Αφηρημένο

Yuanhuacine (YC), ένας daphnane διτερπενικών από τα άνθη της

Δάφνη genkwa

, επέδειξε μία δυνητική δραστικότητα ανασταλτική της ανάπτυξης έναντι κυττάρων ανθρώπινου μη μικροκυτταρικού καρκίνου του πνεύμονα (NSCLC). YC κατέστειλε επίσης την εισβολή και τη μετανάστευση των κυττάρων καρκίνου του πνεύμονα. Ωστόσο, οι ακριβείς μοριακοί μηχανισμοί παραμένουν να διευκρινισθούν. Στην παρούσα μελέτη, αναφέρουμε ότι YC ενεργοποιείται σημαντικά AMP-ενεργοποιημένη πρωτεϊνική κινάση (ΑΜΡΚ) μονοπατιού σηματοδότησης και κατέστειλε mTORC2 μεσολάβηση κατάντη της οδού σηματοδότησης σε H1993 ανθρώπινα κύτταρα NSCLC. ΑΜΡΚ παίζει σημαντικό ρόλο στο μεταβολισμό της ενέργειας και τη βιολογία του καρκίνου. Ως εκ τούτου, οι ενεργοποιητές των οδών σηματοδότησης ΑΜΡΚ μπορεί να είναι εφαρμόσιμη στην αγωγή του καρκίνου. YC ενίσχυσε την έκφραση του ρ-AMPKα. Η συν-θεραπεία YC και την ένωση Γ (ένας αναστολέας ΑΜΡΚ) ή μετφορμίνη (ένας ενεργοποιητής ΑΜΡΚ) επιβεβαίωσε επίσης ότι YC αυξάνεται p-AMPKα. YC κατέστειλε επίσης την ενεργοποίηση του στόχου της ραπαμυκίνης στα θηλαστικά (mTOR) έκφραση, ενός κατάντη στόχου της ΑΜΡΚ. Περαιτέρω μελέτη αποκάλυψε ότι YC διαμορφώνει μονοπάτια σηματοδότησης καθοδικά mTORC2-συσχετίστηκε με μειωμένο εκφράσεις του ρ-Akt, ρ-πρωτεϊνική κινάση C άλφα (ΡΚΟα), ρ-ras σχετίζονται C3 τοξίνη αλλαντίασης υπόστρωμα 1 (Rac1) και νηματοειδείς ακτίνης (F- ακτίνη) που είναι γνωστό ότι ενεργοποιούν την κυτταρική ανάπτυξη και να οργανώσει κυτταροσκελετού ακτίνης. Επιπλέον, YC ανέστειλε την ανάπτυξη του όγκου σε H1993 κύτταρο-εμφυτευμένα ξενομοσχεύματος μοντέλο γυμνού ποντικού. Αυτά τα στοιχεία υποδηλώνουν το YC θα μπορούσε να είναι ένας πιθανός υποψήφιος για τον καρκίνο του χημειοθεραπευτικούς παράγοντες που προέρχονται από φυσικά προϊόντα από τη ρύθμιση AMPK /mTORC2 οδού και την οργάνωση του κυτταροσκελετού της ακτίνης σηματοδότησης

Παράθεση:. Kang JI, Χονγκ JY, Lee HJ, Bae SY, Jung C, Πάρκο HJ, et al. (2015) Αντι-όγκου δραστηριότητα των Yuanhuacine ρυθμίζοντας AMPK /mTOR μονοπάτι σηματοδότησης και ακτίνη Οργάνωση Κυτταροσκελετού σε μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα κύτταρα. PLoS ONE 10 (12): e0144368. doi: 10.1371 /journal.pone.0144368

Επιμέλεια: Cong Cao, Πανεπιστήμιο Suzhou, Κίνα

Ελήφθη: 10, Φεβρουαρίου 2015? Αποδεκτές: 17 του Νοέμβρη 2015? Δημοσιεύθηκε: 11η Δεκεμβρίου του 2015

Copyright: © 2015 Kang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του χαρτιού

Χρηματοδότηση:. η μελέτη αυτή χρηματοδοτήθηκε από τη βασική επιστήμη ερευνητικό πρόγραμμα μέσω του Εθνικού Ιδρύματος Ερευνών της Κορέας (NRF), που χρηματοδοτείται από το Υπουργείο Παιδείας, Επιστημών και Τεχνολογίας (2013R1A1A2012389 και Νο 20100024361) . Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος του πνεύμονα είναι μία από τις πιο κοινές ασθένειες στον κόσμο και η κύρια αιτία θανάτου από καρκίνο σχετίζονται [1]. Υπάρχουν δύο κύριες μορφές της νόσου, μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (SCLC) και μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC), όπου NSCLC είναι περίπου το 85% όλων των περιπτώσεων καρκίνου του πνεύμονα. Μαζί με τη χειρουργική επέμβαση και ακτινοθεραπεία, χημειοθεραπεία είναι μια από τις πιο κοινές θεραπείες για τη θεραπεία του καρκίνου του πνεύμονα. Ωστόσο, η χημειοθεραπεία δεν είναι ακόμα αρκετά αποτελεσματική για τους ασθενείς με προχωρημένο NSCLC με διάμεσο ποσοστό επιβίωσης περίπου ένα χρόνο [2, 3]. Ως εκ τούτου, η ανάπτυξη νέων ισχυρών αντικαρκινικών παραγόντων εξακολουθεί να είναι απαραίτητη για τη θεραπεία της νόσου.

Δάφνη genkwa

(Thymelaeaceae) είναι ένα πολύ γνωστό παραδοσιακό φαρμακευτικό φυτό διανέμονται κυρίως στην Κορέα και την Κίνα, και λουλούδι του έχει αναφερθεί ότι εμφανίζουν αποβολή, αντικαρκινική, αντιβηχικά, διουρητικά, και αποχρεμπτικό δραστηριότητες [4]. Αρκετές ενώσεις συμπεριλαμβανομένων διτερπένια daphnane τύπου έχουν απομονωθεί από το

D

.

genkwa

[5]. διτερπενοειδή Daphane τύπου έδειξαν διάφορες βιολογικές επιδράσεις συμπεριλαμβανομένων αντι-καρκίνου, παροδική υποδοχέα δυναμικό κανάλι κατιόντων μέλος υποοικογένεια V 1 (TRPV1) ενεργοποίηση, αντι-γονιμότητας, παρασιτοκτόνο, νευροτροφικό, τη μείωση της χοληστερόλης, αντι-υπεργλυκαιμικό, ερεθιστικά, προαγωγής όγκων, και ιός ανοσοανεπάρκειας (HIV) δραστηριότητες αντι-ανθρώπου [6]. Yuanhuacine (YC) είναι ένα σημαντικό συστατικό της διτερπενοειδή daphnane τύπου απομονωθεί από τα μπουμπούκια ανθέων,

