Αφηρημένο

Για να εξερευνήσετε την ποικιλομορφία και τη συνέπεια των οδών σηματοδότησης που ρυθμίζουν τη μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων, εμείς επιλέξαμε τρεις ανθρώπινες κυτταρικές γραμμές όγκου που μετανάστευσαν μετά την αγωγή με EGF. Στη συνέχεια προσδιορίζεται ποσοτικά την επίδραση της δεκαπέντε αναστολέων για τα επίπεδα έκφρασης ή τα επίπεδα φωσφορυλίωσης των εννέα πρωτεΐνες που επάγονται από διέγερση EGF σε κάθε μία από αυτές τις κυτταρικές σειρές. Με βάση τα δεδομένα που λήφθηκαν σε αυτή τη μελέτη και χημικά-βιολογικές παραδοχές, μπορούμε συναχθεί μονοπάτια μετανάστευση των κυττάρων σε κάθε κυτταρική σειρά όγκου, και στη συνέχεια να συγκριθούν. Σαν αποτέλεσμα, βρήκαμε ότι τόσο η MEK /ERK και JNK οδών /c-Jun ενεργοποιήθηκαν και στις τρεις κυτταρικές γραμμές που μεταναστεύουν. Επιπλέον, η GSK-3 και ρ38 βρέθηκαν να ρυθμίζουν ΡΙ3Κ /Akt μονοπάτι μόνο σε EC109 κύτταρα και JNK βρέθηκε να αλληλοπαρεμβολές με ρ38 και σχετίζονται Fos μονοπάτι μόνο κύτταρα ΤΤ. Στο σύνολό τους, αναλυτικό σύστημα μας θα μπορούσε εύκολα να γίνει διάκριση μεταξύ των κοινών και των κυτταρικών μονοπατιών ειδικού τύπου υπεύθυνη για τη μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων

Παράθεση:. Μάγων S, Saeki Υ, Kasamatsu Μ, Tashiro Ε, Imoto Μ (2014) Χημικά Genomic-Based αναλύσεις οδός για τον επιδερμικό αυξητικό παράγοντα σηματοδότηση μέσω σε καρκινικά κύτταρα αποδημία. PLoS ONE 9 (5): e96776. doi: 10.1371 /journal.pone.0096776

Επιμέλεια: Laszlo Buday, Ουγγρική Ακαδημία Επιστημών, Ουγγαρία

Ελήφθη: 10 Νοεμβρίου 2013? Αποδεκτές: 11 Απρ 2014? Δημοσιεύθηκε: 12 του Μάη του 2014

Copyright: © 2014 Μάγων et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από μια επιχορήγηση-in-ενισχύσεις για Αμφισβήτηση διερευνητικές Έρευνας και JSPs Fellows, το Υπουργείο Παιδείας, Πολιτισμού, Αθλητισμού, Επιστημών και Τεχνολογίας, την Ιαπωνία. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

η κυτταρική μετανάστευση είναι κεντρικής σημασίας για πολλές φυσιολογικές διεργασίες, συμπεριλαμβανομένης εμβρυϊκή ανάπτυξη, αποκατάσταση τραύματος, ανοσοαποκρίσεις, καθώς επίσης και των καρκινικών κυττάρων εισβολή και τη μετάσταση [1]. Όταν ένα κύτταρο όγκου κινήσεις, οι διάφοροι οδοί σηματοδότησης που επιτυγχάνεται με κινάσες τυροσίνης υποδοχέα (RTKs), G πρωτεΐνη υποδοχείς (GPCRs), ιντεγκρίνες, και άλλους υποδοχείς. Ένα αξιοσημείωτο παράδειγμα ενός ΡΤΚ είναι ο υποδοχέας επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGFR), ο οποίος ενεργοποιείται με την πρόσδεση του συνδέτη, του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGF) [2]. Η ενεργοποίηση του EGFR οδηγεί στην ενεργοποίηση ενός ή περισσοτέρων ενδιάμεσων κλάδων δίκτυο σηματοδότησης που ρυθμίζουν την κυτταρική κινητικότητα, όπως το εξωκυτταρικό-ρυθμιζόμενη (ΕΚΚ) κινάσης [3], το φωσφοϊνοσιτιδίου 3-ΟΗ κινάση (ΡΙ3Κ) μονοπατιού [4], η κινάση Janus (Jak) οδός [5], το c-Jun NH2 τερματικής κινάσης (JNK) οδός, και η οδός p38 [6], [7].

Τα βασικά στοιχεία της ενδοκυτταρικής μετανάστευσης σηματοδότησης δίκτυο έχουν αποδειχθεί σε προηγούμενες μελέτες. Ωστόσο, είναι πιθανό ότι τα μόρια σηματοδότησης που ρυθμίζουν την κυτταρική μετανάστευση σε ένα καρκινικό κύτταρο δεν μπορεί να ρυθμίζει τη μετανάστευση των κυττάρων σε άλλα γενετικά διακριτές καρκινικά κύτταρα. Αρκετές προηγούμενες αναφορές έχουν δείξει ότι κάθε τύπο καρκινικού κυττάρου εκκινεί μετανάστευση σε διαφορετικά πλαίσια χρησιμοποιώντας διακριτά μοριακού ρεπερτόρια, έστω και αν η ίδια βασική διαδικασία της κυτταρικής μετανάστευσης επάγεται [8], [9]. Ως εκ τούτου, η κατανόηση της ποικιλομορφίας και γενικότητα των οδών σηματοδότησης που ρυθμίζουν τη μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων σε διάφορους τύπους κυττάρων είναι σημαντική όχι μόνο για τη βασική έρευνα σε κυτταρική μετανάστευση, αλλά και για την ανάπτυξη των αντι-μεταστατικό φάρμακα κατά του όγκου.

