Αφηρημένο

Ezrin ανήκει στον ΜΣΙ (ezrin-ραδιξίνης-μοεσίνη) οικογένεια πρωτεϊνών και έχει αποδειχθεί ότι ρυθμίζει πρώιμα στάδια της σηματοδότησης του υποδοχέα Fas σε λεμφοειδή κύτταρα, αλλά η συμβολή του στην TRAIL-επαγόμενης ρύθμιση του κυτταρικού θανάτου σε καρκινικά κύτταρα προσκολλημένα παραμένει άγνωστη. Στη μελέτη αυτή αναφέρει ότι η ρύθμιση του FasL και TRAIL επαγόμενη από τον θάνατο των κυττάρων από ezrin είναι ο τύπος κυττάρου εξαρτάται. Ezrin είναι ένας θετικός ρυθμιστής της απόπτωσης σε Τ-κυτταρική γραμμή λεμφώματος Jurkat, αλλά ένας αρνητικός ρυθμιστής σε καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου. Χρησιμοποιώντας φωσφορυλίωση εζρίνη ή μεταλλάγματα πρόσδεσης ακτίνης, παρέχουμε απόδειξη ότι η αρνητική ρύθμιση του θανάτου του υποδοχέα-επαγόμενη απόπτωση με εζρίνης συμβαίνει σε ένα cytoskeleton- και DISC-ανεξάρτητο τρόπο, σε καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα. Αξίζει να σημειωθεί ότι, η αναστολή της απόπτωσης που επάγεται από αυτούς τους συνδέτες βρέθηκε να σχετίζεται στενά με ρύθμιση της εζρίνης φωσφορυλίωση επί της σερίνης 66, το γονίδιο WWOX ογκοκατασταλτικό και την ενεργοποίηση του ΡΚΑ. Ανεπάρκεια σε έκφραση WWOX στο καρκίνο του ήπατος οι παγκρεατικού κυτταρικές γραμμές ΜΙΑ PaCa-2 SK-ΗΕΡ1 ή καθώς WWOX σιγαστήρα ή ρύθμιση της ενεργοποίησης ΡΚΑ με φαρμακολογικά ρυθμιστικές αρχές, στην κυτταρική σειρά καρκίνου του παχέος εντέρου SW480, κατήργησε ρύθμιση της σηματοδότησης TRAIL με εζρίνης. Συνολικά τα αποτελέσματα μας δείχνουν ότι η ρύθμιση του υποδοχέα θανάτου προ-αποπτωτική σηματοδότηση από ezrin μπορεί να συμβεί κατάντη του δίσκου σε καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου

Παράθεση:. Iessi E, Zischler L, Etringer Α, Bergeret M, Morlé Α, Jacquemin G , et al. (2015) Θάνατος Receptor απόπτωση σηματοδότηση κανονισμού από Ezrin εξαρτάται από τον τύπο του κυττάρου και εμφανίζεται σε ένα δίσκο-ανεξάρτητο τρόπο στον Καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα. PLoS ONE 10 (5): e0126526. doi: 10.1371 /journal.pone.0126526

Ακαδημαϊκό Επιμέλεια: Shi-Yong Sun, Πανεπιστήμιο Emory, Ηνωμένες Πολιτείες |

Ελήφθη: 7 Γενάρη, 2015? Αποδεκτές: 3 Απρ 2015? Δημοσιεύθηκε: May 26, 2015

Copyright: © 2015 Iessi et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. η εργασία αυτή χρηματοδοτήθηκε από την Ευρωπαϊκή Κοινότητα (ApopTrain Marie Curie RTN), το πρόγραμμα «Investissements d’Avenir» με αναφορά ANR-11-LabX -0021-01-Lipstic Labex, το Πανεπιστήμιο της Βουργουνδίας, το Conseil Regional de Bourgogne, η Inca (Institut National du Cancer, polynom-174), η Cancéropôle Μεγάλο-Est, η Ligue Nationale contre le Cancer, ARC (Association pour la recherche sur le Cancer), και το Υπουργείο Έρευνας και Εκπαίδευσης. EI, SS, LZ και ΑΜ υποστηρίχθηκαν από υποτροφίες από το Marie Curie RTN, Inca, ακρωτήρια (Αρ BEX4938 /14-3) και η Ligue Nationale Contre Καρκίνου le, αντίστοιχα. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

TNF-Σχετικές συνδέτη που επάγει απόπτωση (TRAIL ή Apo2L) προκαλεί κυτταρικό θάνατο σε μία ευρεία ποικιλία καρκινικών κυττάρων, αλλά όχι σε φυσιολογικά κύτταρα. Αυτή η ιδιαιτερότητα καθιστά TRAIL και TRAIL παράγωγα καινοτόμα και πολλά υποσχόμενη θεραπευτικούς παράγοντες εναντίον κακοήθων ασθενειών. TRAIL προκαλεί κυτταρικό θάνατο κατά τη δέσμευση δύο διαμεμβρανικές αγωνιστική υποδοχείς: TRAIL-R1 (DR4) [1-3] και TRAIL-R2 (DR5) [1, 2, 4, 5], που περιέχει εντός ενδοκυτταρική περιοχή τους μια περιοχή θανάτου (DD ), η οποία είναι απαραίτητη για την πυροδότηση της απόπτωσης. Η ενεργοποίηση του TRAIL-R1 /TRAIL-R2 επιτρέπει την πρόσληψη της πρωτεΐνης προσαρμογέα FADD και τις πρόδρομες μορφές της κασπάσης-8 και -10 για να σχηματίσει το μακρομοριακό σύμπλοκο που ονομάζεται DISC (επάγει θάνατο σηματοδότηση Complex) [6]. Μέσα σε αυτό το συγκρότημα, κασπάσης-8 και -10 ενεργοποιούνται από την αυτόματη πρωτεολυτική διάσπαση και απελευθερώνεται στο κυτταρόπλασμα επιτρέπει ενεργοποίηση των κασπασών τελεστών [7].

Όπως υποδοχείς TRAIL, Fas, επινόησε επίσης CD95 ή APO-1 , σηματοδοτεί απόπτωση μέσω του σχηματισμού ενός DISC [8]. Πειραματική απόδειξη δεικνύει ότι Fas σύνδεση με την κυτταροσκελετού της ακτίνης μέσω εζρίνης πριμοδοτεί τα ανθρώπινα CD4 + Τ λεμφοκύτταρα για Fas απόπτωση που διαμεσολαβείται από [9, 10]. ενεργοποίηση CD4 των κυττάρων Τ, είτε μέσω του HIV-1 gp120 ή IL-7, καθιστά CD4 Τ κύτταρα επιρρεπή σε Fas απόπτωση που διαμεσολαβείται μέσω εζρίνη-Fas σύνδεσης και ως εκ τούτου σε απόπτωση των παρευρισκομένων μη μολυσμένων Τ κυττάρων σε ασθενείς με AIDS [11, 12]. Σε Τ λεμφωμάτων όπως κύτταρα Jurkat, εζρίνη δείχθηκε ότι δεσμεύεται Fas, και να απαιτείται για τον κυτταρικό θάνατο πυροδότηση [13]. Ωστόσο, εζρίνη προτάθηκε επίσης, σε μια άλλη μελέτη, για την αναστολή ρυμουλκουμένων και Fas συνδετήρα-επαγόμενο κυτταρικό θάνατο σε λεμφώματα Τ κυττάρων [14].

