Αφηρημένο

Σκοπός

miRNAs να ρυθμίζουν τις βιολογικές διεργασίες, όπως η διαφοροποίηση, τον πολλαπλασιασμό και την απόπτωση. Dicer και DROSHA είναι δύο μέλη της οικογένειας RNase III, παίζοντας καθοριστικό ρόλο στην οδό της miRNAs βιογένεσης. Σε αυτή τη μελέτη, υποθέσαμε ότι οι γενετικές παραλλαγές των γονιδίων Dicer και DROSHA συσχετίστηκαν με τον κίνδυνο καρκίνου της ουροδόχου κύστης.

Πειραματικός Σχεδιασμός

Πραγματοποιήσαμε μια μελέτη ασθενών-μαρτύρων των 685 περιπτώσεις καρκίνου της ουροδόχου κύστης και 730 ελέγχους για να ερευνήσει τη σχέση μεταξύ των επτά λειτουργικές SNPs του

Dicer

και

DROSHA

γονίδια και τον κίνδυνο καρκίνου της ουροδόχου κύστης. Στη συνέχεια αξιολογείται η λειτουργικότητα των σημαντικών SNPs

Αποτελέσματα

Βρήκαμε ότι rs10719T T0.3330.3760.3780.06798.2rs13078955567473’UTRT A0.0560.0570.0610.13199.1rs1057035955541423’UTRT C0.1110.1120.1100.741100.0rs3742330955533623’UTRA G0.2670.3310.3320.25799.6

DROSHA

(NM_013235) 5p14-p13rs229110931532301promoterA T0.2110.2190.2340.062100.0rs10719314014473’UTRT C0.2330.2820.2430.43799.7rs642321314010033’UTRC T0.4670.4740.5050.655100.0Table 1. Πρωτογενής πληροφορίες του γονότυπου SNPs.

Θέση aSNP στο NCBI dbSNP (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP).bMAF από τις βάσεις δεδομένων HapMap (https://www.hapmap.org) .cHWE

P

αξία στην ομάδα ελέγχου. CSV Λήψη CSV

Βιοπληροφορική ανάλυση του

DROSHA

3’ΙΙΤΡ

Με βάση την ανάλυση βιοπληροφορικής, είχαμε προβλέψει ότι η HSA-miR-27a /b μπορεί να συνδεθεί με την περιοχή 3’UTR του

DROSHA

με τη χρήση τεσσάρων κοινών ιστοσελίδες (Target σάρωσης: https://www.targetscan.org/, Miranda: https://www.microrna.org/, Μικρόκοσμος: https://www.ebi.ac .uk /Enright-srv /μικρόκοσμο /cgi-bin /στόχων /V5 /genome.pl και ΠΙΤΑ: https://genie.weizmann.ac.il/) (Εικόνα 1Α). Θεωρήσαμε ότι ο συνδυασμός αυτών των προσεγγίσεων θα μειώσει σημαντικά την πιθανότητα ψευδών θετικών.

(Α) DROSHA 3’ΙΙΤΡ είχε προβλεφθεί μια θέση πρόσδεσης για την HSA-miR-27a /b. Η αλληλουχία της HSA-miR-27a και HSA-miR-27b είχε μόνο μία διαφορά βάσεως (υπογραμμισμένη). Σάρωση περίπου ± 100 bp περιοχές της θέσης δέσμευσης, εμείς μόνο διαπίστωσε ότι rs10719T & gt? C βρισκόταν στην περιοχή αυτή. Προβλέψτε αποτέλεσμα της αλληλικής ποικιλομορφίας στο rs10719 σε HSA-miR-27a /b αναγνώριση και την κατασκευή του pGL3-DROSHA 3’UTR-T /C που περιέχει το γονίδιο της λουσιφεράσης renilla και πλήρους μήκους 3’UTR του γονιδίου DROSHA με διαφορετικά αλληλόμορφα του rs10719 ( βέλος: T & gt? υποκατάστασης C). (B, C) προσδιορισμούς λουσιφεράσης ανταποκριτή για τη μέτρηση rs10719T ή C αλληλόμορφο διαφορά με την παρουσία ή την παρεμβολή του HSA-miR-27a /b. Στο (Β), Τ24 κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 24 φρεατίων ήταν παροδικά συν-επιμολύνθηκαν με κατασκευές και HSA-miR-27a /b μιμείται ή σταθερό αρνητικό έλεγχο (NC). Στο (C), τα κύτταρα σπάρθηκαν επί J82 πλάκες 24 φρεατίων ήταν παροδικά συν-επιμολύνθηκαν με κατασκευές και HSA-miR-27a /b αναστολείς ή αναστολέας NC. Τα αποτελέσματα δείχνονται ως σχετική δραστικότητα λουσιφεράσης έναντι NC. Τα δεδομένα από τρία ανεξάρτητα πειράματα μορφομετατροπής.