για την αντιμετώπιση αυτού του ζητήματος, έχουμε ήδη διερευνηθεί η επίδραση των αναστολέων μικρών μορίων για τους τύπους του συστήματος μετανάστευσης δέκα κυττάρων. Εμείς διέκρινε μεταξύ των κοινών και την κυτταρική σήματα ειδικού τύπου υπεύθυνο για την κυτταρική μετανάστευση [10]. Προηγούμενη έρευνα έχει δείξει ποια μόρια είναι πραγματικά εμπλέκονται στην κυτταρική μετανάστευση του κάθε τύπου καρκινικού κυττάρου. Ωστόσο, τα δίκτυα σηματοδότηση αυτών των μορίων που ρυθμίζουν την κυτταρική μετανάστευση παραμένουν ασαφείς. Σε αυτή την έκθεση, για να αντιμετωπίσει αυτό το ζήτημα, θα χρησιμοποιηθεί μια προσέγγιση που συνδυάζει χημικά γενετικής και της βιολογίας συστημάτων, η οποία έχει σταδιακά αναγνωριστεί ως μια χρήσιμη μέθοδος για την συναγωγή σηματοδότησης δικτύων μονοπάτι [11]. Στην προηγούμενη έκθεσή μας, βρήκαμε ότι κυτταρικές σειρές τρία καρκίνο (δηλαδή, τα κύτταρα επιδερμικού καρκινώματος Α431, οισοφαγικό κύτταρα EC109 καρκινώματος και κύτταρα του θυρεοειδούς ΤΤ καρκίνωμα) αποκτήθηκαν κυτταρική κινητικότητα με διέγερση EGF, αλλά ανάλυση συστάδων χημειοευαισθησία έδειξε ότι τα κύτταρα Α431 και EC109 κύτταρα είναι συγκεντρωμένα στην ίδια συστάδα, από την άλλη πλευρά, τα κύτταρα ΤΤ ταξινομούνται σε διάφορα συμπλέγματος. Ως εκ τούτου, στην παρούσα μελέτη, για να αποκαλύψει την ποικιλία και τα κοινά στοιχεία του EGF-επαγόμενης οδού σηματοδότησης που ρυθμίζουν την κυτταρική μετανάστευση σε αυτά τα τρία κύτταρα, εξετάσαμε ποσοτικά την επίδραση των χημικών αναστολέων στα επίπεδα έκφρασης EGF που προκαλείται ή το επίπεδο φωσφορυλίωση αρκετών μορίων σηματοδότησης για τον εντοπισμό το οποίο μόριο σηματοδότησης δρα ανάντη άλλων μορίων σηματοδότησης. Χρησιμοποιώντας τα αποτελέσματα αυτών των πειραμάτων, θα χαρτογραφείται μία διαδρομή μετανάστευσης κυττάρων σε κάθε κυτταρική σειρά καρκίνου, και σε σύγκριση με τους χάρτες πορείας για να αποκαλύψει την τοπολογία του δικτύου, θα είναι είτε κοινή για όλα τα καρκινικά κύτταρα ή ειδικά σε ορισμένους τύπους κυττάρων.

αποτελέσματα

Τα διαφορετικά μοτίβα ενεργοποίησης της σηματοδότησης ΕΤΠ μεταξύ των κυτταρικών σειρών τρεις καρκίνο

Κατ ‘αρχάς, θα ανιχνεύσει την φωσφορυλίωση ή την έκφραση των μορίων που προκαλείται από το ΕΤΠ σε τρεις καρκινικές κυτταρικές σειρές πάνω από μια χρονική πορεία σηματοδότησης (Σχήμα 1 και S1). Η αυτοφωσφορυλίωση του υποδοχέα EGF και την επακόλουθη EGF-επαγόμενη φωσφορυλίωση της ρ38 τόσο παρατηρήθηκε σε όλες τις κυτταρικές σειρές μετά από 5 λεπτά μετά την διέγερση EGF, όπως είναι καλά γνωστό. Η αύξηση στην έκφραση του c-Fos και τη φωσφορυλίωση της c-Jun παρατηρήθηκαν σε όλες τις κυτταρικές σειρές 1 ώρα μετά την διέγερση EGF. Από την άλλη πλευρά, πολλά άλλα μόρια έδειξαν διαφορετικά προφίλ ενεργοποίησης εξαρτώμενη από τον χρόνο μεταξύ των τριών καρκινικών κυτταρικών γραμμών. Για παράδειγμα, η φωσφορυλίωση της Akt (ρ-Akt, S473 και T308 υπολείμματα) προκλήθηκε μεταξύ 5 λεπτά και 1 ώρα μετά την διέγερση EGF σε EC109 κύτταρα και κύτταρα ΤΤ. Ωστόσο, τα επίπεδα φωσφορυλίωσης του ρ-Akt (S473) και ρ-Akt (T308) σε κύτταρα Α431 ήταν κάπως σταθερή ακόμη και μετά από διέγερση EGF έως 12 ώρες. Επιπλέον, η σχετική ένταση του ρ-Akt (T308) έδειξε ένα ανώτατο όριο έντασης 5 λεπτά μετά την διέγερση EGF σε κύτταρα ΤΤ, αλλά μετά από 1 ώρα σε EC109 κύτταρα. Το μοτίβο της φωσφορυλίωσης ERK (ρ-ERK) είναι επίσης διαφορετική μεταξύ των τριών καρκινικών κυτταρικών γραμμών. ERK ήταν παροδικά φωσφορυλιώνεται από διέγερση EGF σε όλα τα τρία κελιά, ενώ η αιχμή του Παρατηρήθηκε 5 λεπτά μετά από διέγερση EGF σε κύτταρα Α431 και EC109 κύτταρα, και μετά από 1 h σε κύτταρα ΤΤ. Το επίπεδο έκφρασης του EGFR άρχισε να μειώνεται εξής EGF διέγερση σε EC109 κύτταρα και κύτταρα ΤΤ, αλλά όχι σε κύτταρα Α431.

κύτταρα Α431, EC109 κύτταρα, και τα κύτταρα ΤΤ διεγέρθηκαν με EGF (30 ng ml

-1) για την υποδεικνυόμενη φορά και το συνολικό κυτταρολύματα υποβλήθηκαν σε κηλίδωση Western. Α.υ., αυθαίρετη μονάδα κανονικοποιηθεί από την ένταση της ακτίνης. Τα μέσα και SDS τριών ανεξάρτητων πειραμάτων παρουσιάζονται. Τα χρώματα γράφημα αντιπροσωπεύουν κάθε δεδομένα κυτταρική σειρά: Α431 κύτταρα (κόκκινο), EC109 κύτταρα (πράσινο), και τα κύτταρα ΤΤ (μπλε). Η διακεκομμένη γραμμή δείχνει ότι το ΕΤΠ διέγερση δεν προκαλεί σημαντική μεταβολή του Α.υ. κάθε μορίου (One-way ANOVA). Οι αρχικές εικόνες ανοσοαποτύπωση φαίνεται στο Σχήμα S1.