Ezrin είναι μέλος της εζρίνης, ραδιξίνη, μοεσίνη (ERM) οικογένεια πρωτεϊνών, που συνδέουν διάφορες πρωτεΐνες αναπόσπαστο μεμβράνης στο κυτταρικό σκελετό ακτίνης [15]. πρωτεΐνες ERM συνήθως υπάρχουν στο κυτταρόπλασμα σε μία ανενεργή /κλειστή μορφή, στην οποία η περιοχή δέσμευσης πρωτεϊνών μεμβράνης αμινο-τερματικό (FERM ή πεδίο Ν-ERMAD) καλύπτεται λόγω της σύνδεσης της με την καρβοξυλομάδα, περιοχή πρόσδεσης ακτίνης (C -ERMAD). ενεργοποίηση ΜΣΙ προτείνεται να συμβεί μέσω φωσφορυλίωσης και δεσμευτική φωσφατιδυλινοσιτόλης 4,5-διφωσφορικής (PIP

2) [16].

Η φωσφορυλίωση της εζρίνης σε θρεονίνη 567 προκαλεί μια μετάβαση προς την ανοικτή /ενεργό μορφή, η οποία συσχετίζεται με την πρόσληψη του προς τη μεμβράνη του πλάσματος, όπου δεσμεύεται μεμβράνη μόρια. Άλλες θέσεις φωσφορυλίωσης επί εζρίνης έχουν περιγραφεί. Η φωσφορυλίωση υπολειμμάτων τυροσίνης στις 145 και 353, π.χ. σε απόκριση σε επιδερμικό παράγοντα ανάπτυξης, προωθεί την επιβίωση [17] και επιθηλιακή διαφοροποίηση [18]. Μεσολαβεί η Src εζρίνης φωσφορυλίωση στην τυροσίνη 145 αυξάνει την πρόσφυση των επιθηλιακών κυττάρων σε εξωκυτταρική μήτρα [19], ενώ η φωσφορυλίωση της σερίνης 66 από την πρωτεϊνική κινάση Α (ΡΚΑ) σχετίζεται με την έκκριση οξέος στο γαστρικό κύτταρα [20].

εμείς εδώ διερευνηθεί περαιτέρω η λειτουργία της εζρίνης στην οδό TRAIL. Έχουμε αποδείξει ότι η φωσφορυλίωση εζρίνης στη σερίνη 66 συμβάλλει επιλεκτικά στη ρύθμιση θανάτου κυττάρου TRAIL-επαγόμενης κατάντι του δίσκου TRAIL σε καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου.

Υλικά και Μέθοδοι

παραγωγή αντισωμάτων και Ligand

Flag-tagged διαλυτό ανθρώπινο ανασυνδυασμένο TRAIL, His-tagged TRAIL και συνδέτη Fas παρήχθησαν και χρησιμοποιήθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [21]. Anti-Flag (Μ2), 8-βρωμο-κυκλικό ΑΜΡ, Forskolin και ορθοβαναδικό αγοράστηκαν από την Sigma-Aldrich (Λυών, Γαλλία). αναστολέα της PKA, Η89 ήταν από την Cayman (Interchim, Montluçon, Γαλλία). Για ανάλυση κηλίδος western, αντι-TRAIL-R1 και αντι-TRAIL-R2 αντισώματα αγοράστηκαν από Chemicon (Millipore, Molsheim, France), αντι-FADD, αντι-φωσφο-εζρίνη (Thr567) και αντι-μοεσίνη ελήφθησαν από την Transduction Laboratories (BD Biosciences, Le Pont de Claix, Γαλλία), αντι-κασπάση-8 και αντι-κασπάση-10 ήταν από την Ιατρική & amp? Βιολογικών Εργαστηρίων (Clinisciences, Montrouge, Γαλλία). Αντισώματα έναντι φωσφο-ezrin (Thr567) /ραδιξίνης (Thr564) /μοεσίνη (Thr 558), φωσφο-PKA υποστρώματος (RRXS * /T *) (100G7E), φωσφο- (Ser) PKC Substrate (P-S3-101), φωσφο-CREB (Ser133) (87G3) και η ενεργός διασπασμένο θραύσμα της κασπάσης-3 και κασπάσης-9 ήταν από τη Cell Signaling (Ozyme). Anti-ραδιξίνης, κασπάσης-2, GAPDH και HSC-70 ήταν από την Santa Cruz Biotechnology (Tebu-bio, Le Perray en Yvelines, Γαλλία). Αντι-ακτίνη, αντι-εζρίνη και αντι VSV-γλυκοπρωτεΐνη αντισώματα αγοράστηκαν από την Sigma-Aldrich (Λυών, Γαλλία). Για τα πειράματα κυτταρομετρίας ροής, αντι-Βαχ λήφθηκε από BD βιοεπιστήμες. Το δευτερεύον αντίσωμα ήταν ένα Alexa-488-συζευγμένο αντίσωμα κατσίκας αντι-ποντικού από την Molecular Probes (Invitrogen, Cergy Pontoise, France). Για ανοσοκαταβύθιση, το αντι-εζρίνη (κλώνος 3C12), αντι-Flag (Μ2) και αντι-VSV γλυκοπρωτεΐνη (P5D4) αντισωμάτων αγοράστηκαν από την Sigma-Aldrich Anti-TRAIL-R1 (WB-S26) και αντι-TRAIL-R2 ( B-D37) αντισώματα παρέχονται από Gen-Probe (Diaclone, Μπεζανσόν, Γαλλία).

Κυτταρική καλλιέργεια

Η HCT116 (ανθρώπινο καρκίνωμα του παχέος εντέρου), SW480 (αδενοκαρκίνωμα ανθρώπινου παχέος εντέρου), SK- HEP-1 (ανθρώπινο ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα), και ΜΙΑ PaCa-2 κυτταρικές σειρές καλλιεργήθηκαν με υψηλής γλυκόζης τροποποιημένο μέσο Dulbecco Eagle (Lonza, Levallois-Perret, Γαλλία) συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου (Lonza) και πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη ( 100 μg /ml από το καθένα). PANC-1 (ανθρώπινο καρκίνωμα του παγκρέατος) κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε RPMI 1640 ως ανωτέρω. Όλες οι κυτταρικές γραμμές αναπτύχθηκαν σε 5% CO

2 στους 37 ° C.