**

P

& lt? 0.05.

Η

σε πραγματικό χρόνο ποσοτική αντίστροφη μεταγραφή-PCR (RT-PCR)

Για να αξιολογηθεί το ενδογενές επίπεδο έκφρασης της HSA-miR-27a /b, τέσσερις ουροδόχου κύστης καρκινικές κυτταρικές σειρές (EJ, Τ24, J82, και 5637) εμβολιάστηκαν σε 20 cm

2 πλάκες υποβλήθηκαν σε εκχύλιση του ολικού RNA που απομονώθηκε από κύτταρα χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο ΤπζοΙ (Invitrogen, CA, USA). Πίνακας S1 στο αρχείο S1 έδειξε την εκκινητών πληροφορίες της HSA-miR-27a /b και U6. Οι αντιδράσεις αντίστροφης μεταγραφάσης (10 μλ) περιείχαν 2 μλ συνολικού RNA (500 ng /μl), 1 μΐ ρυθμιστικού διαλύματος 10 Χ AMV RT, 10 pmol κάθε ένα από dNTPs (Toyobo, Tsuruga, Japan), 0.75 μΐ αντιπληροφοριακού βρόχου μείγμα εκκινητή, 0,25 U /μl RNase Αναστολέας (Toyobo, Tsuruga, Japan), 1U /μl AMV αντίστροφης μεταγραφάσης. Το μίγμα επωάστηκε στους 16 ° C για 15 λεπτά, 42 ° C για 60 λεπτά, και 85 ° C για 5 λεπτά. Στη συνέχεια, Applied Biosystems 7900HT Real Time PCR System χρησιμοποιήθηκε για να εκτελέσει σε πραγματικό χρόνο ποσοτικοποίηση PCR (ΑΒΙ, CA, USA) με βάση την SYBR-Πράσινο μέθοδο (Toyobo, Tsuruga, Japan). Όλες οι αντιδράσεις διεξήχθησαν εις τριπλούν. Διπλώστε αλλαγές ομαλοποιήθηκαν στα επίπεδα έκφρασης του U6

Για την ανίχνευση της συσχέτισης μεταξύ των επιπέδων

DROSHA

mRNA και rs10719 T & gt?. C πολυμορφισμός

in vivo

, συνολικά 61 ιστών όγκου της ουροδόχου κύστης με διαφορετικούς γονότυπους (32 για ΤΤ, 24 για TC, και 5 για γονότυπους CC) υποβλήθηκαν σε εκχύλιση του ολικού RNA χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο ΤπζοΙ (Invitrogen, CA, USA). ιστούς όγκων της ουροδόχου κύστης διατηρήθηκαν σε υγρό άζωτο μετά την απομάκρυνση από το σώμα. Το συνολικό RNA αξιολογήθηκε με δύο αντίστροφης μεταγραφάσης αντίδραση και σε πραγματικό χρόνο ποσοτική PCR βασίζεται στην SYBR-Πράσινο μέθοδο (Toyobo, Tsuruga, Japan). Το cDNA χρησιμοποιήθηκε για την ενίσχυση του

DROSHA

γονιδίου και ενός ενδογενούς γονιδίου ελέγχου

GAPDH

. Η εκκινητές πληροφορίες του

DROSHA

και

GAPDH

γονίδια περιλαμβάνονται στον Πίνακα 1. Fold αλλαγές ομαλοποιήθηκαν με τα επίπεδα έκφρασης του

GAPDH

και κάθε δοκιμασία πραγματοποιήθηκε εις τριπλούν .

DROSHA

3’UTR που περιέχει τα κατασκευάσματα γονιδίου αναφοράς rs10719TC και αναλύσεις αναφοράς της λουσιφεράσης

Για την κατασκευή των πλασμιδίων αναφοράς της λουσιφεράσης της

DROSHA

3’ΙΙΤΡ,

DROSHA

3’UTR θραύσματα (937bp) που φέρει το μείζον αλληλόμορφο rs10719T ενισχύθηκαν με PCR. Οι εκκινητές ήταν 5′-ACCTTGGTACCCCAGATGAGACTGAAGACATC-3 ‘(προς τα εμπρός) και 5′-ACCTTCTCGAGGCACTCACTATATATTTGCTG-3′ (αντίστροφο). Τα προϊόντα της PCR εκχυλίστηκαν και διαχωρίστηκαν με πήκτωμα αγαρόζης, τα οποία κλωνοποιήθηκαν με ΤΑ κιτ κλωνοποίησης (Invitrogen, CA, USA). Επιπλέον, το θραύσμα που περιέχει ελάχιστο αλληλόμορφο rs10719C διεξήχθη χρησιμοποιώντας τους ακόλουθους εκκινητές: 5’-TAGTTTTCCTGCAGACAATGAACGAAGTGTGC-3 ‘(προς τα εμπρός) και 5′-TTTATTTCAATGAGCACACTTCGTTCATTGTC-3’ (αντίστροφο). Τέλος, το ενισχυμένο θραύσμα που φέρει Τ ή C αλλήλιο εισήχθη προς τα κάτω του γονιδίου της λουσιφεράσης σε ένα πλασμίδιο pGL3-υποκινητή και στη συνέχεια το πλασμίδιο που περιέχει Τ ή C αλλήλιο διεξήχθη, τα οποία επιβεβαιώθηκαν με αλληλούχιση.

Για αναφοράς λουσιφεράσης δοκιμασίας, Τ24 και J82 κύτταρα τοποθετήθηκαν σε τρυβλία 24 φρεατίων (1 χ 10

5 κύτταρα ανά φρεάτιο) και, στη συνέχεια, συνεπιμολύνθηκαν με pGL3-

DROSHA

3’UTR-T ή pGL3-

DROSHA

3’UTR-C και pRL-SV40 (50: 1). Τα μιμητικά και αναστολείς της HSA-miR-27a /b και αρνητικούς ελέγχους τους (GenePharma, Σαγκάη, Κίνα) συν-επιμολύνθηκαν με τα πλασμίδια ανταποκριτής σε μια τελική συγκέντρωση του 20nmol /μl. Σαράντα οκτώ ώρες μετά την επιμόλυνση σε κύτταρα Τ24 και J82, λουσιφεράση δραστικότητα σε προϊόντα λύσης μετρήθηκε με Dual-Luciferase Reporter System Assay (Promega, WI, USA) και κανονικοποιημένες έναντι της δραστικότητας του pRL-SV40. Οι δοκιμασίες ακολουθήθηκαν από τις προτάσεις του κατασκευαστή. Ανεξάρτητα πειράματα εις τριπλούν διεξήχθησαν για κάθε πλασμίδιο κατασκεύασμα.

Η στατιστική ανάλυση

Η ισορροπία Hardy-Weinberg της κατανομής γονότυπου ανάμεσα στους ελέγχους εφαρμόστηκε χρησιμοποιώντας μια καλοσύνη-of-ταιριάζει χ

2 δοκιμή. Οι κατανομές συχνότητας των επιλεγμένων δημογραφικών μεταβλητών μεταξύ των περιπτώσεων και ελέγχων εξετάστηκαν χρησιμοποιώντας χ

2 δοκιμή. αναλογίες γονότυπο-ειδικό πιθανοτήτων (OR) και 95% διαστήματα εμπιστοσύνης τους (ΠΙ) υπολογίστηκαν από αναλύσεις άνευ όρων μονοπαραγοντική και πολυπαραγοντική λογιστική παλινδρόμηση. Η πολυπαραγοντική προσαρμογή περιλαμβάνεται το καθεστώς ηλικία, το φύλο και το κάπνισμα (ποτέ και ποτέ το κάπνισμα). Επιπλέον, χρησιμοποιήθηκαν Kruskal-Wallis μονόδρομη ANOVA τεστ για την ανάλυση των αποτελεσμάτων των

DROSHA

mRNA έκφραση

in vivo

. Σε αυτή τη μελέτη, η σχετική λουσιφεράσης έκφραση γονιδίου ανταποκριτή για Τ ή C αλλήλιο υπολογίστηκε ξεχωριστά.

t

δοκιμή Student χρησιμοποιήθηκε για να αξιολογήσει τις διαφορές στα επίπεδα έκφρασης του γονιδίου αναφοράς λουσιφεράσης μεταξύ υποομάδες. Όλες οι δοκιμασίες ήταν διπλής όψης με χρήση του λογισμικού SAS (έκδοση 9.1? SAS Institute, Inc, Cary, NC, USA) και

P

& lt? 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική.

