Αφηρημένο

Έχουμε δείξει στο παρελθόν ότι τα ανθρώπινα προστάτη καρκινικά κύτταρα είναι ικανά να αποκτήσουν κακοήθη χαρακτηριστικά μέσω της αλληλεπίδρασης με στρωματικά κύτταρα μικροπεριβάλλον του όγκου, ενώ τα στρωματικά κύτταρα που αλληλεπιδρούν μπορεί επίσης να γίνει επηρεαστεί τόσο με φαινοτυπικές και γονοτυπικές μεταβολές. Αυτή η μελέτη χρησιμοποίησε ένα μοντέλο συν-καλλιέργειας για τη διερεύνηση του μηχανισμού βασίζεται η συν-εξέλιξη του καρκίνου και των στρωματικών κυττάρων. Red φθορίζουσας εξαρτώμενων από ανδρογόνα καρκίνου του προστάτη LNCaP κύτταρα καλλιεργήθηκαν με ένα ζεύγος από φυσιολογικά και καρκινικά κύτταρα που συσχετίζονται με μυοϊνοβλάστη προστάτη για να προσομοιώσουν την αλληλεπίδραση καρκίνο στρωματικά, και κυτταρικές αλλαγές στον συν-καλλιέργειας τεκμηριώνεται με την παρακολούθηση του ερυθρού φθορισμού. Βρήκαμε συχνές αυθόρμητες συντήξεις μεταξύ καρκίνου και στρωματικών κυττάρων σε όλη την συν-καλλιέργεια. Σε προσδιορισμούς σχηματισμού αποικίας αξιολόγηση της τύχης των υβριδικών κυττάρων, τα περισσότερα από τα υβρίδια σύντηξης καρκίνο στρωματικά παρέμεινε ανάπτυξη συνελήφθησαν και τελικά χάθηκαν. Ωστόσο, μερικά από τα υβρίδια επιβίωσαν για να σχηματίσουν αποικίες από την συν-καλλιέργεια με καρκίνο που σχετίζεται στρωματικά κύτταρα. Αυτά τα παράγωγα κλώνοι έδειξαν γονιδιωματική αλλοιώσεις μαζί με ανδρογόνα ανεξάρτητο φαινότυπο. Τα αποτελέσματα από αυτή τη μελέτη δείχνουν ότι ο καρκίνος του προστάτη κύτταρα είναι συντηκογόνα, και την αλληλεπίδραση με τον καρκίνο στρωματικά μπορεί να οδηγήσει σε αυθόρμητη σύντηξη μεταξύ των δύο τύπων κυττάρων. Ενώ μια στρατηγική σύντηξης καρκίνος-στρωματικών μπορεί να επιτρέψει στο στρωματικό διαμέρισμα να εξολεθρεύει εισβάλλοντας καρκινικά κύτταρα, ορισμένα καρκινικά-στρωματικών υβρίδια με αυξημένη ικανότητα επιβίωσης μπορεί να διαφύγει εκμηδένιση για να σχηματίσει ένα παράγωγο του πληθυσμού των καρκινικών κυττάρων με αλλαγμένη γονότυπο και αυξημένη κακοήθεια. Καρκίνος-στρωματικών σύντηξης θέτει έτσι τα θεμέλια για μια αδιάκοπη συνεξέλιξη μεταξύ του καρκίνου και των καρκινικών που σχετίζονται με στρωματικά κύτταρα στο μικροπεριβάλλον του όγκου

Παράθεση:. Wang Ε, Sun Χ, Wang CY, Χου P, Chu CY , Liu S, et al. (2012) Αυθόρμητη Καρκίνος-στρωματικών κυττάρων σύντηξης ως μηχανισμός του καρκίνου του προστάτη ανδρογόνων-Ανεξάρτητη εξέλιξη. PLoS ONE 7 (8): e42653. doi: 10.1371 /journal.pone.0042653

Επιμέλεια: Zoran Culig, Innsbruck Medical University, Αυστρία

Ελήφθη: May 29, 2012? Αποδεκτές: 9, Ιουλίου, 2012? Δημοσιεύθηκε: 3, Αυγούστου, 2012

Copyright: © Wang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίζεται από επιχορηγήσεις έρευνας R21CA112330 και CA132388 από NCI /NIH (National Cancer Institute των Εθνικών Ινστιτούτων Υγείας των ΗΠΑ.), και PC040578 από DoD να Ruoxiang Wang? και NCI /NIH επιχορήγησης CA98912-02 να Leland W. K. Chung. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

θεραπεία του καρκίνου του προστάτη συχνά βρίσκεται πίσω από ανδρογόνα-ανεξάρτητους εξέλιξη και μετάσταση στα οστά. Ενώ πρωτοπαθούς καρκίνου είναι αρχικά ανδρογόνο-εξαρτώμενη και μπορεί να είναι ιάσιμες με στέρηση ανδρογόνου, ανδρογόνο-ανεξαρτησία είναι κοινή σε υποτροπιάζοντα καρκίνο και μετάσταση, τα οποία είναι συχνά ανίατες. Μαζί με την εξέλιξη από την πρωτογενή στην μεταστατική κατάσταση, τα καρκινικά κύτταρα έχουν αποκτήσει ορισμένα χαρακτηριστικά ευνοϊκές για την επιβίωση εν απουσία ανδρογόνων [1], [2].

Η αιτία της ανδρογόνο ανεξαρτησία παραμένει να διευκρινιστεί. Αυξημένα υποδοχέα ανδρογόνων (AR) δραστηριότητα και αυξημένη επιβίωση στα καρκινικά κύτταρα μπορεί να συμβάλλουν παράγοντες [3], [4], αλλά στρωματικά κύτταρα στο μικροπεριβάλλον του όγκου παίζουν επίσης σημαντικό ρόλο [5]. Σε φυσιολογικό προστάτη, το επιθηλιακό στρώμα αδενική δομικά διαχωρίζεται από τον περιβάλλοντα στρώμα από μία μεμβράνη στρωτή υπόγειο. Στον καρκίνο του προστάτη, διεισδύοντας καρκινικά κύτταρα θα σχηματίζουν άμεσες επαφές με στρωματικά κύτταρα, τοποθετώντας τη διαδικασία εξέλιξης του καρκίνου, στο πλαίσιο ενός μικροπεριβάλλοντος στρωματικών. Οριοθετούν το μηχανισμό της αλληλεπίδρασης του καρκίνου-στρωματικών αποτελεί προτεραιότητα για τη βελτίωση της θεραπείας του καρκίνου του προστάτη.

Έχουμε ορίσει έναν υποχρεωτικό ρόλο της μεσεγχυματικών στρώμα στην εξέλιξη του καρκίνου του προστάτη σε ανδρογόνα ανεξαρτησία από τη μοντελοποίηση της αλληλεπίδρασης μεταξύ του καρκίνου και στρωματικά κύτταρα [6], [7], [8], [9]. LNCaP κύτταρα καρκίνου ανθρώπινου προστάτη, για παράδειγμα, είναι ανδρογόνο-εξαρτώμενη όταν δοκιμάστηκαν για σχηματισμό όγκου σε ευνουχισμένα αρσενικά αθυμικά ποντίκια. Αυτά τα κύτταρα, ωστόσο, θα μπορούσε να αποτελέσει συχνή όγκους όταν συν-ενοφθαλμίζονται με κύτταρα του μυελού των οστών μεσεγχυματικά στρωματικά γράμμωσης [9], [10]. Περιέργως, τα καρκινικά κύτταρα που ανακτώνται από τα προκύπτοντα όγκους ήταν ανεξάρτητος από ανδρογόνο, ιδιοσυστατικά που παράγουν υψηλά επίπεδα του ειδικού προστατικού αντιγόνου (PSA), αναπαραγώγιμα σχηματίζοντας ανεξάρτητος από ανδρογόνο όγκους ξενομοσχεύματος, και συχνά παρουσιάζουν μεταστατική ικανότητα στα οστά [9], [10]. Για την προσομοίωση του

in vivo

καρκίνο στρωματικά αλληλεπίδραση, έχουμε συν-καλλιεργήθηκαν τον καρκίνο και στρωματικά κύτταρα υπό συμβατικές και 3-διαστάσεων συνθήκες. Κατά την άμεση επαφή, τα κύτταρα μυοϊνοβλαστών στρωματικά θα μπορούσε να διασώσει τα κύτταρα LNCaP από ανδρογόνων πείνα που προκαλείται από το θάνατο [11], ενώ η 3-διαστάσεων συγκαλλιέργεια οδήγησε σε συστατική εκφραστικές αλλαγές τόσο στον καρκίνο και τα στρωματικά κύτταρα [12], [13], αντανακλώντας τη συνεξέλιξη μεταξύ καρκίνου και μεσεγχυματικών στρωματικών κυττάρων που παρατηρούνται σε εξέλιξη του καρκίνου του προστάτη και μετάσταση στα οστά. Περιέργως, τα καρκινικά κύτταρα προέρχονται από την συν-καλλιέργεια έφεραν μόνιμο γονιδιωματική μετατροπές, ανιχνεύεται από την εμφάνιση των χρωμοσωμάτων δείκτη. Γονιδιωματική μεταβολή μπορεί να είναι το θεμέλιο για την ανευπλοειδία, η πιο σημαντική ανωμαλία σε μεταστατικούς καρκίνους [14], [15]. Έρευνα σχετικά με την άμεση επαφή μεταξύ του καρκίνου και στρωματικά κύτταρα μπορεί να αποκαλύψει το μηχανισμό με τον οποίο η αλληλεπίδρασή του καρκίνου-στρωματικών προωθεί την εξέλιξη του καρκίνου του προστάτη και οστικές μεταστάσεις.

Στην έκθεση αυτή, χρησιμοποιήσαμε μεθόδους συν-καλλιέργειας για να διερευνήσει περαιτέρω την αιτία της ανδρογόνων ανεξαρτησία. LNCaP κύτταρα με ετικέτα με ένα κόκκινο πρωτεΐνη φθορισμού επικαλυφθεί πάνω σε μονοστιβάδα κυττάρων μυοϊνοβλάστη προστάτη για να διευκολύνει την άμεση επαφή μεταξύ των δύο τύπων κυττάρων. Παρακολουθώντας το κόκκινο φθορισμό, βρήκαμε ότι τα καρκινικά κύτταρα θα μπορούσε αυθόρμητα συντηχθούν με στρωματικά κύτταρα. Ακολουθώντας τη μοίρα των καρκινικών-στρωματικών υβρίδια, βρήκαμε ότι τα περισσότερα από τα συντηγμένα κύτταρα πέθαναν, ενώ μερικά θα μπορούσε να επιβιώσει για να σχηματίσουν κλώνους. Τα παράγωγα κλώνοι παρουσίασαν χρωμοσωμική ζημία, με επιταχυνόμενη ανάπτυξη και αυξημένη παραγωγή PSA σε μια ανδρογόνο-ανεξάρτητο τρόπο. Καρκίνος-στρωματικών κυττάρων σύντηξης είναι έτσι ένας συμβάλλοντας μηχανισμός για την εξέλιξη καρκίνου του προστάτη ανεξάρτητη από ανδρογόνο.

Μέθοδοι

Κύτταρα και συνθήκες κυτταρικής καλλιέργειας

Η προέλευση του καρκίνου του προστάτη LNCaP ανθρώπινης κυτταρική γραμμή που χρησιμοποιήθηκε σε αυτή τη μελέτη ήταν προηγουμένως αναφερθεί [16]. Η δημιουργία του RL-1, ένας κλώνος LNCaP εκφράζει μια πρωτεΐνη φθορισμού AsRed2, μαζί με την απομόνωση και τον χαρακτηρισμό ενός ζεύγος των HPS-14 φυσιολογικά και HPS-15 που σχετίζεται με καρκίνο του προστάτη στον άνθρωπο κλώνους μυοϊνοβλάστη στρωματικών προηγουμένως αναφερθεί [11]. Το εμβρυϊκό οι ανθρώπινες κυτταρικές σειρές πνεύμονα στρωματικών MRC-9 MRC-5 και αγοράστηκαν από την American Type Culture Collection (Manassas, VA). PRSC, ένα πρωτεύον φυσιολογικό ανθρώπινο προστάτη στρωματική κυτταρική γραμμή, αγοράστηκε από την Lonza Walkersville, Inc. (Walkersville, MD). Όλα αυτά τα κύτταρα διατηρήθηκαν στους 37 ° C σε Τ-μέσο (Invitrogen, Carlsbad, CA) που περιέχει 10% ορό εμβρύου μόσχου (FBS), αμπικιλλίνη (100 μονάδες /ml) και στρεπτομυκίνη (100 μg /ml), με υγροποιημένο αέρα συμπληρωμένο με 5% CO

2. Κανονικό ανθρώπινο μυελό των οστών πολυδύναμα μεσεγχυματικά στρωματικά κύτταρα σε μεταγωγή με ένα βραδέος ιού πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη (hMSC-GFP) αγοράστηκαν από την Tulane Κέντρο Gene Therapy (Πανεπιστήμιο Tulane, Νέα Ορλεάνη, LA) και καλλιεργήθηκαν σε α Minimum Essential Medium (Invitrogen) που περιέχει 16.5 % FBS και 2 mM L-γλουταμίνη [17].

συν-καλλιέργεια

η άμεση συν-καλλιέργεια των καρκινικών και στρωματικά κύτταρα έχουν αναφερθεί στο παρελθόν [11]. Για να σχηματιστεί μια στρωματική κυτταρική μονοστιβάδα, 5 × 10

5 στρωματικά κύτταρα σε 2 ml μέσου καλλιεργήθηκαν σε κάθε φρεάτιο μιας 6-φρεατίων, και αφέθηκαν να αναπτυχθούν σε πλήρη συρροή. Το μέσο απομακρύνθηκε και 5 × 10

5 κύτταρα του κόκκινου φθορισμού LNCaP RL-1 κλώνο σε 4 ml φρέσκου μέσου επιστρώθηκαν πάνω στην μονοστιβάδα. Το μέσο συν-καλλιέργειας άλλαζε κάθε τρεις ημέρες.

Colony δοκιμασία σχηματισμού

Τα κύτταρα που μελετάται συλλέχθηκαν μετά από αγωγή με θρυψίνη-ΕϋΤΑ και αραιώθηκαν σε μια χαμηλής πυκνότητας μονού κυτταρικού εναιωρήματος (4 κύτταρα /ml). Σε κάθε φρεάτιο σε πλάκα 96 φρεατίων, εφαρμόστηκε 100 μΙ του εναιωρήματος. Μετά από 24 ώρες επώασης, οι πλάκες εξετάστηκαν κάτω από μικροσκόπιο σημαδεύτηκαν και τα φρεάτια που περιέχουν ένα μόνο κύτταρο. Μετά από 8 εβδομάδες καλλιέργειας, οι αποικίες σχηματίζονται στα αξιοσημείωτη φρεάτια ενισχύθηκαν για περαιτέρω χαρακτηρισμό.

ανδρογόνων θεραπεία

Το πρωτόκολλο για τη θεραπεία καλλιεργημένα κύτταρα με ανδρογόνων στο παρελθόν είχε αναφερθεί [18]. Εν συντομία, ίσοι αριθμοί κυττάρων (5 × 10

5 /φρεάτιο) επιστρώθηκαν σε πλάκες 6 φρεατίων. Μετά την προσκόλληση, τη στέρηση ανδρογόνου έγινε με καλλιέργεια των κυττάρων με ερυθρό της φαινόλης-ελεύθερο RPMI 1640 (Invitrogen) για 48 ώρες. Το μέσο αλλάχθηκε σε ελεύθερο ερυθρού φαινόλης RPMI 1640 που περιέχει 1% δεξτράνη-άνθρακα απογυμνωμένο FBS. Συνθετικά μεθυλοτριενολόνη ανδρογόνων (R1881, Perkin Elmer, Waltham, ΜΑ) προστέθηκε στην ομάδα θεραπείας έως 5 ηΜ. Μετά από 24 ώρες κατεργασίας, το μέσο καλλιέργειας συλλέχθηκε για μέτρηση PSA και τα κύτταρα συλλέχθηκαν για την παρασκευή ολικού κυττάρου λύματος.

PSA ELISA

μέσο καλλιέργειας κυττάρων χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση της παραγωγής PSA χρησιμοποιώντας μας έχουν αναφερθεί στο παρελθόν πρωτοκόλλου [11]. Μια εμπορική PSA κιτ ELISA (United Biotech Inc., Mountain View, CA) χρησιμοποιήθηκε και δοκιμασίες εις τριπλούν πραγματοποιήθηκαν σε κάθε δείγμα.

Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων δοκιμασία

Το πρωτόκολλο που χρησιμοποιείται για τον προσδιορισμό του πολλαπλασιασμού των κυττάρων με μετατροπή ΜΤΤ αναφέρθηκε προηγουμένως [11]. Εν συντομία, ίσοι αριθμοί κυττάρων (5 × 10

5 /ml) τοποθετήθηκαν σε ένα 96-φρεατίων. Μετά ανδρογόνο θεραπεία όπως περιγράφηκε παραπάνω, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε μια δοκιμασία πολλαπλασιασμού. δοκιμασίες εις τριπλούν πραγματοποιήθηκαν σε κάθε ομάδα.

κηλίδωση Western

Το πρωτόκολλο για την κηλίδωση Western αναφέρθηκε προηγουμένως [18]. Σε αυτή τη μελέτη, 20 μα πλήρους πρωτεΐνης κυτταρολύματος κλασματοποιήθηκε και στυπώθηκε σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης. Η μεμβράνη ανιχνεύθηκε με ειδικά αντισώματα για AR (Santa Cruz Biotechnologies, Santa Cruz, CA). Το επίπεδο του β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης.

ανάλυση PCR

Οι προϋποθέσεις για γονιδιωματική ενίσχυση του DNA έχουν αναφερθεί στο παρελθόν [18]. Σε αυτή τη μελέτη, φυλετικά χρωμοσώματα ανιχνεύθηκαν με τη μέθοδο ιατροδικαστική sexing [19]. Το ζεύγος εκκινητών χρησιμοποιείται για την ανίχνευση γονιδίων αμελογενίνης ήταν 5′- CTGATGGTTGGCCTCAAGCCTGTG-3 ‘και 5′-TAAAGAGATTCATTAACTTGACTG-3′ [20]. Αυτό το ζεύγος ανιχνεύει τόσο το Χ-συνδεδεμένο και Υ-συνδεδεμένα γονίδια αμελογενίνης, παράγοντας ένα 977 ζευγών βάσεων (bp) από το ιντρόνιο 3 του γονιδίου Χ-συνδεδεμένο και ένα προϊόν 788 bp του Υ-συνδεδεμένο γονίδιο σε ένα μόνο ανάλυση PCR. Ένα ζεύγος εκκινητών 5’-ATGCAATCATATGCTTCTGCTATGTTAAGC-3 ‘και 5′-CTACAGCTTTGTCCAGTGGCTGTAGCGGTC-3’ χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση της περιοχής κωδικοποίησης (615 bp) του Υ-ειδικό γονίδιο SRY. Το προϊόν της αντίδρασης κλασματοποιήθηκε με ηλεκτροφόρηση πηκτής αγαρόζης 1% και οπτικοποιήθηκαν με χρώση βρωμιούχου αιθιδίου.

ενεργοποιούμενη με φθορισμό διαλογή κυττάρων (FACS) ανάλυση

Το πρωτόκολλο για την δοκιμασία FACS περιγράφηκε προηγουμένως [11]. Σε αυτή τη μελέτη, τα καλλιεργημένα κύτταρα αποκολλήθηκαν με θρυψίνη-ΕϋΤΑ. Αφού πλύθηκαν σε ρυθμισμένο με φωσφορικό αλατούχο και στερεώνονται σε 75% αιθυλική αλκοόλη, τα κύτταρα βάφτηκαν με ιωδιούχο προπίδιο παρουσία ΚΝάσης Α για 30 λεπτά και υποβλήθηκαν σε ανάλυση FACS για τη σκιαγράφηση του κυτταρικού κύκλου. Μονοπυρηνικά κύτταρα περιφερικού αίματος από δύο υγιείς άρρενες χρησιμοποιήθηκαν ως κανονικός έλεγχος για γονιδιωματική περιεχόμενο. Χρήση του δείγματος δότη εγκρίθηκε από Διοικητικό Συμβούλιο Institutional Review του Emory University School of Medicine (IRB αριθμό 278 – 2006), με τη γραπτή συγκατάθεση από τους συμμετέχοντες.

μικροσκόπιο φθορισμού

Το πρωτόκολλο για το κόκκινο απεικόνιση φθορισμού προηγουμένως αναφέρθηκε [11]. Σε αυτή τη μελέτη, για λόγους σύγκρισης όλες οι κόκκινες εικόνες φθορισμού ελήφθησαν με σταθερές ρυθμίσεις: 4,15 δευτερόλεπτα για την απεικόνιση σε μεγέθυνση 40 φορές, 2,075 δευτερόλεπτα για την απεικόνιση στα 100 × μεγέθυνση, και 1,0375 δευτερολέπτων για την απεικόνιση στα 200 × μεγέθυνση

Αποτελέσματα

1. Χαρακτηριστικά του καρκίνου του προστάτη και στρωματικών κυττάρων στο σύστημα συν-καλλιέργειας

Χρησιμοποιήσαμε ένα κόκκινο πρωτεΐνη φθορισμού για την παρακολούθηση των κυττάρων LNCaP σε συν-καλλιέργεια [11]. Ένας αντιπροσωπευτικός κλώνος κόκκινο φθορίζον LNCaP, RL-1, χρησιμοποιήθηκε σε αυτή τη μελέτη. RL-1 κύτταρα εμφανίζονται ρυθμούς ανάπτυξης (Σχήμα 1Α), η παραγωγή του PSA (Εικόνα 1Β) και το επίπεδο AR (Σχήμα 1C) παρόμοια με τα γονικά κύτταρα LNCaP. Στο επίπεδο του γονιδιώματος, τα κύτταρα RL-1 περιείχε το χρωμόσωμα Υ (Σχήμα 1 D), ένα γενωμικό χαρακτηριστικό που χάθηκε κατά ανεξάρτητο από ανδρογόνο εξέλιξης [21]. Τόσο τα γονικά κύτταρα LNCaP RL-1 και εμφανίζεται ένα πανομοιότυπο σχεδόν τετραπλοειδείς γονιδιωματική περιεχόμενο (Σχήμα 1 Ε), υποδηλώνοντας έναν καρυότυπο xxyy [21]. Όταν δοκιμάστηκε για τον σχηματισμό ξενομοσχεύματος όγκου, κύτταρα RL-1 δεν σχηματίζουν υποδόριων όγκων σε αθυμικούς ποντικούς, διατηρώντας έτσι την μη ογκογόνων ιδιότητα των γονικών κυττάρων LNCaP.

Α, Διαφορικές ανάπτυξη απόκριση σε ανδρογόνα. Τα αρχικά κύτταρα LNCaP και η κόκκινη φθορίζουσα RL-1 κλώνο, μαζί με ένα ζεύγος στρωματικών κυττάρων του προστάτη, HPS-14 (κανονικό) και HPS-15 (που σχετίζεται με καρκίνο), συγκρίθηκαν για πολλαπλασιασμό με μετατροπή ΜΤΤ. Μετά από 48-ωρών στέρηση ορού, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία σε κανονικό μέσο καλλιέργειας (έλεγχος), ανδρογόνων μέσο στέρηση (στέρηση), και μέσο στέρησης ανδρογόνων που περιέχει 5 ηΜ συνθετικό ανδρογόνο R1881 (R1881). προσδιορισμοί ΜΤΤ διεξήχθηκαν 48 ώρες αργότερα. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± SD από ένα τριπλό προσδιορισμό. Β, η παραγωγή διαφορικού PSA. Το μέσο καλλιέργειας από τα επεξεργασμένα κύτταρα ανιχνεύθηκε για συγκέντρωση PSA με ELISA. Κάθε σημείο δεδομένων αντιπροσωπεύει το μέσο ± SD από προσδιορισμούς εις τριπλούν. C, η έκφραση Διαφορικές AR. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε κηλίδωση Western για έκφραση AR. Το φυσιολογικό ανθρώπινο στρωματική κυτταρική γραμμή pRSC χρησιμοποιήθηκε στη σύγκριση. Το επίπεδο της έκφρασης β-ακτίνης χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Το αποτέλεσμα ήταν αντιπροσωπευτικό δύο χωριστών πειραμάτων. D, Διαφορικές καρυότυπο. Γονιδιακού DNA PCR χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση φυλετικά χρωμοσώματα με ιατροδικαστική μέθοδο προσδιορισμού του φύλου [20]. MRC-5 και MRC-9 κύτταρα ήταν να προετοιμάσει αρσενικά και θηλυκά γονιδιωματικό DNA, αντίστοιχα. Στο άνω φύλλο (αμελογενίνη), το Χ χρωμόσωμα ανιχνεύθηκε ως άνω συγκρότημα, ενώ το Υ χρωμόσωμα ανιχνεύθηκε ως το κατώτερο συγκρότημα. Στο κατώτερο πάνελ (SRY), χρωμόσωμα-ειδικών τόπου SRY χρησιμοποιήθηκε για να επιβεβαιωθεί η παρουσία του χρωμοσώματος Υ. Ε, γονιδιωματική περιεχόμενο διαφορικού. Μονοπυρηνικά κύτταρα περιφερικού αίματος (PBMC) από υγιείς άρρενες είχαν χρησιμοποιηθεί για να δείξει φυσιολογικά διπλοειδή γονιδιωματική περιεχόμενο όπως μετρήθηκε με FACS. κύτταρα RL-1 είχε σχεδόν τετραπλοειδής γονιδιωματική περιεχόμενο, παρόμοια με τα γονικά κύτταρα LNCaP [21]. HPS-14 και HPS-15 κύτταρα παρουσίασαν γονιδιωματική περιεχόμενο παρόμοιο με το κανονικό PBMC.

Η

Έχουμε ήδη χαρακτηρίζεται ζεύγη της κανονικής HPS-14 και του καρκίνου που σχετίζονται με HPS-15 ανθρώπινων κλώνων στρωματικά προστάτη [11] , τα οποία είναι αρκετά μεγάλα και αργή ανάπτυξη μυοϊνοβλάστες (Σχήμα 1Α) που δεν εκφράζουν PSA (Εικόνα 1Β). Είναι ενδιαφέρον, κανένας από τους κλώνους στρωματικών εξέφρασαν ανιχνεύσιμα επίπεδα του AR με κηλίδωση Western (Σχήμα 1 C) ή με RT-PCR (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα). HPS-14 κύτταρα περιείχαν το χρωμόσωμα Υ, το οποίο χάθηκε στον καρκίνο που σχετίζεται με τον ομόλογό (Εικόνα 1D). Η κυτταρομετρία ροής έδειξε ότι και οι δύο HPS-14 και HPS-15 διατήρησε γονιδιωματική περιεκτικότητα κοντά σε εκείνη του φυσιολογικού ανθρώπινου περιφερικού αίματος μονοπυρηνικά κύτταρα (Σχήμα 1 Ε).

2. Αυθόρμητη σύντηξη του καρκίνου και στρωματικά κύτταρα

Για να διερευνηθεί καρκίνο στρωματικά αλληλεπίδρασης σε συν-καλλιέργεια, τα κύτταρα RL-1 επιστρώθηκαν πάνω σε συρρέουσα μονοστιβάδα HPS-14 ή HPS-15 κύτταρα, έτσι τα καρκινικά κύτταρα ήταν σε άμεση επαφή με τα στρωματικά κύτταρα. RL-1 κύτταρα έδειξαν ένα μέγεθος περίπου 15 μm χ 50 μm (Σχήμα 2Α), ενώ τα στρωματικά κύτταρα ήταν σε πολύ μεγαλύτερο και πιο διευρυμένη σχήματα αλλά χωρίς ερυθρό φθορισμό (Σχήμα 2Β).

RL-1 τα κύτταρα (Α) και HPS-15 κύτταρα (Β), σε χωριστά καλλιέργεια. Μετά από 7 ημέρες συν-καλλιέργειας, αυθόρμητη σύντηξη θα μπορούσε να θεωρηθεί (C). Σε μεγαλύτερη μεγέθυνση, το συγχωνευμένο κύτταρο περιείχε δύο πυρήνες, ένα φθοριζόντως κόκκινο και το άλλο με φθορισμό ωχρό (D). Καρκίνος-στρωματικών σύντηξης συχνά σε περιοχές όπου RL-1 και HPS-15 διαμορφώνεται στενή επαφή (Ε). Σε μερικές περιπτώσεις, τα κύτταρα στο μέσον του μια σύντηξη θα μπορούσε να θεωρηθεί (F). Οι δύο πυρήνες θα μπορούσε να θεωρηθεί ένα κοντά στο άλλο (G) ή χωρισμένα (H). Για κάθε όψη, ένα εικόνα αντίθεσης φάσης (επάνω) και ερυθρό φθορισμό εικόνα (κάτω) δείχνονται. Τα βέλη χρησιμοποιούνται για να δηλώσουν πυρήνες.

Η

Καθημερινή επιθεώρηση αποκάλυψε ότι τα κύτταρα στη μονοστιβάδα στρωματικά μπορούσε να μετατρέψει φθορισμό κόκκινο κατά τη διάρκεια της συν-καλλιέργειας (Εικόνες 2C και 2D). Ώστε τα ερυθρά φθορίζοντα στρωματικά κύτταρα προέκυψαν από σύντηξη με τα καρκινικά κύτταρα RL-1 προσδιορίστηκε με βάση τις ακόλουθες παρατηρήσεις. Πρώτον, με φθορισμό κόκκινου στρωματικά κύτταρα βρέθηκαν κυρίως πλησίον των καρκινικών κυττάρων (Σχήμα 2Ε). Δεύτερον, αν και η τεχνολογία πραγματικού χρόνου δεν είχαν χρησιμοποιηθεί για την καταγραφή της δυναμική διαδικασία της σύντηξης, δεν ήταν δύσκολο να βρεθούν περιπτώσεις στις οποίες ένα κύτταρο καρκίνου στα μισά του δρόμου συντήκονται με στρωματικών κυττάρων (Σχήμα 2F). Τρίτον, πολλά από αυτά τα στρωματικά κύτταρα περιείχαν δύο πυρήνες, ένα φθορισμό κόκκινο υποδεικνύοντας προέλευσή της από ένα καρκινικό κύτταρο, και η άλλη με φθορισμό χλωμό υπονοώντας στρωματικά προέλευση του (Σχήματα 2C να 2Η). Τα ερυθρά κύτταρα στη μονοστιβάδα στρωματική με εμφάνιση στρωματικά ήταν κυτταροπλασματική υβρίδια σύντηξη μεταξύ του καρκίνου και των στρωματικών κυττάρων.

Πρόσθετες στρωματικά κύτταρα συν-καλλιεργήθηκαν να παρατηρήσουν τον καρκίνο στρωματικά σύντηξης. Μία από τις μελέτες ήταν ένα συν-καλλιέργεια των RL-1 κύτταρα με hMSC-GFP, φυσιολογικά κύτταρα μεσεγχυματικά ανθρώπινο μυελό των οστών στρωματικά εκφράζει μία πρωτεΐνη πράσινου φθορισμού [17]. Η συν-καλλιέργεια παρατηρήθηκε σε 4 εβδομάδες με εκτιμώμενο 25% του πληθυσμού ως διπλά φθοριζόντων κυττάρων, πράσινη φθορίζουσα κυττάρων με διακριτά στρωματικά μορφολογία εκπέμπουν κόκκινο φθορισμό, τα περισσότερα με μια πρόσθετη κόκκινη φθορίζουσα πυρήνα (Σχήματα 3). Όλες αυτές οι μελέτες επιβεβαίωσαν ότι οι κόκκινη φθορίζουσα LNCaP κύτταρα καρκίνου προστάτη ήταν συντηκογόνα. Μόλις σε άμεση επαφή, τα κύτταρα RL-1 θα μπορούσε να συγχωνεύονται με τα στρωματικά κύτταρα.

Εκπρόσωπος του καρκίνου-στρωματικών γεγονότα σύντηξης κυττάρων από την συν-καλλιέργεια των RL-1 κυττάρων με κύτταρα hMSC-GFP δείξει. Α, Α ενιαία εκδήλωση σύντηξη την ημέρα 7 φαίνεται στο φωτεινό πεδίο, πράσινο φθορισμό, και κόκκινο φθορισμό. Οι εικόνες πράσινο και κόκκινο φθορισμό συγχωνεύθηκαν (νέα φθορισμού) για να δείξει τις δύο πυρήνες των διαφορετικών φθορισμού. Τα Β, Συγχωνευμένος εικόνες φθορισμού για 4 επιπλέον συμβάντα σύντηξης δείχνεται, με εκδηλώσεις 1 και 2 καταγράφονται κατά την ημέρα 7, και 3 και 4 κατά την ημέρα 14. Τα βέλη χρησιμοποιούνται για να υποδείξουν πυρήνες. Όλες οι εικόνες που εμφανίζονται στο 200 × μεγέθυνση.

Η

3. Χαρακτηριστικά του καρκίνου στρωματικών κυτταρική σύντηξη

Δεδομένου ότι το ζεύγος στρωματικών κυττάρων βραδείας ανάπτυξης και την αναστολή της ανάπτυξης των κυττάρων RL-1 [11], ένα συν-καλλιέργεια θα μπορούσε να διατηρηθεί για 8 εβδομάδες για την περιοδική τεκμηρίωση σε 4 επαναλαμβανόμενες πειράματα. Μικρή σύντηξη κυττάρων παρατηρήθηκε κατά τις πρώτες 48 ώρες συν-καλλιέργειας. Ερυθρά φθοριζόντων κυττάρων στο στρώμα στρωματικών άρχισαν να εμφανίζονται στη συνέχεια με την καθημερινή αύξηση του αριθμού σε ένα πλάτωμα γύρω από 4 εβδομάδες, στον οποίο χρόνο ένα ανώτατο όριο 20% του πληθυσμού στρωματικών ενεπλάκη στην σύντηξη (Σχήμα 4). Ο καρκίνος-στρωματικών σύντηξης ήταν έτσι μια αυθόρμητη και μια χρόνια διαδικασία.

συγκαλλιέργειες των RL-1 και HPS-15 κύτταρα παρατηρήθηκαν εβδομαδιαίως για συχνότητα της σύντηξης κυττάρων. Για κάθε όψη, ένα εικόνα αντίθεσης φάσης (επάνω) και ερυθρό φθορισμό εικόνα (κάτω) δείχνονται. Τα βέλη χρησιμοποιούνται για να δηλώσουν τα γεγονότα σύντηξης καρκινικού κυττάρου-στρωματικών. Όλες οι εικόνες που εμφανίζονται σε μεγέθυνση 40 φορές.

Η

Καρκίνος-στρωματικών σύντηξη έλαβε χώρα μόνο όταν χρησιμοποιούνται βιώσιμα καρκινικά κύτταρα. Συγκαλλιέργεια με νεκρούς RL-1 κύτταρα, σκοτώθηκε από ανδρογόνα στέρηση, μικροβιοκτόνο υπεριώδη ακτινοβολία, snap κατάψυξη ή ξήρανση κενού, δεν ήταν σε θέση να κάνουν τα στρωματικά κύτταρα φθορισμό κόκκινο σε 8 εβδομάδες. Επιπλέον, επώαση με καθαρισμένο γονιδιωματικό DNA από κύτταρα RL-1 (10 μg /ml) ή το πλασμίδιο DNA pAsRed2 (10 μg /ml) δεν προκάλεσε κόκκινο φθορισμό σε στρωματικά κύτταρα. Η αυθόρμητη καρκίνο-στρωματικών σύντηξης φαινόταν μια ενεργή διαδικασία, που απαιτεί τη συμμετοχή τόσο του καρκίνου και τα στρωματικά κύτταρα.

Στα 4 ξεχωριστά πειράματα συγκαλλιέργειας, δεν βρήκαμε μια διαφορά μεταξύ των κανονικών HPS-14 και οι σχετιζόμενες με καρκίνο HPS-15 στρωματικών κυττάρων ως προς τη συχνότητα τους σύντηξης με τα καρκινικά κύτταρα. RL-1 θα μπορούσε επίσης να συντήκονται με άλλα ζεύγη ανθρώπινων στρωματικών κυττάρων του προστάτη καθιερώθηκαν στο εργαστήριο μας [11] και με στρωματικά κύτταρα που προέρχονται από άλλους ιστούς, συμπεριλαμβανομένου του μυελού των οστών μεσεγχυματικά στρωματικά κύτταρα (Σχήμα 3). Τα συντηξογονικά καρκινικά κύτταρα φαίνεται να έχουν τη δυνατότητα να ενώνονται με μια μεγάλη ποικιλία από άλλα κύτταρα.

Στο συγκαλλιέργεια με στρωματικά κύτταρα του προστάτη, έχουμε παρατηρήσει ότι τα υβριδικά κύτταρα σπάνια έδωσαν απογόνους που διατήρησε τη μορφολογία του στρώματος. Ακολουθώντας 32 υβριδικά κύτταρα από την ημέρα 7 έως την ημέρα 28 σε συν-καλλιέργεια, για παράδειγμα, δεν βρήκαμε κανένα από τα υβρίδια διαίρεση σε κλωνική συστάδες με μορφολογία στρωματικά, ούτε από την συγκαλλιέργεια με τα κύτταρα hMSC-GFP (Σχήμα 3). Τα υβρίδια φαινόταν να έχει μια ενδιαφέρουσα μοίρα: είτε είχαν δυσκολία στην έναρξη της κυτταρικής διαίρεσης, ή των απογόνων τους είχαν αποκτήσει αποκλίνουσες μορφολογία

4.. Η μοίρα του καρκίνου-στρωματικών υβρίδια

Σύντηξη κυττάρων είναι μια βιολογική διαδικασία που εξυπηρετούν βασικές λειτουργίες [22], [23], [24], [25]. Ενώ κυτταροπλασματική σύντηξης

per se

είναι ένας μηχανισμός συνέργεια, παρέχει επίσης μια ευκαιρία για την πυρηνική σύντηξη, που οδηγεί στην παραγωγή θυγατρικά κύτταρα ετερογενή από τους δύο γονείς. Εμείς παρακολουθούνται την τύχη των καρκινικών-στρωματικά υβριδικά κύτταρα να εκτιμήσει την παθολογική σημασία. κύτταρα RL-1 συν-καλλιεργήθηκαν με HPS-14 και HPS-15 κύτταρα για 4 εβδομάδες, και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με G418 (200 μg /ml) για 7 ημέρες για να αφαιρέσουν τα στρωματικά κύτταρα που δεν εμπλέκονται στη σύντηξη. RL-1 κύτταρα που συνδέονται με αυτά τα στρωματικά κύτταρα απομακρύνονται ταυτόχρονα. Τα εμπλουτισμένα υβριδικά κύτταρα συλλέχθηκαν σε μονό-κυτταρικό εναιώρημα, απλώνονται με περιοριστική αραίωση, και υποβλήθηκε σε σχηματισμό αποικιών για άλλες 8 εβδομάδες.

Η υβρίδια κοινόχρηστο μορφολογικά χαρακτηριστικά και συμπεριφοράς σε όλη την δοκιμασία σχηματισμού αποικίας. Στην αρχή, ενικό υβρίδια παρουσίασαν δραματικά επεκταθεί μεγέθη, τα περισσότερα περιέχουν δύο πυρήνες, και οι δύο δείχνουν παρόμοια ερυθρό φθορισμό (Σχήμα 5Α). Ένα υβριδικό θα μπορούσε να επιβιώσει για περισσότερο από 4 εβδομάδες υπό τις συνθήκες δοκιμασίας, συμφωνώντας με τη σήμανση δυναμικό επιβίωση των γονικών στρωματικά κύτταρα [11]. Αξίζει να σημειωθεί ότι, τα υβριδικά κύτταρα εμφανίστηκαν ηρεμίας, δεδομένου ότι δεν κυτταρική διαίρεση παρατηρήθηκε κατά τη διάρκεια των πρώτων 4 εβδομάδων του σχηματισμού αποικιών. Σε σύγκριση, τα γονικά κύτταρα RL-1 και στρωματικών από αυτή τη φορά σχηματίζονται σημαντικές αποικίες σε ουσιαστική μεγέθη σε δοκιμασίες παραλλήλου ελέγχου. Μετά από 4 εβδομάδες σχηματισμού αποικίας, πολλά από τα υβριδικά κύτταρα που εγκρίθηκαν άτυπα μορφολογίες και συσσωρευμένη επιπλέον πυρήνες (Σχήμα 5Β). Η αδυναμία της διαίρεσης φαίνεται να οφείλεται σε ελλείψεις στην κυτοκίνηση και όχι στην αντιγραφή του DNA.

Οι αντιπροσωπευτικές μορφολογίες των υβριδικών κυττάρων κατά τη διάρκεια του σχηματισμού αποικιών απεικονίζεται. Ένα, δύο εβδομάδες στην καλλιέργεια, τα περισσότερα από τα υβρίδια περιείχε δύο πυρήνες παρόμοιων φθορισμού. Δεν παρατηρήθηκε κυτταρική διαίρεση. Β, τέσσερις εβδομάδες από την έναρξη της συν-καλλιέργεια, τα υβριδικά κύτταρα που εγκρίθηκε άτυπη μορφολογία με πολλαπλές πυρήνες. Δεν παρατηρήθηκε κυτταρική διαίρεση. C, Έξι εβδομάδες στην καλλιέργεια, τα υπόλοιπα υβριδικά κύτταρα έγινε λεπτό ή στενό, με πολλαπλούς πυρήνες σε τμήματα του κυττάρου. D, οκτώ εβδομάδες στην κουλτούρα, την κυτταρική διαίρεση έγινε διαδεδομένη. Η κυτταρική διαίρεση ήταν ανώμαλη, διότι παράγεται θυγατρικά κύτταρα σε ποικίλες μορφές και με μειωμένη βιωσιμότητα. Για κάθε όψη, ένα εικόνα αντίθεσης φάσης (επάνω) και ερυθρό φθορισμό εικόνα (κάτω) δείχνονται. Όταν είναι απαραίτητο, τα βέλη χρησιμοποιούνται για να υποδείξουν πυρήνες. Όλες οι εικόνες που εμφανίζονται στο 200 × μεγέθυνση.

Η

Περίπου τα μισά από τα υβρίδια που χάθηκαν 6 εβδομάδες σε σχηματισμό αποικιών. Παρά το γεγονός ότι δεν έχει ακόμη οριστεί η αιτία του κυτταρικού θανάτου, είναι γνωστό ότι η σύντηξη μεταξύ των κυττάρων με διαφορική ποσοστά πολλαπλασιασμού οδηγεί σε μιτωτικά καταστροφή [26], [27]. Μέσα σε ένα καρκίνο-στρωματικά υβριδικό, ο αντικρουόμενες ελέγχου της μίτωσης από τις δύο asynchronized πυρήνες θα μπορούσε να οδηγήσει είτε σε αποτυχία στην έναρξη της κυτταρικής διαίρεσης, ή σε μια ανώμαλη μίτωση και ασύμμετρη διαίρεση. Ένα κύτταρο στη μιτωτική καταστροφή πεθαίνει μέσω γενετικά προγραμματισμένο μηχανισμών [28]. Η αιτία του υβριδικού κυτταρικού θανάτου ήταν πιθανό μιτωτική καταστροφή.

Τα υπόλοιπα κύτταρα αυτή τη στιγμή έγινε συρρικνωμένο, εμφανίζοντας ένα επίμηκες σχήμα, που περιέχει πολλαπλά πυρήνες σε διάφορα τμήματα του κυττάρου (Σχήμα 5C). Κανένα από αυτά τα κύτταρα επέζησαν να αναπτυχθούν σε αποικίες. Αξίζει να σημειωθεί ότι, την κυτταρική διαίρεση φάνηκε να ξεκινήσει σε λιγότερο από το 5% των υπόλοιπων υβρίδια, επειδή πληθυντικό κύτταρα άρχισαν να εμφανίζονται σε μερικά φρεάτια καλλιέργειας.

Η κυτταρική διαίρεση έγινε εμφανές μόνο στις 8 εβδομάδες. Δεδομένου ότι μόνο ένα μικρό κλάσμα των υβριδίων επιβίωσαν σε αυτό το χρονικό διάστημα, η κυτταρική διαίρεση ήταν διαδεδομένη. Η διαίρεση, ωστόσο, εμφανίστηκε ανώμαλη επειδή τα θυγατρικά κύτταρα έδειξαν αμοιβαία αποκλίνουσες μορφολογίες (Εικόνα 5D), και οι περισσότεροι πέθαναν τελικά. Με βάση αυτές τις παρατηρήσεις και από την παρακολούθηση 2.800 υβρίδια σε 4 επαναλαμβανόμενες μελέτες (Πίνακας 1), καταλήξαμε στο συμπέρασμα ότι η κύρια τύχη των καρκινικών-στρωματικών υβρίδια ήταν ο θάνατος. κύτταρα του προστάτη στρωματικά, αφού συντήκονται από τα καρκινικά κύτταρα, θα μπορούσε να λειτουργήσει σαν ένα εμπόδιο ενάντια στην επιβίωση των καρκινικών κυττάρων.

Η

σύγκριση με τα φυσιολογικά ομόλογό, η λειτουργία φραγμού στον καρκίνο που σχετίζεται με HPS-15 στρωματικών κυττάρων θα μπορούσε να είναι ελλιπής, επειδή ορισμένα υβρίδια από τη συγχώνευση με HPS-15 επέζησαν και μεγάλωσε σε αποικίες. Από τις 4 μελέτες RL-1 και HPS-15 συν-πολιτισμό, ήμασταν σε θέση να αποδείξει 9, 6, 12, και 14 κλώνοι από κάθε μελέτης, αντίστοιχα (Πίνακας 1). Η μορφολογία και η ανάπτυξη των παραγώγων κυττάρων άλλαξε κατά μήκος της διαδικασίας κλωνοποίησης. Σε γενικές γραμμές, τα κύτταρα με πληθυντικό πυρήνες θα εξαφανιστούν, τους εργαζόμενους με άτυπες μορφολογία θα χαθεί, τα μεγέθη των κυττάρων θα μειωθεί και ο ρυθμός ανάπτυξης θα αυξηθεί. Μέχρι τη στιγμή που οι κλώνοι μεγάλωσαν σε 1 × 10

6 πληθυσμού, η οποία διήρκεσε περίπου 20 τμήματα, τα κύτταρα σε ένα παράγωγο κλώνο θα εμφανίζονται σε μια ομοιόμορφη μορφολογία που ήταν σχεδόν δυσδιάκριτες από τα γονικά καρκινικά κύτταρα (Σχήμα 6). Φάνηκε ότι η άμεση απόγονος του καρκίνου-στρωματικών υβρίδια ήταν ασταθής. Η αστάθεια, όμως, σταδιακά χάνεται κατά τη διάρκεια της διαδικασίας πολλαπλασιασμού.

Η μορφολογία ενός παραγώγου αποικία ακολουθήθηκε κατά τη διάρκεια της διαδικασίας κλωνοποίησης, αυξάνεται από ένα μόνο φρεάτιο ενός πλακιδίου 96 φρεατίων σε ένα μόνο φρεάτιο 24- φρεατίων, σε ένα μόνο φρεάτιο μιας πλάκας 6-φρεατίων, και σε ένα πιάτο 10 εκατοστών. Για κάθε όψη, ένα εικόνα αντίθεσης φάσης (επάνω) και ερυθρό φθορισμό εικόνα (κάτω) δείχνονται. Όλες οι εικόνες που εμφανίζονται στο 100 × μεγέθυνση.

Η

5. Ανδρογόνων ανεξαρτησία των παραγώγων κλώνων από καρκίνο-στρωματικά σύντηξης

Εμείς που χαρακτήρισαν τις πρώτες 9 παράγωγο κλώνοι που λαμβάνονται από RL-1 σύντηξη με τα κύτταρα HPS-15 (Πίνακας 1), που πήραν το όνομά τους από RLH15-1 να RLH15 -9. Στο επίπεδο του γονιδιώματος, όλοι οι κλώνοι έχασαν τελείως την Υ χρωμοσώματα (Σχήμα 7Α). Αντί του καρυοτύπου xxyy γνωστό στους γονικής RL-1 κύτταρα, αυτοί οι κλώνοι έφεραν ένα καρυότυπο ΧΧ παρόμοια με εκείνη των μη εξαρτώμενου από ανδρογόνα παράγωγα κύτταρα C4-2 στη γενεαλογία LNCaP [21]. Παρά το γεγονός ότι αυτοί οι κλώνοι εξέφρασαν παρόμοια επίπεδα AR πρωτεΐνης προς τα γονικά RL-1 κύτταρα, μερικά (

δηλαδή

, κλώνοι 1, 6, 8, και 9) που εμφανίζονται σταθερά επίπεδα κατά τη διάρκεια της AR στέρηση ανδρογόνου (Σχήμα 7Β), υποδηλώνουν έλλειψης ευαισθησίας στα ανδρογόνα. Είναι σημαντικό, όλες αυτές οι κλώνοι εξέφρασαν αξιοσημείωτα αυξημένα επίπεδα του PSA, τα περισσότερα από τα οποία ήταν μόλις μειωθεί κατά στέρηση ανδρογόνου (Σχήμα 7C), υποδεικνύοντας ανεξαρτησία ανδρογόνων. Σε δοκιμασίες κυτταρικού πολλαπλασιασμού, όλοι οι κλώνοι έδειξαν σημαντικά αυξημένους ρυθμούς ανάπτυξης σε σύγκριση με τα πατρικά RL-1 κύτταρα, ενώ στέρηση ανδρογόνου ανέστειλε μόνο εν μέρει την ανάπτυξη αυτών των κλώνων (Εικόνα 7D). Αυξημένο επίπεδο AR, η παραγωγή του PSA και ο ρυθμός πολλαπλασιασμού, μαζί με την έλλειψη ευαισθησίας για να στέρησης ανδρογόνων, συνδέονται εν γένει με κακοήθη κατάσταση. Φάνηκε ότι το παράγωγο κλώνοι είχαν αποκτήσει επιπλέον κακοήθη χαρακτηριστικά.

γενοτυπικών και φαινοτυπικών παραμέτρων των πρώτων 9 κλώνων των υβριδίων σύντηξης RL-1 και HPS-15 συγκρίθηκαν με εκείνες των πρώτων 12 κλώνων από κλωνοποίηση έλεγχο . Σε σύγκριση με RL-1 κλώνων, όλα τα παράγωγα κλώνοι έχασαν Υ χρωμοσώματα (Α έναντι Β). Εντοπίστηκε με κηλίδωση Western, ορισμένα από τα παράγωγα κλώνων έδειξε επίμονη έκφραση AR ακόμη και κάτω από ανδρογόνο deprivaton (C έναντι D). Σε αυτές τις μελέτες, τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν για 48 ώρες σε μέσο καλλιέργειας κανονικό (C), ανδρογόνων μέσο στέρηση (-), και μέσο στέρησης ανδρογόνων που περιέχει 5 ηΜ R1881 (+). Τα παράγωγα κλώνοι ανιχνεύθηκαν να εκφράζουν αυξημένα επίπεδα του PSA, ακόμη και κατά τη διάρκεια στέρηση ανδρογόνου (Ε έναντι F). Όταν ρυθμός ανάπτυξης προσδιορίστηκε με μετατροπή ΜΤΤ, οι κλώνοι που προέρχονται από τη σύντηξη του καρκίνου-στρωματικών εμφάνισε επιταχυνόμενη ανάπτυξη σε ανδρογόνα ανεξάρτητο τρόπο (G έναντι H). Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή των προσδιορισμών εις τριπλούν. Για όλα τα σημεία δεδομένων, η τυπική απόκλιση ήταν μικρότερη από 5% του μέσου όρου και δεν φαίνεται.

Η

Μια παρόμοια μελέτη διεξήχθη με την μονοκύτταρους RL-1 κλώνους που απομονώθηκαν από μια παράλληλη αποικία ελέγχου δοκιμασία σχηματισμού (Πίνακας 1). Εξετάστηκαν οι πρώτοι 12 κλώνοι. Κανένας από τους κλώνους αυτούς έχασαν χρωμοσώματα Υ (Σχήμα 7Ε), και όχι σταθερό επίπεδο AR ανιχνεύθηκε μετά στέρηση ανδρογόνου (Σχήμα 7F). Όλες αυτές οι κλώνοι που εμφανίζονται εξαρτώμενων από ανδρογόνα παραγωγή PSA (Εικόνα 7G) και την ανάπτυξη (Σχήμα 7Η). Τα αποτελέσματα από αυτή τη μελέτη ελέγχου πρότεινε ότι η ανάπτυξη των ανδρογόνων ανεξαρτησία των παραγώγων κλώνων από καρκίνο στρωματικά υβριδίων ήταν το αποτέλεσμα του καρκίνου-στρωματικών σύντηξη, παρά κλωνική απόκλιση στα κύτταρα RL-1

per se

.

συζητήσεις

Αυτή η μελέτη εκτίθενται αυθόρμητη συγχώνευση μεταξύ καρκίνου του προστάτη και στρωματικά κύτταρα (Σχήματα 1, 2, και 3), και αποκάλυψε fusogenecity και τον αυθορμητισμό του ως εγγενή χαρακτηριστικά των καρκινικών κυττάρων. Ότι η παρούσα έκθεση περιγράφει την αυθόρμητη σύντηξης μεταξύ ενός RL-1 κλώνο και ένα ζευγάρι των στρωματικών κυττάρων του προστάτη, έχουμε παρατηρήσει συχνά καρκίνο-στρωματικών σύντηξης από την συν-καλλιέργεια των 5 επιπλέον κόκκινη φθορίζουσα κλώνοι LNCaP με 3 ζεύγη των στρωματικών κυττάρων του προστάτη γραμμές που καθιερώθηκαν και χαρακτηρίζεται στο παρελθόν [11]?