Δάφνη genkwa

. YC έδειξε την αντικαρκινική δράση σε διάφορες καρκινικές κυτταρικές γραμμές

in vitro

[7]. Μπορούμε επίσης αναφερθεί ότι YC παρουσιάζει το σχετικά εκλεκτική ανασταλτική της ανάπτυξης δραστικότητα έναντι ανθρώπινων καρκινικών κυττάρων Α549 του πνεύμονα σε σύγκριση με τα MRC-5 φυσιολογικά επιθηλιακά κύτταρα του πνεύμονα [8]. Ωστόσο, η υποκείμενη μοριακός μηχανισμός YC σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα πνεύμονα δεν έχει διευκρινιστεί ακόμα.

AMP-ενεργοποιημένη πρωτεϊνική κινάση (ΑΜΡΚ) είναι μία πανταχού παρούσα πρωτεϊνική κινάση σερίνης /θρεονίνης που αποτελείται από μια καταλυτική υπομονάδα α και δύο ρυθμιστής υπομονάδες (β και γ) [9], και είναι γνωστό ότι ρυθμίζει το μεταβολισμό κυτταρικής ενέργειας [10, 11]. Η ενεργοποίηση της ΑΜΡΚ προκαλείται από κυτταρικό στρες όπως το οξειδωτικό στρες, υποξία, υπογλυκαιμία και, και αυτό οδηγεί σε αύξηση της αναλογίας μεταξύ της κυτταρικής μονοφωσφορική αδενοσίνη (ΑΜΡ) και τριφωσφορική αδενοσίνη (ΑΤΡ). ΑΜΡΚ ελέγχει επίσης την ανάπτυξη των κυττάρων, πολλαπλασιασμό και autophagy μέσω της διαφοροποίησης των στόχων της ραπαμυκίνης στα θηλαστικά (mTOR) δραστηριότητα, η οποία απορυθμίζεται με συνέπεια σε καρκινικά κύτταρα [12]. Υπάρχουν δύο τύποι του mTOR, mTORC1 και mTORC2 που είναι δομικά και λειτουργικά διαφορετικά συμπλέγματα πολλαπλών πρωτεϊνών [13]. Σε γενικές γραμμές, mTORC1 ελέγχει την ανάπτυξη των κυττάρων σε απόκριση σε θρεπτικό διαθεσιμότητα και τα ρυθμιστικά της ανάπτυξης. Σε αντίθεση, mTORC2 είναι ένας ρυθμιστής κλειδί της κυτταροσκελετού της ακτίνης που συσχετίζεται με τη μετάσταση καρκίνου, και ελέγχει την φωσφορυλίωση της Akt σε Ser-473 μέσω της αλληλεπίδρασης μεταξύ της ραπαμυκίνης-insensitive σύντροφος του mTOR (rictor) και mTOR [14, 15].

στην παρούσα μελέτη, η αντινεοπλασματική δραστικότητα του YC και των βασικών μοριακών μηχανισμών δράσης της ερευνήθηκαν τόσο σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα H1993

in vitro

πολιτισμό και στην H1993-εμφυτεύεται ξενομοσχεύματος γυμνού ποντικού το μοντέλο

in vivo

.

Υλικά και Μέθοδοι

Αντιδραστήρια

διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO), δικιγχονικού οξύ (BCA), τριχλωροξικό οξύ (TCA), σουλφοροδαμίνης Β (SRB), και καταλάσης αγοράστηκαν από την Sigma-Aldrich, Inc. (St. Louis, ΜΟ, USA), Roswell Memorial Institute Park (RPMI) 1640 μέσο, ​​ορό εμβρύου μόσχου (FBS), διάλυμα θρυψίνης-ΕϋΤΑ (1Χ ), αντιβιοτικό-αντιμυκητιασικό διάλυμα (100Χ) και αλατούχο φωσφορικό ρυθμιστικό διάλυμα (PBS) (1Χ) αγοράστηκαν από την Hyclone Laboratories, Inc. (South Logan, UT, USA). Anti-π-AMPKα, αντι-AMPKα, αντι-ρ-ACC, αντι-ACC, αντι-ρ-mTOR, αντι-mTOR, αντι-ρ-4EBP1, αντι-4EBP1, αντι-ρ-eIF4E, αντι-eIF4E, αντι-ρ-P70S6K1, αντι-P70S6K1, αντι-ρ-rpS6, αντι-rpS6, αντι-rictor, αντι-ρ-Akt, αντι-Akt, και αντι-Ε-καδερίνης αγοράσθηκαν από τη Cell Signaling Technology (Danvers, ΜΑ , ΗΠΑ). Αντι-PKC-α, αντι-ρ-Rac1, αντι-Rac1, αντι-ΡΟΝΑ, αντι-β-ακτίνης, και όλα τα δευτερογενή αντισώματα αγοράστηκαν από την Santa Cruz Biotechnology. (Santa Cruz, CA, USA). Αντι-ρ-rictor αγοράστηκε από την Millipore (Temecula, CA, USA). Αντι-ρ-ΡΚΟ-α, αντι-F-ακτίνης, και αντι-Ki-67 αγοράστηκαν από την Abcam (Cambridge, ΜΑ, USA). Gefitinib αγοράστηκε από Selleckchem (Houston, TX, USA) και η ραπαμυκίνη αγοράστηκε από Tocris Βιοεπιστημών (Bristol, UK).

Η Ένωση

Yuanhuacine (YC, Σχήμα 1Α) απομονώθηκε και ταυτοποιήθηκε από τα λουλούδια του

Δάφνη genkwa

όπως περιγράφηκε προηγουμένως [8]. Η ένωση διαλύθηκε σε 100% διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO) και αραιώνεται με μέσο για την προετοιμασία του δείγματος.

(Α) Η χημική δομή του YC. (Β) H1993 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με τις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις YC και gefitinib για 72 ώρες. Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων μετρήθηκε με δοκιμασία SRB. (Γ) H1993 κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή με διάφορες συγκεντρώσεις YC για τους υποδεικνυόμενους χρόνους, και ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων προσδιορίστηκε με δοκιμασία SRB. (D) Μορφολογικές αλλαγές που προκαλούνται από τη θεραπεία της YC για 24 ώρες παρατηρήθηκαν κάτω από το μικροσκόπιο αντίθεσης φάσης.

