. Για να εξασφαλιστεί η ίση φόρτωση πρωτεϊνών η μεμβράνη ανοσοστυπώθηκαν με αντίσωμα αντι β-ακτίνης. Γ) δοκιμασία λουσιφεράσης ανταποκριτή εκτελείται με λουσιφεράση πυγολαμπίδας υπό τον έλεγχο του ALDH1A3 3 ‘UTR επιβεβαιώνουν την αναστολή της έκφρασης του mRNA ALDH1A3 (20% μείωση του σήματος της λουσιφεράσης) κατά miR-187 επανεισαγωγής. Τα δεδομένα παρουσιάζονται σε σχέση με τον φορέα ελέγχου αποδίδεται τιμή 100. Η μέση ± s.e.m. τριών ανεξάρτητων πειραμάτων παρουσιάζεται. Δ) Η υπερέκφραση του ALDH1A3 mRNA επιβεβαιώθηκε σε μία ομάδα ανθρώπινων όγκων του προστάτη (n = 96). Υπήρχε μια αντίστροφη συσχέτιση (όχι στατιστικά σημαντική) μεταξύ του κάτω ρύθμιση του miR-187 που βρέθηκαν στα δείγματα αυτά και το up-ρύθμιση του ALDH1A3.

Η

Για την επικύρωση αυτών των ευρημάτων, που επιβεβαίωσε την ισχυρή κάτω -Κανονισμός της ALDH1A3 κατά miR-187 επανεισαγωγή με ανάλυση Western blot σε PC-3, LnCaP και DU-145 κύτταρα (Σχήμα 3Β).

Για να επιβεβαιωθεί περαιτέρω το ρόλο του

ALDH1A3

ως ένα miR-187 στοχεύει σε μια λουσιφεράση πλασμίδιο αναφοράς που περιέχει την αλληλουχία 3’UTR του

ALDH1A3

κλωνοποιήθηκε σε PC-3 κύτταρα επιμολυσμένα με miR-187 μιμούνται. Ενισχυμένη έκφραση του miR-187 δραστηριότητας ρεπόρτερ (PC-3 miR-187 απομίμηση) μείωσε σημαντικά από 3’ΙΙΤΡ

ALDH1A3

κατασκευάζει περίπου 20% σε σύγκριση με τον έλεγχο (PC-3 NC μιμούνται) (Σχ 3C) .

δεδομένα qRT-PCR έδειξε υψηλότερη έκφραση του

ALDH1A3

(1,2 φορές) σε σύγκριση με τα δείγματα εκ νέου εκφράζουν miR-187 (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Επιπλέον, συγκρίναμε την έκφραση του

ALDH1A3

έκφραση mRNA με την προς τα κάτω ρύθμιση του miR-187 σε δύο ανεξάρτητες ομάδες των πρωτογενών όγκων προστάτη από FFPE (n = 96) (Εικ 3D) και φρέσκου ιστού (n = 10) (S1 Σχήμα). Ωστόσο, δεν υπάρχει συσχετισμός μεταξύ

ALDH1A3

και κλινικοπαθολογικών παραμέτρων βρέθηκε, και στη συνέχεια, όπως ήταν αναμενόμενο,

ALDH1A3

δεν αποτελούν προγνωστικό δείκτη είτε για BPFS (p = 0.773) ή PFS (p = 0,430 ) σε αυτή τη σειρά.

έκφραση πρωτεΐνης ALDH1A3 αξιολογήθηκε περαιτέρω με ανοσοϊστοχημεία (IHC) στις 195 περιπτώσεις που περιλαμβάνονται στην ΤΜΑ (Σχήμα 4). Βρήκαμε ότι ALDH1A3 ήταν σημαντικά (ρ & lt? 0,0001) πάνω ρυθμισμένα σε δείγματα προστάτη (μέση ένταση = 1.42), όταν συγκρίθηκε με κανονικό ιστό προστάτη (μέση ένταση = 0,12). Επιπλέον, προκειμένου να διερευνηθεί ο ρόλος του

ALDH1A3

ως στόχος miR-187, μελετήσαμε την συσχέτιση με την έκφραση miR-187. Είναι ενδιαφέρον, βρήκαμε ότι η έκφραση miR-187 ήταν σημαντικά συσχετίζεται αντίστροφα (ρ & lt? 0,0001) με έκφραση της πρωτεΐνης ALDH1A3. Μελετήσαμε περαιτέρω τη συσχέτιση των

