Αφηρημένο

Ιστορικό

Twist2 έχει αποδειχθεί ότι για την προώθηση των ανθρωπίνων εισβολή όγκου, όπως στον καρκίνο του μαστού και Καρκίνος του τραχήλου της μήτρας. Ωστόσο, αν Twist2 προωθεί τα ανθρώπινα εξέλιξης του καρκίνου των ωοθηκών παραμένει να διευκρινιστεί. Εδώ, θα διερευνήσει το ρόλο των Twist2 στη ωοθηκών εισβολή καρκίνου και μετάσταση, καθώς και των υποκείμενων μοριακών μηχανισμών.

Μέθοδοι

Twist2 έκφραση ανιχνεύθηκε με ανοσοϊστοχημεία (IHC) σε μικροσυστοιχίες ιστό του ανθρώπινου ωοθηκών καρκίνοι με διαδικασία βαθμολόγησης ανάλογα με την ένταση χρώσης και μοτίβο. Twist2 γονίδιο εισήχθη σταθερά σε SKOV-3 καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών να εξετάσει τις αλλαγές της κυτταρικής μορφολογίας, κινητικότητα, διεισδυτικότητα, και EMT μοριακών δεικτών.

Αποτελέσματα

Twist2 έκφραση είναι σημαντικά αυξημένη σε καρκίνους των ωοθηκών μαζί με το στάδιο της νόσου ΦΥΓΩ, υποδεικνύοντας ότι Twist2 μπορεί να συνδέεται με τη μετάσταση του καρκίνου των ωοθηκών. Η υπερέκφραση του Twist2 επάγεται το φαινότυπο ΕΜΤ συμπεριλαμβανομένων ρύθμιση προς τα κάτω της Ε-καδερίνης, και προς τα πάνω ρύθμιση του Ν-καντερίνης και β-κατενίνης σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών, προτείνοντας ότι Twist2 μπορεί να προάγει την απελευθέρωση β-κατενίνης από το σύμπλοκο Ε-καδερίνης /β-κατενίνης μέσω αναστολή της Ε-καδερίνης. Έτσι, η υποβάθμιση β-κατενίνης ανεστάλη οφείλεται στην αναστολή της APC, και η οδός /β-κατενίνης Wnt στη συνέχεια ενεργοποιείται με συσσώρευση πυρηνικής β-κατενίνης, η οποία μπορεί να ενεργοποιήσει μεταγραφή των κατάντη γονιδίων-στόχων για την προώθηση εισβολή και μετάσταση όγκου. Συλλογικά, αυτά τα δεδομένα έδειξαν ότι β-κατενίνης εμπλέκεται σε Twist2 επαγόμενη EMT στον καρκίνο των ωοθηκών.

Συμπέρασμα

Τα δεδομένα μας δείχνουν ότι προς τα πάνω ρύθμιση του Twist2 συσχετίζεται με το στάδιο ΦΥΓΩ σε ανθρώπινους καρκίνους των ωοθηκών . Σε αυτή την έκθεση, αποδείξαμε ότι η πυρηνική β-κατενίνης συσσωρεύεται στο Twist2 επαγόμενη EMT κύτταρα να διευκολύνει ωοθηκών εισβολή καρκίνου και μετάσταση

Παράθεση:. Μάο Υ, Xu J, Li Ζ, Ζανγκ Ν, Γιν H, Liu Ζ (2013) Ο ρόλος της πυρηνικής β-κατενίνης συσσώρευση στο Twist2-Induced καρκίνο των ωοθηκών EMT. PLoS ONE 8 (11): e78200. doi: 10.1371 /journal.pone.0078200

Επιμέλεια: Mechthild Hatzfeld, Martin-Luther-University Halle, Γερμανία

Ελήφθη: 15 Ιαν του 2013? Αποδεκτές: 10 Σεπτεμβρίου του 2013? Δημοσιεύθηκε: 11 Νοεμβρίου 2013

Copyright: © 2013 Μάο et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (https://www.nsfc.gov.cn, Νο 30872515, YB Μάο) και της βασικής έρευνας ταμεία για τις Κεντρικές πανεπιστήμια της Κίνας (Νο 2011121062, YB Μάο), και το Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της επαρχία Fujian της Κίνας (Αρ 2012J01417, YB Μάο). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Παρά την πρόσφατη πρόοδο στην κατανόηση της ανάπτυξης καρκίνου των ωοθηκών και της εξέλιξης, ο καρκίνος των ωοθηκών παραμένει έχει το υψηλότερο ποσοστό θνησιμότητας που σχετίζεται γυναικολογικών κακοήθειας στο κυρίως δυτικές χώρες, λόγω του προχωρημένου σταδίου της νόσου κατά τη διάγνωση (στάδια ΙΙΙ-IV) . Η συντριπτική πλειοψηφία των γυναικών διαγιγνώσκονται με διάχυτη ενδοπεριτοναϊκή καρκινωμάτωση [1], [2]. Η πρόσφατη βιβλιογραφία υποδεικνύει ότι η επιθηλιακή προς μεσεγχυματικά μετάβαση (ΕΜΤ) διαδραματίζει έναν κρίσιμο ρόλο στην εξέλιξη της ωοθηκικών καρκινωμάτων [3], [4]. EMT ορίζεται από ένα συγκρότημα μοριακή και κυτταρική πρόγραμμα με το οποίο τα επιθηλιακά κύτταρα χάνουν τα διαφοροποιημένα χαρακτηριστικά τους όπως προσκόλληση κυττάρου-κυττάρου, ακραία-βασική πολικότητα, η έλλειψη της κινητικότητας των κυττάρων και του κέρδους των χαρακτηριστικών μεσεγχυματικών συμπεριλαμβανομένης της κινητικότητας, της διεισδυτικότητας και αυξημένη αντοχή σε απόπτωση [5 ]. Τα παρόμοια κυτταρική ανάπλαση και σηματοδότηση δίκτυα φαίνεται να είναι ενεργά κατά τη διάρκεια της μετάστασης του καρκίνου [6], [7]. Έχει προταθεί ότι η πρωταρχική ΕΓΚ μπορούν να υποβληθούν σε μια διαδικασία EMT κατά τη διάρκεια της τοπικής εισβολής στο περιτόναιο και να διατηρούν τα χαρακτηριστικά των μεσεγχυματικών στις προηγμένες όγκους.