Αποτελέσματα

μελέτης σύνδεσης μεταξύ των πολυμορφισμών του

Dicer

και

DROSHA

και καρκίνου της ουροδόχου κύστης

κινδύνου

τα χαρακτηριστικά των ασθενών 685 κύστη καρκίνωμα από μεταβατικό επιθήλιο και 730 ελέγχων συνοψίζονται στον πίνακα 2. Εδώ, δεν παρατηρήσαμε στατιστική διαφορά στην κατανομή της ηλικίας (

P

= 0.144) και το φύλο (

P

= 0,825) μεταξύ ασθενών και μαρτύρων. Ωστόσο, υπήρχαν περισσότερες ποτέ καπνιστές (55,6%) μεταξύ των ασθενών περισσότερο παρά μεταξύ τους ελέγχους (38,4%), και αυτή η διαφορά ήταν στατιστικώς σημαντική (

P

& lt? 0.001). Αυτές οι μεταβλητές προσαρμόστηκαν για την επόμενη πολυπαραγοντική ανάλυση λογιστικής παλινδρόμησης. Από τις 685 περιπτώσεις, υπήρχαν 315 βαθμού όγκου 1 (46,0%), 261 βαθμού όγκου 2 (38,1%) και 109 βαθμού του όγκου 3 (15,9%) ασθενείς. Επιπλέον, 435 (63,5%) είχαν επιφανειακή όγκους και τα υπόλοιπα 250 (36,5%) είχαν επεμβατικές όγκους.

Μεταβλητές

υποθέσεις (n = 685)

Η Έλεγχοι (n = 730)

P

α

η Ν

%

η Ν

%

η Ηλικία ≤ 6532948.037951.90.144 & gt? 6535652.035148.1Sex Male55480.958780.40.825 Female13119.114319.6Smoking κατάσταση Never30444.445061.6 & lt? 0.001 στάδιο Ever38155.628038.4 Former17225.1729.9 Current20930.520828.5Tumor βαθμό G131546.0 G226138.1 G310915.9Tumor Επιφανειακή (PT

α-ΡΤ

1) 43.563,5 Επεμβατική (PT

2-ΡΤ

4 ) 25036.5Table 2. κατανομές συχνοτήτων των επιλεγμένων μεταβλητών μεταξύ των περιπτώσεων καρκίνου της ουροδόχου κύστης και του καρκίνου χωρίς ελέγχους.

aTwo όψης χ

2-test για την κατανομή συχνότητας των επιλεγμένων μεταβλητών μεταξύ των περιπτώσεων καρκίνου της ουροδόχου κύστης και του καρκίνου χωρίς ελέγχους CSV Λήψη CSV

Οι επτά συχνότητες SNPs γονότυπο μεταξύ του ελέγχου ήταν σε συμφωνία με τις ισορροπίες Hardy-Weinberg (

P

& gt? 0,05? Πίνακας 1). Όπως φαίνεται στον Πίνακα 3, παρατηρήσαμε ότι τα άτομα με τις

DROSHA

3’ΙΙΤΡ αλληλόμορφο rs10719C (TC και CC γονότυπους) είχαν 1,24 φορές αυξημένο κίνδυνο καρκίνου της ουροδόχου κύστης (Adjusted OR = 1.25, 95% CI = 1,01 – 1,55,

P

= 0,041) σε σύγκριση με το γονότυπο rs10719TT. Εν τω μεταξύ, παρατηρήσαμε ότι η κατανομή των γονότυπων rs10719TC μεταξύ των περιπτώσεων και ελέγχων έδειξαν σημαντική διαφορά (

P

= 0,017). Ωστόσο, εμείς δεν παρατηρούμε σημαντικές διαφορές στην κατανομή του γονοτύπου του

Dicer

rs12323635CT, rs13078TA, rs1057035TC, rs3742330AG και

DROSHA

rs2291109AT, πολυμορφισμοί rs642321CT μεταξύ των περιπτώσεων και των ελέγχων (όλα