Η

Οι επιδράσεις των αναστολέων της μετανάστευσης για το ΕΤΠ που προκαλείται από τη μετανάστευση σηματοδότησης

Στη συνέχεια, εξετάσαμε τα αποτελέσματα της 15ης αναστολέων, η οποία επηρέασε την ικανότητα των κυττάρων να μεταναστεύουν στην προηγούμενη έκθεση μας [10], στην φωσφορυλίωση ή την έκφραση αυτών των μορίων σηματοδότησης στο χρονικό σημείο που δείχνει την υψηλότερη ένταση κάθε μορίου σηματοδότησης EGF επαγόμενη όπως υποδεικνύεται από δεδομένα πορεία του χρόνου (Πίνακας S1) σε κάθε καρκινική κυτταρική σειρά ( Εικόνα S2). Πίνακας S2 απαριθμεί τα ονόματα και τις πειραματικές συγκεντρώσεις που χρησιμοποιούνται των χημικών αναστολέων της μεταγωγής σήματος που χρησιμοποιούνται σε αυτή τη μελέτη, και οι τρόποι δράσης τους. Οι εικόνες ανοσοκηλίδα στο Σχήμα S2 περιλαμβάνουν ζώνες για κάθε μία από τις τέσσερις συνθήκες: αρνητικός έλεγχος (EGF – και αναστολέα -, λωρίδα 1), θετικό έλεγχο (EGF + και αναστολέα -, λωρίδα 2), και οι δύο EGF και αναστολέα αγωγή κατάσταση (EGF + και αναστολέα +, λωρίδα 3), και ο αναστολέας επεξεργασμένο κατάσταση (EGF – και αναστολέα +, λωρίδα 4). Για να ποσοτικοποιηθεί η επίδραση των αναστολέων, μπορούμε στη συνέχεια κανονικοποιείται την ένταση του σήματος, έτσι ώστε η λωρίδα 1 (δηλαδή, μη επεξεργασμένα κατάσταση) ορίστηκε ως μηδέν, και η λωρίδα 2 (δηλαδή, η κατάσταση EGF-θεραπεία) ορίστηκε ως 1. Με βάση την Τα πρότυπα αυτά, εμείς ποσοτικοποιηθεί η σχετική ένταση του σήματος των λωρίδων 3 και 4, και, τέλος, πήραμε ποσοτική σύνολο δεδομένων της επίδρασης των χημικών αναστολέων επί EGF-επαγόμενη σηματοδότηση μετανάστευση σε κάθε κυτταρική σειρά (Εικόνα 2).

χάρτες Heat απεικονίζουν τις επιδράσεις των αναστολέων μικρών μορίων για την EGF-επαγόμενη σηματοδότηση σε κύτταρα Α431 (κορυφή), EC109 κύτταρα (μέση) και τα κύτταρα ΤΤ (κάτω). Τα δεδομένα ομαλοποιήθηκαν με κεντράρισμα κατάσταση μη θεραπεία ως μηδέν, και την κλιμάκωση EGF επεξεργασμένο κατάσταση προς 1. Όλες οι κυτταρικές σειρές υποβλήθηκαν σε αγωγή με EGF μετά από προ-θεραπεία με αναστολείς για 15 λεπτά. Μετά τον προκαθορισμένο χρόνο, τα κύτταρα συλλέχθηκαν και υποβλήθηκαν σε κηλίδωση Western. AMD? Ακτινομυκίνη D, CHX? Κυκλοεξιμίδιο, ΕΕΔΕ? Ερβιμυκίνη Α Η συγκέντρωση των χημικών αναστολέων παρατίθενται στον Πίνακα S2. Οι αρχικές εικόνες ανοσοαποτύπωση φαίνεται στο σχήμα S2.

Η

Μείωση της σηματοδότησης της μετανάστευσης σε τρεις γραμμές κυττάρων καρκίνου του

Στη συνέχεια προσπάθησε να συναγάγει το δίκτυο σηματοδότησης που ρυθμίζουν τη μετανάστευση των κυττάρων σε κάθε καρκινική κυτταρική σειρά που βασίζεται τα προφίλ χημειοευαισθησία λαμβάνεται στην κατάσταση έκφρασης του EGF-επαγόμενης μόρια σηματοδότησης. Στον τομέα των χημικών βιολογίας, ένα μονοπάτι σηματοδότησης μπορεί να συναχθεί με τη χρήση της έννοιας που περιγράφεται στο Σχήμα 3 (βλέπε επίσης, Πειραματικές Διαδικασίες). Για να καθοριστεί εάν οι αναστολείς ενόχλησή τα μόρια σηματοδότησης ή όχι, ορίσαμε ± 0,5 ως κατώφλι. Στην περίπτωση του σχήματος 3α, ο αναστολέας U0126 ΜΕΚ κατέστειλε την προκαλούμενη από EGF φωσφορυλίωσης της ERK (ρ-ΕΚΚ) κατά περισσότερο από 50%. Σε τέτοιες περιπτώσεις, ορίσαμε δύο θετικές κανονισμούς σήματος? ένας από EGFR σε ΜΕΚ, και η άλλη από ΜΕΚ σε p-ERK. Στην περίπτωση του σχήματος 3b, ο αναστολέας ΡΙ3Κ LY294002 αυξημένη EGF-επαγόμενη έκφραση c-Fos κατά περισσότερο από 50%. Σε αυτές τις περιπτώσεις, ορίσαμε την ύπαρξη μιας θετικής σχέσης ρύθμιση από EGFR με c-Fos και μία αρνητική σχέση ρύθμιση από την PI3K με c-Fos. Στην περίπτωση του σχήματος 3c, το GSK-3 SB415286 αναστολέα αυξημένη έκφραση c-Jun χωρίς διέγερση EGF. Σε αυτές τις περιπτώσεις, ορίσαμε την ύπαρξη μιας θετικής σχέσης ρύθμιση από EGFR με c-Jun και μία αρνητική σχέση ρύθμιση από GSK-3 σε c-Ιούνιος Με τον τρόπο αυτό, με βάση την ημι-ποσοτική προφίλ (Σχήμα 2 και η ιδέα που περιγράφεται στο Σχήμα 3), θα συναχθεί ένα δίκτυο σηματοδότησης για κάθε κυτταρική σειρά καρκίνου ως υπογεγραμμένο κατευθυνόμενο γράφημα (Σχήμα 4). Η προκαλούμενη από EGF μετανάστευση οδού σε κύτταρα Α431 αποτελούνταν από 19 κόμβους και 39 ακμές (Σχήμα 4α), η οδός σε EC109 κύτταρα αποτελούνταν από 22 κόμβους και 62 ακμές (Σχήμα 4β), και η οδός σε κύτταρα ΤΤ αποτελούνταν από 21 κόμβους και 51 άκρα (Σχήμα 4γ). Ο λόγος για τον οποίο ο αριθμός των οδών σε κύτταρα Α431 είναι λιγότερες απ ‘ότι στις άλλες δύο κυτταρικές γραμμές θα μπορούσε να είναι ότι τα επίπεδα του p-Akt (T308) και ρ-Akt (S473) δεν θα μπορούσε να αξιολογηθεί σε κύτταρα Α431.

