Abstract

βουτυρικό, ένα προϊόν ζύμωσης ινών στο κόλον, δρα ως αναστολέας αποακετυλάσης ιστόνης (HDACi) και επάγει την απόπτωση σε καρκίνο του παχέος εντέρου (CC) κύτταρα

in vitro

. Έχουμε αναφέρει ότι τα αποπτωτικά αποτελέσματα του βουτυρικού εξαρτώνται από την υπερενεργοποίηση του μονοπάτι Wnt /β-κατενίνης. Ωστόσο, η παρατεταμένη έκθεση του CC κυττάρων σε αυξανόμενες συγκεντρώσεις αποτελέσματα βουτυρικού στην απόκτηση αντοχής στο Wnt /β-catenin- και επαγωγής απόπτωσης επιδράσεις αυτού του παράγοντα, καθώς και διασταυρούμενης αντοχής σε δομικά διαφορετικές HDACis. Εδώ αναφέρουμε ότι ένας μηχανισμός με τον οποίο η αντίσταση HDACi τίθεται είναι μέσω της αύξησης της βήτα-κατενίνης-ανεξάρτητο (noncanonical) σηματοδότηση Wnt. Σε σύγκριση με HDACi ευαίσθητη HCT-116 κύτταρα CC, HDACi ανθεκτικά κύτταρα HCT-R εμφανίζουν υψηλότερα επίπεδα επιβίωσης ΑΚΤ /ΡΚΒ κυτταρικής σηματοδότησης, η οποία είναι εν μέρει προκαλείται από την WNT5A και του υποδοχέα του ROR2. Η επαγωγή σηματοδότησης ΑΚΤ με HDACis ανιχνεύεται επίσης σε άλλες CC κυτταρικές γραμμές, αν και σε μικρότερο βαθμό από ό, τι στα ανθεκτικά σε φάρμακο κύτταρα HCT-R. Οι παρατηρήσεις πρότεινε ότι η αποπτωτική επίδραση του βουτυρικού και άλλων HDACis σε CC κύτταρα μπορεί να αυξηθεί με αναστολείς της ρΑΚΤ. Σε συμφωνία με την υπόθεση, ο συνδυασμός MK2206, ενός αναστολέα ρΑΚΤ, και ένα HDACi (βουτυρικό ή LBH589) προκάλεσε υψηλότερες απόπτωση σε CC κυττάρων σε σύγκριση με κάθε παράγοντα μόνο. Η έκθεση σε δύο παράγοντες επίσης επαναευαισθητοποιούνται τα κύτταρα HCT-R στην απόπτωση. Τέλος, η έννοια της ταυτόχρονης επαγωγής κανονική Wnt δραστηριότητα και την καταστολή της σηματοδότησης AKT μεταφράστηκε σε ένα συνδυασμό παραγόντων διατροφής που προέρχονται. Διατροφή προερχόμενο ρΑΚΤ αναστολείς (phethyl εστέρα καφεϊκό οξύ, σουλφοραφάνη, dilallyl τρισουλφιδίου) κατέστειλε τις βουτυρικό επαγόμενη επίπεδα ρΑΚΤ, και αύξησε τους αποπτωτικά αποτελέσματα του βουτυρικού τόσο ευαίσθητα σε φάρμακο και ανθεκτικών σε φάρμακο CC κύτταρα.

Τα ευρήματά μας μπορεί να μεταφραστεί σε (α) θεραπεία CC χρησιμοποιεί συνδυασμούς συνθετικών HDACis και αναστολείς του ρΑΚΤ, καθώς και (β) πρόληψη CC βασίζεται δίαιτες που οδηγούν σε επαρκείς ποσότητες αναστολέων βουτυρικού και ρΑΚΤ.

Citation : Bordonaro M, Tewari S, Cicco CE, Atamna W, Lazarova DL (2011) ένα διακόπτη από την Canonical για να Noncanonical σηματοδότηση Wnt Παρεμβαίνει αντοχή στα φάρμακα για τον καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα. PLoS ONE 6 (11): e27308. doi: 10.1371 /journal.pone.0027308

Επιμέλεια: Cara Gottardi, Northwestern University Feinberg School of Medicine, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 5 Ιουλίου 2011? Αποδεκτές: 13, Οκτώβρη του 2011? Δημοσιεύθηκε: 3 Νοεμβρίου 2011

Copyright: © 2011 Bordonaro et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Νταρίνα Λαζάροβα υποστηρίζεται από το ΝΙΗ /NCI επιχορήγησης # 1R15CA152852-01 και θεσμικών κεφαλαίων από την Κοινοπολιτεία Ιατρικό Κολέγιο (Scratnon, PA). Michael Bordonaro υποστηρίζεται από AICR επιχορήγηση # 09A002, ΝΙΗ /NCI-ΝΙϋϋΚ # 1R15CA149589-01 και θεσμικών κεφαλαίων από την Κοινοπολιτεία Ιατρικό Κολέγιο (Scratnon, PA). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