P

& gt? 0,05, Πίνακας 3). Αξιολογήσαμε περαιτέρω την επίδραση της περιλαμβάνονται επτά πολυμορφισμών στον κίνδυνο καρκίνου της ουροδόχου κύστης με διαστρωμάτωση κατά φύλο και το κάπνισμα κατάσταση. Όπως φαίνεται στον Πίνακα S2 στο αρχείο S1, βρήκαμε ότι rs10719TC πολυμορφισμός μπορεί να αυξήσει τον κίνδυνο καρκίνου της ουροδόχου κύστης στους άνδρες ασθενείς (Adjusted OR = 1.34, 95% CI = 1.05-1.70,

P

= 0.018), και ποτέ καπνιστές (Adjusted OR = 1.56, 95% CI = 01.14 – 02.14,

P

= 0,006).

Γονότυπους

υποθέσεις

Έλεγχοι

ακατέργαστη ή (95% CI )

ρυθμιστεί ή (95% CI)

a

P

a

P

b

N

%

N

%

DICER

rs12323635CT680710CC26639.128640.31.00 (Αναφοράς) 1.00 (αναφοράς) 0.887CT32147.231143.81.11 (0,88 – 1,40) 1,09 (0,86 – 1,37) 0.485TT9313.711315.90.89 (0,64 – 1,22) 0,88 (0,63 – 1,22) 0.441CT /TT41460.942459.71.05 ( 0,85 έως 1,20) 1,03 (0,83 – 1,28) 0.793rs13078TA679723TT60388.864088.31.00 (αναφοράς) 1.00 (αναφοράς) 0.640AT7511.17810.81.02 (0,73 – 1,43) 0,99 (0,70 – 1,39) 0.937AA10.250.70.21 (0,03 – 1,82 ) 0,30 (0,03 – 2,57) 0.271AT /AA7611.28311.50.97 (0,70 – 1,35) 0,95 (0,68 – 1,33) 0.768rs1057035TC685730TT54880.057779.01.00 (αναφοράς) 1.00 (αναφοράς) 0.857TC12017.514519.90.87 (0,67 – 1,14) 0,88 (0,67 – 1,16) 0.371CC172.581.102.34 (0,96 – 5,23) 2,36 (1,00 – 5,59) 0.051TC /CC13720.015321.00.94 (0,73 – 1,22) 0,96 (0,74 – 1,25) 0.753rs3742330AG683727AA30244.233145.51.00 (αναφορά ) 1.00 (αναφοράς) 0.942AG31045.430942.51.10 (0,88 – 1,37) 1,09 (0,87 – 1,37) 0.437GG7110.48712.00.90 (0,63 – 1,27) 0,88 (0,61 – 1,25) 0.464AG /GG38155.839654.51.06 (0.86- 1,30) 1,05 (0,84 – 1,30) 0.686

DROSHA

rs2291109AT685730AA42161.541957.41.00 (αναφοράς) 1.00 (αναφοράς) 0.332AT22833.328038.40.81 (0,65 – 1,01) 0,79 (0,63 – 0,99) 0.044TT365.3314.31. 16 (0,70 – 1,90) 1,20 (0,72 – 2,00) 0.482AT /TT26438.531142.60.85 (0,68 – 1,05) 0,83 (0,67 – 1,03) 0.098rs10719TC684727TT35251.541356.81.00 (αναφοράς) 1.00 (αναφοράς) 0.017TC27840.627537.81.19 (0,95 – 1,48) 1,20 (0,96 – 1,50) 0.116CC547.9395.41.63 (1,05 – 2,51) 1,61 (1,03 – 2,50) 0.036TC /CC33248.531443.21.24 (1,01 – 1,53) 1,25 (1,01 – 1,55) 0.041rs642321CT685730CC19728. 817624.11.00 (αναφοράς) 1.00 (αναφοράς) 0.107CT32647.637150.80.79 (0,61 – 1,01) 0,79 (0,61 – 1,02) 0.075TT16223.718325.10.79 (0,59 – 1,06) 0,78 (0,58 – 1,06) 0.112CT /TT48871.255475.90 0,79 (0,62 – 1,00) 0,79 (0,62 – 1,01) 0.056Table 3. γονότυπος συχνότητες του