Λεπτομερής περιγραφή παρατίθεται στην ενότητα ενότητα Αποτελέσματα και Πειραματικές Διαδικασίες.

η

EGF που προκαλείται από το δίκτυο σηματοδότησης μετανάστευσης στο (α) Α431 κύτταρα, (β) EC109 κύτταρα, και (γ) κύτταρα ΤΤ. Το όριο αυτό ορίζεται σε ± 50% από το θετικό μάρτυρα. Το χρώμα άκρη αποφασίζεται με βάση το σημάδι άκρες? κόκκινο δείχνει θετική σηματοδότηση, και το μπλε δείχνει αρνητική σηματοδότηση. Το μέγεθος του κόμβου δείχνει τον αριθμό των άκρων σύνδεσης. Το χρώμα του κόμβου δείχνει τον αριθμό των μονοπατιών εξόδου:. Ένα χρώμα κλίση κλίμακα από πράσινο σε κόκκινο, με παρεμβολή πάνω από κίτρινο

Η

Σύγκριση των οδών σηματοδότησης σε κάθε κυτταρική σειρά καρκίνου

Με βάση στους χάρτες αυτούς μονοπάτι, εξάγαμε την κοινή δομή των οδών σηματοδότησης για την κυτταρική μετανάστευση και στις τρεις κυτταρικές σειρές καρκίνου που εξετάστηκαν σε αυτή τη μελέτη. Η Εικόνα 5a παριστά την κοινή τοπολογία μεταξύ των τριών κυτταρικών γραμμών. Αυτή η κοινή πορεία περιλαμβάνει το μονοπάτι MEK /ERK /c-Fos και την JNK /c-Jun μονοπάτι, οι οποίες έχουν και οι δύο ευρέως ερευνηθεί στον τομέα της κυτταρικής μετανάστευσης [6], [7], [12], [13]. Βρήκαμε επίσης ότι η ΜΕΚ ρυθμίζονται τα επίπεδα έκφρασης του c-Fos και ρ21, και ότι ΡΙ3Κ κατέστειλε τα επίπεδα έκφρασης του c-Fos στις τρεις κυτταρικές σειρές καρκίνου. Από την άλλη πλευρά, άλλα σήματα EGFR ρυθμιζόμενες όπως ROCK και CysLT1 δεν είχε κανένα οδούς εξόδου, γεγονός που υποδηλώνει ότι οι μεταγενέστεροι σήματα αυτών των μορίων μπορεί να ποικίλει μεταξύ κάθε καρκινική κυτταρική γραμμή. Στη συνέχεια, αξιολογήσαμε τις ειδικές δομές των οδών σηματοδότησης που αφορούν τη μετανάστευση σε κάθε μία από τις καρκινικές κυτταρικές γραμμές (Σχήμα 5b~d). Η ειδική οδός σε κύτταρα Α431 περιλαμβάνει μόνο 11 οδούς, συμπεριλαμβανομένων των π-ΙΝΚ → έκφραση c-Jun και της 5-λιποξυγονάσης (5-LO) → c-Fos. Ο αριθμός των συγκεκριμένων οδών σε EC109 κύτταρα και σε κύτταρα ΤΤ είναι 24 και 13, αντίστοιχα, υποδεικνύοντας ότι περίπου το ένα πέμπτο έως το ένα τρίτο των οδών σε αυτά τα κύτταρα είναι τύπου κυττάρου-dependent pathways.

(α ) κοινή EGF επαγόμενη δίκτυο σηματοδότησης μεταξύ των τριών καρκινικών κυτταρικών γραμμών. (B~d) Ειδική EGF επαγόμενη δίκτυο σηματοδότησης στο (Β) Α431 κύτταρα, (γ) EC109 κύτταρα, και (δ) τα κύτταρα ΤΤ. Το χρώμα άκρη αποφασίζεται με βάση το σημάδι άκρες? κόκκινο δείχνει θετική σηματοδότηση, και το μπλε δείχνει αρνητική σηματοδότηση.