βήτα-κατενίνη – εξαρτώμενη (κανονικός) σηματοδότηση Wnt αρχίζει με την δέσμευση του Wnt συνδέτες για υποδοχείς κυτταρικής επιφάνειας τους, και αυτή η σύνδεση πυροδοτεί μια αλληλουχία από ενδοκυτταρικά συμβάντα που οδηγούν στην συσσώρευση του Ser-37 /Thr- 41 αποφωσφορυλιώθηκε βήτα-κατενίνης. Η αποφωσφορυλιωμένη βήτα-κατενίνης είναι μεταγραφικά ενεργή, και σχηματίζει σύμπλοκα με πρωτεΐνες LEF /TCF να ελέγχουν την έκφραση εκατοντάδων γονιδίων [1] – [3]. Η συστατική ενεργοποίηση του σηματοδότηση Wnt λόγω μεταλλάξεων στα συστατικά, APC ή /και βήτα-κατενίνης, προωθεί την ογκογένεση του παχέος εντέρου [4] – [7], και τέτοιες μεταλλάξεις είναι χαρακτηριστικές της πλειονότητας των καρκίνων του παχέος εντέρου (CC). Έχουμε παρατηρήσει ότι τα κύτταρα CC με μεταλλάξεις σε συστατικά της κανονικής σηματοδότηση Wnt υπερ-επάγουν αυτό το μονοπάτι με την παρουσία αναστολέων αποακετυλάσης ιστόνης (HDACis), όπως το βουτυρικό (ένα προϊόν ζύμωσης ινών στο κόλον), SAHA, MS275, και τριχοστατίνη Α [8], [9]. Αυτές HDACis επάγουν απόπτωση σε CC κύτταρα και τα αποπτωτικά επίπεδα εξαρτώνται από την πολλαπλή μεταβολή σε κανονική Wnt δραστηριότητας: CC κύτταρα που εμφανίζουν χαμηλή επαγωγή σηματοδότηση Wnt /κατενίνης με την παρουσία HDACis είναι σχετικά ανθεκτικά στα αποπτωτικά αποτελέσματα των παραγόντων? Ωστόσο, τα κύτταρα που υποβάλλονται σε σημαντική ενεργοποίηση των κανονικών σηματοδότηση Wnt είναι πολύ ευαίσθητα σε απόπτωση [8]. Έχουμε αποδείξει ότι η αύξηση της δραστηριότητας /κατενίνης Wnt σε βουτυρικό επεξεργασμένα CC κύτταρα προηγείται της αποπτωτικό εκδήλωση από (α) την αναστολή της απόπτωσης από ένα γενικό αναστολέα κασπάσης δεν καταργεί την αύξηση των Wnt δραστηριότητα /κατενίνης (αδημοσίευτα δεδομένα), και (β) κυτταρομετρία ροής-ταξινομημένο κυττάρων κλάσματα με υψηλή κανονική σηματοδότηση Wnt αποτελούνται από δύο ζουν και αποπτωτικά κύτταρα? Ωστόσο, εάν η απόπτωση ήταν μια προϋπόθεση για την επαγωγή της δραστηριότητας Wnt, όλα τα κύτταρα με υψηλή δραστηριότητα Wnt θα έπρεπε να ήταν αποπτωτικά [8]. Η άμεση σχέση μεταξύ της πλάσια επαγωγή του Wnt δραστηριότητα /κατενίνης καθώς και ο βαθμός απόπτωσης παρατηρήθηκε σε αναλύσεις των δέκα ανθρώπινες κυτταρικές σειρές CC εκτίθεται σε βουτυρικό, και αυτή η σχέση είναι αιτιολογικός δεδομένου ότι: (α) κύτταρα που εκφράζουν επαγώγιμο κυρίαρχο αρνητικό TCF4, η οποία καταστέλλει σηματοδότηση Wnt /κατενίνης, εμφανίζουν μειωμένη απόπτωση παρουσία βουτυρικού [8], και (β) κυτταρομετρία ροής-διαλεγμένα κλάσματα κυττάρου με υψηλή κανονική Wnt δραστηριότητα έχουν υψηλότερη αναλογία αποπτωτικών να ζήσουν κυττάρων από κυτταρικά κλάσματα με χαμηλά επίπεδα του κανονικού Wnt δραστηριότητα [8]. Το εύρημα ότι υπερ-ενεργοποίηση των Wnt /β-κατενίνης αποτελέσματα σηματοδότηση σε υψηλά επίπεδα απόπτωσης [8], [9] είναι συνεπές με τις αναφορές που διπλώνουν μεταβολές στις οδούς σηματοδότησης, και όχι απόλυτα επίπεδα σηματοδότησης, προκαλούν σημαντική φυσιολογική απόκριση από κύτταρα [10] – [12]

Μέσω αναλύσεων των δέκα ανθρώπινης CC κυτταρικές γραμμές, έχουμε βρει ότι HCT-116 κύτταρα ανταποκρίνονται σε βουτυρικό και άλλα HDACis με υπερ-επαγωγή /κατενίνης σηματοδότησης και τα υψηλά επίπεδα Wnt. της απόπτωσης [8]. Ωστόσο, με τη σταδιακή έκθεση των HCT-116 κυττάρων σε αυξανόμενες συγκεντρώσεις βουτυρικού, εμείς προέρχεται βουτυρικό-ανθεκτικά κύτταρα HCT-R. Αυτά τα κύτταρα αναπτύσσονται σε παρουσία 5 mM βουτυρικό, μια συγκέντρωση η οποία επάγει υψηλά επίπεδα απόπτωσης στα γονικά κύτταρα HCT-116 [9]. ΗΟΤ-R κύτταρα είναι επίσης διασταυρούμενη αντοχή σε δομικά διαφορετικές HDACis, όπως TSA, MS-275, SAHA, και LBH589 [9]. Εφ’όσον διαπιστώσαμε ότι (1) η αποπτωτική έκβαση σε CC κύτταρα εξαρτάται από την επαγωγή του κανονικού Wnt δραστηριότητα [8], και (2) το υπερ-ενεργοποίηση των κανονικών σηματοδότηση Wnt σε βουτυρικό επεξεργασμένα CC κυττάρων είναι εν μέρει ξεκινήσει σε το επίπεδο συνδετήρα-υποδοχέα [9], θέσαμε ότι το φάρμακο ευαίσθητη και ανθεκτικά σε φάρμακο CC κύτταρα διαφέρουν στην έκφραση του WNT προσδέματα, υποδοχείς, και /ή θετικών και αρνητικών ρυθμιστών της σηματοδότηση Wnt /κατενίνης στο επίπεδο συνδετήρα-υποδοχέα [8], [9]. Στην παρούσα έκθεση ερευνήσαμε τις δυνατότητες αυτές, και διαπίστωσε ότι CC κύτταρα επιβιώνουν έκθεση σε βουτυρικό ή άλλες HDACis μειώνοντας την κανονική σηματοδότηση Wnt και την αύξηση της β-κατενίνης. – Ανεξάρτητο (noncanonical) σηματοδότηση Wnt

Αποτελέσματα

Αυξημένη έκφραση των μεσολαβητών της noncanonical σηματοδότηση Wnt σε HDACi-ανθεκτικά κύτταρα CC

Έχουμε αναφερθεί στο παρελθόν ότι η HDACi ανθεκτικά φαινοτύπου των κυττάρων HCT-R δεν οφείλεται σε μειωμένη ακετυλίωση των πρωτεϊνών ιστόνης, αλλά μάλλον στην ανικανότητα των κυττάρων σε υπερ-επάγει κανονική σηματοδότηση Wnt στην ίδια έκταση όπως και οι γονικές HDACi ευαίσθητα κύτταρα HCT-116 [9]. Τα ευρήματά μας πρότεινε ότι η καταστολή της δραστηριότητας /κατενίνης Wnt σε HDACi-ανθεκτικά κύτταρα οφείλεται στην αλλαγμένη έκφραση προσδεμάτων Wnt, τους υποδοχείς τους, και /ή ρυθμιστές σηματοδότηση Wnt στο επίπεδο συνδετήρα-υποδοχέα [9]. Για να διερευνήσουν αυτή την πιθανότητα, αναλύσαμε τα προφίλ έκφρασης των ψευδώς και βουτυρικού επεξεργασμένο HCT-116 (HDACi-ευαίσθητο) και HCT-R (HDACi ανθεκτικά) κύτταρα με Wnt-συγκεκριμένες συστοιχίες PCR (ΑΕ Biosciences). Οι αναλύσεις αποκάλυψαν ότι κατά την έκθεση σε 5 mM βουτυρικό, HCT-116 και HCT-R κυττάρων αυξήθηκε σημαντικά την έκφραση του