Dicer

και

DROSHA

SNPs μεταξύ ασθενών και μαρτύρων καρκίνου της ουροδόχου κύστης και την ένωσή τους με τον κίνδυνο καρκίνου της ουροδόχου κύστης .

aAdjusted για την ηλικία, το φύλο και το κάπνισμα (ποτέ και ποτέ) στην λογιστική παλινδρόμηση chi-square test model.bTwo όψης για τη διανομή των συχνοτήτων αλληλόμορφο (έλασσον αλληλόμορφο έναντι μεγάλων αλληλόμορφο). CSV Λήψη CSV

DROSHA

3’ΙΙΤΡ rs10719TC επηρεάζει

DROSHA

έκφρασης με τη ρύθμιση δεσμευτική

Για να διερευνηθεί η πιθανή μηχανισμό του το HSA-miR-27b

DROSHA

3’ΙΙΤΡ στον κίνδυνο καρκίνου της ουροδόχου κύστης, πραγματοποιήσαμε τις λειτουργικές δοκιμασίες. Με βάση την ανάλυση βιοπληροφορικής, της

DROSHA

3’ΙΙΤΡ είχε προβλεφθεί μια θέση πρόσδεσης για την HSA-miR-27a /b (Εικόνα 1Α). Εδώ, έχουμε αποδείξει ότι rs10719TC βρισκόταν 46bp κατάντη της HSA-miR-27a /b θέση πρόσδεσης στο

DROSHA

3’ΙΙΤΡ.

Όπως φαίνεται στο Σχήμα S1 στο αρχείο S1, το πραγματικό -Ώρα ποσοτική ανάλυση RT-PCR πρότεινε ότι τα ενδογενή επίπεδα έκφρασης της HSA-miR-27a /b στο J82 κυτταρική γραμμή ήταν πιο σημαντικά υψηλότερο από ό, τι άλλα κύτταρα (Τ24, EJ, και 5637) (

P

& lt? 0.001 ). Εδώ, επιλέξαμε κυτταρικές σειρές J82 και T24 στην περαιτέρω δοκιμασία λουσιφεράσης. Στη συνέχεια, χρησιμοποιήσαμε τα πλασμίδια για την παροδική συν-επιμόλυνση με τα κύτταρα Τ24 [σταθερά αρνητικό έλεγχο (NC) miRNA: σταθερή NC ή HSA-miR-27a /b μιμείται] και τα κύτταρα J82 (αναστολέας NC ή HSA-miR-27a /b απαγορευτής). Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1Β (Τ24 κυττάρων), HSA-miR-27a /b κατασταλεί έκφραση λουσιφεράσης με την παρουσία του αλληλόμορφου rs10719T συγκρίνοντας με NC (

P

& lt? 0,05), αλλά όχι το αλλήλιο rs10719C (

P

& gt? 0,05). Επιπλέον, βρήκαμε επίσης ότι η αναστολή της HSA-miR-27a /b έκφραση μπορεί να αυξήσει την έκφραση λουσιφεράσης αποτελεσματικά για το πλασμίδιο rs10719T περιέχουν παρά το πλασμίδιο rs10719C περιέχει στα κύτταρα J82 (

P

& lt? 0,05? Σχήμα 1 C). Ωστόσο, βρήκαμε επίσης ότι μια σημαντική μείωση της έκφρασης της λουσιφεράσης, όταν προστεθεί αναστολέας HSA-miR-27a σε αλληλόμορφο C στα κύτταρα J82. Το παρόμοιο αποτέλεσμα δεν πρέπει να τηρούνται κατά την προσθήκη αναστολέα HSA-miR-27b σε αλληλόμορφο C στα κύτταρα J82. Ίσως, HSA-miR-27a δεν επηρέασε άμεσα την έκφραση λουσιφεράσης DROSHA. Τα στοιχεία μας πρότεινε ότι rs10719 Τ σε C υποκατάστασης δρα ως μετάλλαξη απώλειας λειτουργίας και θα μπορούσε να επηρεάσει την έκφραση λουσιφεράσης DROSHA με στόχο HSA-miR-27b.