Η

Σε μια προηγούμενη μελέτη, είχαμε προβλέψει ότι παρόμοιες πορείες προκαλέσει και να ρυθμίζουν τη μετανάστευση των κυττάρων σε κύτταρα Α431 και EC109 κύτταρα, αλλά αυτά τα μονοπάτια μπορεί να είναι διαφορετική από ΤΤ κύτταρα [10]. Για να διευκρινιστεί η διαφορά σε μονοπάτια μεταξύ των δύο ομάδων σηματοδότησης, μπορούμε στη συνέχεια συγκρίνονται τα μονοπάτια σηματοδότησης των κυττάρων και των κυττάρων EC109 ΤΤ η οποία περιλαμβάνει όλα τα ίδια κόμβους (Σχήμα 6). Εικόνα 6α δείχνει την επικαλυπτόμενα τοπολογία μονοπάτι στις δύο κυτταρικές σειρές. Αυτός ο χάρτης πορείας περιλαμβάνει PI3K → p-Akt, JNK → p-Akt (S473) και ROCK → p-p38, γεγονός που υποδηλώνει ότι αυτές οι πορείες παίζουν ένα συνεκτικό ρόλο στην κυτταρική μετανάστευση. Σχήμα 6β, c παρουσιάζει τις συγκεκριμένες τοπολογίες μονοπάτι σε EC109 κύτταρα και κύτταρα TT, αντίστοιχα. Ένα σύνολο 29 διόδων (47% των οδών σε κύτταρα EC109), όπως ΜΕΚ → c-Jun, η GSK-3 → p-Akt (S473) και HMG-CoA → pAkt (T308), είναι ειδικά για EC109 κύτταρα, και 18 μονοπάτια (το 35% των οδών σε κύτταρα ΤΤ), συμπεριλαμβανομένων των π-JNK → p-p38, και ROCK → c-Fos, είναι ειδικά για τα κύτταρα ΤΤ. Η φωσφορυλίωση του ρ-Akt ρυθμίζεται προς τα πάνω από ρ38, η GSK-3, και HMG-CoA σε EC109 κύτταρα, ενώ δεν υπήρχε καμία συγκεκριμένη θετική πορεία προς π-Akt σε κύτταρα ΤΤ. Από την άλλη πλευρά, JNK είναι απαραίτητη για την αύξηση τόσο της έκφρασης c-fos και φωσφορυλίωση του ρ38 σε κύτταρα ΤΤ, ενώ δεν παρατηρήθηκε τέτοια ρύθμιση σε EC109 κύτταρα. Επιπλέον, υπάρχει μια EGFR-p38 βρόχος θετική ανάδραση σε κύτταρα ΤΤ αλλά δεν υπάρχει τέτοια οδός σε κύτταρα EC109. Τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν ότι η ενεργοποίηση της Akt μπορεί να είναι απαραίτητη για την κυτταρική μετανάστευση του EC109 κύτταρα, αλλά μονοπάτι ενεργοποίησης Akt εξαρτάται τύπους καρκινικών κυττάρων. Επιπλέον, το άγχος ανταποκρίνεται μονοπάτι ΜΑΡΚ μπορεί να είναι κυρίαρχη στο ρυθμιστικό μονοπάτι της κυτταρικής μετανάστευσης των κυττάρων ΤΤ.

(α) δίκτυο κοινή σηματοδότηση μεταξύ των κυττάρων EC109 και των κυττάρων TT. (Β) Ειδική δίκτυο σηματοδότησης EGF-επάγεται σε EC109 κύτταρα. (Γ) Ειδικοί δίκτυο σηματοδότησης EGF-επάγεται σε κύτταρα ΤΤ. Το χρώμα άκρη αποφασίζεται με βάση το σημάδι άκρες? κόκκινο δείχνει θετική σηματοδότηση, και το μπλε δείχνει αρνητική σηματοδότηση.

Η

Συζήτηση

Σε αυτή τη μελέτη, θα χαρτογραφηθούν τα ρυθμιστικά μονοπάτια σηματοδότησης για τη μετανάστευση των κυττάρων σε κύτταρα Α431 επιδερμικού καρκινώματος, κύτταρα EC109 καρκίνωμα του οισοφάγου και τα κύτταρα καρκίνωμα του θυρεοειδούς ΤΤ. Συγκρίνοντας αυτούς, αποκάλυψε τις κοινές οδούς στις τρεις κυτταρικές σειρές και προσδιόρισε τα μονοπάτια σηματοδότησης κυττάρου-τύπου ειδική, που βασίζεται σε μια χημική προσέγγιση γενετική και τη συστημική βιολογία. Για την επίτευξη αυτού του στόχου, έχουμε κατ ‘αρχάς σε σύγκριση με τα μοτίβα ενεργοποίησης εξαρτώμενη από το χρόνο των μορίων σηματοδότησης σε κάθε κυτταρική σειρά που εμπλέκονται στην προκαλούμενη από EGF κυτταρική μετανάστευση. Τα πρότυπα ενεργοποίησης ορισμένων μορίων σηματοδότησης είναι μερικώς διαφορετική μεταξύ των τριών καρκινικών κυτταρικών γραμμών (Σχήμα 1). Για παράδειγμα, τα πρότυπα ενεργοποίησης του c-Fos και ρ-p38 είναι αρκετά παρόμοια μεταξύ των τριών καρκινικών κυτταρικών γραμμών που εξετάστηκαν, ενώ τα πρότυπα του p-ERK και ρ-c-Jun είναι διαφορετικές. Οι σχετικές εντάσεις των παρατεταμένης ρ-ERK και ρ-c-Jun σε κύτταρα ΤΤ είναι υψηλότερα από αυτά σε κύτταρα Α431 και EC109 κύτταρα. Είναι ενδιαφέρον ότι, η διαφορά αυτή είναι συνεπής με προηγουμένως αναφερθεί ταξινομήσεις των προφίλ χημειοευαισθησίας των τριών αυτών κυτταρικών γραμμών [10], υποδηλώνοντας ότι παρατεταμένη ERK και φωσφορυλίωση c-Jun εμπλέκονται στις συγκεκριμένες οδούς κυτταρικού τύπου για την κυτταρική μετανάστευση σε κύτταρα ΤΤ. Λαμβάνοντας υπόψη ένα θετικό μηχανισμό ανάδρασης από το οποίο υπέστη δραστηριότητα JNK μπορούν να προωθήσουν ERK σηματοδότησης μέσω της IRS-2 [14] αναφέρθηκε, αυτοί οι μηχανισμοί μπορούν επίσης να λειτουργούν σε μετανάστευση των κυττάρων ΤΤ. Αντίθετα, η φωσφορυλίωση της Akt επάχθηκε με διέγερση EGF σε EC109 κύτταρα και κύτταρα TT, αλλά τα επίπεδα φωσφορυλίωσης της Akt ήταν κάπως σταθερά σε κύτταρα Α431 εξής EGF διέγερση. Προηγουμένως, αναφέραμε ότι EGF-επαγόμενη μετανάστευση των κυττάρων Α431 καταστέλλεται με την προσθήκη αναστολέων ΡΙ3Κ [10]. Ως εκ τούτου, αν και EGF δεν προκάλεσε σημαντικά φωσφορυλίωση της Akt, σταθερή κατάσταση φωσφορυλιωμένο Akt και ενεργοποιημένα απαιτείται για την προκαλούμενη από EGF μετανάστευση των κυττάρων Α431. Μια άλλη διαφορά στα δεδομένα πορεία του χρόνου μεταξύ των κυτταρικών σειρών καρκίνου του τρία αποδεικνύεται από το επίπεδο έκφρασης του EGFR. EGF διέγερση μείωσε το επίπεδο έκφρασης του EGFR σε EC109 κύτταρα και κύτταρα ΤΤ, αλλά όχι σε κύτταρα Α431. Όταν EGF δεσμεύεται με EGFR, EGFR είναι γνωστό ότι εσωτερικοποιούνται γρήγορα από την επιφάνεια του κυττάρου μέσω διαφόρων οδών, συμπεριλαμβανομένων κλαθρίνη επικαλυμμένα κοιλώματα [9], [15]. εσωτερικεύονται υποδοχείς είτε ανακυκλώνεται στην κυτταρική επιφάνεια ή μεταφέρονται στα λυσοσώματα για αποικοδόμηση. Είναι γνωστό ότι η τύχη των υποδοχέων ελέγχεται από διάφορες πρωτεΐνες μετά την εσωτερίκευση, όπως Cbl και LRRK1 [16], [17]. Έτσι, τα αποτελέσματά μας μπορεί να υποδεικνύει ότι η ρύθμιση της αποδόμησης του υποδοχέα EGF που προκαλείται είναι διαφορετική μεταξύ των τριών καρκινικών κυτταρικών γραμμών, και αυτή η διαφορά υπαγορεύει την παρατεταμένη ενεργοποίηση των κατάντη στόχων σηματοδότησης.

