Αφηρημένο

Φυσικά προϊόντα γίνονται εκτεταμένα διερευνηθεί για το δυναμικό τους για την πρόληψη, καθώς και του καρκίνου απόλαυση χάρη στην ικανότητά τους να στοχεύουν πολλαπλές μοριακών οδών.

Ficus religiosa

έχει δειχθεί ότι εξασκούν ποικίλες βιολογικές δραστηριότητες, όπως απόπτωση σε κυτταρικές γραμμές καρκίνου του μαστού. Στην παρούσα μελέτη, αναφέρουμε τα πιο αντι-νεοπλασματική δυναμικό του υδατικού εκχυλίσματος του

F. religiosa

(FR

aq) φλοιό σε ανθρώπινο καρκίνο του τραχήλου κυτταρικές σειρές, SiHa και HeLa. FR

aq μεταβληθεί η κινητική ανάπτυξη των SiHa (HPV-16 θετικά) και HeLa (18-HPV θετικά) κυττάρων με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. Είναι μπλοκάρει την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου σε G φάση

1 /S σε SiHa που χαρακτηρίζεται από μία αύξηση στην έκφραση της ρ53, ρ21 και πρωτεϊνών pRb με ταυτόχρονη μείωση στην έκφραση της φωσφο Rb πρωτεΐνης (ppRb). Από την άλλη πλευρά, σε HeLa, FR

επάγεται υδατ απόπτωση μέσω της αύξησης του ενδοκυτταρικού Ca

2+ οδηγώντας σε απώλεια του δυναμικού της μιτοχονδριακής μεμβράνης, η απελευθέρωση του κυτοχρώματος-c και αύξηση στην έκφραση της κασπάσης-3. Επιπλέον, FR

aq μείωσε την μετανάστευση, καθώς και την ικανότητα εισβολής των δύο αυχενικών καρκινικές κυτταρικές γραμμές που συνοδεύεται με ρύθμιση προς τα κάτω της ΜΜΡ-2 και την έκφραση HER-2. Είναι ενδιαφέρον, FR

aq μείωσε την έκφραση των ιικών ογκοπρωτεϊνών Ε6 και Ε7 στην αυχενική καρκινικές κυτταρικές σειρές. Όλα αυτά τα στοιχεία δείχνουν ότι το

F. religiosa

θα μπορούσαν να διερευνηθούν για χημειοπροληπτικές δυναμικό της στον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας

Παράθεση:. Choudhari AS, Suryavanshi SA, Kaul-Ghanekar Ε (2013) το υδατικό εκχύλισμα του

Ficus religiosa

επάγει τον κυτταρικό κύκλος σύλληψης σε Ανθρώπινο Καρκίνο του Τραχήλου της Μήτρας γραμμές κυττάρων SiHa (HPV-16 Positive) και την απόπτωση σε HeLa (HPV-18 Θετική). PLoS ONE 8 (7): e70127. doi: 10.1371 /journal.pone.0070127

Επιμέλεια: Chunhong Yan, Albany Medical College, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 22 Φλεβάρη, 2013? Αποδεκτές: 14, Ιούνη, 2013? Δημοσιεύθηκε: 26 Ιουλ 2013

Copyright: © 2013 Choudhari et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Οι συγγραφείς ευχαριστώ IRSHA, Bharati Vidyapeeth Πανεπιστήμιο και CSIR για την υποστήριξη αυτού του έργου. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

καρκίνος του τραχήλου της μήτρας είναι η δεύτερη κύρια αιτία θανάτου από καρκίνο στις γυναίκες σε όλο τον κόσμο [1], [2]. Οι ανθρώπινοι ιοί θηλωμάτων υψηλού κινδύνου (HPVs) όπως HPV 16, 18, 31 και 33 έχουν αποδοθεί ότι είναι οι κύριοι παράγοντες κινδύνου για τον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας, εκ των οποίων HPV-16 και -18 αντιπροσωπεύουν περίπου το 70% των καρκίνων [ ,,,0],3]. Ε6 και Ε7 είναι οι δύο ιικές ογκοπρωτεΐνες είναι απαραίτητες για την ανάπτυξη και συντήρηση του μετασχηματισμένου φαινοτύπου σε καρκινικά κύτταρα του τραχήλου της μήτρας. E6 προάγει αποικοδόμηση της ρ53 μέσω ενός ουβικιτίνη εξαρτώμενη πρωτεασώματος οδό ενώ Ε7 συνεργάτες με ρετινοβλαστώματος πρωτεΐνη (pRb) και παρεμβάλλεται στην δέσμευση του να E2F [4], [5]. Αυτό έχει ως αποτέλεσμα σε απώλεια της Rb /E2F συγκροτήματα που οδηγεί σε απελευθέρωση του παράγοντα E2F μεταγραφής που επάγει την έκφραση των γονιδίων πολλαπλασιασμού των κυττάρων [5].

Παρά το γεγονός ότι οι τρέχουσες μέθοδοι θεραπείας μπορεί να θεραπεύσει 80-95% των αρχικών σταδίων και 60% των καρκίνων τοπική-περιφερειακή προηγμένες, η περιοδική και μεταστατική νόσο εξακολουθεί να αποτελεί μείζον πρόβλημα [6]. Πρόσφατα, συμπληρωματική και εναλλακτική ιατρική (CAM) κερδίζει δημοτικότητα ως ένα chemopreventive προσέγγιση ως προς τη διαχείριση, καθώς και την πρόληψη της υποτροπής του καρκίνου [7], [8]. Περισσότερο από το 60% του χρησιμοποιούνται σήμερα αντικαρκινικά φάρμακα είναι αρχικά προέρχονται από φυσικές πηγές όπως φυτά, θαλάσσιων οργανισμών και μικροοργανισμών [9]. Διάφορες επιστημονικές μελέτες, συμπεριλαμβανομένων δική μας, έχουν δείξει τις δυνατότητες των φαρμακευτικών φυτών ως αντι-καρκίνου υποψήφιων φαρμάκων [10], [11]. Έχουμε αναφέρει πρόσφατα την αντικαρκινική δράση του

Cinnamomum cassia

(κανέλα) στον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας [12].