ALDH1A3

με κλινικοπαθολογοανατομικές παραμέτρους και την πρόγνωση. Παρά το γεγονός ότι ALDH1A3 έκφραση δεν αποτελεί προγνωστικό δείκτη, βρήκαμε μια στατιστικά σημαντική άμεση συσχέτιση με το σκορ Gleason (p = 0.05). Ως εκ τούτου, το 37% των περιπτώσεων με Gleason σκορ & lt? 7 έδειξαν υψηλή ένταση ALDH1A3 της χρώσης σε σύγκριση με το 56% του προστάτη με Gleason≥7

Η ανοσοϊστοχημική χρώση για ALDH1A3 είναι σημαντικά υψηλότερη (p & lt? 0,0001). Σε όγκο δείγματα (δεξιά) σε σχέση με την κανονική ομάδα ελέγχου (αριστερά). Χρώση μεταξύ των διαφόρων ποιοτήτων του όγκου (Gleason σκοράρει κάτω από 7, ίση ή μεγαλύτερη από 7) συγκρίθηκε βρίσκοντας μια άμεση συσχέτιση μεταξύ Gleason σκοράρει και έκφραση ALDH1A3 (p = 0.05). Η ανοσοϊστοχημική χρώση δείχνεται για ALDH1A3 (δεξιά στήλη) σε κάθε δείγμα μαζί με το αιματοξυλίνη & amp? ηωσίνη-βάφονται ιστό (αριστερή στήλη).

Η

Για να διερευνήσουν περαιτέρω το ρόλο του

ALDH1A3

στη διαγνωστική ρύθμιση πραγματοποιήσαμε μια δοκιμασία ELISA για τη μέτρηση της έκφρασης ALDH1A3 στα ούρα (n = 123 ). Μία μονοπαραγοντική μοντέλο λογιστικής παλινδρόμησης διεξήχθη για να αξιολογήσει την προβλεπτική ικανότητα αυτού του βιοδείκτη, μαζί με την PSA, για την παρουσία του προστάτη σε διαγνωστικές βιοψίες. Σε επίπεδο σημαντικότητας 10%, PSA και ALDH1A3 ήταν τόσο σημαντικά που συνδέονται με μια θετική βιοψία του προστάτη (Σχήμα 5). Οι καμπύλες

ROC από την PSA και ALDH1A3 για την πρόβλεψη του προστάτη σε δείγματα ούρων. Οι περιοχές κάτω από την καμπύλη είναι 0,610 (95% CI 0,509 έως 0,710? P = 0.036 και 0.591 (95% CI 0,490 έως 0,692?. P = 0.083) αντίστοιχα, σε επίπεδο σημαντικότητας 10%, τόσο PSA και ALDH1A3 συσχετίστηκε σημαντικά με τον μια θετική βιοψία του προστάτη.

η

Συζήτηση

τα miRNAs προβλέπεται να ελέγχει τη δραστηριότητα των περίπου 60% όλων των γονιδίων που κωδικοποιεί την πρωτεΐνη, και έχει αποδειχθεί ότι συμμετέχουν στη ρύθμιση της διάφορες κυτταρικές διεργασίες. με βάση την αντιστοίχιση σε mRNA, microRNAs διαμεσολαβούν μεταγραφική καταστολή ή υποβάθμιση του mRNA [4]. Έχοντας προηγουμένως αποδειχθεί ο ρόλος του miR-187 στο προστάτη εξέλιξη και τη διάγνωση [8], αποφασίσαμε να διερευνήσει περαιτέρω πιθανούς στόχους αυτού του miRNA ότι θα μπορούσε να είναι επίσης ενδιαφέρον ως βιοδείκτες. για το σκοπό αυτό εκ νέου miR-187 πρόδρομος σε κύτταρα PC-3 και εκτέλεσε μια πρωτεομική προσέγγιση.

αλληλουχίες που αναγνωρίζονται από σπόρους miRNA βρίσκονται σε πολλά γονίδια, γεγονός που καθιστά δύσκολη την προσδιορίσει φυσιολογικά σχετικές σχέσεις miRNA-στόχου από την ανάλυση ακολουθίας και μόνο [14]. Επιπλέον, τα προηγούμενα αποτελέσματα που λαμβάνονται από τον Yang et al. [6] και Schramedei et al. [15] επιβεβαίωσε ότι λιγότερο από το 10% των πρωτεϊνών που προσδιορίζονται από πρωτεομική προσέγγιση είχαν προβλεφθεί από αλγορίθμους που χρησιμοποιούνται συνήθως όπως Pictar, Targetscan και Miranda. Σύμφωνα με τα ευρήματα αυτά, καμία από τις πρωτεΐνες που προσδιορίζονται από πρωτεομική διαλογής στην παρούσα μελέτη είχαν προβλέψει

in silico

από τις παραπάνω αλγόριθμους. Παρ ‘όλα αυτά, χρησιμοποιώντας το εργαλείο RNA22 ήταν δυνατό να βρεθεί μια αντιστοιχία μεταξύ miR-187 και πιθανός στόχος μας στο