κατασκευή πλασμιδίου

VSV-tagged εζρίνης WT υποκλωνοποιήθηκε από φορέα pEGFP-N1 (Invitrogen) για να pCR- 3 (Invitrogen). Μεταλλάξεις S66A, S66D, Y145F, Y145D, Y353F, Y353D, T567A, T567D, R579A δημιουργήθηκαν από πρότυπες μεθόδους PCR και ένα κιτ κατευθυνόμενης μεταλλαξιγένεσης (Stratagene, La Jolla, CA) σύμφωνα με το εγχειρίδιο (βλ S1 πίνακα του κατασκευαστή για αστάρι περιγραφή). Η S66D, Y145D, Y353D, T567D δημιουργήθηκαν για να μιμηθούν φωσφορυλιωμένη ezrin, ενώ S66A, Y145F, Y353F, T567A δημιουργήθηκαν ως nonphosphorylatable ezrin. Οι VSV-tagged μεταλλάκτες εζρίνης υποκλωνοποιήθηκαν στον φορέα έκφρασης pMSCV-puro ως HindIII /XhoI θραύσματα. Όλα τα κατασκευάσματα επιβεβαιώθηκαν με αλληλούχιση.

παραγωγή ρετροϊού και την μεταγωγή κυττάρων

Ο ρετροϊικός φορέας έκφρασης pMSCV-puro και η παραγωγή ιών έχουν περιγραφεί προηγουμένως [22]. HCT116, SW480, ΜΙΑ PaCa-2 και τα κύτταρα SK-HEP-1 μολύνθηκαν για 16 ώρες με ιικά υπερκείμενα που περιέχουν 8 μg /ml polybrene (Hexadimethrin βρωμίδιο από Sigma Aldrich), πλύθηκαν σε ρυθμισμένο με φωσφορικό αλατούχο από την Lonza (PBS), και καλλιεργήθηκαν σε πλήρες μέσο που περιέχει 2,5 μg /ml πουρομυκίνη από InvivoGen.

Μέτρηση της κυτταρικής βιωσιμότητας

σε πλάκες 96-φρεατίων, 50 000 κύτταρα επωάστηκαν στους 37 ° C για 24 ώρες με αυξανόμενη συγκέντρωση του His-TRAIL (από 0 έως 10 000 ng /ml) ή για 48 ώρες με αυξανόμενη συγκέντρωση του CDDP (από 1 έως 1000 μΜ). Η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε με μπλε του μεθυλενίου [22].

Hoechst ανάλυση

Cells, επεξεργασμένο ή με His-TRAIL ή FasL, επωάστηκαν στους 37 ° C για 6 ώρες. Εναλλακτικά, τα κύτταρα προ-κατεργασμένα ή όχι για 30 λεπτά με 100 μΜ Η89, 1 ή 100 μΜ φορσκολίνης ή για 20 λεπτά με 4 mM 8-βρωμο-κυκλικό ΑΜΡ (8Β), ακολουθούμενη από TRAIL (100 ή 500 ng /ml για 6 ώρα) ή συνδέτη Fas (100 ng /ml για 6 ώρες), επωάστηκαν στους 37 ° C για 6 ώρες. Η απόπτωση εκτιμήθηκε με χρώση Hoechst με προσδιορισμό του ποσοστού των συνοπτικών και κατακερματισμένη πυρήνες από τουλάχιστον 300 κύτταρα ανά συνθήκες. Τα πειράματα επαναλήφθηκαν τουλάχιστον τρεις φορές.

APO 2.7 χρώση

Cells, επεξεργασμένο ή με His-TRAIL ή FasL, προ-επεξεργασμένο ή όχι με 10 μΜ Η89, κατέστησαν περατά (PBS, FCS 2,5% και διγιτονίνη 100 μg /ml) για 10 λεπτά στους 4 ° C και χρωματίστηκαν με ένα ΡΕ-συζευγμένο αντίσωμα 2.7A6A3 (Beckman Coulter) το οποίο αναγνωρίζει την πρωτεΐνη μιτοχονδριακή μεμβράνη APO2.7 εκτίθεται σε πρώιμο στάδιο σε κύτταρα που υποβάλλονται σε απόπτωση. Συνολικά, 10 000 συμβάντα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας κυτταρόμετρο ροής FACSCalibur (BD Biosciences).

ανοσοκαθιζήσεις

Για την ανάλυση TRAIL DISC, 10

8 κύτταρα διεγέρθηκαν με 5 μ§ Flag- TRAIL διασυνδεδεμένου με 10 μg αντι-Flag Μ2 σε 1 ml μέσου για τους υποδεικνυόμενους χρόνους στους 37 ° C. Τα κύτταρα στη συνέχεια πλένονται με ρυθμιστικό αλατούχο κρύο φωσφορικά (PBS) και λύθηκαν σε 1 ml ρυθμιστικού λύσης που περιέχει 1% ΝΡ40, 20 mM Tris-HCl ρΗ 7.5, 150 mM NaCl και 10% γλυκερόλη και αναστολέα πρωτεϊνάσης κοκτέιλ. Τα λύματα προ-καθαριστεί με Sepharose 6Β (Sigma-Aldrich), και ανοσοκαταβυθίστηκαν όλη τη νύκτα στους 4 ° C με σφαιρίδια πρωτεΐνης G-Sepharose (Amersham Biosciences, Les Ullis, France). Για ανοσοκαταβυθίσεις υποδοχέα TRAIL ή GAPDH, τα κύτταρα διεγέρθηκαν όπως περιγράφεται παραπάνω με 5 μg /ml του His-TRAIL. Και στις δύο περιπτώσεις, τα κύτταρα λύθηκαν σε ΝΡ40 που περιέχει ρυθμιστικό διάλυμα λύσης. Κυτταρικά εκχυλίσματα προκαταρκτική διαύγαση και ανοσοκατακρημνίσθηκαν χρησιμοποιώντας 5 μg των αντίστοιχων αντισωμάτων. Σφαιρίδια στη συνέχεια πλύθηκαν τέσσερις φορές με ρυθμιστικό διάλυμα λύσης, και ανοσοϊζήματα εκλούστηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα φόρτωσης (Tris-HCl 63 mM, SDS 2%, ερυθρό φαινόλης 0,03%, γλυκερόλη 10% και DTT 100 mM ρΗ 6,8), έβρασε για 5 λεπτά και επεξεργασία για ανοσοκηλίδωση.