Ficus religiosa

L. της οικογένειας Lauraceae, έχει χρησιμοποιηθεί εκτενώς σε η παραδοσιακή ιατρική για διάφορες διαταραχές. έχουν διαφορετικά μέρη της έχουν χρησιμοποιηθεί ιατρικώς σε διάφορες μορφές όπως επίσης και σε συνδυασμό με άλλα βότανα [13], [14]. Έχει αποδειχθεί ότι παρουσιάζουν διάφορες βιολογικές δραστηριότητες [14], συμπεριλαμβανομένων επούλωση τραυμάτων [15], αντι-βακτηριακή [16], αντι-σπασμωδική [17], αντι-διαβητικό [18], [19], αντι-φλεγμονώδη [20] , ακετυλο χολινεστεράση ανασταλτική δράση [21] και δράση κατά του άγχους [22]. Το εκχύλισμα ακετόνης του

F. religiosa

φύλλα έχει αποδειχθεί ότι διεγείρει απόπτωση σε κυτταρικές γραμμές καρκίνου του μαστού [14].

Έχουμε αναφέρει πρόσφατα την αντιοξειδωτική και κυτταροτοξική δράση του

F. religiosa

φλοιό του τραχήλου της μήτρας τα καρκινικά κύτταρα [23]. Στην παρούσα μελέτη, ερευνήσαμε την υποθετική μοριακός μηχανισμός βασίζεται η αντινεοπλαστική δυναμικού του υδατικού εκχυλίσματος του

F. religiosa

(FR

aq) φλοιός στον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας. Τα δεδομένα μας δείχνουν ότι Ficus αναστέλλει την ανάπτυξη των κυτταρικών σειρών καρκίνου του τραχήλου της μήτρας, SiHa και HeLa, επάγοντας διακοπή του κυτταρικού κύκλου και της απόπτωσης, αντίστοιχα. Είναι ενδιαφέρον, FR

aq μείωσε σημαντικά την έκφραση των ιικών ογκοπρωτεϊνών Ε6 και Ε7, υποδηλώνοντας με τον τρόπο αυτό το θεραπευτικό δυναμικό του

F. religiosa

στον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας.

Υλικά και Μέθοδοι

Χημικά και Αντιδραστήρια

plasticware πολιτισμό ιστών αγοράστηκε από την BD Biosciences (CA, USA) και Axygen Επιστημονική Inc ( CA, USA). Modified Eagles Medium (DMEM) σκόνη, πενικιλλίνη και στρεπτομυκίνη ϋυΐββοοο ελήφθησαν από την Invitrogen /Gibco (Grand Island, ΝΥ, USA). Ο ορός εμβρύου μόσχου (FBS), 3- (4,5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ) -2,5-diphenylthiazolium (ΜΤΤ), FCCP, Ιονομυκίνη και JC-1 αγοράστηκαν από την Sigma-Aldrich (St. Louis, ΜΟ ). Πρωτογενή αντισώματα έναντι ρ53 (DO-1), ρ21 (187), κασπάσης-3 (Η-277), CYTO-c (7H8), Her-2 (F-11), pRb (C-15), ppRb (SER 807/811), HPV16 Ε6 /18 Ε6 (C1P5), HPV16 Ε7 (ED17), HPV18 Ε7 (Ν-19) ή τουμπουλίνης (Β-7) αγοράστηκαν από την Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA, USA ). Annexin V-FITC κιτ απόπτωσης # 3 αγοράστηκε από την Invitrogen (CA, USA). Όλα τα άλλα κοινά αντιδραστήρια που προμηθεύονται από Qualigens Fine Chemicals (Βομβάη, Ινδία).

Προετοιμασία του υδατικού εκχυλίσματος του

Ficus religiosa

(FR

aq) και Προκαταρκτική φυτοχημικές έρευνες

Ο φλοιός του Ficus

religiosa

L. συλλέχθηκαν από πούνε District, Μαχαράστρα, Ινδία και κυρώθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [23]. Το δείγμα κουπόνι (MPCC 2417) των αυθεντικών ειδών φυτών κατατέθηκε στο ερμπαρίου των φαρμακευτικών φυτών Conservation Center (MPCC), Pune, Maharashtra, Ινδία. Ο φλοιός ζυγίστηκε, κονιοποιημένο και εκχυλίζεται σε διπλά αποσταγμένο νερό σε εκχυλιστήρα καυτό νερό όπως περιγράφηκε προηγουμένως [23], [24]. Το προκύπτον εκχύλισμα φυγοκεντρίσθηκε υπό 13.000 rpm για 15 λεπτά για να απομακρυνθεί το σωματιδιακό υλικό. Το υπερκείμενο περαιτέρω αποστειρώνονται με διήθηση χρησιμοποιώντας φίλτρο Swiney (μέγεθος πόρων, 0,45 μm) και το προκύπτον διήθημα φυλάχθηκε σε δείγματα στους -80 ° C μέχρι τη χρήση. Η απόδοση του αποξηραμένου εκχυλίσματος που λαμβάνεται από το αρχικό ακατέργαστο υλικό ήταν 8,6% (w /w). Το πρόσφατα παρασκευασμένο FR

εκχύλισμα υδατ ήταν ποιοτικά ελέγχθηκαν για την παρουσία των φλαβονοειδών, φαινόλες, σαπωνίνες, τανίνες και υδατάνθρακες με τη χρήση τυποποιημένων διαδικασιών ανάλυσης [25].

Cell Culture

Το ανθρώπινο τραχήλου κυτταρικές σειρές καρκινώματος, SiHa (HPV-16), HeLa (HPV-18) και C33A (HPV-αρνητικό) λήφθηκαν από National Center for Cell Science (NCCS), Pune, Maharashtra, Ινδία. Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε ϋΜΕΜ συμπληρωμένο με 10% FBS, 2 mM L-γλουταμίνη, και αντιβιοτικά (100 μονάδες /ml πενικιλλίνη και στρεπτομυκίνη). Τα κύτταρα επωάστηκαν σε υγροποιημένο 5% CO

2 επωαστήρα στους 37 ° C.

ΟβΙΙ Growth Ανάλυση

Η δοκιμασία διεξήχθη όπως περιγράφεται προηγουμένως [12]. Εν συντομία, SiHa και HeLa κύτταρα σπάρθηκαν σε πυκνότητα 1 × 10

5 και 1,5 × 10

5 κύτταρα /ml, αντίστοιχα, σε 24-φρεατίων εις τριπλούν. Την επόμενη ημέρα, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διαφορετικές συγκεντρώσεις FR

aq (0-80 μg /ml) για 24, 48 και 72 ώρες. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν και μετρήθηκαν για βιωσιμότητα χρησιμοποιώντας trypan blue μέθοδο αποκλεισμού χρώματος [12], [26].