ALDH1A3

περιοχή κωδικοποίησης (CDS). Ο αλγόριθμος αυτός είναι διαφορετικός από προηγουμένως αναφερθείσες μεθόδους κατά το ότι δεν χρησιμοποιεί ένα φίλτρο διατήρηση αλληλουχίας μεταξύ των ειδών, επιτρέποντας έτσι την ανακάλυψη θέσεων δεσμεύσεως microRNA που μπορεί να μην είναι παρούσα σε στενά συγγενικά είδη [13]. Επιπλέον, RNA22 λαμβάνει υπόψη την υπόθεση ότι, εκτός από την 3’UTRs, πολλές θέσεις πρόσδεσης είναι πιθανόν να υπάρχουν σε 5’UTRs και ‘CDS που επιτρέπει την αναγνώριση των προηγουμένως αγνώστων ετεροδίκλωνων miRNA /mRNA.

Σε αυτή τη μελέτη , 9 υποτιθέμενη στόχους του miR-187 εντοπίστηκαν από 2D-ΨΗΦΟ και MS ανάλυση (S1 πίνακα). Από αυτά επιλέξαμε αφυδρογονάση αλδεΰδη 1Α3 (

ALDH1A3

) για περαιτέρω αξιολόγηση, επειδή έχει περιγραφεί να ρυθμίζεται από ανδρογόνα [16]. ανάλυση Western blot, qRT-PCR και IHC επιβεβαίωσε την άμεση ρύθμιση του

ALDH1A3 από

miR-187. Πρώτον, η αντίστροφη συσχέτιση μεταξύ ALDH1A3 και miR-187 επιβεβαιώθηκε από την ανάκτηση miR-187 έκφρασης σε PC-3, LNCaP και DU-145 κύτταρα, τα οποία οδήγησαν σε προς τα κάτω ρύθμιση των επιπέδων της πρωτεΐνης ALDH1A3. Δεύτερον, η ανασταλτική δράση του miR-187 επί της έκφρασης ALDH1A3 επιβεβαιώθηκε περαιτέρω με δοκιμασία ανταποκριτή λουσιφεράσης που έδειξαν μια μείωση στην έκφραση ALDH1A3 (μείωση περίπου 20% στο σήμα της λουσιφεράσης) κατά miR-187 μιμούνται την επιμόλυνση. Τρίτον, η αναστολή της

ALDH1A3

παρατηρήθηκε κατά την ανάλυση μια ομάδα δειγμάτων ασθενούς ανθρώπου προστάτη, τόσο φρέσκο ​​και FFPE ιστούς. Σε αυτές τις ομάδες, η ισχυρή ρύθμιση προς τα κάτω του miR-187 συνοδεύεται από αυξημένο

ALDH1A3

έκφραση του mRNA. Forth, ο ρόλος του

ALDH1A3

ως στόχο miR-187 επιβεβαιώθηκε με ανάλυση IHC. Ως εκ τούτου, ALDH1A3 βρέθηκε να είναι ρυθμισμένα προς τα πάνω σε όγκους του προστάτη και η έκφραση της πρωτεΐνης αυτής είναι αντιστρόφως ανάλογη με την έκφραση του miRNA. Επιπλέον, ο πιθανός ρόλος του

ALDH1A3

ως υποψήφιο προγνωστικό βιοδείκτη για την PCA αξιολογήθηκε, αν και στην ομάδα των δειγμάτων που αναλύθηκαν δεν παρέχει καμία πρόσθετη πληροφορία. Παρ ‘όλα αυτά, η ένωση του

ALDH1A3

έκφρασης με σκορ Gleason παρέχει ενδείξεις μιας αύξησης στο

ALDH1A3

έκφρασης με σταδιοποίηση του όγκου. Έχουμε αξιωματική προηγουμένως ότι η απώλεια του miR-187 κατά τη διάρκεια της εξέλιξης του προστάτη θα μπορούσε να δείξει ένα ρόλο ως καταστολέας των όγκων [8]. Επιπλέον, ALDH1A3 βρέθηκε να συνεργάζεται με PSA στην πρόβλεψη του αποτελέσματος βιοψίας. Εκτός από τη συνεργασία της με την παρουσία του όγκου σε IHC της FFPE διαφάνειες, ήμασταν σε θέση να μετρήσουν ALDH1A3 σε δείγματα ούρων, βρίσκοντας μια θετική συσχέτιση με την εμφάνιση όγκων.