Οι μεταγραφικοί παράγοντες της οικογένειας Twist (Twist1, Twist2), σαλιγκάρι οικογένειας (SNAI1 /σαλιγκάρι , SNAI2 /γυμνοσάλιαγκα), καθώς και Zeb οικογένεια (ZEB1, ZEB2), τον έλεγχο της διαδικασίας EMT στον καρκίνο [5], [8], [9]. Twist2 έχει δειχθεί ότι προάγει την εξέλιξη του όγκου μέσω της ΕΜΤ στον καρκίνο του μαστού [10]. Twist2 είναι ένας πιθανός προγνωστικός δείκτης για τον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας [11], αδενοκυστικό καρκίνωμα [12], και η γλώσσα καρκίνωμα των πλακωδών κυττάρων [13]. Twist2 συσχετίζεται επίσης με τη φτωχή βαθμού διαφοροποίησης και μικρή επιβίωση κεφαλής και λαιμού πλακωδών κυττάρων καρκινώματα [14]. Ωστόσο, αν Twist2 προωθεί τα ανθρώπινα εξέλιξης του καρκίνου των ωοθηκών παραμένει ελάχιστα κατανοητή. Εδώ, έχουμε ερευνήσει το ρόλο των Twist2 στην πρόοδο του καρκίνου των ωοθηκών και των πιθανών μοριακών μηχανισμών που διέπουν τη Twist2 επαγόμενη εισβολή καρκίνου και μετάσταση. Δείξαμε Twist2 εκφράζεται έντονα σε ιστούς του καρκίνου των ωοθηκών. Η έκτοπη έκφραση του Twist2 σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών παρέχει ένα φαινότυπο EMT. Επιπλέον, η ενεργοποίηση β-κατενίνης μπορεί να συμμετέχει σε αυτές τις Twist2 που προκαλείται από τις ιδιότητες EMT.

Αποτελέσματα

1. Αυξημένη έκφραση Twist2 συσχετίστηκε με το στάδιο της νόσου στην πρωτογενή καρκίνο των ωοθηκών

IHC αναλύσεις έδειξαν την παρουσία υψηλών επιπέδων Twist2 σε καρκινικά κύτταρα των πρωτογενών όγκων των ωοθηκών σε συστοιχία ιστού (Εικόνα 1). Twist2 έκφραση ήταν σημαντικά αυξημένη σε καρκίνο των ωοθηκών (70,24%, 59 σε 84 περιπτώσεις) σε σχέση με το φυσιολογικό ιστό ωοθηκών (Ρ & lt? 0,05, Εικόνα 1, Πίνακας 1). Η θετική χρώση Twist2 ανιχνεύθηκε τόσο στον πυρήνα και το κυτταρόπλασμα.

τομές ιστών από ωοθηκικών καρκινωμάτων και φυσιολογικές ωοθήκες αναλύθηκαν με κηλίδωση IHC με ένα ειδικό μονοκλωνικό αντίσωμα κατά της ανθρώπινης Twist2. Η θετική χρώση Twist2 δείχθηκε σε καφέ χρώμα. Οι τομές βάφτηκαν αντίθετα με αιματοξυλίνη για να δείξει πυρήνες. Αντιπροσωπευτικά εικόνες χρώσης Twist2 σε ζεύγη κανονική ωοθήκη και επιθηλιακά καρκινώματα των ωοθηκών εμφανίζεται. Αριθ έκφραση Twist2 μπορούσε παρατηρηθεί σε φυσιολογικούς ιστούς ωοθήκη ενηλίκων, ενώ θετικές εκφράσεις Twist2 εντοπίστηκαν κυρίως σε κυτόπλασμα ή πυρήνα του ορώδες αδενοκαρκίνωμα και των βλεννωδών αδενοκαρκινώματος κύτταρα όγκου ωοθηκών. Μέγεθος × 200, 400 ×.

Η

Σύμφωνα με την ιστολογική κατάταξη τύπο, ισχυρή έκφραση της Twist2 βρέθηκε σε 19 από τις 69 ορώδες καρκίνωμα (27,54%), 1 από 8 βλεννώδες καρκίνωμα (12,5% ), κανένα από 4 καρκινωμάτων endometriod (0%), και 2 από 5 Clear καρκινώματα (40%). Καμία σημαντική διαφορά θα μπορούσε να ανιχνευθεί σε διάφορους όγκους ιστολογικού τύπου (Ρ & gt? 0,05). Η έκφραση της Twist2 αυξήθηκε μαζί με το στάδιο ΦΥΓΩ (P & lt? 0,05), γεγονός που επιβεβαιώνεται ως εξής: 22,73% στο στάδιο Ι (10 σε 44 περιπτώσεις), ενώ το 53,85% στο στάδιο IV (7 σε 13 περιπτώσεις). Συνολικά, κατά το στάδιο Ι, 31.82% (14/44) περιπτώσεις έδειξε Twist2 αρνητική έκφραση, 45.45% (20/44) περιπτώσεις έδειξαν ασθενή έκφραση, και 22,73% (10/44) περιπτώσεις εμφανίζεται ισχυρή έκφραση? στο στάδιο ΙΙ, Twist2 αρνητική 7,69% (1/13)? ασθενής έκφραση: 61.54% (8/13), και την ισχυρή θετική: 30.77% (4/13)? στο στάδιο III, Twist2 αρνητική έκφραση: 57,14% (8/14), η ασθενής έκφραση: 35,71% (5/14), και ισχυρή έκφραση: 7,14% (1/14)? κατά το στάδιο IV, αρνητική έκφραση: 15.38% (2/13), αδύναμη έκφραση: 30.77% (4/13), ισχυρή έκφραση:. 53,85% (7/13)

Αυτά τα δεδομένα κατέδειξαν ότι η πρωτεΐνη Twist2 αυξάνεται σημαντικά σε ιστούς του καρκίνου των ωοθηκών και το υψηλό επίπεδο των Twist2 συσχετίστηκε με το στάδιο της νόσου ΦΥΓΩ, γεγονός που υποδηλώνει ότι Twist2 μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως δείκτης της υψηλής ποιότητας της κακοήθειας και κακή πρόγνωση σε ανθρώπινους καρκίνους των ωοθηκών. Ωστόσο, δεν υπάρχει καμία συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης Twist2 και του όγκου ιστολογικό τύπο.

2. Twist2 έκφραση επηρεάζεται η μορφολογία των κυττάρων, αλλά όχι ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων του SKOV-3 κύτταρα

in vitro

Η

Για να εξακριβωθεί αν Twist2 είναι ένα κρίσιμο μεσολαβητής του καρκίνου των ωοθηκών, της εξέλιξης, ιδρύσαμε κυτταρικές σειρές που υπερεκφράζουν σταθερά Twist2 (Εικ. 2Α). Στη συνέχεια αναλύεται /SKOV-3 κύτταρα Twist2 και γονικών κυττάρων τους μέσω μορφολογική παρατήρηση των κυττάρων, κυτταρομετρία ροής (FCM), και δοκιμασία ΜΤΤ.