κυτταρικής ανάπτυξης σε μονόφυλλο

Η δοκιμασία διεξήχθη όπως περιγράφεται προηγουμένως [12]. Εν συντομία, SiHa και HeLa κύτταρα απλώθηκαν σε μια πυκνότητα σποράς 1 χ 10

3 κύτταρα /ml σε πλάκες 6 φρεατίων. Μετά από 24 ώρες, τα κύτταρα εκτέθηκαν σε διάφορες συγκεντρώσεις FR

aq (0-80 μg /ml) που ακολουθείται από επώαση στους 37 ° C σε ένα 5% CO

2 εκκολαπτήριο για μία εβδομάδα σε παρουσία του εκχυλίσματος . Αυτό ακολουθήθηκε από τον καθορισμό των αποικιών με 4% παραφορμαλδεΰδη και χρώση με 0,5% κρυσταλλικό ιώδες. Οι αποικίες φωτογραφήθηκαν με Sony DSC-S75 Cyber-shot φωτογραφική μηχανή.

Η ανάπτυξη των κυττάρων σε μαλακό άγαρ Δοκιμασία

Η δοκιμή διεξήχθη όπως περιγράφηκε προηγουμένως [12], [26]. Εν συντομία, SiHa και HeLa κύτταρα (5 × 10

3 κύτταρα /ml) μαζί με διαφορετικές συγκεντρώσεις FR

aq (0-80 μg /ml) αναμίχθηκαν με 0.35% αγαρόζη (βαθμός DNA, GIBCO BRL) σε ολοκληρώσει μέσο ϋΜΕΜ στους 40 ° C και σε μορφή γέλης σε θερμοκρασία δωματίου για 20 λεπτά πάνω από ένα προηγουμένως ζελατινοποιημένη στρώση 0,5% αγαρόζη σε πλήρες μέσο σε πλάκες 6 φρεατίων. Μετά την επώαση για δύο εβδομάδες, οι αποικίες μετρήθηκαν σε 10 διαφορετικούς τομείς, χρησιμοποιώντας ένα Axiovert 200 Μ μικροσκόπιο (Carl Zeiss, Γερμανία) και η μέση αξία υπολογίστηκε.

Επούλωση Δοκιμασία

Τόσο SiHa και τα κύτταρα HeLa σπάρθηκαν σε πυκνότητα 4 Χ 10

5 /ml σε πλάκες 24 φρεατίων και αφέθηκαν να προσκολληθούν όλη τη νύκτα στους 37 ° C σε 5% CO

2 θερμοκοιτίδα. Την επόμενη ημέρα, τα κύτταρα στερήθηκαν ορού για για 6 ώρες, ακολουθούμενο από την προσθήκη πλήρους μέσου μετά ή άνευ FR

aq (0-80 μg /ml). Ένα τεχνητό τραύμα έγινε στις πλάκες που περιέχουν κατεργασμένα και μη κατεργασμένα κύτταρα με ένα άκρο 10 μΙ μικροπιπέτα και η πληγή αφέθηκε να επουλωθεί για 24 ώρες στους 37 ° C σε

2 επωαστήρα 5% CO. Οι εικόνες για 0 ​​h, καθώς και 16 ώρες συλλήφθηκαν με τη βοήθεια των Axiovert 200 Μ μικροσκόπιο. Η μέση έκταση του κλεισίματος του τραύματος εκτιμήθηκε με μέτρηση του πλάτους της πληγής χρησιμοποιώντας ImageJ 1.44p [27].

Δοκιμασία Invasion Matrigel διαμεμβρανικού

Για τις μελέτες εισβολής, 24 φρεατίων Biocoat Matrigel εισβολής επιμελητήρια (BD Bioscience, Bedford, ΜΑ) χρησιμοποιήθηκαν [28]. SiHa και HeLa κύτταρα (5 × 10

4) με ή χωρίς FR

θεραπεία υδατ (0-80 μg /ml) σπάρθηκαν σε μέσο χωρίς ορό εντός των θαλάμων άνω εισβολή και αφέθηκε να εισβάλουν σε όλη την Matrigel- επικαλυμμένη μεμβράνη για 24 ώρες. Το μέσο που περιέχει 10% FBS προστέθηκε στον κάτω θάλαμο η οποία χρησίμευσε ως προσελκυστικό χημειο. Μετά από 24 ώρες επώασης, τα μη-εισβάλλοντα κύτταρα απομακρύνθηκαν από την κορυφή της κάθε μεμβράνης με βρεγμένα μπατονέτες? εισβάλλοντα κύτταρα συνδέονται με το κάτω μέρος της μεμβράνης μονιμοποιήθηκαν με 4% φορμαλίνη και χρωματίζονται με τη χρήση 0,5% κρυσταλλικό ιώδες. Οι αριθμοί των κυττάρων μετρήθηκαν σε δέκα τυχαία υψηλής ισχύος (× 20) πεδία χρησιμοποιώντας Axiovert 200 Μ μικροσκόπιο (Carl Zeiss, Γερμανία) εξοπλισμένο με ένα Sony Cyber-shot 3.3 mega pixels κάμερα.

ζυμογραφία ζελατίνης

Η δραστικότητα του ΜΜΡ-2 στο ρυθμισμένο μέσο προσδιορίστηκε με ζυμογραφία ζελατίνης όπως περιγράφηκε προηγουμένως [12]. Εν συντομία, SiHa και HeLa κύτταρα σπάρθηκαν σε πυκνότητα 4 Χ 10

5 κύτταρα /ml σε τρυβλία 6 φρεατίων και αφέθηκαν να προσκολληθούν όλη τη νύκτα στους 37 ° C σε 5% CO

