Αφηρημένο

Σκοπός

Η ανάλυση του

ΚΟΑ

αριθμού αντιγράφων γονιδίου (ΣΟ ) έχει θεωρηθεί ότι είναι ένας πιθανός βιοδείκτη για την πρόβλεψη της απόκρισης σε MET-στοχευμένες θεραπείες σε διάφορους καρκίνους. Ωστόσο, οι τρέχουσες πρότυπες μεθόδους για τον προσδιορισμό

MET

CN είναι SNP 6.0 στο γονιδιωματικό DNA των καρκινικών κυτταρικών γραμμών και ο φθορισμός

in situ

υβριδισμός (FISH) σε μοντέλα όγκων, αντίστοιχα, οι οποίες είναι δαπανηρές και απαιτούν προηγμένες τεχνικές δεξιότητες και οδηγούν σε σχετικά υποκειμενικές κρίσεις. Ως εκ τούτου, χρησιμοποιήσαμε μια νέα μέθοδο, σταγονίδιο ψηφιακή PCR (ddPCR), για τον προσδιορισμό του

ΚΟΑ

αριθμού αντιγράφων γονιδίου με υψηλή ακρίβεια και την ακρίβεια.

Μέθοδοι

Το γονιδιακό DNA κυτταρικών σειρών καρκίνου ή μοντέλα όγκων εξετάστηκαν και συγκρίθηκαν με το

ΚΟΑ

γονίδιο ΣΟ και

ΚΟΑ /CEN-7

αναλογία καθορίζεται από SNP 6.0 και FISH, αντίστοιχα.

αποτελέσματα

Σε κυτταρικές σειρές, η γραμμική συσχέτιση του

ΚΟΑ

ΣΟ ανιχνεύεται από ddPCR και SNP 6.0 είναι ισχυρή (Pearson συσχέτιση = 0.867). Σε μοντέλα όγκων, η

ΚΟΑ

ανιχνεύεται ΣΟ από ddPCR ήταν σημαντικά διαφορετική μεταξύ των

ΚΟΑ

ομάδες γονιδιακής ενίσχυσης και μη ενίσχυσης σύμφωνα με FISH (μέση τιμή: 15.4 vs 2.1?

P

= 0,044). Δεδομένου ότι

ΚΟΑ

ενίσχυση γονιδίου ορίζεται ως

ΚΟΑ

ΣΟ & gt? 5.5 από ddPCR, το ποσοστό αντιστοιχίας μεταξύ ddPCR και FISH ήταν 98,0%, και ο συντελεστής κάππα Cohen ήταν 0.760 (95% CI, 0,498 έως 1,000?

P

& lt?. 0.001)

Συμπεράσματα

Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η μέθοδος ddPCR έχει τη δυνατότητα να ποσοτικοποιηθεί η

ΚΟΑ

γονίδιο αριθμό αντιγράφων με υψηλή ακρίβεια και την ακρίβεια σε σύγκριση με τα αποτελέσματα από SNP 6.0 και FISH σε καρκινικές κυτταρικές γραμμές και δείγματα όγκων, αντίστοιχα

Παράθεση:. Zhang Υ, Tang ET, Du Z (2016) Ανίχνευση

MET

Gene Αριθμός Αντιγραφή σε δείγματα καρκίνου με τη βοήθεια της σταγόνας ψηφιακή μέθοδο PCR. PLoS ONE 11 (1): e0146784. doi: 10.1371 /journal.pone.0146784

Επιμέλεια: Soheil Σ Dadras, Πανεπιστήμιο του Κονέκτικατ Κέντρο Υγείας, Ηνωμένες Πολιτείες |

Ελήφθη: 18, Σεπτεμβρίου, 2015? Αποδεκτές: 22, Δεκεμβρίου, 2015? Δημοσιεύθηκε: 14, Γενάρη 2016

Copyright: © 2016 Zhang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Όλη η δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. Η μελέτη χρηματοδοτήθηκε από την Amgen Inc. Όλοι οι συγγραφείς είναι υπάλληλοι της Amgen Inc. Ο χρηματοδότης παρέχεται στήριξη με τη μορφή των μισθών για το YZ, ET, και ZD, αλλά δεν έχουν κανένα πρόσθετο ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου. Οι συγκεκριμένοι ρόλοι αυτών των συγγραφέων αρθρωτά στο τμήμα Συγγραφέας Συνεισφορές

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Όλοι οι συγγραφείς είναι υπάλληλοι της Amgen Inc. Η εμπορική ασφάλισης δεν μετέβαλε την τήρηση των συγγραφέων να PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών .

Εισαγωγή

σε κανονικές φυσιολογικές λειτουργίες, ΚΟΑ εκφράζεται σε κύτταρα επιθηλιακής προέλευσης, όπου παίζει σημαντικό ρόλο στην κυτταρική ανάπτυξη και ομοιόσταση [1]. Ωστόσο, παρεκκλίνουσα σηματοδότηση ΜΕΤ έχει παρατηρηθεί σε πολλούς καρκίνους του ανθρώπου, συμπεριλαμβανομένων των ηπατικών και γαστρικών καρκίνων [2-6].

MET

ενίσχυσης γονιδίου έχει αναφερθεί ότι συσχετίζεται με κακή πρόγνωση σε ασθενείς με GC [7-9] και μπορούν να χρησιμοποιηθούν ενδεχομένως ως βιοδείκτη για να εκτιμηθεί η πρόγνωση της νόσου ή προγνωστική απόκριση σε αναστολείς ΜΕΤ σε κλινικές δοκιμές. Έτσι, είναι σημαντικό να αναπτυχθεί μια ακριβή και βελτιστοποιημένη πλατφόρμα για να καθορίσει το

ΚΟΑ

αριθμό αντιγράφων του γονιδίου πριν από την ΚΟΑ-στοχευμένη θεραπεία. Σε συνήθεις μελέτες, SNP 6.0 και τα ψάρια είναι οι τυποποιημένες μεθόδους για την αξιολόγηση του

ΚΟΑ

αριθμό αντιγράφων των κυτταρικών σειρών καρκίνου

in vitro

και όγκου δείγματα

in vivo

, αντίστοιχα. Ωστόσο, αυτές οι μέθοδοι έχουν πολλούς περιορισμούς, συμπεριλαμβανομένων των προηγμένων τεχνικών δεξιοτήτων που απαιτούνται υψηλές δαπάνες και την ανάγκη για έμπειρους ειδικούς για την ανάλυση των δειγμάτων του όγκου, η οποία οδηγεί σε μεταβλητά αποτελέσματα μεταξύ εργαστηρίων. Για παράδειγμα, η ανάλυση FISH συνήθως πραγματοποιείται σε σταθεροποιημένο με φορμαλίνη, εγκλεισμένα σε παραφίνη (FFPE) ιστούς, η οποία απαιτεί μια σειρά πολύπλοκων διαδικασιών, όπως είναι η δέσμευση και ανοσοϊστολογική χρώση, και μπορεί να προκαλέσει βλάβες στο DNA γονιδιωματική και κάταγμα. Τα ζητήματα αυτά αυξάνουν την πιθανότητα ψευδώς αρνητικών αποτελεσμάτων λόγω της χαμηλής ποιότητας και της ποσότητας του DNA. Ως εκ τούτου, η ανίχνευση του γονιδίου ενισχύσεις είναι δύσκολη λόγω της χαμηλής ευαισθησίας αυτών των προσεγγίσεων.

Το σταγονίδιο ψηφιακή PCR (ddPCR) είναι μια μέθοδος που μπορεί να είναι απολύτως ποσοτικοποιηθεί η

συναντήθηκε

αριθμού αντιγράφων χωρίς ανάγκη για τυπικές καμπύλες. Σε ένα τυπικό ψηφιακό PCR, το δείγμα κατανεμήθηκαν τυχαία σε διακριτές χωρίσματα έτσι ώστε μερικές να περιέχουν καμία εκμαγείο νουκλεϊκού οξέος και άλλα περιέχουν ένα ή περισσότερα αντίγραφα προτύπου. Τα χωρίσματα είναι ενισχυμένο με PCR για τον τερματισμό σημείο και έπειτα αναγνώστηκε χρησιμοποιώντας μια συσκευή ανάγνωσης σταγονιδίων για να προσδιοριστεί το κλάσμα των θετικών χωρίσματα στο πλάτος του φθορισμού, από την οποία η απόλυτη συγκέντρωση του στόχου ή αναφοράς DNA υπολογίζεται στατιστικώς με μοντελοποίηση ως κατανομή Poisson. Ως εκ τούτου, ddPCR είναι μια μέτρηση τελικού σημείου που επιτρέπει την ποσοτικοποίηση νουκλεϊκών οξέων χωρίς την ανάγκη για πρότυπες καμπύλες, τις εξωτερικές βαθμονομητές και ενδογενών ελέγχους [10].

Σε αυτή τη μελέτη, επιδιώξαμε να απασχολούν προσδιορισμούς ddPCR να ποσοτικοποιηθεί απολύτως η

MET

αριθμό αντιγράφων σε καρκινικές κυτταρικές γραμμές και δείγματα όγκου και συγκρίθηκαν τα αποτελέσματά μας με εκείνα που λαμβάνονται χρησιμοποιώντας SNP 6.0 και FISH για τα ίδια δείγματα.

Υλικά και Μέθοδοι

κυττάρων γραμμές, τα δείγματα PDX και εκχύλιση του γενωμικού DNA

οκτώ τριάντα οκτώ κυτταρικές σειρές HCC ανθρώπινη GC και αγοράστηκαν από πέντε οργανισμούς: η American Type Culture Collection (ATCC), Ιαπωνικά συλλογή της έρευνας Bioresources (JCRB), Κορέας γραμμή Τράπεζας κυττάρων (KCLB), Σαγκάη Ινστιτούτα Βιολογικών Επιστημών, CAS (αδελφοί), και Zhongshan Νοσοκομείο Πανεπιστήμιο Fudan (ZHFU) (βλέπε πίνακα 1). Οι κυτταρικές γραμμές ήταν συνήθως καλλιεργούνται σε πλάκες 96-φρεατίων σε μέσο ανάπτυξης συνιστάται ATCC στους 37 ° C, 5% CO

2 και 95% υγρασία. Γενωμικό DNA εκχυλίστηκε από τις καρκινικές κυτταρικές γραμμές με την TIANampGenomic DNA Kit (Tiangen, Cat: DP304) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Εκατόν πενήντα έξι FFPE του ξένου μοσχεύματος ασθενή που προέρχεται (PDX) μοντέλα (συμπεριλαμβανομένων των 116 GC και 39 μοντέλα HCC) ελήφθησαν από τη Σαγκάη LIDE Biotech Company. Για τα δείγματα μοντέλο PDX, γενωμικό DNA εκχυλίστηκε χρησιμοποιώντας το DNeasy Αίματος και Kit Tissue (Qiagen, Cat #: 69509) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Η συγκέντρωση του DNA προσδιορίστηκε με ένα φασματοφωτόμετρο NanoDrop (Thermo), και υποβάλλεται σε πέψη με το ένζυμο HaeⅢ (ΝΕΒ, Cat #: R0108S) στους 37 ° C για 1 ώρα. Η πέψη του δείγματος DNA αραιώνεται 10 φορές με αυτόκαυστες Millipore H

2Ο και αποθηκεύονται σε καταψύκτη -20 ° C.