ρυθμιστικές οδούς για τη μετανάστευση των κυττάρων σε κάθε καρκίνο κυτταρική γραμμή προσδιορίστηκαν με την εξέταση της επίδρασης των αναστολέων κυτταρικής μετανάστευσης για μόρια μεταγωγής σήματος (Σχήμα 4). Η επικαλυπτόμενα τοπολογία μονοπάτι και στις τρεις δοκιμαζόμενες κυτταρικές γραμμές περιλαμβάνει JNK → ρ-c-Jun, η οποία προβλέπεται ως κοινός ρυθμιστής σε προηγούμενη μελέτη. Αυτό υποδηλώνει ότι οι ρυθμιστικοί σηματοδότηση για μετανάστευση καρκινικών κυττάρων από JNK μέσω της φωσφορυλίωσης της c-Jun είναι στην πραγματικότητα ένας κοινός μηχανισμός σε όλους τους τύπους των καρκινικών κυττάρων. Επειδή δεν μπορούσαν να ανιχνεύσουν σημαντική αυξητική ρύθμιση του π-Akt σε κύτταρα Α431 EGF που διεγείρεται σε αυτή τη μελέτη, EGF οδό σηματοδότησης χάρτη σε κύτταρα Α431 δεν θα μπορούσε να περιλαμβάνει τη ρύθμιση του π-Akt και ως εκ τούτου περιλαμβάνει λιγότερους κόμβους και ακμές από εκείνο στο EC109 κύτταρα και κύτταρα ΤΤ στην αναλυτική μέθοδο μας. Ως εκ τούτου, η ερμηνεία της σύγκρισης μεταξύ των χαρτών πορείας μεταξύ των κυτταρικών σειρών τρεις καρκίνου πρέπει να γίνεται με προσοχή.

Για να συζητήσουμε και να επιβεβαιωθούν τα αποτελέσματα της ανάλυσης διασποράς στην προηγούμενη έκθεσή μας [10], εμείς τελικά σε σύγκριση με το χάρτη πορείας υπεύθυνο για την κυτταρική μετανάστευση μεταξύ κυττάρων και κυττάρων EC109 ΤΤ, και καθόρισαν την επικαλυπτόμενη ή τύπο κυττάρου ειδική τοπολογία (σχήμα 6). Akt φωσφορυλίωση κύματα σε EC109 κύτταρα είναι πιο αργή από ότι στα κύτταρα ΤΤ (Σχήμα 1 και Πίνακας S1), γεγονός που υποδηλώνει ότι περισσότερες ενδιάμεσες πρωτεΐνες ρυθμίζουν Akt φωσφορυλίωση σε EC109 κύτταρα από τα κύτταρα ΤΤ. Στην πραγματικότητα, το επίπεδο της φωσφορυλίωσης Akt ήταν up-ρυθμίζεται από ρ38, η GSK-3, και HMG-CoA αναγωγάσης σε EC109 κύτταρα, ενώ οι εν λόγω οδοί δεν περιελήφθησαν σε κύτταρα ΤΤ (Σχήμα 6b, c). Από την άλλη πλευρά, ERK κύματα φωσφορυλίωση σε κύτταρα ΤΤ είναι πιο αργή και πιο συνεχής σχέση με EC109 κύτταρα (Σχήμα 1 και Πίνακας S1), γεγονός που υποδηλώνει ότι περισσότερες ενδιάμεσες πρωτεΐνες ρυθμίζουν φωσφορυλίωση ERK σε κύτταρα ΤΤ από EC109 κύτταρα. Αλλά δεν θα μπορούσε να ανιχνεύσει καμία ειδική ρύθμιση, η οποία μπορεί να διατηρήσει το επίπεδο φωσφορυλίωσης της ERK σε κύτταρα ΤΤ. Θεωρούμε ότι ένα άλλο μόριο δεν είχαμε εκτιμήσει σε αυτή τη μελέτη μπορεί να συμβάλει στη βιώσιμη ΕΚΚ φωσφορυλίωση. Αυτές οι διαφορές στην οδό σηματοδότησης EGF-επαγόμενη ενδέχεται να αντανακλά τις διαφορές στον τρόπο λειτουργίας της κυτταρικής μετανάστευσης με βάση την μορφολογία των κυττάρων. Σε προηγούμενη μελέτη μας, διαπιστώσαμε ότι EC109 κύτταρα μετακινούνται ενώ διατηρεί επαφές κυττάρου-κυττάρου (συλλογική μετανάστευση), αλλά τα κύτταρα ΤΤ μετακινηθεί ως μονά κύτταρα (ατομική μετανάστευση) [10]. Υπό το φως των παραπάνω αποτελεσμάτων, είναι πιθανόν ότι τα καρκινικά κύτταρα κινούνται σαν ένα μόνο κύτταρο όταν μονοπάτι ΜΑΡΚ συνεχώς ενεργοποιημένη, ενώ, τα κύτταρα μεταναστεύουν συλλογικά και να διατηρήσει προσκόλλησης κυττάρου-κυττάρου όταν ΡΙ3Κ /Akt μονοπάτι συνεχώς ενεργοποιείται από ρ38 και GKS- 3. Αυτά διακριτούς ρόλους των ΜΑΡΚ και ΡΙ3Κ για τους τρόπους μετάβασης υποστηρίζεται επίσης από τις ακόλουθες προηγούμενες εκθέσεις. συνεπώς ενεργοποίηση ΜΑΡΚ επάγει ενεργοποίηση RhoA και επιθηλιακά-μεσεγχυματικά-μετάβασης, ενώ η ενεργοποίηση της ΡΙ3Κ καταστέλλει δραστικότητα RhoA στον καρκίνο του παχέος εντέρου [9]. Επιπλέον, ΡΙ3Κ στρατολογείται σε σύμπλοκα προσκόλληση [18], όπου η ενεργοποίηση τους μέσω των επιπτώσεων σηματοδότηση καδερίνης καντερίνη λειτουργία και ενισχύει προσκόλλησης κυττάρου-κυττάρου [19], [20]. Αυτό θα μπορούσε να περιλαμβάνει την ενεργοποίηση Rac1 ΡΙ3Κ επαγόμενη, επειδή E-cadherin-διεγερμένα αναδιοργάνωση του κυτταροσκελετού της ακτίνης απαιτεί Rac ενεργοποίηση και PI3P ενεργοποιούμενη GEF Tiam1 [21].