2 θερμοκοιτίδα. Την επόμενη ημέρα, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διάφορες συγκεντρώσεις FR

aq (0-80 μg /ml) που παρασκευάζεται σε μέσο ελεύθερο ορού και επωάστηκαν για 24 ώρες. Την επόμενη ημέρα, το μέσο καλλιέργειας συλλέχθηκε και φυγοκεντρήθηκε στις 14.000 rpm για 20 λεπτά στους 4 ° C για να απομακρυνθεί το κυτταρικό απόρριμμα. Το ρυθμισμένο μέσο από κύτταρα ελέγχου, καθώς και κύτταρα επεξεργασμένα με FR

aq συλλέχθηκε και συμπυκνώθηκε σε Centricon ΥΜ-30 σωλήνες (Millipore, ΜΑ). Τα δείγματα που περιείχαν μία ίση ποσότητα ολικών πρωτεϊνών, αναμίχθηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα δείγματος (2% SDS, 25% γλυκερόλη, 0,1% μπλε βρωμοφαινόλης και 60 mM Tris-HCl ρΗ 6.8) και υποβλήθηκαν υπό μη αναγωγικές συνθήκες επί σε 7,5% SDS- πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου που περιέχει ζελατίνη (0,5 mg /ml). Μετά την ηλεκτροφόρηση, το πήκτωμα πλύθηκε με 0,25% Triton Χ-100 και επωάστηκαν όλη τη νύχτα στους 37 ° C σε ρυθμιστικό που περιέχει 150 mM NaCl, 100 mM ΟαΟ

2, 50 mM Tris-HCl ρΗ 7.5, 1% Triton Χ- 100, 0,02% NaN

3. Η γέλη χρωματίστηκε με διάλυμα χρώσης (0.1% Coomassie Brilliant blue R-250 σε 40% ισοπροπανόλη) και αποχρωματίζονται σε 7% οξικό οξύ. Ζελατινολυτική δραστηριότητα ανιχνεύεται ως μη χρωματισμένα λωρίδες κατά γαλάζιο φόντο. Η ποσοτικοποίηση των ζωνών σε έλεγχο και επεξεργασία δειγμάτων πραγματοποιήθηκε με πυκνομετρική ανάλυση σχετικά με την Alpha Imager χρησιμοποιώντας την Alpha λογισμικού Ευκολία FC, η Alpha Innotech.

Ανοσοαποτύπωσης

HeLa και SiHa κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε πυκνότητα σποράς των 4 × 10

5 κύτταρα /ml σε τρυβλία 6 φρεατίων και αφέθηκαν να προσκολληθούν όλη τη νύκτα στους 37 ° C σε CO

2 θερμοκοιτίδα. Την επόμενη ημέρα, τα κύτταρα εκτέθηκαν σε διάφορες συγκεντρώσεις FR

aq (0-80 μg /ml) και επωάστηκαν για 24 ώρες. Μετά την επώαση, τα κύτταρα συλλέχθηκαν με θρυψινοποίηση, πλύθηκαν με 1 χ PBS και η πρωτεΐνη εκχυλίστηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [12]. Εν συντομία, τα κυτταρικά σφαιρίδια επαναιωρήθηκαν σε 60 μΐ ρυθμιστικού διαλύματος λύσης που περιέχει 50 mMTris (ρΗ 7.4), 5 mM EDTA, 0.5% ΝΡ40, 50 mM NaF, 1 mM DTT, 0,1 mM PMSF, 0.5 μg /ml λευπεπτίνης (Pro-καθαρό Amersco , Solon, USA), 1 μg /ml πεπστατίνη (Amresco, Solon, USA), 150 mM NaCl, 0,5 μg /ml απρωτινίνη (Amersco, Solon, USA) και ο αναστολέας πρωτεάσης κοκτέιλ (Roche, Lewes, UK) και επωάστηκαν σε πάγο για 1 ώρα με διακοπτόμενη ανάμειξη. Το εκχύλισμα φυγοκεντρήθηκε για 20 λεπτά στους 4 ° C στα 12000 rpm. Για απελευθέρωση του κυτοχρώματος-c, κυτοσολικά και μιτοχονδριακή κλάσματα παρασκευάστηκαν όπως περιγράφεται προηγουμένως [29]. Η πρωτεΐνη εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο Bradford (Biorad Laboratories Inc, CA, USA). Ίση ποσότητα πρωτεΐνης φορτώθηκε σε είτε 10% ή 12% (για Ε6 πρωτεΐνη) SDS-πολυακρυλαμιδίου και μεταφέρθηκαν ηλεκτροφορητικά σε μεμβράνη Amersham Hybond-P PVDF (GE Healthcare, UK) σε ρυθμιστικό φωσφορικού νατρίου (ρΗ 6.8). Η μεμβράνη μπλοκαρίστηκε σε 5% BSA σε TST και επωάστηκαν στους 4 ° C όλη τη νύχτα με το πρωτογενές αντίσωμα έναντι ρ53, ρ21, κασπάση-3, CYTO-c, Her-2, pRb, ppRb, HPV16 Ε6 /18 Ε6, HPV16 Ε7, HPV18 Ε7 ή τουμπουλίνης (Santacruz, CA, USA) σε αραίωση 1:500. Η μεμβράνη πλύθηκε σε TST και επωάστηκαν με δευτερεύον προϊόν σύζευξης IgG HRP στο 1:5000 αραίωση. Πρωτεΐνες έγιναν ορατές με ένα κιτ χημειοφωταύγειας (western αποτύπωση κιτ Amersham ECL Advance ανίχνευσης, GE Healthcare, Ηνωμένο Βασίλειο) και η ανάλυση πυκνομετρίας έγινε στις σαρωμένες εικόνες ανοσοαποτύπωση χρησιμοποιώντας το εργαλείο ανάλυσης τζελ J εικόνας.

Αξιολόγηση του κυτταρικού κύκλου σύλληψης

για την ανάλυση του κυτταρικού κύκλου, κυτταρικές σειρές HeLa, SiHa και C33A απλώθηκαν σε μια πυκνότητα σποράς 5 × 10

5 κύτταρα /φρεάτιο σε τρυβλία 6 φρεατίων και αφέθηκαν να προσκολληθούν για 24 ώρες στους 37 ° C σε CO

2 θερμοκοιτίδα. Την επόμενη ημέρα, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με FR

aq (0-80 μg /ml) για 24 ώρες. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν με θρυψινοποίηση και μονιμοποιήθηκαν σε παγωμένο 70% αιθανόλης στους -20 ° C για 30 λεπτά. Μετά την πλύση με 1 χ PBS, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με RNAse Α (100 mg /ml) σε θερμοκρασία δωματίου για 30 λεπτά και χρωματίστηκαν με ΡΙ (20 μg /ml). Βαμμένα κύτταρα αναλύθηκαν για φθορισμό DNA-ΡΙ χρησιμοποιώντας μια flowcytometer (FACS Calibur, BD). Ένα ελάχιστο 10000 συμβάντα μετρήθηκαν ανά δείγμα? δεδομένα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας λογισμικό FACS Calibur-Cell Quest (Becton Dickinson) για τις αναλογίες των κυττάρων σε G

0 /G

1, φάση S και G

2 /M φάσεις του κυτταρικού κύκλου.