A. Η έκτοπη έκφραση της Flag-taggedTwist2 σε SKOV-3 (Twist2 /SKOV-3) τα καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών ελέγχθηκε με στύπωμα Western. Twist2 /SKOV-3 κύτταρα εξέφρασαν τόσο Twist2 και τη σημαία-tag σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου φορέα. χρώση Β Twist2 παρατηρήθηκε χρησιμοποιώντας το συνεστιακό μικροσκόπιο σάρωσης με λέιζερ (Olympus) σε SKOV-3 κύτταρα. Οι πυρήνες βάφτηκαν αντίθετα με DAPI (μπλε). χρώση ανοσοφθορισμού των Twist2 σε κύτταρα Twist2 /SKOV-3, που δείχνει κύτταρα με Twist2 (σε πράσινο) σε πυρήνες κυττάρων σε σύγκριση με τον έλεγχο φορέα SKOV-3 κύτταρα. Τα κύτταρα από τα σταθερώς επιμολυσμένα δείγματα. Γ κυττάρων μορφολογικά σχήματα παρατηρήθηκαν χρησιμοποιώντας μικροσκοπία φάσης (Όλυμπος). Twist2 /SKOV-3 κύτταρα πήρε το ινοβλάστες παρόμοια μορφολογικά σχήμα, ενώ τα κύτταρα ελέγχου φορέα /SKOV-3 εμφανίστηκε επιθηλιακών κυττάρων σχήμα.

Η

Στο αρχικό χαρακτηρισμό αυτών των κυττάρων, παρατηρήσαμε μια ξεχωριστή μορφολογική μεταβολή στα κύτταρα που υπερεκφράζουν Twist2 (Εικ. 2Β). Τα κύτταρα SKOV-3 που εκφράζουν Twist2 υποβλήθηκε σε μια φαινοτυπική αλλαγή και εμφανίζονται μοιάζουν με ινοβλάστες μεσεγχυματικών μορφολογικές σχήμα, ενώ τα κύτταρα ελέγχου SKOV-3 (Vector /SKOV-3) φαίνονται επίπεδες επιθηλιακό κύτταρο μορφολογικές σχήμα (Σχ. 2Β). χρώση ανοσοφθορισμού έδειξε ότι Twist2 εντοπίζεται σε πυρήνες, η οποία ήταν σύμφωνη με το γεγονός ότι Twist2 είναι ένας παράγοντας μεταγραφής (Σχ. 2C).

Στη συνέχεια αξιολογήθηκε ο πολλαπλασιασμός των SKOV-3 κύτταρα που εκφράζουν Twist2through αναλύσεις Η κατανομή κυτταρικού κύκλου και το ρυθμό ανάπτυξης των κυττάρων. Τα αποτελέσματα δεν έδειξαν εμφανή επίδραση της έκφρασης Twist2 στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό (Σχ. 3Α, 3Β). Όπως Akt και Erk1 /2 είναι σημαντικοί δείκτες που εμπλέκονται στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, οι εκφράσεις αυτών των πρωτεϊνών και φωσφορυλίωση τους εξετάσθηκαν με ανάλυση κηλίδος Western. Συνέπεια, δεν είχαμε την ανίχνευση μεταβολών στη Akt, Erk1 /2, και τις μορφές φωσφορυλίωση τους σε Twist2 /SKOV-3 κύτταρα Realtive με τα κύτταρα ελέγχου φορέα /SKOV-3 (Σχ. 3C).

Α. Κυτταρομετρίας ροής ανάλυση δεν έδειξε καμία διαφορά της κατανομής του κυτταρικού κύκλου μεταξύ καρκίνου SKOV-3 κύτταρα με ή χωρίς Twist2 έκτοπη έκφραση. B. Ο ρυθμός πολλαπλασιασμού των επιμολυσμένων κυττάρων ανιχνεύθηκε και συγκρίθηκε με εκείνη του ελέγχου φορέα μέσω απαριθμήσεις βιώσιμων κυττάρων με χρήση χρώσης trypan-blue. Εις τριπλούν προσδιορισμοί πραγματοποιήθηκαν σε κάθε ομάδα κυττάρων. Τα δεδομένα εκφράστηκαν ως μέση τιμή ± SD. Κανένας προφανής η επιρροή της Twist2 παρατηρήθηκε στο ρυθμό ανάπτυξης των κυττάρων. Γ Εκφράσεις της Akt, Erk1 /2, και τις μορφές phosphoralation τους υποδεικνύεται Twist2 είχε καμία επίδραση στον πολλαπλασιασμό με κηλίδα Western. Σε σύγκριση με τα κύτταρα Vector /SKOV-3, δεν προφανείς αλλαγές της Akt, Erk1 /2, και τις μορφές φωσφορυλίωση τους βρέθηκαν σε Twist2 /SKOV-3 κύτταρα.

Η

3. Twist2 Έκφραση Ενισχυμένη τη Μετανάστευση και την εισβολή των SKOV-3 καρκίνου των ωοθηκών κύτταρα

Twist2 έχει αποδειχθεί ότι είναι ένας σημαντικός επαγωγέας της EMT σε καρκίνο του μαστού και του τραχήλου της μήτρας. EMT διαδικασία προωθεί τα επιθηλιακά κύτταρα για να εμφανιστεί το σχήμα των ινοβλαστών, η οποία χαρακτηρίζεται από αυξημένη κινητικότητα και διεισδυτικότητα [15]. Για να καθοριστεί εάν Twist2 /SKOV-3 κύτταρα έχουν αποκτήσει την αυξημένη ικανότητα να μεταναστεύουν, πραγματοποιήσαμε μια πληγή δοκιμασία στην οποία η κινητικότητα των κυττάρων που βρίσκονται στην άκρη του τραύματος εκτιμήθηκε με βάση την ικανότητά τους να αποικίζουν τον πληγωμένο περιοχή επούλωσης. Με την παρουσία του ορού (10% FBS), αποκατάσταση τραύματος παρατηρήθηκε ταχύτερη στα κύτταρα Twist2 /SKOV-3 από ομάδα κύτταρα ελέγχου στις 24 ώρες (Σχ. 4Α). Καθώς δεν υπήρχε αύξηση στον πολλαπλασιασμό που επάγεται από Twist2 (Σχ. 3C), οι SKOV-3 κύτταρα Twist2 /ενδέχεται να έχει την μεγαλύτερη κυτταρική μετανάστευση δυναμικού

in vitro

σε «επούλωση των πληγών» δοκιμασία (Σχ. 4Α, 4Β ). Αυτά τα αποτελέσματα επιβεβαιώθηκαν με μια δοκιμασία θαλάμου Transwell που περιέχει ένα εξωκυτταρικό στρώμα μήτρας (matrigel). Όπως φαίνεται στην Εικόνα 4C, ο αριθμός των /SKOV-3 κύτταρα Twist2 μετανάστευσαν μέσω των πόρων είναι μεγαλύτερη από τα κύτταρα ελέγχου έκαναν.

A. In vitro τραύματος δοκιμασία SKOV-3 καρκινικά κύτταρα επούλωσης με ή χωρίς Twist2 έκτοπη έκφραση. Αντιπροσωπευτικές εικόνες των κυττάρων σε θέσεις «θεραπεία» στους 12 και 24 ώρες μετά την απόξεση δείχνονται αυξημένη μετανάστευση των κυττάρων σε κύτταρα Twist2 /SKOV-3. B. Η ανέλυσε τα αποτελέσματα της μετανάστευσης από τη δοκιμή ANNOVA ένας τρόπος (λογισμικό Graphpad Prism5). Ένα P-τιμή του 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική. Οι Twist2 εκφράζουν SKOV-3 κύτταρα μετανάστευσαν ταχύτερα από τα κύτταρα ελέγχου φορέα-επιμολυσμένα. C. Ιη vitro δοκιμασία Matrigel εισβολή του SKOV-3 κύτταρα με ή χωρίς έκτοπη έκφραση της Twist2. Ποσοτικοποίηση έδειξε ότι Twist2-κύτταρα που εκφράζουν είναι 8-9 διπλώνει πιο επεμβατική από τα κύτταρα ελέγχου φορέα στον vitro δοκιμασία εισβολής στην Matrigel. *,

σ

& lt?. 0.005

Η

4. Πυρηνική β-κατενίνης συσσωρεύτηκε σε κύτταρα καρκινώματος των ωοθηκών όταν Twist2 επαγόμενη EMT φαινότυπο

Όταν Twist2 υπερ-εκφράζεται σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών, η μορφολογία καρκινικών κυττάρων μετασχηματίστηκε σε παρόμοια με ινοβλάστη σχήμα μαζί με αυξημένη κινητικότητα και διεισδυτικότητα, ενώ καμία αλλαγή βρέθηκε στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων. Τα στοιχεία μας έδειξαν ότι η αναγκαστική έκφραση Twist2 θα μπορούσε να ωθήσει αυτά τα EOCs να υποβληθούν σε επιθηλιακά-μεσεγχυματικά μετάβασης.

EMT συνήθως περιλαμβάνει τη διάσπαση των σφιχτών συνδέσεων, ενώσεις προσφύσεως που συμβάλλουν στο διαχωρισμό σε μεμονωμένα κύτταρα [16], [17]. Για να καθοριστεί περαιτέρω εάν η έκφραση του Twist2 προωθεί πράγματι EMT σε αυτά των ωοθηκών καρκινικά κύτταρα, εξετάσαμε την έκφραση Ε-καδερίνης και Ν-cadherin, δύο καθιερωμένες επιθηλιακών στους φορείς λήψης μεσεγχυματικά, σε Twist2 εκφράζουν και ο φορέας-επιμολυσμένα SKOV-3 κύτταρα. Βρήκαμε ότι η έκφραση της Ε-καδερίνης (επιθηλιακό maker) ήταν αξιοσημείωτα μειωμένη σε Twist2-κύτταρα που εκφράζουν σε σχέση με τα κύτταρα ελέγχου, αλλά η έκφραση του Ν-καδερίνης (μεσεγχυματικά maker) αυξήθηκε στα κύτταρα που εκφράζουν Twist2 με πραγματικού χρόνου PCR ( Σχ. 5Α, 5Β). Επιβεβαιώσαμε περαιτέρω τα αποτελέσματα της έκφρασης Ε-καδερίνης, Ν-καντερίνης με Western Blot (Σχ. 5C).

Α και Β Real Time PCR αποτελέσματα Twist2, Ε-καδερίνης, Ν-cadherin, και APC mRNA που εκφράζουν επίπεδα στους Twist2 κύτταρα που εκφράζουν και τα κύτταρα ελέγχου φορέα-επιμολυσμένα (* Ρ & lt? 0,05, ** Ρ & lt? 0,01, *** Ρ & lt? 0.001). Αποτελέσματα Γ Western Blot του Twist2, Ε-καδερίνης, Ν-cadherin, η έκφραση β-κατενίνης στα Twist2 /SKOV-3 κύτταρα σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου φορέα /SKOV-3. D. Διανομή β-κατενίνης σε κυτταρόπλασμα και στον πυρήνα ανιχνεύονται με την μέθοδο κύτταρο κλασματοποίησης. P-γονική SKOV-3 καρκινικά κύτταρα, V-διάνυσμα-επιμολυσμένα κύτταρα ελέγχου, Τ-Twist2 εκφράζουν SKOV-3 κύτταρα.

Η

Όπως Twist2 κύτταρα /SKOV-3 εμφανίζονται οι μορφολογικές αλλαγές (Εικ. 2Β), ενισχυμένη δυνατότητα να μεταναστεύσουν (Εικ. 4), και δείκτες EMT έκφρασης, καταλήξαμε στο συμπέρασμα ότι η έκτοπη έκφραση της Twist2 προωθεί ένα φαινότυπο ΕΜΤ σε επιθηλιακά κύτταρα του καρκινώματος των ωοθηκών.

είναι γνωστό ότι η β-κατενίνης σύμπλοκο -Ε-καντερίνη αποτελεί το δομικό πυρήνα των επαφών προσφύσεως, και παρεμποδίζει τη μεταφορά β-κατενίνης στον πυρήνα και μεταγραφική δραστηριότητα της [18]. β-κατενίνης ήταν επίσης επάνω ρυθμισμένη στα Twist2 κύτταρα που εκφράζουν σε σχέση με τα κύτταρα ελέγχου με μειωμένη Ε-καδερίνης (Εικ. 5C). Σχήμα 5D έδειξε διανομή β-κατενίνης με την μέθοδο κύτταρο κλασμάτωση. Πυρηνική β-κατενίνης αυξήθηκε σε Twist2 /SKOV-3 κύτταρα. Επιπλέον, η APC mRNA μειώθηκε (Σχ. 5Β).

5. TOPflash μεταγραφική ανάλυση 293FT κυττάρων

Για να ανιχνευθεί η επίδραση των Twist2 επαγόμενης πυρηνική μετατόπιση του β-κατενίνης επί της έκφρασης γονιδίου, ελέγξαμε κατάντη γονίδια στόχους όπως c-myc, Κυκλίνη-D1 σε Wnt σηματοδοτικό μονοπάτι . Αμφότερες οι c-Myc και Κυκλίνη D1-αυξήθηκαν με Twist2 υπερέκφραση (Σχήμα 6). Στη συνέχεια μετράται TCF /LEF-εξαρτώμενη μεταγραφική δραστηριότητα χρησιμοποιώντας TOP /FOP πλασμίδια αναφοράς flash. Μετά γονίδια ανταποκριτές εισήχθησαν σε 293FT κύτταρα για 48 ώρες, η μεταγραφική δραστικότητα αξιολογήθηκε με λουσιφεράση και δραστηριότητα Renilla. 293FT κύτταρα έδειξαν σημαντικά αυξημένα LEF /TCF εξαρτώμενη μεταγραφή με Twist2 συν-επιμόλυνσης (σε σχέση προς τον φορέα ελέγχου? Ν = 3? Ρ & lt? 0,001? Εικόνα 7).

Όπως c-Myc και κυκλίνη D1 είναι ως επί το πλείστον θεωρούνται ως γονιδίων στόχων Wnt, εξετάσαμε περαιτέρω τις εκφράσεις τους με κηλίδα western επαναλαμβάνεται για τρεις φορές. ανάλυση ανοσοκηλίδος που δείχνει ότι και οι δύο γ-Myc και κυκλίνη-D1 αυξήθηκε σε ομάδα Twist2 /SKOV-3 σε σύγκριση με την ομάδα Vector /SKOV-3 στην αντιπροσωπευτική εικόνα.

Η

Για να μετρηθεί TCF4 /LEF1 εξαρτώμενη μεταγραφική δραστικότητα του 293FT κυτταρικές σειρές, τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με TOP /FOP πλασμίδια φλας ανταποκριτή. Μετά την επιμόλυνση γονιδίων για 48 ώρες, η μεταγραφική δραστικότητα μετρήθηκε με τη χρήση διπλής Λουσιφεράσης σύστημα προσδιορισμού Reporter. Κύτταρα σε FOP ομάδες flash έδειξαν αμελητέα επίπεδα της μεταγραφικής δραστηριότητας. Σε αντίθεση, τα κύτταρα σε ομάδες TOPflash συν-επιμολύνθηκαν με Twist2 εμφάνισαν σημαντική αύξηση στο σήμα. Τα αποτελέσματα είναι ο μέσος όρος ± s.d. από τρία πειράματα (Ν = 3? Ρ & lt? 0.001).

Η

Πάρτε μαζί, αυτά τα δεδομένα αποδεικνύουν ότι η υπερέκφραση Twist2 σε SKOV-3 κύτταρα διαταράσσει κυττάρου-κυττάρου προσφύσεων επαφές και προάγει την κυτταρική μετανάστευση. Με τη μειωμένη Ε-καδερίνης, β-κατενίνης που απελευθερώνεται από σύμπλεγμα Ε-καδερίνης /β-κατενίνης. Εν τω μεταξύ, η υποβάθμιση β-κατενίνης μειώνεται συνοδεύεται περαιτέρω από τη μειωμένη APC, η οποία είχε ως αποτέλεσμα την συσσώρευση των ελεύθερων β-κατενίνης στο κυτταρόπλασμα και προκάλεσε μεταφορά β-κατενίνης στον πυρήνα να αυξήσουν την μεταγραφική δραστικότητα της. Αυτά τα δεδομένα έδειξαν ότι η πυρηνική β-κατενίνης είχε εμπλακεί σε Twist2 επαγόμενη EMT του καρκίνου των ωοθηκών.

Συζήτηση

Ο καρκίνος των ωοθηκών είναι μια ιδιαίτερα μεταστατικής νόσου και η ταυτοποίηση των μορίων ή /και οδών σηματοδότησης που εμπλέκονται σε εισβολή καρκίνου και μετάσταση είναι πολύ σημαντικό για τις οποίες η ανίχνευση πρώιμου σταδίου εξακολουθεί να αποτελεί εμπόδιο [4]. Ο καρκίνος των ωοθηκών κύτταρα είναι επιρρεπή σε μετάσταση σε ολόκληρη την περιτοναϊκή κοιλότητα κυρίως από ενδοκοιλιακές διάδοσης και με λεμφικό διάδοσης. Η μετάσταση είναι μία πολύπλοκη διαδικασία που περιλαμβάνει αλλαγές στο εξωκυττάριο κόμβους μήτρας και κυττάρου-κυττάρου. Επιθηλιακών-to-μεσεγχυματικά μετάβασης (EMT) είναι ένα απαραίτητο βήμα προς τη μεταστατική εξέλιξη του όγκου κατά τη διάρκεια της απόσπασης των καρκινικών κυττάρων από τον πρωτογενή χώρο του όγκου και προσκόλληση σε μεταστατικές θέσεις. Λίγες μελέτες έχουν εξετάσει τους παράγοντες που προωθούν την EMT του επιθηλιακού καρκίνου των ωοθηκών (EOC) κυττάρων [4], [19].

Πολλές ρυθμιστικές EMT-προκαλώντας καταστέλλουν E-cadherin μεταγραφή,

μέσω

αλληλεπίδρασης με ειδικές E-boxes του εγγύς υποκινητή Ε-καδερίνης [20]. Σημαντικότερα από αυτά είναι το σαλιγκάρι (SNAI1 και Slug) [21], [22], Zeb (ZEB1 και ZEB2) [23] και τις βασικές helixloop-έλικα (bHLH) (Twist1 [24]) οικογένειες παράγοντα μεταγραφής. Μόνο πρόσφατα, πειστικά στοιχεία έδειξαν ότι Twist2 υπερέκφραση σημαντικά συνδέονται με τον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας εξέλιξη [25], [26]. Twist2 ενεργοποιεί προγράμματα ΕΜΤ και προωθεί ένα φαινότυπο καρκινικό κύτταρο βλαστικών στον καρκίνο του μαστού [10]. Ωστόσο, η βιολογική λειτουργία της Twist2 στον όγκο έχει παραμείνει ως επί το πλείστον άγνωστα.

Σε αυτή τη μελέτη, θα παρέχουν την πρώτη απόδειξη ότι η έκφραση Twist2 συνδέεται με υψηλό στάδιο ΦΥΓΩ στον καρκίνο των ωοθηκών. Μπορεί να αναμένεται ότι Twist2 παίζει παρόμοιες λειτουργίες ΕΜΤ στον καρκίνο των ωοθηκών. Για το σκοπό αυτό, παρουσιάσαμε

twist2

στην SKOV-3 ωοθηκών κυτταρική γραμμή και εξετάστηκαν κύτταρα βιολογικές συμπεριφορές συμπεριλαμβανομένης πολλαπλασιασμό, τη μετανάστευση και εισβολή. Βρήκαμε ότι η υπερ-έκφραση του Twist2 είχε καμία επίδραση στην κυτταρική ανάπτυξη και Akt, Erk1 /2 ενεργοποίηση. Ενδιαφέρον, τα κύτταρα Twist2 /SKOV-3 αύξησε την μετανάστευση και την εισβολή των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών, όπως αξιολογήθηκε με δοκιμασία γρατσουνιές πληγών και δοκιμασία εισβολής. Όπως EMT οδηγεί σε αυξημένη κινητικότητα των κυττάρων και εισβολής, ελέγξαμε περαιτέρω τους δείκτες EMT. Ένας διακόπτης από το E-cadherin σε Ν-cadherin είναι επίσης ένα βασικό χαρακτηριστικό του EMT στον καρκίνο των ωοθηκών [4]. Η υπερέκφραση του Twist2 μειώθηκε σημαντικά Ε-καδερίνης και αυξημένη έκφραση Ν-καδερίνης τόσο σε mRNA και τα επίπεδα της πρωτεΐνης αντίστοιχα.

Ε-καδερίνης είναι μία διαμεμβρανική γλυκοπρωτεΐνη τύπου-Ι καντερίνη υπεροικογένειας. κυτταροπλασματικό τμήμα του συνδέεται με τον κυτταρικό σκελετό ακτίνης μέσω των κατενίνες [27]. Η Canonical σηματοδότηση /β-κατενίνης Wnt έχει σημαντικό αντίκτυπο στην EMT κατά τη διάρκεια της εξέλιξης του καρκίνου [28], [29]. Wnt σήματα αναστέλλουν τη δράση της κινάσης της ΟδΚ3β να σταματήσει η υποβάθμιση και να αναγκάσει την ταχεία αύξηση των επιπέδων των ελεύθερων, κυτοσολίου β-κατενίνης, και πολύ σύντομα μετά, μετατοπίζεται στον πυρήνα όπου δεσμεύεται με TCF παράγοντες /Lef μεταγραφής [30], [31] . Η μείωση των επιπέδων της Ε-καδερίνης συχνά απελευθερώνει β-κατενίνης από adheren διασταύρωση, με αποτέλεσμα τη συσσώρευση της πυρηνικής β-κατενίνης, και η συνακόλουθη μετενεργοποίησης ενός πάνελ γονιδίων στόχων, μεταξύ των οποίων εκείνες που καθορίζουν διάφορους παράγοντες ΕΜΤ-επαγωγής [18], [28 ].

μια πρόσφατη μελέτη που δημοσιεύθηκε στις αρχές του κρανίου δερματική ανάπτυξης έδειξε μια συνεπή ρόλο για σηματοδότηση Wnt /β-κατενίνης μέσω Twist2 στην δερματική προδιαγραφή σε διάφορες περιοχές του εμβρύου [32]. Twist2 μπορεί να είναι ένας άμεσος στόχος της μεταγραφής και μπορεί να μεσολαβήσει ο λειτουργικός ρόλος του Wnt σηματοδότηση των πρόδρομων ουσιών δερματική. Στο πείραμά μας, Twist2 αυξημένη πυρηνική β-κατενίνης. Επιπλέον, οι διαλυτές και μη διαλυτό κυτοσολικό μορφές β-κατενίνης ρυθμίζονται αυστηρά από το σύστημα πρωτεόσωμα /ουβικιτινίωση που αποτελείται από ΟδΚ3β, αξίνη, και αδενωματώδη πολυποδίαση coli (APC) πρωτεΐνη [25]. Λόγω ρύθμιση προς τα κάτω της APC, η υποβάθμιση της β-κατενίνης ήταν επίσης κατασταλεί. Μόλις στον πυρήνα, β-κατενίνης θα μεσολαβούν την ενεργοποίηση ειδικών γονιδίων μεσεγχυματικών. Δείξαμε μια αύξηση της c-Myc και Κυκλίνη D1-σε μονοπάτι σήματος /β-κατενίνης Wnt (Εικ. 6). Επειδή β-κατενίνης ήταν απαραίτητη για την έκφραση των γονιδίων μεσεγχυματικών, ελέγξαμε κατά πόσο η μεταγραφική δραστικότητα της πρωτεΐνης αυτής επηρεάστηκε από έκτοπη Twist2. Όπως φαίνεται στο Σχ. 7, η δραστικότητα του TCF4 /LEF1 εξαρτώμενη προαγωγό (TOP) ρυθμίζεται αυξητικά (δύο φορές) σε κύτταρα επιμολυσμένα με Twist2. Συνεπώς, αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι η έκφραση των μεσεγχυματικών γονιδίων είναι υπό τον έλεγχο της β-κατενίνης μέσω /LEF1 εξαρτώμενη TCF4 συγκροτήματα. Επιβεβαιώνεται από το αποτέλεσμα που φαίνεται στο Σχ. 5D, διανομή πυρηνικής β-κατενίνης ήταν αυξημένη σε Twist2 /SKOV-3 κύτταρα. Έτσι, Twist2 μπορεί να αυξήσει TCF4 /Ι.ΕΡ1-εξαρτώμενη β-κατενίνης μεταγραφική δραστηριότητα.

Σε αυτή τη μελέτη, θα παρέχουν αποδείξεις ότι Twist2 επηρεάζει την κυτταρική συμπεριφορές σε SKOV-3 κύτταρα, συμπεριλαμβανομένων των μεταβολών στη μορφολογία και την κινητικότητα. Στο μοριακό επίπεδο, Twist2 προκαλεί σημαντική μεταβολή των δεικτών EMT. Επιπλέον, Twist2 προωθείται κυτταρική μετανάστευση και εισβολή του SKOV-3 κύτταρα. Ως εκ τούτου, Twist2 προωθείται απελευθέρωση β-κατενίνης από σύμπλοκο Ε-καδερίνης /β-κατενίνης μέσω της αναστολής της Ε-καδερίνης. Με τη συσσώρευση των πυρηνικών β-κατενίνης, μονοπάτι Wnt /β-κατενίνης στη συνέχεια ενεργοποιείται για να προωθήσει ένα φαινότυπο EMT.

Για το καλύτερο της γνώσης μας, δείχνουμε για πρώτη φορά ότι η ενεργοποίηση Wnt στην Twist2 που προκαλείται από την πρόοδο EMT στον καρκίνο των ωοθηκών, παρέχοντας νέες γνώσεις σχετικά με τη μετάσταση τους.

Συμπεράσματα

Τα στοιχεία μας δείχνουν ότι η ρύθμιση προς τα πάνω του Twist2 συσχετίζεται με το στάδιο ΦΥΓΩ σε ανθρώπινους καρκίνους των ωοθηκών. Αν και δεν υπάρχει συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης Twist2 και όγκου ιστολογικό τύπο, Twist2 είναι ένας πιθανός δείκτης της υψηλής ποιότητας της κακοήθειας και κακή πρόγνωση σε κλινικές καρκίνου των ωοθηκών. Η υπερέκφραση του Twist2 επάγεται οι φαινότυποι EMT σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών

in vitro

. Προς τα κάτω ρύθμιση της Ε-καδερίνης και APC, καθώς και προς τα πάνω ρύθμιση του Ν-καντερίνης και β-κατενίνη (σε κυτταρικό πυρήνα), υποδεικνύουν ότι Twist2 προάγει απελευθέρωση β-κατενίνης από Ε-καδερίνης /β-κατενίνης μέσω της αναστολής της Ε-καδερίνης. Επιπλέον, λόγω ρύθμιση προς τα κάτω της APC, η υποβάθμιση της β-κατενίνης είχε κατασταλεί. Ως εκ τούτου, κανονικό μονοπάτι /β-κατενίνης Wnt στη συνέχεια ενεργοποιείται με συσσώρευση πυρηνικής β-κατενίνης, έτσι προκαλείται η μεταγραφή των κατάντη γονιδίων-στόχων για την προώθηση εισβολή και μετάσταση όγκου. Συλλογικά, αυτά τα δεδομένα έδειξαν ότι η β-κατενίνης εμπλέκεται σε Twist2 επαγόμενη EMT στον καρκίνο των ωοθηκών.

Υλικά και Μέθοδοι

Υλικά |

Ποντίκι αντίσωμα αντι-Twist2 αγοράστηκε από Abnova Βιοτεχνολογίας. Ποντικού αντι-Flag, αντι-β-ακτίνης, και αντι-Akt αντισώματα αγοράστηκαν από την Sigma Chemical Co. (St Louis, ΜΟ, USA). Κουνέλι αντι-Ε-καδερίνης, Goat anti-Ν-cadherin, Rabbit anti-ΙΚΒ-α, Κουνέλι αντι-β-κατενίνης, ποντικού αντι-Oct-1, κουνέλι αντι-κυκλίνη D1, κουνέλι αντι-ο-Μγο, Mouse IgG αντι-κουνελιού, αντισώματα αντι-ποντικού IgG αγοράσθηκαν από την Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA)

κουνελιού αντι-φωσφο-Ακί (Ser 473) αντίσωμα αγοράσθηκε από την R & amp?. ϋ Systems Europe . Rabbit anti-Erk1 /2, Rabbit anti-ρ-Erk1 /2, Rabbit anti-Ακί, Rabbit anti-ρ-Ακί αγοράσθηκαν από τη Cell Signaling Company. ABC κιτ και το υπόστρωμα DAB κιτ αγοράστηκαν από την Thermo Scientific and Pierce, αντίστοιχα. Φορμαλίνη σταθερών και εγκλεισμένα σε παραφίνη τσιπ μικροσυστοιχιών καρκινικού ιστού των ωοθηκών ήταν από Alenabio Company. Το ερευνητικό πρωτόκολλο και τα σχέδια εγκρίθηκαν από την Επιτροπή Δεοντολογίας του Πανεπιστημίου Xiamen (ΑΔΤ: 20.100.602). Όλα κλινικές έρευνες μας διεξήχθησαν σύμφωνα με τις αρχές που διατυπώνονται στη Διακήρυξη του Ελσίνκι.

ανοσοϊστοχημική χρώση

τμήματα συστοιχία ιστού σε φορμόλη-σταθερές και παραφίνη-ενσωματωμένες πρωτοπαθή καρκίνο των ωοθηκών ανθρώπινο εξετάστηκαν για την αξιολόγηση η έκφραση της Twist2, και ανοσοϊστοχημική χρώση (IHC) πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [25], [33]. Twist2 δείχθηκε να αναγνωρίζουν ειδικά τους αντίστοιχες πρωτεΐνες (Εικ. 1Α). Διαμινοβενζιδίνη χρησιμοποιήθηκε για να απεικονίσει τη ανοσοϊστοχημική αντίδραση, που ακολουθείται από αντικηλίδωση με αιματοξυλίνη. Για την παρασκευή του αρνητικού ελέγχου, το πρωτογενές αντίσωμα αντικαταστάθηκε με κανονικό IgG ποντικού. Η χρώση IHC για συστοιχία ιστού επαναλήφθηκε για 3 φορές, αναλύονται μέσω πρότυπο οπτικό μικροσκόπιο. Θετικά κύτταρα έδειξαν καφέ κόκκους σε κυτόπλασμα ή πυρήνα του κυττάρου

Το ποσοστό θετικού κυττάρου προσδιορίστηκε με υπολογισμό του ποσοστού των θετικών κυττάρων στο σύνολο παρατηρούμενη κύτταρα: αν & lt? 10%, 0? 10% -20%, 1. ? 20% -50%, 2? & gt? 50%, 3. Η ένταση αποφασίστηκε συγκρίνοντας την χρώση των καρκινικών κυττάρων: καμία χρώση ή διφορούμενες χρώση, 0? ασθενής χρώση, 1? μέσον χρώσης, 2? ισχυρή χρώση, 3. Οι δύο βαθμολογίες πολλαπλασιάστηκαν για να ταξινομήσουν τη χρώση: 0-1, αρνητικό (-)? 2-4, θετικό (+)? ≥5, ισχυρή θετική (++)

Γενιάς. του Twist2-υπερέκφραση Stable ωοθηκών καρκινικά κύτταρα

Η ανθρώπινη κυτταρική σειρά καρκίνου των ωοθηκών SKOV-3 ελήφθη από την ATCC. Τα κύτταρα διατηρήθηκαν σε μέσο McCoy 5Α συμπληρωμένο με 10% βόειο εμβρυϊκό ορό και πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη. Η σημαία-Twist2 εκφράζουν πλασμίδιο είχε κατασκευαστεί σε προηγούμενη μελέτη μας [25]. Το Flag-Twist2 εκφράζουν πλασμίδιο και ο φορέας pBabe-πουρομυκίνης συν-επιμολύνθηκαν σε SKOV-3 καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών χρησιμοποιώντας το lipofectamine2000

αντιδραστήριο TM διαμόλυνσης (Invitrogen) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Οι Twist2 εκφράζουν σταθεροί κλώνοι και οι κλώνοι φορέα ελέγχου ελήφθησαν αντίστοιχα με επιλογή με πουρομυκίνη. Τα επίπεδα έκφρασης Twist2 στις επιλεγμένες σταθεροί κλώνοι στη συνέχεια επαληθεύονται μέσω ανάλυσης ανοσο-κηλίδα με Twist2 και σημαία αντισώματα.

τηλέφωνα μορφολογική παρατήρηση και Ομοεστιακή χρώση ανοσοφθορισμού

κυττάρων μορφολογικά σχήματα παρατηρήθηκαν χρησιμοποιώντας μικροσκοπία φάσης (Άλυμπος). Η ανοσοϊστοχημική χρώση πραγματοποιήθηκε σε Twist2 /SKOV-3 και Vector /SKOV-3 καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών όπως περιγράφηκε προηγουμένως [25]. Η χρώση του Twist2- και του φορέα-επιμολυσμένα παρατηρήθηκαν SKOV-3 κύτταρα και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το συνεστιακό μικροσκόπιο σάρωσης με λέιζερ (Olympus).

Cell Growth Δοκιμασία

Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε κανονικό μέσο μέχρι συγκομιδή. Η ανάπτυξη των κυττάρων εκτιμήθηκε μέσω δοκιμασίας ΜΤΤ όπως περιγράφηκε προηγουμένως [34]. Ο ρυθμός πολλαπλασιασμού των επιμολυσμένων κυττάρων ανιχνεύθηκε και συγκρίθηκε με εκείνη του ελέγχου φορέα μέσω απαριθμήσεις βιώσιμων κυττάρων με χρήση χρώσης trypan-blue. Εις τριπλούν προσδιορισμοί πραγματοποιήθηκαν σε κάθε ομάδα κυττάρων. Τα δεδομένα εκφράστηκαν ως μέση τιμή ± SD. Ο ρυθμός πολλαπλασιασμού των κυττάρων (%) υπολογίστηκε ως εξής: ο αριθμός των κυττάρων της πειραματικής ομάδας /αριθμός της ομάδας ελέγχου Χ 100%

πληγών επούλωσης δοκιμασία

Τα κύτταρα σπάρθηκαν επί έξι. φρεατίων (1 × 10

5 κύτταρα /τρυβλίο) και όταν έφτασαν πάνω από το 90% συρροή, μια γρατσουνιά έγινε σε όλη τη μονοστοιβάδα των κυττάρων με την άκρη. Τα κύτταρα ήπια πλύθηκαν με PBS 3 φορές και διατηρήθηκαν σε φρέσκο ​​μέσο. Τα κύτταρα επωάστηκαν για 24 ώρες και φωτογραφήθηκαν χρησιμοποιώντας ανεστραμμένο μικροσκόπιο ιστοκαλλιέργειας στους × 100 μεγέθυνση. Οι ανιχνεύσεις πραγματοποιήθηκαν τουλάχιστον τρεις φορές και τα δεδομένα παρουσιάστηκαν ως μέσο ± SD. Η πιθανή μετανάστευση μεταξύ Twist2 κύτταρα που εκφράζουν και τα κύτταρα ελέγχου συγκρίθηκε με σχετική απόσταση διακένου. Και αναλύσαμε τα αποτελέσματα από τη δοκιμή ANNOVA ένας τρόπος (λογισμικό Prism5). Ένα P-τιμή του p & lt? 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική

Κυττάρου εισβολή Δοκιμασία

Για την ανίχνευση εισβολής, 5 × 10

3 κύτταρα σπάρθηκαν σε επικαλυμμένα με Matrigel ένθετα μεμβράνης (BD. Bioscience). Το κάτω θάλαμος περιείχε 0,75 ml McCoy 5Α συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου βοοειδών ως χημειοελκτικό. Τα κύτταρα επωάστηκαν για 24 ώρες, τα κύτταρα που παραμένουν στο εσωτερικό του ενθέτου απομακρύνθηκαν με μια μπατονέτα και τα κύτταρα που είχαν διεισδύσει στην Matrigel να εισβάλει στην κάτω επιφάνεια της μεμβράνης μονιμοποιήθηκαν σε μεθανόλη και χρωματίστηκαν με Η &? Ε. Μετά αέρα ξήρανση της μεμβράνης, τα κύτταρα μετρήθηκαν σε μεγέθυνση χ 100 σε 10 τυχαία πεδία του άποψη κάτω από ένα μικροσκόπιο. Τρία ανεξάρτητα πειράματα σε κάθε περίπτωση.

Ανάλυση

κύκλος κυττάρου μέσω Κυτταρομετρίας Ροής

κύκλος κυττάρου ταυτοποιήθηκε μέσω ανάλυσης κυτταρομετρίας ροής όπως περιγράφηκε προηγουμένως [34]. Εν συντομία, τα κύτταρα σπάρθηκαν επί 24 ώρες, στη συνέχεια συλλέχθηκαν, πλύθηκαν δύο φορές με PBS και σταθεροποιήθηκαν σε 70% αιθανόλη στους 4 ° C όλη τη νύκτα. Οι σβώλοι κυττάρων αιωρήθηκαν σε διάλυμα χρώσης με ιωδιούχο προπίδιο (/mL ιωδιούχου προπιδίου 20 μg και 0,2 mg /mL RNase σε PBS) και επωάστηκαν για 30 λεπτά στους 37 ° C. Τα δείγματα στη συνέχεια αναλύθηκαν μέσω κυτταρομετρίας ροής.

Απομόνωση των υποκυτταρικών κλασμάτων, και Western Blot ανάλυση

Κυττάρων κλασματοποίηση και ανάλυση κηλίδος Western έγιναν όπως προηγούμενες δημοσιεύσεις μας [34], [35]. Λεπτομέρειες του κυττάρου κλασματοποίηση έχει ως εξής: τα εκχυλίσματα ολόκληρου κυττάρου παρασκευάστηκαν με απόξεση κυττάρων off Petri πιάτα, σφαιρίδια κυττάρου πλύσιμο δύο φορές σε PBS, και στη συνέχεια επαναιώρηση σφαιριδίων σε δύο γεμάτο όγκους κυττάρων ρυθμιστικού διαλύματος RIPA [150 mM NaCl /50 mM Tris · HCl, ρΗ 7,5 /0,25% (β /ol) δεοξυχολικό /1% Nonidet Ρ-40/5 mM ορθοβαναδικό νάτριο /2 μίγμα αναστολέα mM φθοριούχο νάτριο /πρωτεάση]. Πυρηνικά και κυτταροπλασματικά εκχυλίσματα απομονώθηκαν με κύτταρο πλύσιμο σφαιρίδια σε ρυθμιστικό διάλυμα Α (10 mM Hepes, ρΗ 7,5 /10 mM KCl /1.5 mM Mg

2Cl /0.5 mM NaF /1 mM γλυκερίνης φωσφορικό /μείγμα πρωτεάσης), τότε λύσης σε ρυθμιστικό Α + Β (ρυθμιστικό διάλυμα Α συν 0,5% Nonidet Ρ-40) σε ένα μίγμα 2:01.