Στο σύνολό τους, ανάλυση μονοπάτι χημική γονιδιωματική βασίζεται μας σε τρεις καρκινικό κύτταρο γραμμές καταδεικνύουν τη συνέπεια και την ποικιλία στο κανονιστικό σηματοδοτικό μονοπάτι EGF που προκαλείται για τη ρύθμιση της μετανάστευσης των κυττάρων καρκίνου μεταξύ των διαφόρων τύπων κυττάρων χρησιμοποιώντας μια προσέγγιση συνδυασμού της χημικής βιολογίας και βιολογίας συστημάτων. Ειδικότερα, η GSK-3 και ρ38 ρυθμίζει ρ-Akt μόνο οισοφαγικού κύτταρα EC109 καρκινώματος, από την άλλη πλευρά, JNK ρυθμίζει ρ38 και Fos σχετίζονται μονοπάτι μόνο σε καρκίνωμα του θυρεοειδούς κύτταρα ΤΤ. Αυτά τα ευρήματα δείχνουν ότι ορισμένοι κυτταρικό τύπο οδού σηματοδότησης μετανάστευση ρυθμίσεως κύτταρο θα είναι θεραπευτική μοριακοί στόχοι για το συγκεκριμένο τύπο κυττάρου μετάσταση καρκίνου: GSK-3 και p38- σχετίζονται περιόδων οισοφαγικό καρκίνωμα, και μονοπάτια στρες αποκρίνονται-MAPKs-relaterd σε καρκίνωμα του θυρεοειδούς . Ωστόσο, για να κατανοήσουν τη συνοχή και την ποικιλία των ρυθμιστικών μονοπατιού σηματοδότησης ακριβέστερα, υπάρχουν πολλά ζητήματα που πρέπει να ασχοληθεί με το μέλλον. Παρά το γεγονός ότι χρησιμοποιείται ένας αναστολέας έναντι ενός μορίου σηματοδότησης σε αυτή τη μελέτη, διάφοροι αναστολείς έναντι ενός μορίου σηματοδότησης θα πρέπει να χρησιμοποιηθεί για την επιβεβαίωση της ειδικότητας των αναστολέων. Επιπλέον, ο χρόνος όταν αξιολογηθούν τα αποτελέσματα των αναστολέων στην φωσφορυλίωση ή την έκφραση αυτών των μορίων σηματοδότησης EGF που προκαλείται πρέπει να επαληθεύονται. Θα πρέπει να επινοηθούν επίσης πώς να διακρίνουν ρυθμιστική οδό για την κυτταρική μετανάστευση από ότι για άλλες κυτταρικές αποκρίσεις όπως κυτταρική ανάπτυξη. Παρ ‘όλα αυτά, σε αυτή τη μελέτη, παρέχουμε μια νέα προσέγγιση για την κατανόηση των χαρακτηριστικών της σηματοδότησης μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων, και να ανοίξει τη δυνατότητα για την αποκάλυψη ενός νέου μοριακού μονοπατιού ως στόχος για θεραπεία του καρκίνου.

Υλικά και Μέθοδοι

Cell Culture

κύτταρα Α431 (που ελήφθησαν από ATCC CRL-1555) διατηρήθηκαν σε ϋΜΕΜ συμπληρωμένο με 5% ορό μόσχου (CS), 0.1 GL

-1 καναμυκίνη, 100 μονάδες ml

-1 πενικιλλίνη G, 0.6 GL

-1 L-γλουταμίνη, και 2.5 GL

-1 NaHCO

3. EC109 (προικισμένος από τον Δρ Doki, Πανεπιστήμιο Οσάκα της Ιαπωνίας), κύτταρα ΤΤ (προικισμένος από Kirin εταιρείας, Ιαπωνία) διατηρήθηκαν σε Roswell Park Memorial Institute (RPMI) μέσο 1640 με 5% FBS, 0.1 GL

-1 καναμυκίνη , 100 μονάδες ml

-1 πενικιλλίνη G, 0.6 GL

-1 L-γλουταμίνη, και 2.5 GL

-1 NaHCO

3. Για συνήθη καλλιέργεια, τα κύτταρα επωάστηκαν σε ένα πρότυπο υγροποιημένο επωαστή στους 37 ° C σε 5% CO

2.

Αντιδραστήρια

AG1478 (αναστολέας EGFR), ραπαμυκίνη (αναστολέας mTOR), και Y27632 (αναστολέας ROCK) αγοράστηκαν από την Calbiochem. MK571 (αναστολέας CysLT1) αγοράστηκε από την Cayman. ΑΑ861 (αναστολέας της 5-λιποξυγενάσης), ακτινομυκίνη D (αναστολέα της μεταγραφής), Κυκλοεξιμίδιο (αναστολέας Translation), LY294002 (αναστολέας ΡΙ3Κ), μεβαστατίνη (HMG-CoA αναγωγάσης), MG132 (Proteasome αναστολέα), SB203580 (αναστολέας ρ38), SB415286 ( GSK-3 αναστολέα), SP600125 (αναστολέας JNK), U0126 (αναστολέας ΜΕΚ), και Επιδερμικού Παράγοντα Ανάπτυξης (EGF) αγοράστηκαν από τη Sigma. Ερβιμυκίνης Α (αναστολέας της Hsp90) καθαρίστηκε από καλλιέργειες

Streptomyces

sp. στο δικό μας εργαστήριο.