Αξιολόγηση της απόπτωσης

Για να προσδιορίσετε τον αριθμό των κυττάρων που υφίστανται απόπτωση μετά FR

θεραπεία υδατ, HeLa, SiHa και C33A απλώθηκαν σε πυκνότητα σποράς των 5 × 10

5 κύτταρα /φρεάτιο σε τρυβλία 6 φρεατίων και αφέθηκαν να αναπτυχθούν όλη τη νύκτα στους 37 ° C σε CO

2 θερμοκοιτίδα. Την επόμενη ημέρα, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διάφορες συγκεντρώσεις FR

aq (0-80 μg /ml) και επωάστηκαν για 24 ώρες. Τα κύτταρα χρωματίστηκαν με Αννεξίνη V-FITC σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Annexin V-FITC κιτ απόπτωσης # 3, Invitrogen, Grand Island, ΝΥ). Συνολικά 10.000 γεγονότα αποκτήθηκαν και δύο παραμέτρων dot οικόπεδο FL2-Η (Χ-άξονα? Φθορισμού ΡΙ, γραμμική κλίμακα) έναντι FL1-H (Y-άξονα? Annexin V-FITC-φθορισμού, linearscale) καταγράφηκε. Τα δεδομένα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό FACS CaliburCell Quest (Becton Dickinson).

Ανάλυση δυναμικό μιτοχονδριακής μεμβράνης (Δψπι)

Η ανάλυση κυτταρομετρίας ροής πραγματοποιήθηκε σε κύτταρα χρησιμοποιώντας JC-1 βαφή όπως περιγράφηκε προηγουμένως [12]. κύτταρα HeLa απλώθηκαν σε μια πυκνότητα σποράς 5 × 10

5 κύτταρα πλάκες /φρεάτιο σε 6-φρεατίων και αφέθηκαν να προσκολληθούν όλη τη νύκτα στους 37 ° C σε CO

2 θερμοκοιτίδα. Την επόμενη ημέρα, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με FR

aq (0-80 μg /ml) για 24 ώρες. Αυτό ακολουθήθηκε από συλλογή των κυττάρων, πλύση δύο φορές με 1 χ PBS που ακολουθείται από επώαση με φρέσκο ​​μέσο καλλιέργειας που περιέχει JC-1 βαφή (2,5 μg /ml) για 30 λεπτά στους 37 ° C σε σκοτάδι. Χρωματισμένα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές με παγωμένο 1 × PBS, επαναιωρήθηκαν σε 1 ml 1 χ PBS και αναλύθηκαν για Δψ

m

με κυτταρομετρία ροής. FCCP (10 μΜ) χρησιμοποιήθηκε ως θετικός έλεγχος. Ένα ελάχιστο 10000 συμβάντα μετρήθηκαν ανά δείγμα και μετρήθηκαν οι εντάσεις φθορισμού στα 527 nm (πράσινο) και 590 nm (κόκκινο).

Ανίχνευση ενδοκυτταρικού ασβεστίου με χρήση Fluo-3 /AM

κύτταρα HeLa απλώθηκαν σε μια πυκνότητα σποράς 5 × 10

5 κύτταρα /φρεάτιο σε πλάκα 6 φρεατίων και αφέθηκαν να προσκολληθούν όλη τη νύκτα. Την επόμενη ημέρα, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία FR

aq (0-80 μg /ml) για 24 ώρες στους 37 ° C σε 5% CO

2. Μετά την επώαση, τα επίπεδα ενδοκυτταρικού Ca

2+ αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής όπως περιγράφηκε προηγουμένως [12]. Εν συντομία, τα κύτταρα φορτώθηκαν με 5 μΜ Fluo-3 /AM (Sigma, St. Louis, ΜΟ) και 100 μg /ml του Pluronic F127 (Sigma, St. Louis, ΜΟ) σε σωλήνες φυγοκέντρησης και επωάστηκαν στους 37 ° C, 5% CO

2 για 1 ώρα στο σκοτάδι. Τα κύτταρα επαναιωρήθηκαν μετά κάθε 20 λεπτά για να εξασφαλίσει ακόμη βαφή φόρτωσης. Τα σφαιρίδια του κυττάρου πλύθηκαν δύο φορές με 0,9% αλατούχο διάλυμα και επαναιωρήθηκαν σε 3 ml ισορροπημένο διάλυμα άλατος Hank (HBSS) σε σωλήνες FACS. Ιονομυκίνη (30 μΜ) χρησιμοποιήθηκε ως θετικός έλεγχος. εντάσεις φθορισμού μετρήθηκαν στα 525 nm με FACS Calibur (Becton Dickinson Immunocytometry Systems, San Jose, CA) για να ληφθεί γραμμή βάσης αναγνώσεις. Οι μέσες εντάσεις φθορισμού κανάλι υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας λογισμικό CellQuest.

Στατιστική Ανάλυση

Όλα τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν και επαναλήφθηκαν τουλάχιστον τρεις φορές και τα δεδομένα έχουν παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± SD. Η στατιστική ανάλυση πραγματοποιήθηκε με το πρόγραμμα SigmaStat 3.5 (Systat Software, Inc.) με τη χρήση μονόδρομης ANOVA με α = 0,05.