Στην παρούσα μελέτη, πραγματοποιήθηκε επίσης ανάλυση RT-PCR να διερευνήσει κατά πόσον HSA-miR-27b επηρεάζονται έκφραση DROSHA υποβαθμίζοντας mRNA ή καταστολή mRNA μετα-μεταφραστική μετάφραση (Σχήμα S1 στο αρχείο S1). Ένα σύνολο των καρκινικών ιστών 61 κύστης με διαφορετικούς γονότυπους του

DROSHA

rs10719TC πολυμορφισμός χρησιμοποιήθηκαν για να εκτιμηθεί η έκφραση

DROSHA

mRNA. Δεν παρατηρήθηκε σημαντική διαφορά επιπέδων της

DROSHA

mRNA μεταξύ των ατόμων με το ΤΤ, TC και γονότυπους CC (

P

& gt? 0,05). Στο σύνολό τους, HSA-miR-27b μπορεί να επηρεάσει DROSHA έκφρασης με τη ρύθμιση της μετάφρασης πρωτεϊνών.

Συζήτηση

Στην παρούσα μελέτη, διερευνήθηκε η σχέση μεταξύ επτά πολυμορφισμών των

Dicer

και

DROSHA

κίνδυνο γονιδίων και της ουροδόχου κύστης σε ένα κινεζικό πληθυσμό, και διαπίστωσε ότι ο πολυμορφισμός rs10719TC δίπλα στη θέση σύνδεσης σε HSA-miR-27b

DROSHA

3’ΙΙΤΡ συσχετίστηκε με αυξημένο σημαντικά το κίνδυνο καρκίνου της ουροδόχου κύστης. Λειτουργικές δοκιμασίες έδειξαν ότι

DROSHA

rs10719 Τ υποκατάστασης C μπορεί να μειώσει τη δραστικότητα δέσμευσης της HSA-miR-27b με

DROSHA

3’ΙΙΤΡ.

DROSHA είναι μέλος της RNase III υπεροικογένεια και είναι ένα σημαντικό νουκλεάση που εκτελεί το αρχικό βήμα στην επεξεργασία miRNA με την κοπή pri-miRNA να προ-miRNA [31]. Παρεμβολή RNA DROSHA είχε ως αποτέλεσμα τη συσσώρευση των pri-miRNA και τη μείωση των προ-miRNA και ώριμο RNA [31]. Μέχρι τώρα, αρκετές ομάδες έχουν μελετήσει το ρόλο του

DROSHA

στον καρκίνο [32,33]. Έχει αναφερθεί ότι

DROSHA

rs644236 ΤΤ γονότυπο και rs7737174 ΑΑ γονότυπο συσχετίστηκαν με τον κίνδυνο εμφάνισης καρκίνου του μαστού σε μετεμμηνοπαυσιακές γυναίκες [32].

DROSHA

rs10719 3’ΙΙΤΡ είναι σε ισχυρή ανισορροπία σύνδεσης με rs644236 με βάση τα χίλια δεδομένων γονιδιώματος (r

2 = 0,88) [33]. Στην παρούσα μελέτη σύνδεσης, διαπιστώσαμε ότι

DROSHA

3’ΙΙΤΡ rs10719TC πολυμορφισμός σχετίζεται με τον κίνδυνο καρκίνου της ουροδόχου κύστης. Στρωματοποιημένη ανάλυση έδειξε ότι rs10719TC /CC γονότυπους μπορεί να αυξήσει σημαντικά τον κίνδυνο καρκίνου της ουροδόχου κύστης, ειδικά στους άνδρες και οι καπνιστές. Μια πιθανή εξήγηση είναι ότι το κάπνισμα τσιγάρων έχει καθιερωθεί ως ο πιο σημαντικός παράγοντας κινδύνου για την ανάπτυξη καρκίνου της ουροδόχου κύστης, η οποία περιέχει εκατοντάδες χημικές ουσίες, όπως οι πολυκυκλικοί αρωματικοί υδρογονάνθρακες [34,35]. Έτσι, ποτέ καπνιστές μπορεί να είναι επιρρεπείς να είναι καρκίνος. Ένας άλλος λόγος μπορεί να είναι ότι σε σύγκριση με τα θηλυκά, τα αρσενικά άτομα είναι πιο πιθανό να εκθέσει σε συσσωρευμένη περιβαλλοντικών παραγόντων κινδύνου που εμπλέκονται στην αιτιολογία του καρκίνου της ουροδόχου κύστης, όπως το κάπνισμα, η επαγγελματική έκθεση (δηλαδή την κατασκευή χρωστική ουσία, δερμάτινα εργασίας). Επιπλέον, έχουμε το σχετικά μικρό μέγεθος του δείγματος των γυναικών ανθρώπων. Ως εκ τούτου, δεν μπορούμε να ανιχνεύσει την σημαντική συσχέτιση σε θηλυκά άτομα. Weng et al. Πρότεινε επίσης ότι rs10719TC πολυμορφισμός σχετίζεται με κακοήθη περιφερική κίνδυνο όγκων νεύρο θήκη, η οποία στήριξε τα συμπεράσματά μας [33]. Πάνω από έκφραση του DROSHA φάνηκε ότι επηρεάζει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και την προβλεπόμενη κακή πρόγνωση σε καρκίνο του οισοφάγου [36], τον καρκίνο των ωοθηκών [37], του καρκίνου του μαστού [38], και του καρκίνου του τραχήλου [39]. Προηγούμενη μελέτη είχε επίσης αποκάλυψε ότι υπερέκφραση DROSHA μπορεί να προωθήσει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και αναστέλλουν την κυτταρική απόπτωση σε καρκίνο της ουροδόχου κύστης [24]. Ως εκ τούτου, υποθέσαμε ότι