Η

Cell Culture

Οι ανθρώπινες κυτταρικές σειρές NSCLC (Η358, Η460, Calu-1, Η1299, Α549, και H1993 κύτταρα) αγοράστηκαν από την American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε RPMI1640 συμπληρωμένο με 10% FBS και αντιβιοτικά-αντιμυκητιακά (PSA? 100 μονάδες /ml πενικιλλίνης G νάτριο, 100 μg /mL στρεπτομυκίνη, και 250 ng /mL αμφοτερικίνη Β) σε 37 ° C υγροποιημένο επωαστή με 5% CO

2.

κυτταρικού πολλαπλασιασμού Δοκιμασία

Η επίδραση της YC στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων εκτιμήθηκε από SRB μέθοδος κυτταρικής πρωτεΐνης-χρώση. Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων με διάφορες συγκεντρώσεις των δειγμάτων και επωάζονται στους 37 ° C σε υγροποιημένο επωαστή με 5% CO

2. Μετά από 72 ώρες επώασης, τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν με διάλυμα TCA 10% για 30 λεπτά και χρωματίστηκαν κυτταρικές πρωτεΐνες με 0,4% SRB σε διάλυμα οξικού οξέος 1% για 1 ώρα. Τα χρωματισμένα κύτταρα διαλύθηκαν σε 10 mM Tris ρυθμιστικό (ρΗ 10,0). Η επίδραση των δειγμάτων στη βιωσιμότητα των κυττάρων υπολογίστηκε ως ποσοστό, σε σχέση με τον διαλύτη αγωγή ελέγχου. Τα IC

50 τιμές υπολογίστηκαν με ανάλυση μη γραμμικής παλινδρόμησης χρησιμοποιώντας το λογισμικό v5.01 Πίνακα Curve 2D (Systat Software Inc., Richmond, CA, USA).

Western Blot και Ανοσοκαταβύθιση Ανάλυση

για ανάλυση κηλίδος Western, τα κύτταρα εκτίθενται σε διάφορες συγκεντρώσεις των δειγμάτων λύθηκαν και οι συγκεντρώσεις πρωτεΐνης προσδιορίστηκαν με τη μέθοδο BCA. Σύνολο πρωτεΐνες (40 μg) σε κάθε προϊόν λύσης κυττάρου υποβλήθηκαν σε ανάλυση σε διάφορες συγκεντρώσεις (6-15%) της ηλεκτροφόρησης δωδεκυλοθειικού νατρίου-πολυακρυλαμιδίου (SDS-PAGE) και ηλεκτρο-μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες PVDF. Οι μεμβράνες επωάστηκαν με ρυθμιστικό αποκλεισμού (5% αλβουμίνη βόειου ορού (BSA) σε Tris ρυθμιστικό αλατούχο διάλυμα και Tween 20 (TBST) για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου και στη συνέχεια επωάστηκαν περαιτέρω με ειδικά αντισώματα αραιωμένα σε 2,5% BSA σε TBST όλη τη νύκτα σε 4 ° C. Μετά από πλύση με TBST οι μεμβράνες επωάστηκαν με υπεροξειδάση κρένου (HRP) δευτερεύοντα αντισώματα για 2 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου και έγινε ορατό με HRP-χημειοφωταύγειας κιτ ανίχνευσης (Lab Frontier, Σεούλ, Κορέα) με τη χρήση LAS-4000 Imager ( Fuji Film Corp., Japan).

Για την ανοσοκατακρήμνιση του καλλιεργημένου μέσου, το κυτταρικό υπερκείμενο διηθείται μέσω ενός φίλτρου 0,2 μm, και οι αναστολείς πρωτεάσης και φωσφατάσης (Roche Applied Science, Penzberg, Γερμανία) ήταν από προστέθηκαν . Για ανοσοκαθίζηση των καλλιεργημένων κυττάρων, τα κύτταρα λύθηκαν σε ΙΡ ρυθμιστικό λύσης αναστολείς πρωτεάσης και φωσφατάσης (50 mM Tris-HCl ρΗ 7,4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, και 0.5% ΝΡ-40) που περιέχει. το διηθημένο καλλιεργημένο μέσο ή ίση ποσότητα κυτταρολυμάτων προδιαυγάστηκε για 30 λεπτά στους 4 ° C με πρωτεΐνη G-Sepharose 4FastFlow (GE Healthcare, Little Chalfront, UK). Μετά την απομάκρυνση των σφαιριδίων (10 λεπτά, 12,000 rpm, 4 ° C), το υπερκείμενο επωάστηκε με την ενδεικνυόμενη αντίσωμα όλη τη νύκτα στους 4 ° C. Το ανοσοσύμπλοκο συλλέχθηκε με σφαιρίδια στους 4 ° C για 2 ώρες. Τα σφαιρίδια πλύθηκαν τέσσερις φορές με ρυθμιστικό διάλυμα λύσης IP, και οι συνδεδεμένες πρωτεΐνες εκλούστηκαν με 2 χ ρυθμιστικό διάλυμα δείγματος Laemmli στους 95 ° C για 10 λεπτά. Τα συλλεγέντα δείγματα πρωτεΐνης υποβλήθηκαν σε ανάλυση κηλίδος Western.

ανοσοκυτταροχημεία.

Τα κύτταρα H1993 υπο-καλλιεργήθηκαν στην καλυπτρίδα επικαλυμμένα με πολυ-L-λυσίνη (Sigma-Aldrich, St. Louis, ΜΟ, USA) σε ένα δίσκο καλλιέργειας 12 φρεατίων. Τα επεξεργασμένα κύτταρα πλύθηκαν τρεις φορές με ψυχρό PBS, και μονιμοποιήθηκαν σε 2% παρα-φορμαλδεϋδη για 15 λεπτά, ακολουθούμενη από διαπερατοποίηση με 0,5% Triton Χ-100 σε PBS για 5 λεπτά. Τα κύτταρα στη συνέχεια πλύθηκαν με 0,1% Triton Χ-100 σε PBS (PBS-T) και επωάστηκαν σε διάλυμα αποκλεισμού (3% BSA και 1% φυσιολογικό ορό κατσίκας σε PBS-T) για 1 ώρα. Πρωτογενή αντισώματα προστέθηκαν στο διάλυμα δέσμευσης και τα κύτταρα επωάστηκαν για 1 ώρα στους 37 ° C. Μετά από πλύση με PBS-T τρεις φορές, τα κύτταρα επωάστηκαν με τα κατάλληλα δευτερεύοντα αντισώματα σε διάλυμα αποκλεισμού για 45 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Τα επισημασμένα κύτταρα πλύθηκαν με PBS-T για έξι φορές και τοποθετήθηκαν με διάλυμα στερέωσης [100 mg /οκτανίου (DABCO) σε 90% γλυκερόλη mL 1, 4-διαζαδικυκλο [2.2.2]]. Τα πλακίδια παρατηρήθηκαν με ένα ομοεστιακό λέιζερ LSM710 μικροσκόπιο σάρωσης (Carl Zeiss, Germany).