Η

DDPCR για τον προσδιορισμό των

ΚΟΑ

ΣΟ

το μίγμα της αντίδρασης PCR TaqMan συναρμολογήθηκε σε ένα τελικό όγκο 20 μι με 2χ Supermix, 20x εκκινητές και ανιχνευτές 20x και 20 ng του γονιδιωματικού DNA ως μήτρα. Κάθε μίγμα αντίδρασης στη συνέχεια φορτώνεται σε φυσίγγιο DG8 (Bio-Rad) με 70 μL του πετρελαίου σταγονιδίου γενιάς για να δημιουργήσει ένα σταγονίδιο. Τα σταγονίδια από κάθε φρεάτιο μεταφέρθηκαν έπειτα σε πλάκα 96 φρεατίων PCR. Οι πλάκες θερμοσυγκολλούνται και έπειτα θερμικά εναλλάσσονται κάτω από τις ακόλουθες συνθήκες: 95 ° C για 10 λεπτά (ένας κύκλος)? 40 κύκλους PCR στους 95 ° C για 15 δευτερόλεπτα και 60 ° C για 1 λεπτό? και μια διατήρηση στους 4 ° C. Μετά την PCR, οι πλάκες τοποθετήθηκαν σε αναγνώστη σταγονιδίου QX200 (Bio-Rad) που ανέλυσε τα σταγονίδια του κάθε φρεάτιο της πλάκας και να ποσοτικοποιηθεί το DNA στόχο. Τα δεδομένα PCR αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας QuantaSoft έκδοση 1.7.4.0917 (Bio-Rad) για να προσδιοριστεί η μεταβολή αριθμού αντιγράφων (CNV). Η δοκιμασία 20x αναφοράς για AP3B1 περιλαμβάνονται εκκινητές στοχεύουν το loci κεντρομερίδιο στο χρωμόσωμα 5 και έναν ανιχνευτή επισημασμένο με ένα σήμα ΗΕΧ φθορισμού (Bio-Rad). Το x CNV PCR δοκιμασία 20 για την αναγνώριση ΚΟΑ περιλαμβάνονται εκκινητών που στοχεύουν την περιοχή από ιντρόνιο 20-εξόνιο 21 στο χρωμόσωμα 7, και ο ανιχνευτής ήταν επισημασμένο με ένα σήμα FAM φθορισμού (Life Technologies, cat # Hs02884964_cn). Κάθε φρεάτιο αναπαραχθεί για όλα τα δείγματα. Η

ΚΟΑ

αριθμός αντιγράφων υπολογίσθηκε ως ο λόγος των συγκεντρώσεων του

MET

και

AP3B1

και πολλαπλασιάζεται επί δύο. Κάθε δεδομένων για

ΚΟΑ

ΣΟ χρησιμοποιώντας ddPCR αντιπροσωπεύει δύο ή τρεις συγχωνεύονται τεχνική πηγάδια επανάληψη χωρίς έλεγχο πρότυπο (NTC) ως αρνητικός μάρτυρας.

SNP 6.0 δοκιμασία

Μεταξύ των 46 κυτταρικές γραμμές, οι SNP 6.0 ανεπεξέργαστα δεδομένα για 35 από τις κυτταρικές γραμμές είχαν κατεβάσει από το έργο CCLE (https://www.broadinstitute.org/ccle/home), και τα ακατέργαστα δεδομένα για τις άλλες 11 κυτταρικές γραμμές συλλέχθηκαν χρησιμοποιώντας η Affymetrix Genome-Wide Ανθρωπίνων SNP Array 6,0 πλατφόρμα, συμπεριλαμβανομένων BEL7402, HCCC-810, NOZ, OCUG-1, OZ, QGY7701, QGY7703, SMMC7721, SNU354, SNU368 και SNU739. Όλα τα ανεπεξέργαστα δεδομένα που υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με τη χρήση του λογισμικού πικ νικ και παρουσιάζονται ως

ΚΟΑ

αντίγραφα.

ΚΟΑ

FISH

ΚΟΑ

γονίδιο ενίσχυση αναλύθηκε με FISH χρησιμοποιώντας την Dako

ΚΟΑ /CEN-7

IQISH μείγμα ιχνηλατών (RUO). Η

CEN-7

κεντρομερίδιο ανιχνευτής χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος αναφοράς, σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Τα σταθεροποιημένα με φορμαλίνη, εγκλεισμένα σε παραφίνη δείγματα (σβώλοι κυττάρων) κόπηκαν και στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε αποπαραφινώσεως και επανυδάτωση. H & amp? Χρώση Ε παρουσιάστηκε για πρώτη φορά. Η προεπεξεργασία θερμότητα διεξήχθη σε διάλυμα προκατεργασίας σε ένα φούρνο μικροκυμάτων για 3 λεπτά και 50 δευτερόλεπτα, ψύχθηκε σε RT επί 15 λεπτά, και στη συνέχεια πλένονται. Οι τομές υπέστησαν πέψη σε RTU πεψίνη για 6 λεπτά στους 37 ° C (ο χρόνος μπορεί να ρυθμιστεί για διαφορετικά πάχη τμήμα). Μετά την πλύση, οι τομές ήταν εντελώς αφυδατωμένοι. Τα τμήματα που περιέχουν τον ανιχνευτή μετουσιώθηκαν στους