DROSHA

αλληλόμορφο rs10719C 3’UTR μπορεί να αυξήσει τον κίνδυνο καρκίνου της ουροδόχου κύστης, κυρίως μέσω ρύθμισης της έκφρασης DROSHA.

Έχει προταθεί ότι ορισμένα από τα 3’UTR πολυμορφισμοί μπορεί να είναι στη θέση σύνδεσης miRNA ή πλησίον της τοποθεσίας πρόσδεσης και μπορεί να επηρεάσει τη λειτουργία των miRNA που οδηγεί σε διαφορική γονιδιακή έκφραση να επηρεάσει την ανάπτυξη του καρκίνου [19,20]. λουσιφεράσης αναφερθεί προσδιορισμοί γονιδίου μας έδειξε ότι

DROSHA

rs10719 Τ υποκατάστασης C διαταράσσεται μια θέση πρόσδεσης για την HSA-miR-27b, με αποτέλεσμα τα αυξημένα επίπεδα του

DROSHA

έκφραση λουσιφεράσης 3’ΙΙΤΡ. Έτσι, το αλληλόμορφο C συσχετίζεται με αυξημένο κίνδυνο καρκίνου της ουροδόχου κύστης, ενδεχομένως μέσω της αυξημένης έκφρασης DROSHA, το οποίο ήταν σύμφωνο με την προηγούμενη διαπίστωση [24]. Επιπλέον, καμία σημαντική διαφορά από το

παρατηρήθηκε DROSHA

επίπεδο έκφρασης του mRNA μεταξύ διαφορετικών γονοτύπων rs10719TC σε ιστούς όγκων της ουροδόχου κύστης με χρήση δοκιμασίας RT-PCR. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι ο SNP δεν επηρεάζει την έκφραση του mRNA, ωστόσο, δεδομένου ότι η δέσμευση miRNA να mRNAs δεν οδηγεί πάντα σε διάσπαση μεταγραφής, και μερικές φορές οδηγεί σε μετάφραση καταστολή, είναι πιθανό ότι ο SNP οδηγεί σε μια αλλαγή στη DROSHA πρωτεΐνη. Ωστόσο, δεν είχαμε δοκιμάσει αυτό στη μελέτη μας, και ως εκ τούτου παραμένει μια πιθανότητα, αλλά δεν έχει αποδειχθεί. Αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι η HSA-miR-27b μπορεί να επηρεάσει DROSHA έκφρασης με τη ρύθμιση της μετάφρασης πρωτεϊνών. Ήταν αξίζει να σημειωθεί ότι η λειτουργική τα ευρήματά μας ήταν σε συμφωνία με τα αποτελέσματα μιας μελέτης ασθενών-μαρτύρων.

Στην παρούσα μελέτη, HSA-miR-27b ήταν αρχικά αναφέρθηκε για τη ρύθμιση της έκφρασης του

DROSHA

στον καρκίνο της ουροδόχου κύστης. HSA-miR-27b είχε μελετηθεί ευρέως, το οποίο είχε εντοπιστεί να είναι συσχέτιση με πολλά είδη καρκίνων, όπως του ορθοκολικού καρκίνου [40], το νευροβλάστωμα [41]. Lee et al.