Κυττάρων Η μετανάστευση Δοκιμασία

Για να εκτιμηθεί η επίδραση του YC για τη μετανάστευση των κυττάρων, ένα επούλωσης πληγών δοκιμασία διεξήχθη όπως περιγράφηκε προηγουμένως [16]. Εν συντομία, τα κύτταρα H1993 σπάρθηκαν σε πλάκες έξι φρεατίων και επωάστηκαν για 48 ώρες μέχρις ότου έφθασαν 80-90% συρροές. Μια συρρέουσα μονοστιβάδα κυττάρων H1993 τεχνητά τραυματίστηκε με μια άκρη μικροπιπέττα, και τα αποκολλημένα κύτταρα πλύθηκαν με RPMI1640 ελεύθερο ορού και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με ενώσεις δοκιμής σε μέσο καλλιέργεια για 24 ώρες. Τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές με PBS. Εικόνες από τις πληγές φωτογραφήθηκαν σε 0 και 24 ώρες κάτω από ένα ανεστραμμένο μικροσκόπιο (CKX41, η Olympus, Tokyo, Japan).

κυτταρική διείσδυση Δοκιμασία

Η επίδραση της YC στην κυτταρική εισβολή πραγματοποιήθηκε με τη χρήση τα κύτταρα H1993 όπως περιγράφηκε προηγουμένως [17]. Τα κύτταρα σπάρθηκαν στην κορυφαία θαλάμους 24 φρεατίων επικαλυμμένα με Matrigel ένθετα μεμβράνη τερεφθαλικού πολυαιθυλενίου με 8 μΜ πόρους (Millipore, Billerica, ΜΑ, USA). Οι πλάκες επικαλύφθηκαν με 10 μι θαλάμου τύπου Ι του Matrigel επικαλυμμένων ένθετο transwell. Το μέσο των κατώτερων θαλάμων επίσης περιείχε 0,1 mg /mL αλβουμίνης βόειου ορού ως χημειοελκτικό. Τα κύτταρα επωάστηκαν για 48 ώρες στους 37 ° C. Τα κύτταρα που είχαν εισβάλει την εξωτερική επιφάνεια της μεμβράνης μονιμοποιήθηκαν με μεθανόλη και χρωματίστηκαν με αιματοξυλίνη και ηωσίνη, και φωτογραφήθηκαν (CKX41, η Olympus, Tokyo, Japan).

Ανάλυση του συνδυασμού φαρμάκων

Τα κύτταρα (5 χ 10

4 κύτταρα /φρεάτιο) επιστρώθηκαν σε πλάκες 96-φρεατίων με διάφορες συγκεντρώσεις YC και rapamyacin ή gefitinib. Μετά από 48 ώρες επώασης, ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας την δοκιμασία SRB. Η επίδραση συνδυασμός αξιολογήθηκε με τον υπολογισμό του δείκτη συνδυασμού (CI) τιμές ως εξής: CI = D

1 /(D

x)

1 + D

2 /(D

x)

2, όπου D

1 και D

2 είναι οι συγκεντρώσεις των συνδυασμένων ενώσεων δοκιμής που επιτυγχάνουν το αναμενόμενο αποτέλεσμα, και (D

x)

1 και (D

x )

2 είναι οι συγκεντρώσεις που έχουν παρόμοια αποτελέσματα όταν οι ενώσεις δοκιμής χρησιμοποιούνται μόνα τους. Σε αυτή τη μελέτη, το 50% αναστολή λήφθηκε ως το αποτελεσματικό επίπεδο. Οι τιμές CI συγκρίθηκαν με τις τιμές αναφοράς που αναφέρονται από τους Chou [18].

In Vivo ξενομοσχεύματος όγκου Μελέτη

Θηλυκά γυμνά ποντίκια [ηλικίας 5 εβδομάδων, BALB /c-nu (ηυ /ηυ )] αγοράστηκαν από Κεντρικό Εργαστήριο ζώων, Inc (Κορέα) και διατηρήθηκαν σε συνθήκες χωρίς παθογόνα. Όλα τα πειράματα και τη φροντίδα των ζώων διεξήχθησαν κατά τρόπο σύμφωνο με τις κατευθυντήριες γραμμές της Επιτροπής ζώων Φροντίδα και Χρήση των Ewha Γυναικείο Πανεπιστήμιο. Το πρωτόκολλο εγκρίθηκε από την Επιτροπή Δεοντολογίας των πειραμάτων σε ζώα της Ewha Γυναικείο Πανεπιστήμιο. κύτταρα H1993 ενέθηκαν υποδορίως σε φιάλες των ποντικών (1 χ 10

7 κύτταρα σε 200 μΐ μέσου), και οι όγκοι αφέθηκαν να αναπτυχθούν. Όταν ο όγκος του όγκου έφθασε περίπου το 90 mm

3, ξεκίνησε φαρμακευτική αγωγή. Τα ποντίκια τυχαιοποιήθηκαν σε ομάδες ελέγχου και θεραπείας όχημα των πέντε ζώων ανά κάθε μία. YC (0,5 ή 1,0 mg /kg σωματικού βάρους) ή gefitinib (10 mg /kg σωματικού βάρους) διαλύθηκε σε ένα όγκο 100 μΙ διαλύματος (αιθανόλη-Tween 80-H

2O, 1: 1: 98) χορηγήθηκε από του στόματος μία φορά την ημέρα για 21 ημέρες. Η ομάδα ελέγχου υποβλήθηκε σε επεξεργασία με ίσο όγκο οχήματος του DMSO. Ο όγκος του όγκου παρακολουθήθηκε επί 21 ημέρες κάθε 4 ~ 6 ημέρες χρησιμοποιώντας καλίμπρες και ο όγκος του όγκου υπολογίστηκε σύμφωνα με τον ακόλουθο τύπο: όγκος του όγκου (mm

3) = 3,14 x L x Π x Υ /6, όπου L είναι το μήκος, W είναι το πλάτος, και η είναι το ύψος.