κηλίδωση Western

ανοσοκαταβύθισης ή κυτταρολύματα διαλύθηκαν με δωδεκυλικού νατρίου ηλεκτροφόρηση πηκτής θειικού-πολυακρυλαμιδίου (SDS-PAGE) και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες νιτροκυτταρίνης. Μη ειδικές θέσεις δέσμευσης φράχθηκαν με επώαση σε PBS που περιέχει 0,05% Tween 20 και 5% σκόνη γάλακτος. Οι μεμβράνες στη συνέχεια επωάστηκαν με ένα ειδικό πρωτογενές αντίσωμα που ακολουθείται από horseradish δευτερεύον αντίσωμα συζευγμένο με υπεροξειδάση, και αναπτύχθηκαν από την ενισχυμένη μέθοδο χημειοφωταύγειας σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή (Pierce, Rockford, IL, USA).

Ανάλυση του Βαχ ενεργοποίηση με κυτταρομετρία ροής

Cells, επεξεργασμένο ή με His-TRAIL, σταθεροποιήθηκαν με 4% PFA, κατέστησαν διαπερατά (PBS, 1% BSA και 0,1% σαπωνίνη) για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου και βάφτηκαν με ένα αντι -Bax αντίσωμα το οποίο αναγνωρίζει τη δραστική μορφή Ν-τερματικό του Βαχ (κλώνος 6A7, BD Biosciences). 10 000 εκδηλώσεις αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας κυτταρόμετρο ροής FACSCalibur (BD Biosciences).

Στατιστική Ανάλυση

Για in vitro μελέτες, οι διαφορές προσδιορίστηκαν είτε με αμφίδρομη επαναλαμβανόμενων μετρήσεων ανάλυση διακύμανσης (ANOVA ) με δοκιμή Bonferroni για πολλαπλές συγκρίσεις, ή με δοκιμασία t του Student, χρησιμοποιώντας λογισμικό Prism 5.0a (GraphPad Software, San Diego, CA, USA). Ένα επίπεδο σημαντικότητας * P & lt? 0.05, ** P & lt? 0,01 ή *** P & lt? 0.001 υποτέθηκε για όλες τις δοκιμές

Αποτελέσματα

Ezrin είναι ένας αρνητικός ρυθμιστής του Fas και ρυμουλκουμένων. επαγόμενο κυτταρικό θάνατο

Ezrin και μοεσίνη προηγουμένως αποδειχθεί ότι είναι θετικοί ρυθμιστές της Fas κυτταρικό θάνατο που επάγεται μέσω της ικανότητάς τους να αλληλεπιδρούν με τον υποδοχέα Fas σε λεμφοειδή κύτταρα Τ [9, 13]. Κατά συνέπεια, εζρίνη και μοεσίνη σίγηση σε κύτταρα Jurkat ανέστειλε σημαντικά FasL απόπτωση, και παρομοίως παρεμπόδισε την απόπτωση που επάγεται από TRAIL (S1 Εικ). Ο ρόλος του στη ρύθμιση εζρίνης στερέωσαν και TRAIL απόπτωση που επάγεται στη συνέχεια αξιολογήθηκε σε κύτταρα καρκινώματος του κόλου. Ezrin ήταν είτε σταθερώς υπερεκφράζεται (Σχήμα 1Α και 1Β) ή σιγήσει χρησιμοποιώντας siRNA (Σχ 1C και 1D) εντός HCT116 και τα κύτταρα SW480 και την απόπτωση που επάγεται από TRAIL ή συνδέτη Fas αξιολογήθηκε με χρώση Hoechst. Η έκτοπη έκφραση του Ezrin μετρίασε σημαντικά Fas συνδέτη και TRAIL-επαγόμενο κυτταρικό θάνατο στις δύο κυτταρικές σειρές (Σχήμα 1Α και 1Β). Ευαισθησία στην απόπτωση που επάγεται από σταυροσπορίνη, έναν PKC αναστολέα γνωστό ότι επάγει μιτοχονδριακό ενεργοποίηση, ήταν ωστόσο δεν μεταβάλλονται σε αυτά τα κύτταρα (Σχήμα 1Α και 1Β). Σε συμφωνία με αυτά τα αποτελέσματα, εζρίνη σίγηση αυξήθηκε τόσο FasL- και TRAIL-επαγώμενη απόπτωση (Σχ 1C και 1D).

(Α) HCT116 ή (Β) κύτταρα SW480, που εκφράζουν ή όχι VSV-εζρίνης έλαβαν θεραπεία για 6 ώρα με συνδέτη Fas (100 ng /ml) ή His-TRAIL (500 ng /ml) ή 16 ώρες με 1 μΜ σταυροσπορίνη (STS). Η απόπτωση ποσοστώθηκε με χρώση Hoechst. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± SD από τουλάχιστον τρία διαφορετικά πειράματα. (* P & lt? 0,05? ** P & lt? 0,01 αντίστοιχες για τον έλεγχο των κυττάρων). επίπεδα έκτοπη έκφραση Ezrin αναλύθηκαν με ανοσοκηλίδωση χρησιμοποιώντας αντίσωμα αντι-VSV σε έλεγχο ή εζρίνης WT-εκφράζουν HCT116 και SW480 κυττάρων. HSC70 χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. (C) HCT116 ή (D) κύτταρα SW480, επιμολύνονται εζρίνη ή αγωνίζομαι (SCR) siRNAs. 72 ώρες μετά την επιμόλυνση τα κύτταρα διεγείρονται για 6 ώρες με συνδέτη Fas (100 ng /ml) ή His-TRAIL (500 ng /ml) και η απόπτωση ποσοτικοποιήθηκε μετά από χρώση με APO2.7 αντίσωμα με κυτταρομετρία ροής. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± SD από τουλάχιστον τρία διαφορετικά πειράματα. (* P & lt? 0,05? ** P & lt? 0,01 αντίστοιχες για τον έλεγχο των κυττάρων). επίπεδα έκφρασης Ezrin αναλύθηκαν με ανοσοκηλίδωση. Η ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. (Ε) Ανάλυση του σχηματισμού TRAIL DISC. HCT116 και SW480 κύτταρα διεγέρθηκαν ή όχι με 5 μg /ml Flag-TRAIL διασυνδεδεμένου με 10 μg /ml αντι-Flag (Μ2) αντίσωμα. Τα κύτταρα λύθηκαν, και ο δίσκος ανοσοκαταβυθίστηκε και αναλύθηκε με στύπωμα Western. Ένα από τα τρία ανεξάρτητα πειράματα. (F) Κύτταρα HCT116 διεγέρθηκαν ή όχι με 5 μg /ml His-TRAIL για 20 και 60 λεπτά. Μετά τη λύση των κυττάρων, GAPDH αντίσωμα προστέθηκε στα κυτταρικά λύματα και ανοσοϊζήματα αναλύθηκαν με western blot.