Αποτελέσματα

Ficus ρυθμίζει την ανάπτυξη Κινητική Cells καρκίνου του τραχήλου

Έχουμε αναφερθεί στο παρελθόν ότι

F. religiosa

εμφάνισαν σημαντική αντιοξειδωτική δυναμικό καθώς και κυτταροτοξικότητα σε καρκίνο του τραχήλου κυτταρικές γραμμές, HeLa και SiHa [22]. Με βάση αυτό, επιλέξαμε μη κυτταροτοξικές συγκεντρώσεις των FR

aq (0-80 μg /ml) για SiHa (HPV-16) και HeLa (HPV-18) σε δοκιμασίες μας. Παρατηρήθηκε ότι FR

aq μείωσε την ανάπτυξη των κυττάρων σε ένα δόση και το χρόνο-εξαρτώμενο τρόπο. Σε SiHa, FR

aq μείωσε την ανάπτυξη των κυττάρων σε 80 μg /ml συγκέντρωση με ~4.78- (p = 0,008), ~4.72- (p = 0,001) και ~3.42 φορές (p = 0.053) σε 24, 48 και 72 ώρες, αντίστοιχα, σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα ελέγχου (Σχήμα 1Α). Ομοίως, σε 80 μg /συγκέντρωση του FR

aq, κύτταρα HeLa παρουσίασαν ~5.53- (p≤0.001), ~5.94- (p = 0.010) και ~6.37 φορές (p = 0,001) μείωση της κυτταρικής ανάπτυξης ml στις 24, 48 και 72 ώρες, αντίστοιχα, σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα ελέγχου (Εικόνα 1Β). Αυτό υποστηρίζεται περαιτέρω από σχηματισμό αποικιών και μαλακό άγαρ δοκιμασίες όπου μια δοσοεξαρτώμενη μείωση στον αριθμό των αποικιών παρατηρήθηκε στην αυχενική καρκινικές κυτταρικές γραμμές (Σχήμα 1 C και D, αντίστοιχα). Είναι ενδιαφέρον ότι, στα 80 μg /ml συγκέντρωση, FR

aq μείωσε σημαντικά τον αριθμό των αποικιών σε HeLa (~4.97 φορές? P≤0.001) και SiHa (~2.95 φορές? P≤0.001) σε σύγκριση με τις αντίστοιχες μη-κατεργασμένα κύτταρα ελέγχου ( Εικόνα 1D). Έτσι, Ficus ρυθμίζεται η κινητική ανάπτυξη των τραχηλικών καρκινικών κυττάρων σε σημαντικό βαθμό. Ως αρνητικός έλεγχος, πήραμε C33A (HPV αρνητικό) κυτταρική γραμμή και ανέλυσε την κυτταροτοξικότητα του FR

aq σε αυτό. Ficus δεν προκάλεσε καμία κυτταροτοξικότητα έως και 160 μg /ml συγκέντρωση στα κύτταρα C33A, η οποία ήταν παρόμοια με αυτή που παρατηρήθηκε σε SiHa και HeLa (Εικόνα S1). Ωστόσο, σε υψηλότερες συγκεντρώσεις, FR

aq επαγόμενη κυτταροτοξικότητα σε όλες τις τρεις κυτταρικές γραμμές, όπου τα HeLa και C33A κύτταρα έδειξαν παρόμοια κυτταροτοξική επίδραση.

SiHa (Α) και HeLa (Β) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ΡΚ

aq (0-80 μg /ml) για 24-72 ώρες και ο αριθμός των βιώσιμων κυττάρων μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας τη μέθοδο εξαίρεσης trypan blue dye. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν μέση τιμή ± SD τριών ανεξαρτήτων πειραμάτων. Οι τραχήλου καρκινικές κυτταρικές σειρές (SiHa και HeLa) (C) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με FR

aq (0-80 μg /ml) για μία εβδομάδα. Οι αποικίες κηλιδώθηκαν με κρυσταλλικό ιώδες και φωτογραφήθηκαν. Τα πειράματα επαναλήφθηκαν τρεις φορές. (D) Τόσο SiHa και HeLa (5 × 10

3), μαζί με FR

aq (0-80 μg /ml) αναπτύχθηκαν σε μαλακό άγαρ για δύο εβδομάδες. Αποικίες μετρήθηκαν από τουλάχιστον 10 διαφορετικές περιοχές και ο μέσος όρος του καθενός έχει απεικονίζονται. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν μέση τιμή ± SD από πέντε ανεξάρτητα πειράματα.

Η

Ficus Προκαλεί G

1 Φάση σύλληψης σε SiHa και μεταβάλλει την έκφραση του κυτταρικού κύκλου Ρυθμιστικές πρωτεΐνες

Για να αναλύσουμε το μηχανισμό πίσω από το Ficus μεσολάβηση ρύθμιση της κινητικής ανάπτυξης σε τραχήλου καρκινικά κύτταρα, μελετήθηκε η κατανομή του κυτταρικού κύκλου σε SiHa, HeLa και C33A. Η ανάλυση κυτταρομετρίας ροής έδειξε ότι σε παρουσία FR

aq, SiHa παρουσίασε μια αύξηση στην G

1 πληθυσμού με ταυτόχρονη μείωση σε φάση S με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο (Σχήμα 2Α). Είναι ενδιαφέρον ότι, σε συγκέντρωση 80 μg /ml, παρατηρήθηκε αύξηση στο ποσοστό των κυττάρων σε G

1 φάση (από 59,88 να 72,33%) με ταυτόχρονη μείωση του πληθυσμού S φάση (από 15,98 να 8,50%, ρ & lt? 0.050). Από την άλλη πλευρά, σε HeLa, υπήρξε μια σημαντική αύξηση στην υπο-G

0 πληθυσμός (από 3,65 να 87,38%, ρ & lt? 0.001) που υποδεικνύει αποπτωτικών πληθυσμού (Σχήμα S2). Είναι ενδιαφέρον ότι, σε μη τοξικές δόσεις, FR

υδατ δεν επηρέασε την ανάπτυξη του HPV κύτταρα αρνητικά C33A (Εικόνα S2).

κύτταρα SiHa υποβλήθηκαν σε θεραπεία με διαφορετικές συγκεντρώσεις FR

υδατ (0- 80 μg /ml) για 24 ώρες. (Α) Ενισχυμένη συσσώρευση των κυττάρων σε G

1 φάση με ταυτόχρονη μείωση του πληθυσμού S-φάση παρατηρήθηκε μετά από θεραπεία με Ficus (όπως υποδεικνύεται από ιστογράμματα). κηλίδα Western δείχνει τα επίπεδα έκφρασης του p53 και pRb (Β), καθώς και ρ21 και ppRb (C). Τουμπουλίνης χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. ανάλυση (D, E) πυκνομετρική του δυτικού στυπώματος δείχνει φορές αλλαγή στα επίπεδα της πρωτεΐνης μετά FR

aqtreatment. Οι ζώνες ποσοτικά με σάρωση πυκνότητας χρησιμοποιώντας ImageJ 1.44p (Wayne Rasband, National Institutes of Health, USA, https://imagej.nih.gov/ij). Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν μέση ± SD τριών ανεξαρτήτων πειραμάτων.