Ανοσοϊστοχημεία των όγκων

αποκομμένοι ιστοί όγκου μονιμοποιήθηκαν σε 4% παραφορμαλδεΰδη (PFA) και εγκλείστηκαν σε παραφίνη. Διαδοχικές τομές των ενσωματωμένων δείγματα αποπαραφινοποιήθηκαν, επανυδατώθηκαν, και υποβλήθηκαν σε ανάκτηση αντιγόνου. Τα πλακίδια επωάστηκαν με τα αντισώματα, τα οποία ανιχνεύθηκε με χρήση του κιτ LSAB + System-HRP (Dako, Glostrup, Denmark) και με αιματοξυλίνη. Χρωματισμένες τομές παρατηρήθηκαν και φωτογραφήθηκαν κάτω από μικροσκόπιο ανεστραμμένης αντίθεσης φάσης.

Ex vivo βιοχημική ανάλυση των όγκων.

Ένα τμήμα των κατεψυγμένων όγκων αποκόπηκε από το γυμνούς ποντικούς αποψύχθηκε πάνω σε πάγο και ομογενοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας έναν ομογενοποιητή σε Πλήρες Lysis Buffer (Active Motif, Carlsbad, CA, USA). λύματα όγκων υποβλήθηκαν σε δοκιμασίες προσδιορισμού συγκέντρωσης πρωτεΐνης και δείγματα φυλάχτηκαν στους -80 ° C.

Στατιστική Ανάλυση

Τα δεδομένα εκφράστηκαν ως η μέση ± τυπική απόκλιση (S.D.). Οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση

t-

δοκιμασία του Student. Οι διαφορές θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές σε

* ρ

& lt? 0,05,

** ρ

& lt?. 0.01

Αποτελέσματα

Ανάπτυξη ανασταλτικές επιδράσεις της YC στην καλλιεργημένα κύτταρα H1993

προηγούμενες μελέτες μας έδειξαν ότι η YC έχει σχετικά εκλεκτική ανασταλτική της ανάπτυξης δραστικότητα έναντι ανθρώπινων κυττάρων καρκίνου του πνεύμονα σε σύγκριση με φυσιολογικά επιθηλιακά κύτταρα πνεύμονα [8]. Ως εκ τούτου, στην παρούσα μελέτη, επεκτείναμε για να αξιολογηθεί η αντι-πολλαπλασιαστική δράση του YC σε διάφορες κυτταρικές σειρές NSCLC. YC επέδειξε μία δυνητική δραστηριότητα αναστολής αύξησης σε καλλιεργημένα ανθρώπινα κύτταρα NSCLC (Πίνακας 1). Ειδικότερα, η κυτταρική σειρά H1993 φάνηκε να είναι η πιο ευαίσθητη με το IC

50 αξία 9 ηΜ, μετά από 72 ώρες επώασης, και YC φάνηκε να είναι πιο ισχυρό από το gefitinib, ένα αντικαρκινικό φάρμακο για τη θεραπεία ασθενών ΜΜΚΠ κλινική, υπό τις ίδιες πειραματικές συνθήκες (Σχήμα 1Β). Όταν υποβλήθηκε σε επεξεργασία με διάφορες συγκεντρώσεις YC για αρκετά χρονικά σημεία (24, 48 και 72 ώρες), YC ανέστειλε τον πολλαπλασιασμό των H1993 κυττάρων σε ένα συγκέντρωσης- και χρονο-εξαρτώμενο τρόπο (Σχήμα 1 C). Επειδή η H1993 κυτταρική γραμμή ήταν το πιο ευαίσθητο κύτταρο να YC, η μελέτη μηχανισμός δράσης για την αντι-πολλαπλασιαστική δράση του YC διεξήχθη στα κύτταρα H1993.

Η

Οι μορφολογικές αλλαγές των YC-κατεργασμένα κύτταρα παρατηρήθηκαν κάτω από το μικροσκόπιο αντίθεσης φάσης μετά από 24 ώρες επώασης. Οι αριθμοί κυττάρων μειώθηκαν σε εξαρτώμενο από τη συγκέντρωση τρόπο, και το πολυγωνικό σχήμα των κυττάρων ελέγχου μετατράπηκε σε στενόχωρα και ακανόνιστα δενδρίτη-σχήμα των κυττάρων (Εικ 1D).

Επιδράσεις της YC επί της οδού σηματοδότησης ΑΜΡΚ

Για να διευκρινιστεί περαιτέρω η αντι-πολλαπλασιαστική μηχανισμό YC, η ρύθμιση ενός μονοπατιού μεταγωγής κυτταρικού σήματος που σχετίζεται με την ανάπτυξη καρκινικών κυττάρων αναλύθηκε χρησιμοποιώντας Western blot. ΑΜΡΚ θεωρείται ως βασικό μόριο που ελέγχει την κυτταρική ανάπτυξη, πολλαπλασιασμό, και αυτοφαγία. Μετά από 24 αγωγή ώρες με YC, το επίπεδο πρωτεΐνης του ρ-ΑΜΡΚ ήταν σημαντικά αυξημένη, και το επίπεδο της π-ακετυλ-ΟοΑ καρβοξυλάσης (ACC), ένα προς τα κάτω στόχος του ΑΜΡΚ, στη συνέχεια μειώθηκε σε εξαρτώμενο από τη συγκέντρωση τρόπο (σχήμα 2Α ). Δεδομένου ότι η ενεργοποίηση ΑΜΡΚ είναι ένα πολύ πρώιμο συμβάν [19, 20], η ενεργοποίηση των ΑΜΡΚ με YC επίσης παρακολουθήθηκε κατά τη διάρκεια μιας σύντομης χρονικής περιόδου. Το επίπεδο ρ-ΑΜΡΚ μετρήθηκε έως και 8 ώρες μετά τη θεραπεία του YC (1 μΜ). Το επίπεδο πρωτεΐνης του ρ-ΑΜΡΚ αυξήθηκε σημαντικά μετά από 2 ώρες επώαση σε ένα χρονοεξαρτώμενο τρόπο σε καλλιεργημένα κύτταρα H1993 YC-αγωγή (Σχήμα 2Β). Η ενεργοποίηση της ΑΜΡΚ με YC επιβεβαιώθηκε περαιτέρω με την προεπεξεργασία της ένωσης Ο (ένας ειδικός αναστολέας της ΑΜΡΚ) ή μετφορμίνη (ένας ενεργοποιητής ΑΜΡΚ). Τα κύτταρα H1993 προκατεργάστηκαν με την ένωση Γ (20 μΜ) ή μετφορμίνη (10 mM) για 1 ώρα και στη συνέχεια συν-κατεργασία με YC (1 μΜ) για επιπλέον 2 ώρες. Ένωση C κατέστειλε την έκφραση του ενεργοποιημένου ΑΜΡΚ (ρ-ΑΜΡΚ), αλλά η συν-θεραπεία του YC ανακτηθεί την ενεργοποίηση ΑΜΡΚ. Ομοίως, YC επίσης ενίσχυσε σημαντικά τη μετφορμίνη διαμεσολαβούμενη ενεργοποίηση της ΑΜΡΚ (Σχήμα 2C). Επιπλέον, YC ενεργοποιηθεί αποτελεσματικά το επίπεδο π-AMPK σε διάφορες κυτταρικές σειρές NSCLC (Σχήμα 2D). Αυτά τα ευρήματα υποδεικνύουν ότι ΑΜΡΚ μπορεί να είναι μια πρωτεΐνη-στόχο στο αντι-πολλαπλασιαστική δραστικότητα των YC σε ανθρώπινα κύτταρα NSCLC.

(Α) H1993 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία για 24 ώρες με τις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις YC και πρωτεΐνης εκφράσεις ήταν μετρήθηκε με ανάλυση στυπώματος Western. (Β) H1993 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία για διαφορετικούς σύντομο χρονικά σημεία με 1 μΜ YC και πρωτεΐνης εκφράσεις μετρήθηκαν με ανάλυση αποτύπωσης Western. (Γ) H1993 κύτταρα προκατεργάστηκαν για 1 ώρα με 20 μΜ της ένωσης Ο, το οποίο είναι ένα πολύ γνωστό για τον αναστολέα ΑΜΡΚ ή ​​10 mM της μετφορμίνης που είναι ένας ενεργοποιητής ΑΜΡΚ. Στη συνέχεια, 1 μΜ YC υποβλήθηκε σε επεξεργασία ή συν-θεραπεία για 2 ώρες και οι πρωτεΐνες εκφράσεις μετρήθηκαν με ανάλυση αποτύπωσης Western. (D) Η358, Η460, Calu-1, Η1299, Α549 και H1993 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία για 2 ώρες με 1 μΜ YC και πρωτεΐνης εκφράσεις μετρήθηκαν με ανάλυση στυπώματος Western.

Η

Επιδράσεις της YC επί της οδού σηματοδότησης mTOR

είναι γνωστό ότι ΑΜΡΚ ρυθμίζει αρνητικά mTOR μονοπάτι σηματοδότησης. Από ΑΜΡΚ ενεργοποιείται από YC στα κύτταρα H1993, θα διερευνηθεί περαιτέρω κατά πόσον YC επηρεάζει επίσης σηματοδοτικό μονοπάτι mTOR. Βρήκαμε ότι YC μειωτικά την ενεργοποίηση του mTOR (p-mTOR (Ser2448)). Ως εκ τούτου, mTOR σχετίζεται με εκφράσεις κατάντη πρωτεΐνη προσδιορίστηκαν περαιτέρω. Επειδή YC δεν διαφοροποιούν τα επίπεδα mTORC1 σχετίζονται πρωτεΐνες όπως 4Ε-πρωτεΐνης δέσμευσης 1 (4EBP1), ευκαρυωτικά μετάφραση παράγοντα έναρξης 4Ε (eIF4E), p70S6 κινάση 1 (p70S6K1), και ριβοσωμική πρωτεΐνη S6 (rpS6) (σχήμα 3Α) , YC αναλύθηκε περαιτέρω για την επίδραση σε ένα άλλο συγκρότημα mTOR, mTORC2, ένα διαμορφωτή της ακτίνης οργάνωσης του κυτταροσκελετού. Ως αποτέλεσμα, YC καταστέλλεται mTOR αυτοφωσφορυλίωσης κατά Ser2481, ένα μοριακό βιοδείκτη για δραστικότητα mTORC2 (σχήμα 3Β). Για να διερευνηθεί αν YC ανέστειλαν δραστικότητα mTORC2 επηρεάζοντας τη σύνδεση της mTOR με rictor, rictor ανοσοκαταβυθίστηκε από YC-επεξεργασμένα κύτταρα, και mTOR και rictor αντισώματα ανιχνεύθηκαν με ανοσοστύπωση αντίστοιχα. Όπως φαίνεται στο Σχ 3C, YC διαταράσσεται τη σύνδεση των mTOR και rictor, και αυτά τα γεγονότα μεταγενέστερα κατέστειλε την ενεργοποίηση των mTORC2 που σχετίζονται κατάντη στόχοι, συμπεριλαμβανομένων Akt, πρωτεΐνη άλφα κινάσης C (PKC-α), σχετιζόμενες με την ras υπόστρωμα C3 τοξίνη αλλαντίασης 1 (Rac1), και νηματοειδείς ακτίνη (Ρ-ακτίνη) δια κατεργασίας YC (Σχήμα 3Β). YC ενεργοποιείται επίσης την έκφραση ενός μορίου προσκόλλησης κυττάρου Ε-καδερίνης, ένας αρνητικός ρυθμιστής του F-ακτίνης στα κύτταρα H1993 (Σχήμα 3Β). Το κατασταλτικό αποτέλεσμα του YC στην έκφραση της Ρ-ακτίνης επιβεβαιώθηκε επίσης με ανοσοκυτταροχημική ανάλυση (Σχήμα 3D), γεγονός που υποδηλώνει ότι YC αναστέλλει αποτελεσματικά την οργάνωση του κυτταροσκελετού των κυττάρων NSCLC. Αυτά τα ευρήματα είναι συνεπή με την παρατήρηση των κυτταρικών μορφολογικών αλλαγών με τη θεραπεία των YC στα κύτταρα H1993.

(Α) H1993 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία για 24 ώρες με υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις YC και τις εκφράσεις του mTORC1 σηματοδότησης που σχετίζονται πρωτεΐνες μετρήθηκαν με ανάλυση αποτύπωσης Western. (Β) H1993 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία για 24 ώρες με υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις YC και τις εκφράσεις του mTORC2 σηματοδότησης που σχετίζονται με πρωτεΐνες μετρήθηκαν με ανάλυση αποτύπωσης Western. (Γ) Η αλληλεπίδραση του mTOR και rictor έχουν αναλυθεί με ανοσοκαθίζηση rictor με τις ακόλουθες ανοσοστυπώματα των κυτταρικών λυμάτων (κατώτερο πάνελ) και ανοσοϊζήματα (άνω πάνελ) με τα υποδεικνυόμενα αντισώματα. IP: ανοσοκατακρήμνιση. (D) H1993 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία για 24 ώρες με τις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις YC και το F-ακτίνης έκφραση μετρήθηκε με ανοσοκυτταροχημεία.

Η

Επιδράσεις της YC για εισβολή και τη μετανάστευση

είναι καλά γνωστό ότι η ασύμμετρη συσσώρευση του F-ακτίνης σχετίζεται με κύτταρο εισβολή και τη μετανάστευση. YC κατέστειλε την έκφραση του F-ακτίνης σε κύτταρα NSCLC. Ως εκ τούτου, έχουμε αξιολογηθεί περαιτέρω η επίδραση της YC στην καρκινικών κυττάρων εισβολή και τη μετανάστευση. Η θεραπεία του YC για 24 ώρες ανέστειλε τη μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων σε ένα τραύμα δοκιμασία επούλωσης σε εξαρτώμενο από τη συγκέντρωση τρόπο (Εικ 4Α). Επιπλέον, προσδιορισμός εισβολή Matrigel διεξήχθη για να μελετηθεί αν YC επηρεάζει την διεισδυτικότητα των κακοηθών καρκινικών κυττάρων. YC εμπόδισε τα καρκινικά κύτταρα από το να κινείται μέσα σε έναν θάλαμο Matrigel σε εξαρτώμενο από τη συγκέντρωση τρόπο (Εικόνα 4Β). Αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι YC ανέστειλε αποτελεσματικά τη μετανάστευση και εισβολή των καρκινικών κυττάρων η οποία είναι εν μέρει συνδέονται με την καταστολή της ακτίνης οργάνωση του κυτταροσκελετού, μέσω της προς τα κάτω ρύθμιση F-ακτίνης και προς τα πάνω ρύθμιση της έκφρασης Ε-καδερίνης.

(Α) κύτταρα H1993 επωάστηκαν σε μια 12-φρεατίων για 24 ώρες, τραυματίες με ένα κίτρινο άκρη, και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με τις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις YC. Μετά από επώαση για 24 ώρες, τα κύτταρα φωτογραφήθηκαν χρησιμοποιώντας μικροσκόπιο αντίθεσης φάσης. (Β) H1993 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία για 48 ώρες με τις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις YC. Η δοκιμασία κύτταρο εισβολή διεξήχθη σε επικαλυμμένα με Matrigel σύστημα θαλάμου όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι.

Η

Anti-πολλαπλασιαστικά αποτελέσματα με συνδυασμό των χημειοθεραπευτικών παραγόντων καρκίνου

Εξετάσαμε περαιτέρω το αποτέλεσμα του YC σε συνδυασμό με gefitinib ή ραπαμυκίνη στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό H1993. Αρκετές μελέτες έχουν αναφέρει τις ευεργετικές επιδράσεις του συνδυασμού του gefitinib, ενός αναστολέα EGFR, με αναστολείς mTOR σε προκλινικό μοντέλο. Σε αυτή τη μελέτη, ο συνδυασμός YC με gefitinib εμφανίζονται οι σημαντικές συνεργιστικές ανασταλτικές επιδράσεις επί των κυττάρων H1993 (Σχήμα 5Α). Επιπλέον, ο συνδυασμός της ραπαμυκίνης (αναστολέας mTORC1) και YC ανέστειλε αποτελεσματικά τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό των κυττάρων H1993 σύγκριση με ραπαμυκίνη μόνη (Σχήμα 5Β). Είναι γνωστό ότι η ραπαμυκίνη εμποδίζει mTORC1 και δεν αναστέλλει mTORC2. αναστολή mTORC1 χωρίς καταστολή mTORC2 να ενεργοποιήσετε PI3K /Akt και να προωθήσει την επιβίωση του όγκου. Ως εκ τούτου, το αποτέλεσμα αυτό υποδηλώνει ότι η αναστολή της ανάπτυξης του YC συνδυασμό με ραπαμυκίνη θα μπορούσε να οφείλεται στην προς τα κάτω ρύθμιση mTORC2 με YC.

Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με YC μόνη ή σε συνδυασμό με gefitinib ή ραπαμυκίνης για 48 ώρες . Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων μετρήθηκε χρησιμοποιώντας δοκιμασία SRB. (Α) YC σε συνδυασμό με gefitinib (Β) YC σε συνδυασμό με ραπαμυκίνη.

Η

Ανασταλτική δράση της ανάπτυξης όγκου από YC στα κύτταρα H1993 εμφυτεύονται μοντέλο ξενομοσχεύματος ποντικού

Το αντι- δραστηριότητα του όγκου των YC αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας ένα

in vivo

γυμνό ξενομοσχεύματος κυττάρων ποντικού μοντέλο που φέρει H1993. Όταν ο όγκος του όγκου έφθασε περίπου 90 mm

3 μετά εμφυτεύεται με τα κύτταρα H1993, YC (0,5 ή 1 mg /kg του YC) ή gefitinib (10 mg /kg) χορηγήθηκε από του στόματος σε ποντικούς μία φορά την ημέρα για 21 ημέρες. Ο όγκος του όγκου στην ομάδα ελέγχου υπό αγωγή με όχημα ήταν περίπου 750 mm

3 σε 30 ημέρες μετά τα κύτταρα εμφυτεύτηκαν υποδορίως στην δεξιά περιοχή πλευρό του κάθε ποντικού. Σε σύγκριση με τις ομάδες ελέγχου υπό αγωγή με όχημα, YC ανέστειλε σημαντικά την ανάπτυξη του όγκου κατά 33,4% και 38,8% στα 0,5 mg /kg και 1,0 mg /kg, αντίστοιχα, στο τέλος των πειραμάτων (Σχήμα 6Α). Τα βάρη των όγκων αναστέλλεται επίσης σημαντικά με τη θεραπεία του YC (Σχήμα 6Β). Παρόμοια αποτελέσματα παρατηρήθηκαν στη θεραπεία της gefitinib (10 mg /kg). Δεν υπάρχουν αλλαγές σωματικό βάρος και έκδηλη τοξικότητα βρέθηκαν στο

in vivo

πειράματα με YC (Σχήμα 6C).

(Α) H1993 κύτταρα εγχέονται υποδόρια στα πλευρά γυμνών ποντικών και οι όγκοι, και αφέθηκαν να αναπτυχθούν για 21 ημέρες. Όταν έφτασαν περίπου το 90 mm

3, ξεκίνησαν οι ενδεικνυόμενες συγκεντρώσεις του YC. Όλα τα φάρμακα της μελέτης δόθηκαν στόματος μία φορά ημερησίως για 21 ημέρες. Τα μεγέθη των όγκων παρακολουθούνται κάθε 4 ~ 6 ημέρες. (Β) Ο όγκος και το βάρος του κάθε όγκου ξενομοσχεύματος μετρήθηκαν κατά τον τερματισμό του πειράματος την ημέρα 21. (γ) τα ζώα στον έλεγχο και την αγωγή ομάδες ζυγίστηκαν κάθε 4 ~ 6 ημέρες. Το μέσο σωματικό βάρος κάθε ομάδα παρουσιάζεται.

Η

Επιπλέον, μια βιοχημική ανάλυση των καρκινικών ιστών επιβεβαίωσε επίσης την ενεργοποίηση της ΑΜΡΚ με την κατεργασία YC χρησιμοποιώντας στύπωμα Western (Εικόνα 7Α) και ανοσοϊστοχημική ανάλυση (Σχήμα 7Β) με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. YC εμφάνισαν επίσης την αναστολή της έκφρασης των βιοσημειωτών πολλαπλασιασμού Ki-67 (Σχήμα 7C) και πυρηνικό αντιγόνο πολλαπλασιαζόμενων κυττάρων (PCNA) (Εικ 7D) σε ιστούς όγκων. Αυτά τα δεδομένα πρότειναν ότι YC κατέστειλε αποτελεσματικά την ανάπτυξη του όγκου του H1993 κυττάρων

in vivo

, και αντικαρκινική δραστικότητα της μπορεί εν μέρει να σχετίζεται με την ενεργοποίηση του μονοπατιού σηματοδότησης ΑΜΡΚ.

Η πρωτεΐνη εκχυλίσματα που προέρχονται από ιστούς όγκων του μοντέλου ξενομοσχεύματος H1993. (Α) Οι εκφράσεις ΑΜΡΚ μετρήθηκαν με ανάλυση στυπώματος Western. (Β) Η π-ΑΜΡΚ έκφραση μετρήθηκε με ανοσοϊστοχημεία. (Γ) Η έκφραση Ki-67 μετρήθηκε με ανοσοϊστοχημεία. (Δ) Η έκφραση PCNA μετρήθηκε με ανοσοϊστοχημεία.

Η

Συζήτηση

Φυσικές προϊόντα έχουν διαδραματίσει σημαντικό ρόλο στην ανακάλυψη και ανάπτυξη [21] του φαρμάκου. Ειδικότερα, με βάση φυτά επίγειων φυσικά προϊόντα έχουν πολύτιμες πηγές θεραπευτικών παραγόντων. Yuanhuacine (YC), ένα διτερπενοειδές daphnane, είναι ένα κύριο συστατικό των λουλουδιών του

Δάφνη genkwa

. Πρόσφατες μελέτες από την ομάδα μας και άλλοι ανέφεραν τα ισχυρή αντι-πολλαπλασιαστικά αποτελέσματα της YC έναντι διαφόρων κυτταρικών γραμμών καρκίνου [8, 22-24]. Ένας εύλογος μηχανισμός περιλαμβάνει τη στόχευση των συμπλοκών τοποϊσομεράση-ΟΝΑ, και YC θεωρείται ως παράγοντας προκαλούν βλάβη στο DNA [25]. YC έδειξε επίσης την επαγωγή του G2 /M φάση διακοπή του κυτταρικού κύκλου σε ανθρώπινο κύστη και ο καρκίνος του παχέος εντέρου κυττάρων [26]. Ωστόσο, ο ακριβής μοριακός μηχανισμός του YC στην αντικαρκινική δράση των ανθρώπινων κυττάρων καρκίνου του πνεύμονα, ιδιαίτερα, την ανάπτυξη των κυττάρων NSCLC έμενε να διευκρινιστεί. Αυτή η μελέτη καταδεικνύει ότι YC ρυθμίζει την /mTOR μονοπάτι σηματοδότησης ΑΜΡΚ και αναστέλλει ακτίνης οργάνωση του κυτταροσκελετού σε ανθρώπινο πνεύμονα καρκίνο H1993 κυττάρων.

Πρόσφατες μελέτες αποκάλυψαν ότι ΑΜΡΚ /mTOR μονοπατιών σηματοδότησης συνδέονται στενά στη ρύθμιση της ανάπτυξης καρκινικών κυττάρων, πολλαπλασιασμό και την επιβίωση. Ειδικότερα, η ενεργοποίηση του ΑΜΡΚ ρυθμίζει αρνητικά την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων μέσω της κατάντη του mTOR μονοπατιών σηματοδότησης [26]. Πράγματι, πολλά φυσικά προϊόντα που προέρχονται από ενώσεις, συμπεριλαμβανομένων galegine από

Galega officinalis

[27], η ρεσβερατρόλη από κόκκινα σταφύλια, κουερσετίνη υπάρχει σε πολλά φρούτα και λαχανικά, ginsenoside από

Panax ginseng

, η κουρκουμίνη από

Curcuma longa

, berberine από

Coptis chinensis

, επιγαλλοκατεχίνη από πράσινο τσάι, θεαφλαβίνης από το μαύρο τσάι [28], και hispidulin από χιόνι λωτού [29] παρουσίασαν την αντικαρκινική δράση από την ενεργοποίηση της μονοπάτια ΑΜΡΚ. Στην παρούσα μελέτη, διαπιστώσαμε επίσης ότι YC ενεργοποιεί αποτελεσματικά το ΑΜΡΚ και ρυθμίζει προς τα κάτω τα μονοπάτια σηματοδότησης mTORC2 που σχετίζονται. Η ενεργοποίηση της ΑΜΡΚ με YC βρέθηκε να συνέβη σε ένα πρώιμο συμβάν στα κύτταρα H1993 και την ενεργοποίηση του ΑΜΡΚ επίσης επιβεβαιώθηκε από την συν-θεραπεία με έναν αναστολέα ΑΜΡΚ (ένωση C) ή ένας ενεργοποιητής (μετφορμίνη). Αυτά τα ευρήματα υποδεικνύουν ότι η αντι-πολλαπλασιαστική δράση του YC είναι εν μέρει συνδέονται με την ενεργοποίηση των ΑΜΡΚ στα ανθρώπινα κύτταρα NSCLC.

ΑΜΡΚ εμφανίζει πολλές κατάντη στόχου όπως ACC, mTOR, ρ-ρ53, και COX- 2 σε καρκινικά κύτταρα.