Η

Ezrin δεν προσλαμβάνονται στο DISC TRAIL

Δεδομένου ότι εζρίνη έχει αποδειχθεί ότι είναι ένα συστατικό του δίσκου Fas σε λεμφοειδή κύτταρα [13, 14], μπορούμε επόμενη ελέγχεται εάν εζρίνης προσελήφθη στο δίσκο TRAIL σε καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου. HCT116 ή SW480 κύτταρα αφέθηκαν μη διεγερμένα (CTL και 0) ή διεγέρθηκαν με 1 μg /ml rhFlag-TRAIL διασυνδεδεμένου με 2 μg /ml Μ2 για 15, 20, 30 ή 60 λεπτά. Μετά από διέγερση, τα κύτταρα λύθηκαν και ο δίσκος ανοσοκατακρημνίστηκε, χρησιμοποιώντας σφαιρίδια σεφαρόζης πρωτεΐνης G. ανοσοκαταβύθιση ελέγχου πραγματοποιήθηκε επίσης χρησιμοποιώντας ένα άσχετο αντίσωμα (CTL) σε μη διεγερμένα κύτταρα. Όπως φαίνεται Σχήμα 1Ε, TRAIL διέγερση που προκαλείται από το σχηματισμό του δίσκου, όπως αποδεικνύεται από την πρόσληψη της πρωτεΐνης προσαρμογέα FADD καθώς εκκινητή κασπάσες-8 και -10 με τους υποδοχείς TRAIL. Πρόσληψη εζρίνης ήταν, ωστόσο, δεν παρατηρήθηκαν με συνέπεια μέσα στο δίσκο TRAIL, ακόμη και μετά από εκλεκτική ανοσοκαταβύθιση του είτε TRAIL-R1 (S2 Εικ) ή TRAIL-R2 (S3 Εικ). Για τον έλεγχο της δυνατότητας που εζρίνης pull-down θα μπορούσε να είναι μη ειδική, μια πρωτεΐνη που δεν σχετίζεται με την TRAIL ή Fas μονοπάτι ανοσοκαταβυθίστηκε σε κύτταρα διεγερμένα με μια άλλη εκδοχή του TRAIL, το RH-His-TRAIL, ένας συνδέτης είναι σε θέση να διεγείρει απόπτωση με την απουσία του Μ2 εγκάρσια σύνδεση. Ανοσοκαταβύθιση των GAPDH τράβηξε τα κάτω παρόμοιες ποσότητες εζρίνης, μοεσίνη και ακτίνη από μη διεγερμένα κύτταρα αλλά σε μικρότερο βαθμό από λύματα που προέρχονται από TRAIL διεγερμένα κύτταρα (Σχ 1 F). Συνολικά αυτά τα αποτελέσματα υποστηρίζουν έναντι φυσιολογική λειτουργία για εζρίνης σε επίπεδο δίσκο σε καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα.

Ezrin φωσφορυλίωση ρυθμίζει TRAIL-επαγόμενο κυτταρικό θάνατο

ρύθμιση της φωσφορυλίωσης εζρίνης προτάθηκε να λογοδοτήσει για την ικανότητά του να παρεμβαίνει με Fas σηματοδότηση [13, 23]. Όπως FasL, TRAIL προκάλεσε μια αύξηση στη φωσφορυλίωση εζρίνης στις θρεονίνη 567 σε SW480 κύτταρα (Σχ 2Α). Επιπλέον, όπως αποδεικνύεται μετά εζρίνης ανοσοκαταβύθιση, μια αύξηση στην εζρίνη τυροσίνης 145 και υπολείμματα σερίνης φωσφορυλίωση βρέθηκε επίσης μετά τη διέγερση TRAIL (Σχήμα 2Β). Από την άλλη πλευρά, ωστόσο, η φωσφορυλίωση της τυροσίνης εζρίνης 353 βρέθηκε να μειώνεται ελαφρώς σε κύτταρα διεγερμένα με TRAIL, αλλά σε μικρότερο βαθμό σε σύγκριση με κύτταρα διεγερμένα με FasL (Σχήμα 2Β).

(Α) Η ανάλυση ανοσοστυπώματος των επιπέδων φωσφο-εζρίνη (Thr567) έκφραση σε κύτταρα SW480 μετά από διέγερση με His-TRAIL, συνδετήρα ή ορθοβαναδικό Fas (NAV). Ποσοστό σχετικής φωσφο-εζρίνη (Thr567) εντάσεις προσδιορίστηκαν ως ακολούθως: Ένταση του συγκεκριμένη ζώνη σε διεγερμένα κύτταρα διαιρούμενη με την κανονικοποιημένη ένταση του μη διεγερμένα κύτταρα, κανονικοποιημένη με την hsc70. (Β) κύτταρα SW480 διεγέρθηκαν με 500 ng /ml His-TRAIL ή 100 ng /ml συνδέτη Fas για 15 λεπτά ή αφεθεί χωρίς θεραπεία. Μετά τη λύση των κυττάρων σε ΝΡ40 που περιέχει ρυθμιστικό διάλυμα, εζρίνη ανοσοκατακρημνίσθηκε με ένα αντίσωμα αντι-εζρίνη (κλώνος 3C12). Το επίπεδο της φωσφορυλίωσης εζρίνης προσδιορίστηκε με κηλίδα western χρησιμοποιώντας αντι-φωσφο-ezrin στόχευση τυροσίνες 353 και 145, αντι-φωσφο-ERM αναγνωρίζοντας φωσφορυλιωμένη-ezrin σε θρεονίνη 567, -moesin σε θρεονίνη 558 και-ραδιξίνης σε θρεονίνη 564 και ενός αντι- τηγάνι φωσφοσερίνη. (C) Σχηματική αναπαράσταση των τομέων εζρίνης και θέσεις φωσφορυλίωσης εντός της πρωτεΐνης. (D) κύτταρα SW480 μολύνθηκαν με ένα άδειο pMSCV ρετροϊού (Mock) ή με μια κωδικοποίηση ezrin φορέα pMSCV WT, εζρίνη S66A, εζρίνη S66D, εζρίνη Y145F, εζρίνη Y145D, εζρίνη Y353F, εζρίνη Y353D, εζρίνη T567A, εζρίνη T567D και ezrin R579A. Τα επίπεδα έκφρασης των κατασκευασμάτων εζρίνης προσδιορίστηκαν με ανοσοστύπωμα από κυτταρικά εκχυλίσματα ΝΡ40 χρησιμοποιώντας αντίσωμα αντι-VSV. Η ακτίνη χρησιμοποιήθηκε εδώ ως έλεγχος φόρτωσης. Τα δεδομένα που εμφανίζονται είναι αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. (Ε) Επιλεγμένα κυτταρικά εκχυλίσματα που λαμβάνονται μετά από λύση σε SDS αναλύθηκαν με ανοσοκηλίδα όπως παραπάνω. (F) Επίδραση εζρίνης WT και εζρίνης phosphomutants έκτοπη έκφραση στο TRAIL-επαγόμενης κυτταρικό θάνατο σε κύτταρα SW480. Τα κύτταρα διεγέρθηκαν με TRAIL 500 ng /ml για 6 ώρες. Η απόπτωση μετρήθηκε με χρώση APO2.7 με κυτταρομετρία ροής. (G) Η βιωσιμότητα των κυττάρων στα κύτταρα SW480 που εκφράζουν εζρίνης S66A, εζρίνη S66D ή εζρίνης R579A σε σύγκριση με ψευδο-μολυσμένα κύτταρα αξιολογήθηκε με μπλε του μεθυλενίου 24 ώρες δοκιμασίας μετά την αγωγή χρησιμοποιώντας αυξανόμενες συγκεντρώσεις του His-TRAIL. (H) Ποσοστό ανασταλτική καμπύλες συγκέντρωσης TRAIL, σε ng /ml, από κύτταρα SW480 που εκφράζουν εκτοπικά τις αναφερόμενες μεταλλάξεις εζρίνης ελήφθησαν με μεθυλεν κυανή χρώση 16 ώρες μετά αυξανόμενες συγκεντρώσεις His-TRAIL. Αντίστοιχες IC25, IC50 και IC90, προκαλώντας το θάνατο 25, 50 και 90% των κυττάρων, ελήφθησαν χρησιμοποιώντας CompuSyn. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν μέση τιμή ± SD από τουλάχιστον 3 ανεξάρτητα πειράματα. * P & lt? 0,05? ** P & lt? 0,01? *** P & lt?. 0.001 αντίστοιχων να Mock κύτταρα ελέγχου