Η

Ερευνήσαμε το μηχανισμό της G

1 /S σύλληψης φάση σε SiHa με την αξιολόγηση της έκφρασης του G

1 πρωτεΐνες οδοφράγματος όπως p53, pRb, φωσφο Rb (ppRb) και p21. Υπήρξε μια σημαντική αύξηση στην έκφραση του p53 (Σχήμα 2Β και Δ), καθώς και καθοδικός τελεστής του, p21 (Σχήμα 2C και Ε) μετά την επεξεργασία των κυττάρων με FR

υδ. Η έκφραση του pRb αναλύθηκε αφού αποφωσφορυλιωμένο pRb είναι γνωστό ότι σχηματίζει σύμπλοκα με E2F να καταστείλει τη μεταγραφή του πολλαπλασιασμού γονιδίων των κυττάρων [30]. FR

aq, αύξησε σημαντικά την έκφραση του pRb (Σχήμα 2Β και D) με ταυτόχρονη μείωση των επιπέδων ppRb (Σχήμα 2C και Ε) με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι Ficus επάγεται G

1 /S συλλήψεως SiHa διαμορφώνοντας την έκφραση των ρυθμιστικών πρωτεϊνών του κυτταρικού κύκλου.

Ficus επάγει απόπτωση σε HeLa μέσω Αύξηση Cyt c και Caspase 3 Έκφραση

Βρήκαμε ότι σε HeLa, θεραπεία Ficus οδήγησε σε αύξηση του αριθμού των κυττάρων σε υπο-G

0 φάση, ενδεικτικό της αποπτωτικών πληθυσμού (Σχήμα S2). Στις χρώση με Annexin V-FITC, τα κύτταρα έδειξαν μια δοσοεξαρτώμενη αύξηση τόσο νωρίς όσο και αργά πληθυσμός αποπτωτικό κυτταρικό (Σχήμα 3Α). Είναι ενδιαφέρον ότι, στα 80 μg /ml FR

συγκέντρωση υδατ, υπήρχε ~4.4 φορές (p≤0.050) και ~5.5 φορές (p≤0.050) αύξηση τόσο νωρίς όσο και αργά πληθυσμός αποπτωτικό κυτταρικό, αντίστοιχα, σε σύγκριση στα μη επεξεργασμένα κύτταρα ελέγχου. Από την άλλη πλευρά, δεν απόπτωση παρατηρήθηκε σε FR

aq κατεργασία SiHa ή κυττάρων C33A (Σχήμα S3).

(Α) Εικονογράμματα Αντιπροσωπευτικά FACS των κυττάρων που έλαβαν θεραπεία με FR

aq (0-80 μg /ml) δείχνονται. Ποσοστό αννεξίνη (νωρίς-αποπτωτικά κύτταρα, κάτω δεξιά τεταρτημόριο) V-θετικά και αννεξίνη V /PI-double-θετικά κύτταρα (αργά-αποπτωτικών κυττάρων, άνω δεξιά τεταρτημόριο) υποδεικνύονται. (Β) Ανάλυση κυτταρομετρίας ροής της ταχείας απελευθέρωσης ασβεστίου σε κύτταρα HeLa μετά από θεραπεία με FR

aq (0-80 μg /ml) έχει αποδειχθεί. Ιονομυκίνη χρησιμοποιήθηκε ως θετικός έλεγχος. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν μέση τιμή ± SD τριών ανεξαρτήτων πειραμάτων. (Γ) FACS ανάλυση εξής JC-1 χρώση των HeLa έδειξε μεταβολή του δυναμικού της μιτοχονδριακής μεμβράνης μετά FR

aq (0-80 μg /ml) θεραπείας σε σύγκριση με μη επεξεργασμένα κύτταρα ελέγχου. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν μέση τιμή ± SD τριών ανεξαρτήτων πειραμάτων. (D) στύπωμα Western δείχνει την έκφραση του κυτοχρώματος c από κυτοσολικό κλάσμα. Τουμπουλίνης χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. (Ε) Η συνολική πρωτεΐνη απομονώθηκε και αναλύθηκε για την έκφραση του p53 και κασπάσης 3 με ανοσοστύπωση. Τουμπουλίνης χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. (F και G) πυκνομετρική ανάλυση της κηλίδος western που δείχνει φορές αλλαγή στα επίπεδα πρωτεΐνης. Οι ζώνες ποσοτικά με τη χρήση ImageJ 1.44p (Wayne Rasband, National Institutes of Health, USA, https://imagej.nih.gov/ij).

Η

Μελετήσαμε Ca

2+ μηχανισμός σε κύτταρα κατεργασμένα με FR

aq και παρατήρησε ότι προκάλεσε μια δοσοεξαρτώμενη αύξηση στα ενδοκυτταρικά επίπεδα του ασβεστίου (Σχήμα 3Β) σηματοδότησης. Ιονομυκίνη χρησιμοποιήθηκε ως θετικός έλεγχος. Είναι ενδιαφέρον ότι η αύξηση του ενδοκυτταρικού ασβεστίου οδήγησε σε διακοπή του δυναμικού της μιτοχονδριακής μεμβράνης (Δψπι) που παρατηρήθηκε από μείωση στην ένταση φθορισμού κόκκινο, μετά από χρώση των κυττάρων με JC-1 βαφή (Σχήμα 3C). Υπήρχε -3-πλάσια μείωση στο κόκκινο ένταση φθορισμού (p≤0.001) στους 80 μg /συγκέντρωση του FR

aq ml. FCCP χρησιμοποιήθηκε ως θετικός έλεγχος στη μελέτη. Η αποπόλωση της μιτοχονδριακής μεμβράνης συνδέθηκε με μια δοσοεξαρτώμενη αύξηση στο κυτοσολικό κυτοχρώματος c (Σχήμα 3D και F) που συνοδεύτηκε από αύξηση στην έκφραση της κασπάσης 3 και ρ53 (Σχήμα 3Ε και G). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι Ficus επαγόμενη απόπτωση σε HeLa μέσω μιτοχονδριακής οδού που εξαρτάται.