WNT5A

και

WNT11

mRNA (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται), και έχουμε επιβεβαιώσει αυτή η αλλαγή στην έκφραση στο επίπεδο πρωτεΐνης (Εικ. 1Α). Σε σύγκριση με HCT-116 κύτταρα, HCT-R κύτταρα εξέφρασαν υψηλότερα επίπεδα των δύο συνδετήρων, και η παρουσία εκκρινόμενης WNT5A και WNT11 σε μέσα καλλιέργειας ιστού εξαρτάται από CC κύτταρα επιβεβαιώθηκε (Εικ. 1Α)

(Α) Αντιπροσωπευτικά αναλύσεις στυπωμάτων western των CC κυττάρων και ρυθμισμένα μέσα τους μετά από έκθεση σε εικονικές θεραπεία (Μ) ή 5 mM βουτυρικού (Β) για 19 ώρες. (Β και C). Αποσιώπηση του

WNT5A

και

ROR2

έκφραση αυξάνει /κατενίνης μεταγραφική δραστικότητα Wnt του HCT-116 (Β) και κύτταρα HCT-R (C). Κύτταρα (50.000 /φρεάτιο) συν-επιμολύνθηκαν με ανταποκριτές για /κατενίνης μεταγραφική δραστηριότητα Wnt (TopFlash ή FopFlash, 50 ng /φρεάτιο), ρΡΙ_-ΤΚ ως έλεγχος για την αποτελεσματικότητα της επιμόλυνσης και του ελέγχου,

ROR2

, ή

WNT5A

siRNAs (10 pmol /φρεάτιο). Τα νουκλεϊκά οξέα εισήχθησαν στα κύτταρα μέσω μιας αντίστροφης πρωτόκολλο διαμόλυνσης με Lipofectamine 2000 σε πλάκες 96 φρεατίων. Στις 31 ώρες μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα εκτέθηκαν για 20 ώρες για να κοροϊδεύει (m) ή 5 mM βουτυρικού (β) θεραπεία. Wnt μεταγραφική δραστηριότητα υπολογίστηκε ως ο λόγος της δραστηριότητας της TopFlash (με θέσεις πρόσδεσης άγριου τύπου Λεφ /τρισεκατομμυρίων κυβικών μέτρων) και FopFlash (με μεταλλαγμένες θέσεις πρόσδεσης Λεφ /τρισεκατομμυρίων κυβικών μέτρων). Κάθε διαμόλυνση διεξήχθη εις διπλούν φρεάτια? δεδομένα αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή από τα αποτελέσματα τριών πειραμάτων. (ΡΕ). Η υπερέκφραση του WNT5A καταστέλλει κανονική μεταγραφική δραστηριότητα Wnt των HCT-116 κυττάρων. Η συν-επιμόλυνση των HCT-116 κύτταρα (50000 /φρεάτιο) με την Wnt ρεπόρτερ δραστηριότητα TopFlash ή FopFlash (50 ng ανά φρεάτιο), και pcDNANeo3.1 ή WNT5A εκφράζουν κατασκεύασμα (150 ng ανά φρεάτιο) διεξάγεται μέσω μιας αντίστροφης διαμόλυνση με Lipofectamine (0,7 μl /φρεάτιο) σε πλάκες 96 φρεατίων. Μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα εκτέθηκαν σε εικονικές θεραπεία (m) ή 5 mM βουτυρικού (β) για 20 ώρες. Κάθε διαμόλυνση διεξήχθη εις διπλούν φρεάτια? δεδομένα αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή από τα αποτελέσματα τουλάχιστον τριών πειραμάτων. (Ε) Καταστολή

ROR

2 έκφραση αυξάνει την ευαισθησία των HDACi-ανθεκτικά κύτταρα HCT-R στην ανάπτυξη-κατασταλτικό αποτέλεσμα του βουτυρικού. κύτταρα HCT-R (10

6) έχουν nucleofected με 175 pmol του

ROR2

(Invitrogen) ή τον έλεγχο siRNA, και 500.000 κύτταρα επιστρώθηκαν ανά φρεάτιο σε πλάκα 6 φρεατίων. Σε 24 ώρες, τα κύτταρα εκτέθηκαν σε εικονικές θεραπεία (m) ή 5 mM βουτυρικού (β) για 17 ώρες. Στις 48 ώρες μετά τη nucleofection, τα κύτταρα επιστρώθηκαν στα 100 ή 200 ανά βοθρίο εις τριπλούν. Η επί τοις εκατό κλωνική ανάπτυξης υπολογίστηκε ως ο αριθμός των αποικιών που προκύπτουν από ένα μόνο κύτταρο εναιώρημα 100 κυττάρων. Το πείραμα επαναλήφθηκε τρεις φορές και τα αποτελέσματα είναι ο μέσος όρος από τα δεδομένα των τριών πειραμάτων. Οι στατιστικά σημαντικές διαφορές που παρατηρούνται από τα αστέρια

Η

Ανάλογα με το πλαίσιο υποδοχέα, WNT5A και WNT11 προκαλέσει είτε κανονική ή noncanonical Wnt σηματοδότηση [13] – [17].. Από WNT5A επάγει noncanonical Wnt δραστηριότητα με την παρουσία του υποδοχέα ROR2, αναλύσαμε την έκφραση της ROR2 στις δύο κυτταρικές σειρές CC. Οι αναλύσεις στυπώματος Western αποκάλυψαν ότι και οι δύο τύποι κυττάρων εκφράζεται ROR2? Ωστόσο, HCT-R κύτταρα εμφάνισαν υψηλότερα επίπεδα από τα ROR2 HDACi-ευαίσθητα κύτταρα HCT-116 (Εικ. 1Α). Ως εκ τούτου, είναι πιθανό ότι WNT5A λειτουργεί ως noncanonical συνδέτη σε κύτταρα βουτυρικό-θεραπεία, και ότι τα κύτταρα HCT-R εμφανίζουν υψηλότερα επίπεδα noncanonical σηματοδότησης Wnt από HCT-116 κύτταρα.