Η

Για να καθοριστεί αν η φωσφορυλίωση ezrin [19, 20, 24] επηρεάζει σηματοδότηση TRAIL, δημιουργήσαμε την επόμενη αρκετές μεταλλάξεις φωσφορυλίωση κωδικοποιεί nonphosphorylatable παραλλαγές ή pseudophosphorylated παραλλαγές εζρίνης, στη σερίνη 66, θρεονίνη 567 και τυροσίνες 145 και 353 θέσεις με τοποκατευθυνόμενη μεταλλαξογένεση (Σχήμα 2C). Εκτός από αυτές τις μεταλλάξεις φωσφορυλίωση, ένα μεταλλαγμένο εζρίνη ελαττωματικά στην F-ακτίνη δέσμευσης, εζρίνη R579A δημιουργήθηκε για να προσδιοριστεί ο ρόλος του κυτταροσκελετού ακτίνης σε εζρίνη μεσολάβηση της αναστολής TRAIL [25]. Η μόλυνση των κυττάρων SW480 με ρετροϊικό φορέα που κωδικοποιεί αυτές τις κατασκευές οδήγησαν στην μεταβλητή αλλά αισθητά τα επίπεδα έκφρασης των μεταλλαγμένων εζρίνης (Σχήμα 2D), με εξαίρεση την nonphosphorylatable παραλλαγής Y145F, ότι εκφράστηκε κυρίως στο αδιάλυτο κλάσμα (Εικ 2Ε). Είναι ενδιαφέρον ότι οι περισσότεροι εζρίνη μεταλλάξεις εξασθενημένη ρυμουλκουμένων (Σχήμα 2F) και την απόπτωση που επάγεται με συνδέτη Fas (S4 Εικ). Είναι αξιοσημείωτο ότι ο nonphosphorylatable παραλλαγή S66A σημαντικά και επιλεκτικά ενισχυμένη απόπτωση που επάγεται από TRAIL ενώ η pseudophosphorylated παραλλαγή S66D κατέδειξε ανώτερη προστατευτική δράση σε σύγκριση με εζρίνη WT και να κοροϊδεύει κύτταρα (Σχ 2F και 2G). Αλλοίωση της φωσφορυλίωσης S66, ωστόσο, απέτυχε να ρυθμίσει εζρίνης μεσολάβηση FasL-επαγόμενη αναστολή απόπτωσης (S4 Εικ). Όπως WT εζρίνη, ο πρόσδεσης ακτίνης με ανεπάρκεια μεταλλαγμένο R579A ανέστειλε απόπτωση που επάγεται από FasL και TRAIL (Σχ 2F και S4 Σχήμα), γεγονός που υποδηλώνει ότι η αναστολή της απόπτωσης που επάγεται από εζρίνη υποδοχέα θανάτου σε καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου μπορεί να συμβεί ανεξάρτητα από τις ιδιότητες του κυτταροσκελετού δέσμευσης του ezrin. Αλλοίωση της φωσφορυλίωσης εζρίνης σε σερίνη 66 φαίνεται να είναι μακράν το πιο σημαντικό γεγονός που ελέγχει την ικανότητα ezrin να αναστέλλει τη σηματοδότηση TRAIL.

Σε σύγκριση με τα γονικά κύτταρα στα οποία περίπου 200 ng /ml TRAIL απαιτούνται για την πρόκληση κυτταρικού θανάτου σε 50% των κυττάρων, τα κύτταρα μεταλλαγμένη εκφράζουν εζρίνης WT ή R579A εμφανίζεται μια IC50 260 και 380 ng /ml, ενώ η IC50 σε S66A κύτταρα που εκφράζουν ήταν μικρότερη από 40 ng /ml και εκείνη του S66D έφθασε 850 ng /ml (Σχ 2G ). Με άλλα λόγια, η ρύθμιση της φωσφορυλίωσης εζρίνης επί S66 διαμορφώνει TRAIL-επαγόμενης ευαισθησία κυτταρικό θάνατο κατά μία τάξη μεγέθους που κυμαίνεται από 0,2 έως περισσότερο από 4 φορές σε σύγκριση με γονικά κύτταρα (Σχ 2Η και S2 Πίνακα, για τιμές% IC).