Ficus Μειώνει εισβολή και Μετανάστευσης SiHa και HeLa

Οι επουλωτικές των πληγών δοκιμασία διεξήχθη σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές και παρατηρήθηκε ότι Ficus ανέστειλε αποτελεσματικά τη μετάβαση των δύο SiHa (Σχήμα 4Α) και HeLa (Σχήμα 4Β) σε ένα δόση και το χρόνο εξαρτώμενο τρόπο σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα ελέγχου. Μετά από 16 ώρες, τα μη επεξεργασμένα κύτταρα SiHa και HeLa ήταν σε θέση να καλύψει έως -82% του τραύματος, ενώ στα 80 μg /ml του FR

θεραπεία υδατ, τα κύτταρα που καλύπτει το τραύμα κατά ~ 33% (ρ & lt? 0.001 ) και 22% (ρ & lt? 0.001), αντίστοιχα (Σχήμα 4C). Σε αυτό συγκεκριμένη δόση, Ficus μείωσε την επεμβατική ικανότητα τόσο SiHa και HeLa με ~2.45- (p≤0.001) και ~3.8-πτυχώσεις (p≤0.001), αντίστοιχα, σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα ελέγχου (Εικόνα 4D).

Ανάλυση της κυτταρικής μετανάστευσης SiHa (Α) και HeLa (Β) υποβάλλεται σε επεξεργασία με FR

aq (0-80 μg /ml) μετρήθηκε με δοκιμασία επούλωση της πληγής. Το πάνω τμήμα της εικόνας δείχνει την πληγή γίνεται σε 0 h. Το κάτω πάνελ δείχνει την μετανάστευση των κυττάρων που αντιστοιχεί στην απόσταση που διανύθηκε σε 16 ώρες. (C) Γραφική αναπαράσταση του κλεισίματος τραύματος στα κύτταρα SiHa και HeLa σε 16 ώρες μετά FR

θεραπεία υδατ έχει αποδειχθεί. Οι τιμές παρουσιάζονται ως ποσοστό κλείσιμο του τραύματος και εκφράζονται ως μέση τιμή ± SD για τρία ανεξάρτητα πειράματα. (D) δοκιμασία εισβολή κυττάρων που δείχνει το ποσοστό των κυττάρων που εισέβαλαν ανά πεδίο υπό την παρουσία ή απουσία FR

υδ. Τα εισέβαλαν κύτταρα μετρήθηκαν σε δέκα τυχαία πεδία και οι τιμές έχουν εκφράζονται ως μέση τιμή ± SD για τρία ανεξάρτητα πειράματα. (Ε) Ζελατίνη ζυμογραφία που δείχνει προς τα κάτω ρύθμιση της έκφρασης ΜΜΡ-2 στο FR

aq (0-80 μg /ml) κατεργάζεται SiHa και HeLa. (F) ανάλυση κηλίδας Western που δείχνει μείωση της έκφρασης Her-2 σε SiHa και HeLa κατεργάζεται με FR

aq (0-80 μg /ml). Τουμπουλίνης χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. ανάλυση (G) πυκνομετρική του δυτικού στυπώματος δείχνει φορές αλλαγή της HER-2 επίπεδα πρωτεΐνης σε SiHa και HeLa. Οι ζώνες ποσοτικά με πυκνομετρία χρησιμοποιώντας ImageJ 1.44p (Wayne Rasband, National Institutes of Health, USA, https://imagej.nih.gov/ij).

Η

Είναι γνωστό ότι η αυξημένη έκφραση των MMPs σε ιστούς όγκων συσχετίζεται με την αποδόμηση της μήτρας των καρκινικών κυττάρων, εισβολή καθώς και μετάσταση [31]. Παρατηρήσαμε ότι FR

aq σημαντικά κάτω ρυθμισμένη η έκφραση του ΜΜΡ-2 και στα δύο κύτταρα SiHa και HeLa (Εικόνα 4Ε) σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα ελέγχου.

HER2 /

neu

έχει αναφερθεί ότι ενισχύει την μεταστατικό δυναμικό των καρκίνων κυττάρων [32] και συσχετίζεται θετικά με ΜΜΡ-2 έκφραση [33]. Βρήκαμε ότι FR

aq μείωσε την έκφραση του Her-2 σε ένα δοσο-εξαρτώμενο τρόπο τόσο SiHa και HeLa (Εικόνα 4F και G). Τα στοιχεία δείχνουν ότι Ficus μείωσε την μετανάστευση, καθώς και εισβολή του τραχήλου της μήτρας καρκινικών κυττάρων με ρύθμιση της έκφρασης του Her-2 και ΜΜΡ-2 πρωτεΐνες.

Ficus Μειώνει την έκφραση των ιικών ογκοπρωτεϊνών Ε6 και Ε7

Δεδομένου ότι, Ficus παρουσίασαν σημαντική αντινεοπλασματική δυναμικό τόσο HPV16 (SiHa) και HPV 18 (HeLa) θετικές κυτταρικές σειρές, ερευνήσαμε την έκφραση των ιικών πρωτεϊνών Ε6 και Ε7 στα επεξεργασμένα και μη επεξεργασμένα κύτταρα. Παρατηρήθηκε ότι, FR

aq μείωσε σημαντικά την έκφραση του Ε6 και Ε7 ογκοπρωτεϊνών τόσο SiHa και HeLa (Σχήμα 5Α και Β, αντίστοιχα). Στα 80 μg /ml FR

συγκέντρωση υδατ, η έκφραση των πρωτεϊνών Ε6 και Ε7 μειώθηκαν κατά ~3.0- (p≤0.001) και 3,7-πτυχώσεις (p≤0.001), αντίστοιχα, σε SiHa (Σχήμα 5Α και C) και με ~3.2- (p≤0.001) και 4,0-πτυχώσεις (p≤0.001), αντίστοιχα, σε HeLa σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα ελέγχου (Σχήμα 5Β και D). Έτσι, Ficus μείωσε την έκφραση των ιικών ογκοπρωτεϊνών Ε6 και Ε7, τα οποία ενισχύει θεραπευτική σημασία της στην ρύθμιση του καρκίνου.

Η έκφραση των Ε6 και Ε7 ογκοπρωτεϊνών προσδιορίστηκε με ανοσοκηλίδωση με Ε6 και Ε7 αντισώματα σε SiHa (Α) και HeLa (Β) υποβάλλεται σε επεξεργασία με FR

aq (0-80 μg /ml). Τουμπουλίνης χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης.