Αφηρημένο

Οι ευκαρυωτικοί έναρξης της μετάφρασης παράγοντας 5A2 (EIF5A2) διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στην εξέλιξη των όγκων και την αξιολόγηση πρόγνωση. Ωστόσο, λίγες πληροφορίες είναι διαθέσιμες σχετικά με το δυναμικό της ρόλο στον καρκίνο του στομάχου. Αυτή η μελέτη είχε ως στόχο να διερευνήσει τη λειτουργία της EIF5A2 στην πρόοδο του όγκου και των πιθανών μηχανισμών της. EIF5A2 έκφραση μετρήθηκε σε ανθρώπινο γαστρικό καρκίνο κυτταρικές γραμμές, το αθανατοποιημένα γαστρικού βλεννογόνου επιθηλιακή κυτταρική σειρά (GES-1) και ανθρώπινου γαστρικού καρκινικούς ιστούς και γκρέμισε με παρεμβολή RNA ή απορυθμίζεται με EIF5A2 πλασμιδίου διαμολύνσεως. Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων, αξιολογήθηκαν μετανάστευση και την εισβολή

in vitro

. Οι μεταγενέστεροι στόχοι της EIF5A2 εξετάστηκαν με κηλίδωση Western. EIF5A2 και το δυναμικό μετάστασης-πρωτεΐνης που συνδέεται με 1 (MTA1) έκφραση στόχο εξετάστηκαν σε 160 ζεύγη του ανθρώπινου γαστρικού καρκίνου και των παρακείμενων δείγματα μη-όγκου χρησιμοποιώντας χρώση ανοσοϊστοχημείας (IHC), και η συσχέτιση της με κλινικοπαθολογοανατομικών χαρακτηριστικά και επιβίωση διερευνήθηκε. Knockdown του

EIF5A2

ή

MTA1

προκάλεσε εμφανή καταστολή του κυτταρικού πολλαπλασιασμού HGC27, τη μετανάστευση και εισβολή. Μετά νοκ ντάουν του

EIF5A2

στο HGC27 κύτταρα, τα επίπεδα E-cadherin ήταν ρυθμίζεται προς τα πάνω και βιμεντίνης, κυκλίνη D1, κυκλίνη D3, C-MYC και τα επίπεδα MTA1 ρυθμίστηκαν προς τα κάτω. Προς τα πάνω ρύθμιση EIF5A2 στα κύτταρα ΜΚΝ45 είχε ως αποτέλεσμα το αντίστροφο. Αποτελέσματα IHC έδειξαν θετική συσχέτιση μεταξύ EIF5A2 και της έκφρασης MTA1 σε γαστρικών καρκίνων (

P

& lt? 0.001). Τόσο EIF5A2 και MTA1 υπερέκφραση συσχετίστηκαν με τη φάση Pt (

P

= 0.018 και

P

= 0,042), το στάδιο ΡΝ (

P

= 0.037 και

P

= 0.020) και lymphovascular εισβολή (

P

= 0.016 και

P

= 0,044). EIF5A2 ή MTA1 υπερέκφραση ήταν σημαντικά σχετίζονται με την κακή συνολική επιβίωση και την επιβίωση ελεύθερη νόσου (όλα

P

& lt? 0,05). αναλύσεις πολυμεταβλητή προσδιορίζονται EIF5A2 ως ανεξάρτητος προγνωστικός παράγοντας τόσο για τη συνολική επιβίωση (

P

= 0,012) και την επιβίωση ελεύθερη νόσου (

P

= 0,008) σε ασθενείς με καρκίνο του στομάχου. Τα ευρήματά μας δείχνουν ότι EIF5A2 προς τα πάνω ρύθμιση διαδραματίζει σημαντικό ογκογόνο ρόλο στον καρκίνο του στομάχου. EIF5A2 μπορεί να αντιπροσωπεύει ένα νέο προγνωστικό για κακή επιβίωση και είναι ένας πιθανός θεραπευτικός στόχος για καρκίνο του στομάχου

Παράθεση:. Meng Q-Β, Kang W-M, Yu J-C, Liu Υ-Q, Ma Z-Q, Zhou L, et al. (2015) Η υπερέκφραση του ευκαρυωτικοί Μετάφραση Έναρξη Factor 5A2 (EIF5A2) συσχετίζεται με το κινητό Επιθετικότητα και κακή επιβίωση σε γαστρικό καρκίνο. PLoS ONE 10 (3): e0119229. doi: 10.1371 /journal.pone.0119229

Ακαδημαϊκό Επιμέλεια: Jun Li, η Sun Yat-sen University Medical School, ΚΙΝΑ

Ελήφθη: 22 Ιανουαρίου 2014? Αποδεκτές: 29, Ιανουαρίου του 2015? Δημοσιεύθηκε: 20, Μαρτίου, 2015

Copyright: © 2015 Meng et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση: Το έργο υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις από το Ίδρυμα Επιστημών του Πεκίνου Δημοτική Φυσικό (Νο 7132209), Hubei επαρχία υγεία και τον οικογενειακό προγραμματισμό επιστημονικής έρευνας (Αρ WJ2015MB137) και μεγάλα έργα της επιστήμης και της τεχνολογίας στην Πόλη του Πεκίνου (Νο D141100000414004). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Γαστρικό καρκίνο (GC) είναι μια ιδιαίτερα μεταστατική νόσο και ένα από τα πιο θανατηφόρα από τις γαστρεντερικές κακοηθειών. [1] Παρά τις προόδους σε χειρουργική και κυτταροτοξικών θεραπειών για GC, οι τρέχουσες διαθέσιμες θεραπείες σε ασθενείς με προχωρημένο GC είναι πολύ περιορισμένη. [2, 3] για την ανάπτυξη νέων θεραπευτικών στρατηγικών, είναι ζωτικής σημασίας για τη διαλεύκανση των μοριακών μηχανισμών που προωθούν τις επεμβατικές και μεταστατικές ιδιότητες των κυττάρων GC.

παράγοντα έναρξης ευκαρυωτικά μετάφρασης 5A2 (EIF5A2) βρίσκεται σε ανθρώπινο χρωμόσωμα 3q26.2, και είναι μέλος του

EIF5A

οικογένεια γονιδίων. [4] η υπερέκφραση του

EIF5A2

mRNA σε ορισμένα ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα, σε αντίθεση με υπερέκφραση περιορίζεται σε ανθρώπινους όρχεις και τμήματα του εγκεφάλου, προτείνει

EIF5A2

είναι ένας πιθανός ογκογονίδιο. [4] Προηγούμενες μελέτες διαπιστώθηκε ότι EIF5A2 υπερεκφράστηκε σε πολλούς ανθρώπινους καρκίνους όπως παγκρεατικού πόρου αδενοκαρκίνωμα, ο καρκίνος των ωοθηκών, καρκίνος ηπατοκυτταρικό, καρκίνο του πνεύμονα, καρκίνο του παχέος εντέρου και μελάνωμα , και συσχετίστηκε με κακή επιβίωση των ασθενών με καρκίνο και /ή καρκινικό κύτταρο επιθετικότητα. [5-11] Πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι η EIF5A2 έχει καρκινογόνο ικανότητες μέσω της ενεργοποίησης του της EIF5A2-MTA1 /άξονα C-MYC. [8] Ωστόσο, λίγες πληροφορίες είναι διαθέσιμες σχετικά με την έκφραση της πρωτεΐνης EIF5A2, προγνωστική σημασία της και το δυναμικό ογκογόνο ρόλο στην ανθρώπινη GC.

κατά συνέπεια, ερευνήσαμε πρώτα την έκφραση του

EIF5A2

σε ανθρώπινες κυτταρικές GC γραμμές και το δυναμικό ρόλο της στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, τη μετανάστευση και εισβολή. Στη συνέχεια, προσδιορίζονται πιθανές πρωτεΐνες προς τα κάτω στόχος για τη διαλεύκανση της αντίκτυπο από την εξάντληση EIF5A2 ή ρύθμιση προς τα άνω στις κυτταρικές λειτουργίες των κυττάρων GC. Τέλος, αναλύσαμε τη συσχέτιση των EIF5A2 και της έκφρασης MTA1 στην ανθρώπινη GC και συνάφειά του με κλινικοπαθολογοανατομικών παράγοντες και την επιβίωση σε ασθενείς με GC.

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθική Δήλωση

Η μελέτη εγκρίθηκε από την Επιτροπή Δεοντολογίας της PUMCH, κινεζική Ακαδημία Ιατρικών Επιστημών και του Πεκίνου Ένωση Medical College, το Πεκίνο, η Κίνα, και γραπτή συγκατάθεση λήφθηκε από κάθε ασθενή.