Για να εξακριβώσει τα αποτελέσματα του WNT5A και ROR2 για Wnt δραστηριότητα, είμαστε συν-επιμολυσμένα κύτταρα HCT-116 και HCT-R με μεταγραφική δημοσιογράφους για τη σηματοδότηση Wnt /β-κατενίνης (TopFlash ή FopFlash) και τα siRNA να

WNT5A

ή

ROR2

. Η μειωμένη έκφραση του WNT5A και ROR2 σε HCT-116 κύτταρα αυξήθηκε Wnt /β-κατενίνης μεταγραφική δραστικότητα κατά στατιστικώς σημαντικό τρόπο (Εικ. 1Β). Βουτυρικό επεξεργασμένου HCT 116-κυττάρων με κατασταλεί

ROR2

και

WNT5A

έκφραση αυξημένα επίπεδα τους κανονικών δραστηριοτήτων Wnt /κατενίνης στα 233,0 ± 19,8 και 161,0 ± 32,0 σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου-επιμολυσμένα ( 94,8 ± 10,8), P & lt? 0,05, σε ψευδο-κατεργασμένων κυττάρων ΗΟΤ-R, η καταστολή του

ROR2

και

WNT5A

έκφραση δεν μετέβαλε σημαντικά Wnt μεταγραφικά επίπεδα σε σύγκριση με εκείνα στα κύτταρα επιμολυσμένα με siRNA ελέγχου (17,4 ± 4,6 και 12,8 ± 1,8, σε σύγκριση με 15,3 ± 3,7 σε κύτταρα ελέγχου, Ρ & gt? 0,05) (Σχήμα 1C.). Ωστόσο, σε βουτυρικό-επεξεργασμένα κύτταρα HCT-R, η καταστολή της

ROR2

και

WNT5A

έκφραση οδήγησε σε σημαντικά υψηλότερα επίπεδα κανονικών μεταγραφική δραστικότητα Wnt, σε σύγκριση με κύτταρα επιμολυσμένα με έλεγχο siRNA (60,2 ± 12,5 και 53,1 ± 8,4 έναντι 31,2 ± 7,9 σε κύτταρα ελέγχου, Ρ & lt?. 0,05) (Σχήμα 1C). Ως εκ τούτου, WNT5A και του υποδοχέα της ROR2 εξουδετερώσει την επαγωγή της δραστηριότητας /β-κατενίνης Wnt σε βουτυρικό επεξεργασμένο HCT-116 και HCT-R κύτταρα.

Το συμπέρασμα αυτό υποστηρίζεται από τα αποτελέσματα από την υπερέκφραση του WNT5A σε HCT -116 κύτταρα. HCT-116 κύτταρα, τα οποία εκφράζουν χαμηλότερα επίπεδα από ότι τα κύτταρα WNT5A HCT-R (Εικ. 1Α), συν-επιμολύνθηκαν με τα ρεπόρτερ Wnt /β-κατενίνης και ένα άδειο φορέα, ή φορέα έκφρασης WNT5A. Τα κύτταρα συν-επιμολυσμένα με ένα άδειο φορέα αυξημένη δραστικότητα Wnt /β-κατενίνης τους (TopFlash /FopFlash) από 5,2 ± 1,1 να 62,2 ± 9,3? λαμβάνοντας υπόψη ότι τα κύτταρα που υπερεκφράζουν WNT5A αυξημένη δραστηριότητα τους /β-κατενίνης Wnt από 3,7 ± 0,1 έως 13,2 ± 0,3 (Εικ. 1D). Η διαφορά στην Wnt /β-κατενίνης μεταγραφική δραστηριότητα μεταξύ ελέγχου-και WNT5A επιμολυσμένα κύτταρα με την παρουσία βουτυρικού ήταν στατιστικά σημαντική (Ρ & lt? 0,05).

Δεδομένου ότι η αποσιώπηση του

ROR

2 έκφραση σε κύτταρα ΗΟΤ-R οδήγησε σε υψηλότερα επίπεδα σηματοδότηση Wnt /β-κατενίνης, και έχουμε παρατηρήσει προηγουμένως ότι η υψηλότερη επαγωγή του Wnt /β-κατενίνης σε CC κύτταρα αντιστοιχεί σε υψηλότερη ευαισθησία των κυττάρων με τα αποτελέσματα της βουτυρικού [8 ], αναλύσαμε την κλωνική ανάπτυξη των HCT-R κύτταρα nucleofected με έλεγχο siRNA ή

ROR

2 siRNA. Σε περίπτωση απουσίας του βουτυρικού, του ελέγχου siRNA- και

ROR

2 siRNA επιμολυσμένα κύτταρα εμφάνισαν μια ελαφρά, αλλά στατιστικά σημαντική, διαφορά στην κλωνική ανάπτυξη (75,3 ± 1,4% έναντι 67,6 ± 3,4%, Ρ & lt? 0,05) . Με την παρουσία του βουτυρικού, η διαφορά στην κλωνική ικανότητα ανάπτυξης ήταν πιο έντονη? ελέγχου-nucleofected κύτταρα ΗΟΤ-R παρουσίασαν κλωνική ανάπτυξη των 71,3 ± 3,8% και

ROR

2 siRNA-nucleofected κύτταρα παρουσίασαν 51,4 ± 5,5% της κλωνική ανάπτυξη (Εικ. 1 Ε).

Πρόκληση η οδός επιβίωση ΑΚΤ /ΡΚΒ από WNT5A και ROR2 σε CC κύτταρα

η αύξηση στην έκφραση WNT5A σε βουτυρικό επεξεργασμένο HCT-116 και HCT-R κύτταρα ζητηθεί μια αναζήτηση για καθοδικούς τελεστές του συνδέτη. Αρκετές noncanonical WNT5A επαγόμενη οδοί έχουν αναγνωριστεί, και τουλάχιστον δύο από αυτά είναι ROR2 εξαρτώμενη: η φωσφατιδυλινοσιτόλη-3 κινάση (ΡΙ3-Κ) /σηματοδότηση ΑΚΤ προκλήθηκε από την φωσφορυλίωση της κινάσης ΑΚΤ [18] – [20], και ο μονοπάτι σηματοδότησης JNK [21] – [23]. Σε συμφωνία με αυτές τις αναφορές, παρατηρήσαμε ότι Serine473-φωσφορυλιωμένη ΑΚΤ (ρΑΚΤ) εκφράζεται σε υψηλότερα επίπεδα σε HDACi-ανθεκτικά κύτταρα ΗΟΤ-R σε σύγκριση με HCT-116 κύτταρα, και στις δύο κυτταρικές σειρές, η έκθεση σε βουτυρικό αύξησε τα επίπεδα του ρΑΚΤ ( Εικ. 2Α).