Ezrin αναστέλλει TRAIL-επαγόμενο κυτταρικό θάνατο κατάντη του δίσκου TRAIL

Ανάλυση της κασπάσης-8 και κασπάσης-10 ενεργοποίησης σε προϊόντα λύσης κυττάρου που λαμβάνεται από κύτταρα SW480 που εκφράζουν είτε εζρίνης WT, R579A, S66A ή S66D, διεγείρονται με αυξανόμενες συγκεντρώσεις του TRAIL, αποκάλυψε ότι το TRAIL DISC σχετίζεται κασπάσες έναρξης ενεργοποιήθηκαν με παρόμοιο τρόπο, ανεξάρτητα από την εζρίνης μετάλλαγμα (σχήμα 3Α). Από την άλλη μεριά, η ενεργοποίηση της κασπάσης-9 και κασπάσης-3 ήταν ελαφρώς ενισχυμένη σε εζρίνη S66A εκφράζουν SW480 κύτταρα και με συνέπεια μειωμένο σε κύτταρα SW480 που εκφράζουν εζρίνης WT, εζρίνη S66D και εζρίνης R579A, όπως jugged από τα αντίστοιχα διασπασμένων προϊόντων (σχήμα 3Α) . Επιπλέον, ο σχηματισμός TRAIL δίσκος ούτε μεταβληθεί από έκτοπη έκφραση της εζρίνης S66A, ούτε μεταλλάξεις S66D (Σχήμα 3Β), και κανένα από τα μεταλλαγμένου εζρίνης που έχουμε δοκιμαστεί μέχρι τώρα ήταν σε θέση να αλλάξουν τα επίπεδα έκφρασης TRAIL-R1 ή TRAIL-R2 (S5 Σχήμα), υποδεικνύοντας ότι η κανονιστική δραστηριότητα εζρίνης του συμβαίνει κατάντη DISC TRAIL, πιθανότατα στο επίπεδο των μιτοχονδρίων. Υποστηρίζοντας το συμπέρασμα αυτό ήταν το εύρημα ότι η ενεργοποίηση Ββχ σε απόκριση προς 200 ng /διέγερση ml TRAIL μειώθηκε από 45% σε 30% σε κύτταρα που εκφράζουν εζρίνης WT ή εζρίνης S66D σε σύγκριση με ψευδο-επιμολυσμένα κύτταρα (Σχ 3C), ενώ, η ενεργοποίηση του Βαχ σε S66A εζρίνη κύτταρα που εκφράζουν έφθασε σχεδόν το 57% των κυττάρων μετά από διέγερση (Σχήμα 3C).

(Α) ανάλυση ανοσοκηλίδος της ενεργοποίησης της κασπάσης, στα κύτταρα SW480 που εκφράζουν είτε εζρίνης S66A, S66D, R579A ή WT, 16 ή 6 ώρες μετά την His-TRAIL (20 ή 200 ng /ml) διέγερσης, αντίστοιχα. (Β) Ανάλυση του σχηματισμού TRAIL DISC στα κύτταρα SW480 που εκφράζουν είτε S66A, S66D, ή WT εζρίνη. Τα κύτταρα διεγέρθηκαν με 5 μg /ml Flag-TRAIL διασυνδεδεμένου με 10 μg /ml (Μ2) αντίσωμα αντι-Flag. Μετά την κυτταρική λύση, ο δίσκος ανοσοκαταβυθίστηκε και αναλύθηκε με στύπωμα Western. (C) Ανάλυση της ενεργοποίησης Βαχ. Ezrin S66A, S66D, WT και ψευδομολυνθέντα SW480 κύτταρα αφέθηκαν χωρίς θεραπεία ή διεγείρονται με His-TRAIL (20 ή 200 ng /ml) για 16 ώρες, στη συνέχεια κατέστησαν διαπερατά και υπέστησαν χρώση με ένα αντίσωμα που αναγνωρίζει ενεργό Βαχ πριν από την ανάλυση με κυτταρομετρία ροής. Η επίδραση των δυο διαφορετικών συγκεντρώσεων TRAIL (20 ή 200 ng /ml, γκρι και μαύρες γραμμές, αντίστοιχα) σε σύγκριση με μη διεγερμένα κύτταρα (γκρι συμπληρώθηκε καμπύλη). Το ποσοστό των κυττάρων που περιέχουν δραστικές Βαχ μετά από διέγερση TRAIL παρουσιάζεται (άνω και κάτω τιμή, αντίστοιχα).

Η

Ezrin μεσολάβηση ρύθμιση TRAIL σχετίζεται με WWOX

πρωτεϊνοκινάσης Α υπήρξε φαίνεται να μεσολαβούν την φωσφορυλίωση εζρίνης επί σερίνης 66 [20]. Όπως φορσκολίνη, έναν ενεργοποιητή της ΡΚΑ, TRAIL επαγόμενη ενεργοποίηση του ΡΚΑ, αλλά επίσης PKC, όπως αποδεικνύεται χρησιμοποιώντας αντισώματα που αναγνωρίζουν ΡΚΑ και PKC υποστρωμάτων (Εικ 4Α και 4Β). Συνεπής με την ενεργοποίηση ΡΚΑ, φωσφορυλίωση του CREB σε σερίνη 133 αυξήθηκαν σε δόση και χρονο-εξαρτώμενη τρόπο σε αυτά τα κύτταρα (Σχήμα 4Β), και φαρμακολογική ρύθμιση της ΡΚΑ σε κύτταρα SW480 phenocopied τη ρύθμιση του TRAIL απόπτωση που επάγεται από τους μεταλλάκτες S66 εζρίνη (σχήμα 4Γ και 4D). Ομοίως, η αναστολή της ΡΚΑ, με τη χρήση του αναστολέα Η89, μιμήθηκε τις επιδράσεις της έκφρασης εζρίνης S66A, αν και σε μικρότερο βαθμό, και αυξημένη TRAIL απόπτωση, ενώ η ενεργοποίηση του ΡΚΑ χρησιμοποιώντας φορσκολίνη ή 8-Bromoadenosine 3 ‘, 5’- κυκλική μονοφωσφορική (8Β), μειώνεται TRAIL επαγόμενη απόπτωση σε SW480 κύτταρα (Σχ 4C και 4D). Θα πρέπει να σημειωθεί εδώ ότι συμφωνεί με τα αποτελέσματα που ελήφθησαν με εζρίνης σερίνη 66 μεταλλακτών φωσφορυλίωση και ισχυρότερη ικανότητά του να πυροδοτήσει ενεργοποίηση ΡΚΑ (Σχήμα 4Β), που επάγεται με συνδέτη κυτταρικό θάνατο Fas, σε αντίθεση με TRAIL, δεν μεταβλήθηκε σημαντικά με φαρμακολογικά ρυθμιστικές ΡΚΑ (Σχ 4C και S6 σχήμα). ΡΚΑ επαγόμενη φωσφορυλίωση της εζρίνης στις S66 έχει αποδειχθεί ότι ρυθμίζει την αλληλεπίδραση του με WWOX (WW οξειδοαναγωγάση που περιέχει την περιοχή) [26], μια πρωτεΐνη καταστολής όγκου [27], η οποία ρυθμίζει την απόπτωση που επάγεται στο μιτοχονδριακό επίπεδο [28]. Είναι ενδιαφέρον ότι, ενώ αμφότερες οι κυτταρικές σειρές καρκινώματος του κόλου SW480 και HCT116 εκφράζουν WWOX, δύο παγκρεατικών κυτταρικών σειρών, ΜΙΑ PaCa-2 και PANC-1, καθώς και η κυτταρική σειρά καρκίνου του ήπατος SK-HEP-1 (Σχήμα 5Α) δεν το κάνουν, και η εκτοπική έκφραση του εζρίνης κβ σε ΜΙΑ PaCa-2 ή SK-HEP-1 απέτυχε να ρυθμίζουν την απόπτωση που επάγεται από FasL ή TRAIL (Σχήμα 5Β). Επιπλέον, ούτε S66A ούτε S66D εζρίνης μεταλλάξεις, οι οποίες σε SW480 κύτταρα εμφανίζουν το πιο εντυπωσιακό ρυθμιστική φαινότυπο, διαμορφωμένο απόπτωση που επάγεται από TRAIL (Σχ 5C). Από την άλλη πλευρά, WWOX σίγηση ανέστειλε απόπτωση που επάγεται από TRAIL τόσο στην Mock και S66A SW480 που εκφράζουν κύτταρα, αλλά όχι σε κύτταρα που εκφράζουν S66D (Σχήμα 5D). Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι η επίδραση της εζρίνης σε απόπτωση επαγόμενη από υποδοχέα θανάτου είναι πιο πιθανό έμμεσο και ότι η ρύθμιση της φωσφορυλίωσης εζρίνης επί σερίνης 66 του ΡΚΑ είναι πιθανό να στοχεύουν WWOX προ-αποπτωτικών δυναμικού, εξηγώντας τουλάχιστον όσον αφορά την ικανότητα μέρει εζρίνης να ελέγχει την απόπτωση που επάγεται από τους υποδοχείς θανάτου.