Western Blotting

Μετά προ-θεραπεία με είτε όχημα ή αναστολείς για 15 λεπτά, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με EGF για τον υποδεικνυόμενο χρόνο. Τα κύτταρα λύθηκαν σε ρυθμιστικό RIPA (25 mM Hepes ρΗ 7,8, 1,5% Triton Χ-100, 1% δεοξυχολικό νάτριο, 0,1% SDS, 0,5 Μ NaCl, 5 mM EDTA, 50 mM NaF, 0.1 mM βαναδικό νάτριο, 1 mM PMSF, και 0.1 mg ml

-1 λευπεπτίνη) στους 4 ° C με υπερήχους. Τα προϊόντα λύσης φυγοκεντρήθηκαν και τα υπερκείμενα ανακτήθηκαν. Μετά τον προσδιορισμό της συγκέντρωσης της πρωτεΐνης σε κάθε προϊόν λύσης, και βράζει σε ίσο όγκο ρυθμιστικού διαλύματος φόρτωσης (150 mM Tris ρΗ 6,8, 30% γλυκερόλη, 3% SDS, 15 mg ml

-1 βρωμοφαινόλης βαφή, και 100 mM 2 μερκαπτοαιθανόλης), τα δείγματα στη συνέχεια ηλεκτροφορήθηκαν σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου. Οι πρωτεΐνες μεταφέρθηκαν πάνω σε μεμβράνη PVDF, και ανοσοστυπώθηκαν. Αντισώματα που χρησιμοποιούνται για ανοσοκηλίδωση ήταν: αντι-ΕΟΡ υποδοχέα αντίσωμα (# 2232), αντι-Akt αντίσωμα (# 9272), αντι-φωσφο-Ακί αντίσωμα (Thr308) (# 9275), αντι-φωσφο-Ακί αντίσωμα (Ser473) (# 9271), αντι-c-Jun αντίσωμα (# 9165), αντι-φωσφο-ρ38 αντίσωμα (# 9211), αντι-ΜΑΡΚ (ERK 1/2) αντίσωμα (# 9102), αντι-φωσφο-ΜΑΡΚ (ERK 1/2 ) αντίσωμα (# 9101) (Cell Signaling)? αντι-c-Fos αντίσωμα (sc-7202), το αντίσωμα αντι-p38 (sc-7972), το αντίσωμα αντι-p21 (sc-397) (Santa Cruz Biotechnology)? αντίσωμα αντι-φωσφο-τυροσίνης (05-321) (Upstate)? αντι-φωσφο-c-Jun αντίσωμα (558.036) (BD Pharmingen)? αντι-β-ακτίνης αντίσωμα (A5316) (Sigma).

Η στατιστική ανάλυση

Η μονόδρομη ANOVA χρησιμοποιήθηκε για να καθοριστεί σημαντικές διαφορές στα σύνολα δεδομένων χρονοσειρών. Ένα προϊόν στιγμή συντελεστής συσχέτισης Pearson χρησιμοποιήθηκε για να επιβεβαιωθεί η αναπαραγωγιμότητα των δεδομένων. Αυτές οι στατιστικές αναλύσεις υπολογίστηκαν με τη χρήση του R (www.r-project.org/).

έκπτωση δικτύου με βάση την χημική βιολογία

Το υπογεγραμμένο σκηνοθεσία του δικτύου προέκυψε από μια διαφορά στην φωσφορυλίωση της πρωτεΐνης ή τα επίπεδα έκφρασης μεταξύ ψευδο-αγωγή και αναστολέα επεξεργασμένα δεδομένα, σύμφωνα με τον κανόνα που φαίνεται στο Σχήμα 3. Αυτός ο κανόνας περιλαμβάνει τρεις απλές παραδοχές που χρησιμοποιούνται συνήθως στη χημική βιολογία: α) ότι υπάρχει μια θετική ρύθμιση από μόριο σε μόριο Χ Υ όταν το επίπεδο του μορίου Υ με την παρουσία και των δύο EGF και ενός αναστολέα του Χ είναι πάνω από 50% χαμηλότερο από αυτό της κατάσταση EGF-αγωγή? β) Υπάρχει μια αρνητική ρύθμιση από το μόριο Χ Υ μόριο όταν το επίπεδο του μορίου Υ παρουσία τόσο EGF και αναστολέας του Χ είναι πάνω από 50% υψηλότερο σε σχέση με EGF-θεραπεία κατάσταση? γ) Υπάρχει μία αρνητική ρύθμιση από μόριο σε μόριο Χ Υ όταν το επίπεδο του μορίου Υ υπό την παρουσία του αναστολέα του Χ είναι υψηλότερο από το ήμισυ του επιπέδου σε EGF-αγωγή κατάσταση. Η επεξεργασία των δεδομένων που εξάγει τελικά πληροφοριών μονοπάτι αποτελείται από τον κόμβο πηγή, ο κόμβος στόχου, και ρυθμιστικές τύπου (θετική ή αρνητική) διεξήχθη με τη χρήση R. Αυτό το αρχείο εισάγεται στο λογισμικό Cytoscape (www.cytoscape.org/), και τη σηματοδότηση χάρτες πορείας παρήχθησαν. Η σύγκριση της τοπολογίας οδού πραγματοποιήθηκε επίσης με τη χρήση προηγμένων Cytoscape plugin συγχώνευση του δικτύου.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Εικόνα S1.

Εκπρόσωπος εικόνες ανοσοαποτύπωση παρουσιάζονται στο Σχήμα 1. (α) Α431 κύτταρα, (β) EC109 κύτταρα, και (γ) κύτταρα TT

doi:. 10.1371 /journal.pone.0096776.s001

(PDF)

Εικόνα S2.

Εκπρόσωπος εικόνες ανοσοαποτύπωση παρουσιάζονται στο Σχήμα 2. (α) Α431 κύτταρα, (β) EC109 κύτταρα, και (γ) κύτταρα TT

doi:. 10.1371 /journal.pone.0096776.s002

(PDF)

Πίνακας S1. .

Το χρονοδιάγραμμα αξιολόγησης των επιπτώσεων των αναστολέων

doi: 10.1371 /journal.pone.0096776.s003

(DOCX)

Πίνακας S2.

συγκεντρώσεις και οι στόχοι της αναστολής ένωση που χρησιμοποιείται στην παρούσα μελέτη

doi:. 10.1371 /journal.pone.0096776.s004

(DOCX)