(Α) HDACi-ανθεκτικά κύτταρα ΗΟΤ-R εκφράζουν υψηλότερα επίπεδα ρΑΚΤ από HDACi-ευαίσθητα κύτταρα HCT-116. Τα κύτταρα επιστρώθηκαν σε πλάκες 6-φρεατίων σε 450.000 κύτταρα ανά φρεάτιο, και στις 24 ώρες εκτέθηκαν σε κοροϊδεύει (Μ) ή 5 mM βουτυρικού (Β) θεραπεία για 17 ώρες. Η συνολική πρωτεΐνη λύματα αναλύθηκαν με αναλύσεις western blot, και τα επίπεδα του Ser473-φωσφορυλιωμένη ΑΚΤ (ρΑΚΤ), ολική Akt (ΑΚΤ), και η ακτίνη ανιχνεύθηκαν όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. (Β) HCT-R κύτταρα είναι πιο ανθεκτικά στην 5-φθοριοουρακίλη (5-FU) απόπτωση που επάγεται από τη γονική HDACi-ευαίσθητων κυττάρων ΗΟΤ-116. Τα κύτταρα εκτέθηκαν σε 1.5 mM 5-FU για 24 ώρες, και αποπτωτικά δοκιμασίες διεξήχθησαν όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. Ποσοστό ζώντων κυττάρων υπολογίζεται διαιρώντας τον αριθμό των ζωντανών κυττάρων με τον ολικό αριθμό των κυττάρων που αναλύθηκαν. (Γ) Η σίγαση της έκφρασης ROR2 σε κύτταρα ΗΟΤ-R ελαττώνει τα επίπεδα Ser473-φωσφορυλιωμένου ΑΚΤ. Ένα εκατομμύριο κύτταρα nucleofected με έλεγχο ή

ROR

2 siRNAs (175 pmol, Invitrogen), και απλώνονται σε 500.000 ανά φρεάτιο σε τρυβλία 6 φρεατίων. Σε 24 ώρες μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα εκτέθηκαν σε κοροϊδεύει (Μ) ή 5 mM βουτυρικού (Β) για 19 ώρες. Σύνολο κυτταρολύματα αναλύθηκαν με western blot? ένα αντιπροσωπευτικό κηλίδα western δείχνεται. Το ραβδόγραμμα κάτω από την εικόνα κηλίδος Western αντιπροσωπεύει την ποσοτικοποίηση των ρΑΚΤ επίπεδα σε τρία ανεξάρτητα πειράματα με πυκνομετρία, η διαφορά μεταξύ των κυττάρων βουτυρικό αγωγή είναι στατιστικά σημαντική (Ρ & lt? 0,05), (Δ) .Overexpression ανασυνδυασμένης WNT5A σε HCT-116 κύτταρα οδηγεί σε αυξημένη ρΑΚΤ επίπεδα. HCT-116 κύτταρα επιμολύνθηκαν με ένα άδειο φορέα ή ένα φορέα έκφρασης WNT5A, και επιλέχθηκαν για σταθερή έκφραση αυτών των κατασκευασμάτων. Διπλά δείγματα αναλύθηκαν για επίπεδα έκφρασης των WNT5A και ρΑΚΤ όπως περιγράφεται παραπάνω? ένα αντιπροσωπευτικό κηλίδα western δείχνεται. Το ραβδόγραμμα υπό την κηλίδα western αντιπροσωπεύει την ποσοτικοποίηση των ρΑΚΤ σε τρία ανεξάρτητα πειράματα με πυκνομετρία, Ρ & lt? 0.05. (Ε) αντιπροσωπευτική ανάλυση western blot των SW620 κυττάρων ανθρώπινου CC και κυττάρων SW620R που αναπτύσσονται σε 3 mM βουτυρικού. Οι δύο κυτταρικές γραμμές εκτέθηκαν σε κοροϊδεύει (m) ή 5 mM βουτυρικού (β) θεραπεία για 17 ώρες και αναλύθηκε όπως στο Σχήμα 2Α. (ΦΆ). SW620 κύτταρα που εκφράζουν εξωγενή WNT5A έκθεμα κατέστειλε την επαγωγή της Wnt μεταγραφής /β-κατενίνης από βουτυρικό, P & lt? 0,05. Επιμόλυνση και αναλύσεις διεξήχθησαν όπως περιγράφεται στο Σχ. 1D.

Η

Από AKT /PKB είναι ένα μονοπάτι κυτταρικής επιβίωσης, εμείς αιτιολογημένη ότι τα υψηλά επίπεδα ρΑΚΤ σε κύτταρα HCT-R μπορεί να προστατεύσει τα κύτταρα όχι μόνο κατά την απόπτωση που επάγεται από HDACis, αλλά και εναντίον άλλων αποπτωτικά ερεθίσματα . Για να αξιολογηθεί αυτή η πιθανότητα, συγκρίναμε την απόκριση των κυττάρων HCT-R και HDACi ευαίσθητα αντίστοιχά τους, HCT-116 κύτταρα, σε 5-φθοριοουρακίλη (5-FU), μια ευρέως χρησιμοποιούμενη χημειοθεραπευτικό παράγοντα για CC. Η συγκέντρωση του 5-FU που απαιτείται για 50% αναστολή της ανάπτυξης έχει αναφερθεί για HCT-116 κύτταρα, και ανθεκτικά σε φάρμακο κυτταρικές σειρές που προέρχονται από HCT-116 κύτταρα, και είναι στην περιοχή από 0,09 mM έως 2,4 mM [24]? Ως εκ τούτου, αναλύσαμε την απόκριση των κυττάρων ΗΟΤ-116 και HCT-R σε 1.5 mM 5-FU (Σχ. 2Β). Θεραπεία της HCT-116 κυττάρων με 5-FU είχε σαν αποτέλεσμα σημαντική μείωση του αριθμού των ζωντανών κυττάρων από 86,7 ± 8,3 να 48,1 ± 8,0 (Ρ & lt? 0,05)? ότι, η ίδια η έκθεση των κυττάρων HCT-R δεν άλλαξε σημαντικά τον αριθμό των ζωντανών κυττάρων. Έτσι, ψευδο-κατεργασμένα κύτταρα παρουσίασαν 95,8 ± 2,1% ζωντανά κύτταρα, και 5-FU – επεξεργασμένα κύτταρα εμφάνισαν 91,6 ± 4,2% ζωντανά κύτταρα, P & gt?. 0.05 (Εικ. 2Β)

Η δυνατότητα για μια αιτιακή σχέση μεταξύ των αυξημένων επιπέδων της ρΑΚΤ και την έκφραση του WNT5A και ROR2 ελέγχθηκε μέσω γονιδιακή σίγηση και πειράματα γονίδιο υπερέκφραση. Αποσιώπηση του

ROR2

έκφραση σε κύτταρα ΗΟΤ-R με siRNA είχε ως αποτέλεσμα μια μέτρια μείωση στην ρΑΚΤ επίπεδα, και η διαφορά στα επίπεδα ρΑΚΤ ήταν στατιστικά σημαντική μόνο μεταξύ κυττάρων βουτυρικό αγωγή (Εικ. 2C), η υπερέκφραση WNT5A σε HCT-116 κύτταρα οδήγησε σε αυξημένα επίπεδα ρΑΚΤ, και η διαφορά ήταν επίσης στατιστικά σημαντική (Σχ. 2D).

Πρόσθετες μελέτες με τα καρκινικά κύτταρα ανθρώπινου κόλον SW620, και ο που προέρχονται από αυτά SW620R κύτταρα, που αναπτύσσονται σε 3 mM βουτυρικό, έδειξε ότι αυτά τα κύτταρα δεν εκφράζουν ανιχνεύσιμα επίπεδα ROR2 (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα)? Ωστόσο, εκφράζουν WNT5A, και η έκθεση σε βουτυρικό αυξάνει τα επίπεδα ρΑΚΤ (Σχ. 2Ε). Είναι ενδιαφέρον ότι, η εξωγενής έκφραση του WNT5A σε κύτταρα SW620 κατασταλεί Wnt /β-κατενίνης εξαρτώμενη μεταγραφή ακόμη και εν απουσία του ανιχνεύσιμη έκφραση ROR2: παρουσία βουτυρικού τα Wnt επίπεδα δραστηριότητας σε SW620 κύτταρα WNT5A εκφράζουν ήταν 271 ± 32, και η αυτά σε κύτταρα ελέγχου επιμολυσμένα ήταν 389 ± 35 (Σχ. 2F). Ως εκ τούτου, εκτός από ROR2, άλλοι υποδοχείς μπορεί να μεσολαβεί το σήμα WNT5A, και το κατάντη ενεργοποίηση της κινάσης ΑΚΤ.

Καταστολή της ρΑΚΤ επιπέδων αυξάνει την αποπτωτική απόκριση των κυττάρων CC να HDACis

Από ΑΚΤ σηματοδότηση είναι μια σημαντική διαδρομή κυτταρικής επιβίωσης, εμείς αιτιολογημένη ότι η καταστολή του στην CC κύτταρα που εκτίθενται σε HDACis θα αυξήσουν τις αποπτωτικά αποτελέσματα αυτών των παραγόντων. Χρησιμοποιήσαμε MK2206, η οποία είναι ένας αναστολέας της αλλοστερικής ΑΚΤ [25], και προσδιορίστηκε ότι στα 5 μΜ ο παράγοντας καταστέλλει ρΑΚΤ επίπεδα τόσο HCT-116 και τα κύτταρα HCT-R (σχ. 3Α). Για να προσδιοριστεί πως σηματοδότηση Wnt /β-κατενίνης επηρεάζεται από τον αναστολέα ΑΚΤ κινάσης MK2206 μόνο του ή σε συνδυασμό με ένα HDACi (βουτυρικό ή LBH589), αναλύσαμε τα επίπεδα μεταγραφικά ενεργή (αποφωσφορυλιωμένη) βήτα-κατενίνης σε HCT-116 κύτταρα σε αγωγή για 8 ή 17 ώρες (Σχ. 3Β). Σε 8 ώρες, HDACi ευαίσθητη HCT-116 κύτταρα δεν εμφανίζουν σημάδια απόπτωσης, όπως επιβεβαιώνεται από τη ροή αναλύσεις κυτταρομετρίας με αννεξίνη V (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα)? Ωστόσο, σε 17 ώρες απόπτωση έχει ήδη ανιχνευθεί και βήτα-κατενίνης διασπάται σε Ν- και Ο-άκρο από κασπάσες (βλέπε βέλος στο δεύτερο πάνελ του Σχ. 3Β). Ως εκ τούτου, οι αναλύσεις των μεταγραφικά ενεργά επίπεδα β-κατενίνης διεξήχθησαν στους 8 ώρες σε HCT-116 και τα κύτταρα HCT-R (Σχ. 3Β και 3C). Σε αμφότερες τις κυτταρικές γραμμές, MK2206 δεν είχε ως αποτέλεσμα σημαντικές αλλαγές στα επίπεδα της ενεργού β-κατενίνης σε σύγκριση με δείγματα που κατεργάζονται μόνο με ένα HDACi? Ωστόσο, τα επίπεδα του ρΑΚΤ κατεστάλησαν με MK2206 σε όλες τις θεραπείες (Σχ. 3D).

(Α) καταστολή των επιπέδων ρΑΚΤ σε CC κύτταρα από τον αναστολέα MK2206 αλλοστερική. Αντιπροσωπευτικά ανάλυση western blot των CC κυττάρων που εκτέθηκαν για 17 ώρες για να κοροϊδεύει (Μ), 5 mM βουτυρικού (Β), βουτυρικό και 1 μΜ MK2206 (MK1B), ή βουτυρικό και 5 μΜ MK2206 (MK5B). (Β) Τα επίπεδα σταθερής κατάστασης των μεταγραφικά ενεργή β-κατενίνης δεν μειώθηκε σε HCT-116 κύτταρα με συνδυασμένη θεραπεία με HDACi και MK2206. Τα κύτταρα εκτέθηκαν για 8 ή 17 ώρες για να mock θεραπεία (Μ), 5 mM βουτυρικού (Β), βουτυρικό και 5 μΜ MK2206 (BMK), 100 nm LBH589 (L), ή 100 nm LBH589 και 5 μΜ MK2206 (LMK). Σύνολο κυτταρικά λύματα αναλύθηκαν για επίπεδα σταθερής κατάστασης του συνόλου και Ser37 /Thr41 αποφωσφορυλιώθηκε βήτα-κατενίνης. Ανάλυση Εκπρόσωπος western blot παρουσιάζεται. (Γ) Active επίπεδα βήτα-κατενίνης σε HCT-R κύτταρα εκτίθενται για 8 ώρες να κοροϊδεύει (Μ), 5 mM βουτυρικού (Β), βουτυρικό και 5 μΜ MK2206 (BMK), 100 nm LBH589 (L), ή 100 nm LBH589 και 5 μΜ MK2206 (LMK). επίπεδα σε CC κύτταρα εκτέθηκαν για 17 ώρες να κοροϊδεύει (Μ) (D) Ανάλυση Αντιπροσωπευτικά western blot του Ser473-φωσφορυλιωμένου ΑΚΤ (ρΑΚΤ) και η συνολική ΑΚΤ (ΑΚΤ), 5 mM βουτυρικού (Β), βουτυρικό και 5 μΜ MK2206 (BMK) , 100 nm LBH589 (L), ή 100 nm LBH589 και 5 μΜ MK2206 (LMK). (Ε) Η επαγωγή της δραστικότητας μεταγραφικών /κατενίνης εξαρτώμενη Wnt (TopFlash /FopFlash) σε CC κύτταρα από ένα HDACi (βουτυρικό ή LBH589) δεν καταστέλλεται από έναν αναστολέα ρΑΚΤ. Τα κύτταρα nucleofected σε ένα εκατομμύριο με 1 μg πλασμιδίου (TopFlash ή FopFlash) και ρΡΙ_-ΤΚ, αραιώνεται, και επιστρώθηκαν σε 30.500 κύτταρα ανά φρεάτιο σε πλάκες 96 φρεατίων. Σε 24 ώρες μετά τη nucleofection, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία για 8 ώρες με mock (Μ), 5 mM βουτυρικού (Β), βουτυρικό και 5 μΜ MK2206 (BMK), 100 nm LBH589 (L), ή 100 nm LBH589 και 5 μΜ MK2206 (LMK). Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν τον μέσο όρο από τα αποτελέσματα τουλάχιστον τριών πειραμάτων. Οι στατιστικά σημαντικές διαφορές που παρατηρούνται από ένα αστέρι. επίπεδα (F) Τα αποπτωτικά σε HCT-116 και τα κύτταρα HCT-R που εκτίθενται σε HDACis και ενός αναστολέα ρΑΚΤ. Τα κύτταρα εκτέθηκαν για 28 ώρες σε: ψευδο θεραπεία (Μ), 5 mM βουτυρικού (Β), βουτυρικό και 5 μΜ MK2206 (BMK), 100 nm LBH589 (L), ή 100 nm LBH589 και 5 μΜ MK2206 (LMK). Ποσοστό απόπτωση και νέκρωση υπολογίστηκε διαιρώντας τον αριθμό των αποπτωτικών και νεκρωτικών κυττάρων από το συνολικό αριθμό των κυττάρων που αναλύθηκαν. Κάθε πείραμα είχε τριπλούν δείγματα ανά θεραπεία? δεδομένα αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή τριών πειραμάτων. Οι στατιστικά σημαντικές διαφορές που παρατηρούνται από ένα αστέρι. (G, H) SW48 ανθρώπινα κύτταρα ΤΚ με άγριου τύπου KRAS είναι τόσο ευαίσθητο όσο HCT-116 κυττάρων με μεταλλαγμένο KRAS με τη συνδυασμένη θεραπεία με ένα HDACi και ενός αναστολέα ρΑΚΤ. κύτταρα SW48 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία και αναλύθηκαν όπως περιγράφεται στο Figs.3D και 3F. Αντιπροσωπευτικές κηλίδες Western και αποπτωτικά δεδομένα, που αντιπροσωπεύει το μέσο όρο τριών πειραμάτων, παρουσιάζονται. Οι στατιστικά σημαντικές διαφορές που παρατηρούνται από ένα αστέρι.

Η

Για να μετρηθεί άμεσα Wnt μεταγραφής /β-κατενίνης στα κύτταρα που εκτίθενται σε έναν αναστολέα ρΑΚΤ ή /και HDACis, εμείς επιμολυσμένα κύτταρα με έναν δημοσιογράφο για Wnt /β- δραστηριότητα κατενίνης (TopFlash) ή με έναν δημοσιογράφο ελέγχου (FopFlash) (Εικ. 3Ε). Ο /κατενίνης μεταγραφική δραστηριότητα Wnt (TopFlash /FopFlash) σε HCT-116 κύτταρα που εκτίθενται σε κοροϊδεύει ή θεραπεία MK2206 ήταν 3.9 ± 0.4 και 2.8 ± 0.8, αντίστοιχα (P & gt? 0,05). Σε HCT-116 κύτταρα που εκτίθενται σε βουτυρικό, ή βουτυρικό και MK2206, η δραστηριότητα αυξήθηκε σε 8,73 ± 2,9 και 12,8 ± 1,3 (για τις δύο θεραπείες, Ρ & gt? 0,05). Τέλος, όταν HCT-116 κύτταρα εκτέθηκαν σε LBH589 ή LBH589 και MK2206, η δραστικότητα /βήτα-κατενίνης Wnt αυξήθηκε σε 7,1 ± 0,6 και 11,3 ± 2,1, αντιστοίχως, (Ρ & lt? 0,05). Στα κύτταρα HCT-R, η έκθεση σε χλευάσουν, MK2206, βουτυρικό, βουτυρικό και MK2206, LBH589, ή LBH589 και MK2206 ως αποτέλεσμα της δραστηριότητας /β-κατενίνης Wnt 6,1 ± 0,9, 4,6 ± 1,2, 11,7 ± 2,8, 16,0 ± 2,9, 15,2 ± 0,5, και 17,2 ± 1,2, αντιστοίχως, (Ρ & gt? 0,05 για συνδυαστική θεραπείες σε σχέση με τις θεραπείες με HDACi μόνο). Έτσι, MK2206 δεν καταστέλλει την προς τα πάνω ρύθμιση της δραστηριότητας της μεταγραφής Wnt από HDACis.

Το συνδυασμένο αποτέλεσμα των HDACis και MK2206 στην απόπτωση μετρήθηκε μέσω αναλύσεων κυτταρομετρίας ροής. Αν και δεν υπήρχε στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ των αποπτωτικών επίπεδα σε ψευδο και MK2206-επεξεργασμένα κύτταρα, η προσθήκη MK2206 να βουτυρικό ή LBH589 οδήγησε σε στατιστικά σημαντική αύξηση στην απόπτωση σε σύγκριση με τη θεραπεία με κάθε μόνος HDACi (Σχ. 3F). Έτσι, HCT-116 κύτταρα που εκτίθενται σε κοροϊδεύει ή MK2206 εμφάνισαν αποπτωτική επίπεδα 12,8 ± 2,2% και 14,3 ± 3,5%, αντίστοιχα, (Ρ & lt? 0,05). Θεραπεία της HCT-116 κυττάρων με βουτυρικό, ή βουτυρικό και MK2206 οδήγησε σε 44,2 ± 1,5% και 64,2 ± 4,4% της απόπτωσης, αντίστοιχα (Ρ & lt? 0,05). Με την παρουσία του LBH589 ή LBH589 και MK2206, HCT-116 κύτταρα παρουσίασαν 55,7 ± 6,9% και 73,5 ± 4,7% της απόπτωσης, αντίστοιχα (Ρ & lt? 0,05). Σε κύτταρα HCT-R, η έκθεση σε κοροϊδεύει ή θεραπεία MK2206 οδήγησε σε 11,4 ± 3,6% και 11,0 ± 4,0% απόπτωση, αντίστοιχα (P & gt? 0,05)? έκθεση σε βουτυρικό, ή βουτυρικό και MK2206 οδήγησε σε 14,4 ± 3,6% και 25,2 ± 4,1% της απόπτωσης (Ρ & lt? 0,05), και η έκθεση σε LBH589, ή ο συνδυασμός των LBH589 και MK2206 οδήγησαν σε 31,6 ± 5,3 και 45,7 ± 4,4% της απόπτωσης ( P & lt?. 0.05)

προς το παρόν, ο αναστολέας ρΑΚΤ MK2206 είναι σε μια κλινική δοκιμή για καρκίνους του παχέος εντέρου με άγριου τύπου KRAS? Ωστόσο, ο συνδυασμός ενός HDACi και ενός αναστολέα κινάσης ρΑΚΤ ήταν ιδιαίτερα αποτελεσματική στην επαγωγή της απόπτωσης στην κυτταρική σειρά HCT-116, το οποίο είναι

KRAS

μεταλλαγμένου, και σε εκ νέου ευαισθητοποίηση των κυττάρων ΗΟΤ-R με την αποπτωτική επιδράσεις της HDACis. Για τη σύγκριση της αποτελεσματικότητας του συνδυασμού των φαρμάκων σε CC κυττάρων με άγριου τύπου KRAS, αναλύσαμε την αποπτωτική απόκριση των ανθρώπινων κυττάρων καρκίνου του παχέος εντέρου κύτταρα SW48. κύτταρα SW48 ανταποκρίθηκαν στην συνδυασμό ενός HDACi και MK2206 με στατιστικά σημαντική αύξηση στην απόπτωση (Εικ. 3G): mock και θεραπείες MK2206 οδήγησε σε 16,6 ± 0,7% και 16,9 ± 0,7% της απόπτωσης, αντίστοιχα (Ρ & gt? 0,05). Η επεξεργασία των κυττάρων SW48 με βουτυρικό, ή βουτυρικό και MK2206 οδήγησε σε 49,7 ± 4,4 και 75,6 ± 1,2% της απόπτωσης, αντίστοιχα (Ρ & lt? 0,05), και η έκθεση σε LBH589, ή LBH589 και MK2206 οδήγησε σε 56,1 ± 6,3% και 78,3 ± 3,7% απόπτωση, αντίστοιχα (Ρ & lt? 0,05). Οι αναλύσεις στυπώματος Western επιβεβαίωσε ότι MK2206 κατέστειλε αξιόπιστα τις HDACi επαγόμενη επίπεδα ρΑΚΤ σε κύτταρα SW48 CC (Εικ. 3Η).

Δίαιτα προερχόμενο παράγοντες που μιμούνται τις επιδράσεις των συνθετικών HDACis και ρΑΚΤ αναστολείς

ότι ο συνδυασμός των συνθετικών HDACis και αναστολείς ρΑΚΤ θα μπορούσε να εφαρμοστεί στη θεραπευτική CC ή στην πρόληψη σε ασθενείς με αυξημένο κίνδυνο για CC (π.χ., ασθενείς με εκτομή CC ή /και χρόνιες IBD), δίαιτες που παρέχουν οι μεταβολίτες με HDAC- και ρΑΚΤ Ανασταλτικό λειτουργίες θα μπορούσε να γίνει μια προσέγγιση για την πρόληψη CC για το γενικό πληθυσμό. Δεδομένου ότι το βουτυρικό είναι το πιο ισχυρό δίαιτα προερχόμενο HDACi παράγεται στο κόλον [26], ένα CC-προληπτική δίαιτα θα πρέπει να περιέχει επαρκή επίπεδα ζυμώσιμων ινών. Για να βρείτε έναν αναστολέα ρΑΚΤ που μπορεί να προέρχεται από τη διατροφή, πραγματοποιήσαμε μια βιβλιογραφική έρευνα και βρήκε δημοσιεύσεις σε σουλφοραφάνη, φυσικό sphingadienes, το σκόρδο που προέρχονται διαλλύλιο τρισουλφιδίου (DATs), καφεϊκό φαιναιθυλ οξέος (CAPE, από πρόπολη μελισσών), κουρκουμίνη, και ρεσβερατρόλη, τα οποία αναστέλλουν την ρΑΚΤ επίπεδα σε διαφορετικούς τύπους κυττάρων [27] – [33]. Δοκιμάσαμε κάποιες από αυτές τις ενώσεις για την ικανότητά τους να καταστέλλουν τα επίπεδα του βουτυρικού επαγόμενης ρΑΚΤ σε CC κύτταρα, και βρήκαν ότι CAPE, DATs, και σουλφοραφάνη κατέστειλε την αύξηση των επιπέδων της κινάσης ρΑΚΤ σε HCT-116 κύτταρα βουτυρικό αγωγή, και μόνο CAPE και DATs ήταν ενεργά σε κύτταρα HCT-R (Εικ. 4Α). Από τις τρεις ενώσεις που εξετάστηκαν, CAPE ήταν πιο ισχυρή στην καταστολή των βουτυρικό επαγόμενη επίπεδα ρΑΚΤ στους δύο τύπους κυττάρων? Ωστόσο, δεν διεγείρουν απόπτωση σε οποιοδήποτε από αυτά τα κύτταρα από μόνη της (σχ. 4Β). Έτσι, σε HCT-116 κύτταρα, ψευδο έκθεση και επεξεργασία με 4 μg ανά ml CAPE κατέληξε σε 12,2 ± 3,1% και 11,9 ± 0,8% απόπτωση, αντίστοιχα? έκθεση σε βουτυρικό ή τον συνδυασμό βουτυρικού και CAPE οδήγησε σε 44,8 ± 1,8% και 78,4 ± 6,5% της απόπτωσης, αντίστοιχα (Ρ & lt? 0,05). Σε κύτταρα HCT-R, mock έκθεση, η θεραπεία με βουτυρικό, και θεραπεία με κάπα μόνος είχε σαν αποτέλεσμα 8,9 ± 1,2%, 12,6 ± 1,7%, και 10,9 ± 3,0% της απόπτωσης, αντίστοιχα (Ρ & gt? 0,05). Ωστόσο, όταν τα κύτταρα HCT-R έχουν εκτεθεί στον συνδυασμό CAPE και βουτυρικό, τα αποπτωτικά επίπεδα αυξήθηκαν κατά σχεδόν τρεις φορές, για να 30,6 ± 3,6% (Ρ & lt? 0,05) (Εικόνα 4Β).. Μεταγενέστερες αναλύσεις αποκάλυψαν ότι σε βουτυρικό-επεξεργασμένα κύτταρα HCT-R, CAPE καταστέλλει τα φωσφορυλιωμένα επίπεδα της ρ55 υπομονάδας της φωσφατιδυλο-ινοσιτόλη-3 κινάση (ΡΙ3Κ), ένα σημαντικό ανάντη ενεργοποιητή της ΑΚΤ κινάσης (Εικ. 4C). Ωστόσο, η ακριβής βήμα στο οποίο λαμβάνει χώρα αυτή η καταστολή δεν είναι γνωστή, και είναι το επίκεντρο της μελλοντικής έρευνας. Δεν ανιχνεύθηκαν συνεπής καταστολή των επιπέδων φωσφο-ρ55 ΡΙ3Κ σε HCT-116 κύτταρα που εκτίθενται σε CAPE και βουτυρικό (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

(Α) Διατροφή προερχόμενο ενώσεις καταστέλλουν βουτυρικό επαγόμενη ρΑΚΤ επίπεδα σε CC κύτταρα. Αντιπροσωπευτικά Western Blot των κυττάρων που εκτέθηκαν για 14 ώρες για να mock θεραπεία (Μ), 5 mM βουτυρικού (Β), 5 mM βουτυρικού και 4 μg /ml CAPE (BC), 5 mM βουτυρικού και 20 μΜ σουλφοραφάνη (BS), 5 mM βουτυρικού και 40 μΜ DATs (BD). Ανίχνευση ρΑΚΤ, ολική Akt (ΑΚΤ), και η ακτίνη διεξήχθη με συνολικών κυττάρων προϊόντα λύσης.