(Α) γονικά κύτταρα SW480 διεγέρθηκαν για 30 λεπτά με φορσκολίνη και τα κυτταρικά εκχυλίσματα αναλύθηκαν με ανοσοκηλίδα χρησιμοποιώντας επιλεκτική ΡΚΑ ή υπόστρωμα PKC αντισώματα, καθώς και ένα αντίσωμα CREB αντι-φωσφο-S133. (Β) γονικά κύτταρα SW480, αναλύθηκαν όπως παραπάνω μετά από διέγερση με TRAIL ή FasL όπως υποδεικνύεται για 15 έως 120 λεπτά. (Γ) γονικά κύτταρα SW480 ήταν προ-επεξεργασμένο ή όχι για 30 λεπτά με δεικνυόμενες συγκεντρώσεις του forskolin, ακολουθούμενη 6 ωρών διέγερση με 100 ή 500 ng /ml FasL ή TRAIL. Η απόπτωση ποσοστώθηκε με χρώση Hoechst. (D) γονικά κύτταρα SW480 υποβλήθηκαν σε προ-θεραπεία ή όχι για 30 λεπτά με 100 μΜ Η89 ή 20 λεπτά με 4 mM 8Β, ακολουθούμενη 6 ωρών διέγερση με 100 ή 500 ng /ml TRAIL. (Γ και Δ) Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± SD από τουλάχιστον τρία διαφορετικά πειράματα. (** P & lt? 0,01? *** P & lt? 0.001 αντίστοιχες για τον έλεγχο ή Η89 διεγερμένα κύτταρα? Ns σημαίνει όχι στατιστικώς σχετική)

Η

(Α) επίπεδα έκφρασης WWOX στην ενδεικνυόμενη κυτταρικές σειρές αναλύθηκαν. με ανοσοστύπωμα. HSC70 χρησιμοποιήθηκε εδώ ως έλεγχος φόρτωσης. (Β) VSV-εζρίνης WT εκφράστηκε εκτοπικά σε WWOX ελλειμματικά κύτταρα SK-HEP-1 και ΜΙΑ PaCa-2. Τα επίπεδα έκφρασης αναλύθηκαν με ανοσοκηλίδα και απόπτωση στα αντίστοιχα κυτταρικές γραμμές μετά FasL (100 ng /ml) ή TRAIL (500 ng /ml) διέγερση αναλύθηκε με χρώση Hoechst. (Γ) S66A και S66D εζρίνης μεταλλάγματα εκφράστηκαν σε ΜΙΑ PaCa-2. Τα επίπεδα έκφρασης αναλύθηκαν με ανοσοκηλίδα όπως παραπάνω και η ευαισθησία των κυττάρων σε TRAIL-επαγόμενο κυτταρικό θάνατο προσδιορίστηκε ποσοτικά με κυανού του μεθυλενίου. κύτταρα (D) SW480 που εκφράζουν είτε εζρίνης βάρος ή εζρίνης S66A ή S66D επιμολύνθηκαν με μπάλα (SCR) ή WWOX (WOXX) SI-RNAs για 4 ώρες και ευαισθησία στην απόπτωση που επάγεται από TRAIL ποσοτικοποιήθηκε με χρώση Hoechst. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± SD από τουλάχιστον τρία διαφορετικά πειράματα. (** P & lt? 0,01? * P & lt? 0,05 αντίστοιχων να Scr siRNA επιμολυσμένα κύτταρα? Ns σημαίνει όχι στατιστικά σχετικό).

Η

Συζήτηση

Αν και η συμβολή των εζρίνης σε Fas σηματοδότηση έχει μελετηθεί εκτεταμένα, λίγα είναι γνωστά σχετικά με TRAIL, με εξαίρεση μια πρόσφατη μελέτη στην οποία προτάθηκε εζρίνης να βλάψουν τόσο Fas συνδέτη και TRAIL-επαγόμενης κυτταρικό θάνατο σε Τ-κύτταρο όγκου κυτταρική γραμμή λεμφώματος Η9 [14]. Στη μελέτη αυτή, εζρίνη προτάθηκε να αναστέλλει τη μεσολάβηση υποδοχέων θανάτου κυτταρικό θάνατο σε κύτταρα τύπου Ι, οι οποίες είναι ανεξάρτητες της μιτοχονδριακής οδού, αλλά όχι σε κύτταρα τύπου [14] που βασίζονται στα μιτοχόνδρια II [29]. Στα χέρια μας, αρνητική ρυθμιστική λειτουργία εζρίνης δεν ήταν αυστηρά περιορισμένη σε κύτταρα τύπου Ι, αφού Fas συνδέτη και TRAIL-επαγόμενης κυτταρικό θάνατο ανεστάλησαν από εζρίνη υπερέκφραση τόσο στο SW480 και σε κύτταρα HCT116, που θεωρείται ως τύπος Ι και τύπου II, αντίστοιχα.

Ezrin μεσολάβηση ρύθμιση του κυτταρικού θανάτου TRAIL που προκαλείται δεν ήταν ούτε σχετίζεται με αλλαγές στις προσλήψεις συστατικό TRAIL DISC ούτε σε διαφορετική ενεργοποίηση των κασπασών εκκινητή μέσα στο δίσκο, συμπεριλαμβανομένης της κασπάσης-8.