ασθενείς και δείγματα

ιστού GC και συμφωνημένα δίπλα δείγματα μη καρκινικό ιστό ελήφθησαν από 160 διαδοχικούς ασθενείς που υποβλήθηκαν σε χειρουργική εκτομή για την πρωτοβάθμια GC στην Ένωση Medical College Hospital του Πεκίνου (PUMCH) μεταξύ Ιανουαρίου 2002 και Δεκεμβρίου 2006. Δεν ασθενείς έλαβαν εισαγωγική χημειοθεραπεία ή ακτινοθεραπεία. Τα δεδομένα επιβίωσης ελήφθησαν με βάση τόσο τα αρχεία των ασθενών και τηλέφωνο παρακολούθησης. Ο μέσος χρόνος παρακολούθησης ήταν 53 μήνες (εύρος, 1-113 μήνες). Άλλες δύο ζεύγη των νωπών ιστών GC και noncancerous γαστρικού βλεννογόνου ιστούς ελήφθησαν από ασθενείς που υποβλήθηκαν σε χειρουργική εκτομή για φτωχά διαφοροποιημένο αδενοκαρκίνωμα του στομάχου σε PUMCH το 2014.

Εμείς ορίζεται lymphovascular εισβολής, όπως η παρουσία των εμβόλων των καρκινικών κυττάρων εντός των χώρων που περιβάλλεται από ένα σαφώς ορατό ενδοθηλιακή επένδυση στην περιφέρεια των τμημάτων του όγκου. [12, 13] οι ασθενείς σταδιακή σύμφωνα με την 7η έκδοση της ταξινόμησης AJCC ΤΝΜ για καρκίνωμα του στομάχου. [14] Lauren histotype χωρίστηκε σε εντερικό και diffuse- κατηγορίες μικτού τύπου. [15]

κυτταρική καλλιέργεια

Πέντε τύποι των ανθρώπινων κυτταρικών σειρών GC ελήφθησαν από το Κέντρο τηλέφωνα της Σαγκάης Ινστιτούτα Βιολογικών Επιστημών (AGS και MGC803, Σαγκάη, Κίνα) και το κινητό Κέντρο Ινστιτούτο Βασικών Ιατρικών Επιστημών (ΜΚΝ45, SGC7901 και HGC27, Πεκίνο, Κίνα). Η απαθανάτισε γαστρικού βλεννογόνου επιθηλιακά κυτταρική σειρά GES-1 ελήφθη από το Πεκίνο ComWin Biotech Co., Ltd (Πεκίνο, Κίνα). Όλα τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε RPMI 1640 συμπληρωμένο με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό (FBS? Ϋίβ Technologies, Carlsbad, CA, USA) στους 37 ° C σε μια υγροποιημένη ατμόσφαιρα αέρα που περιέχει 5% CO

2. Κύτταρα σε λογαριθμική φάση ανάπτυξης χρησιμοποιήθηκαν για περαιτέρω πειράματα.

Νοκ ντάουν EIF5A2 ή MTA1 από μικρές-παρεμβαλλόμενα RNA (siRNA που)

Το siRNA ειδικά κατά EIF5A2 και MTA1 [16] και μη στόχευση τους ελέγχου siRNA (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) συντέθηκαν χημικά για αυτή τη μελέτη. Οι αλληλουχίες siRNA EIF5A2 ήταν ως ακολούθως: # 1: 5′-GGAUCUUAAACUGCCAGAATT-3 ‘, 5′-UUCUGGCAGUUUAAGAUCCTT-3′? # 2: 5’-GGUUCACCUUGUUGGAAUUTT-3 ‘, 5′-AAUUCCAACAAGGUGAACCTT-3? και # 3: 5’-GCUUCCAGCACUUACCCUATT-3 ‘, 5′-UAGGGUAAGUGCUGGAAGCTT-3? η μη στόχευση ελέγχου (NC1) siRNA: 5’-UUC UCC GAA CGU GUC ACG UTT-3 ‘? 5’-ACG UGA CAC Ουυ CGG AGA ΑΤΤ-3 ‘). Οι αλληλουχίες siRNA MTA1 (Target 2 siRNA, Τ2-siRNA) ήταν: 5’-GCUGAGAGCAAGUUAAAGCdTdT-3 ‘, 5′-GCUUUAACUUGCUCUCAGCdTdT-3’) και FAM-σημασμένο siRNA (AM4620) χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος μη-στόχευσης siRNA (NC2 ).

Εικοσιτέσσερις ώρες μετά την επίστρωση σε πλάκες έξι φρεατίων, τα κύτταρα GC επιμολύνθηκαν με 100pmol EIF5A2-siRNA, MTA1-siRNA ή ελέγχουν siRNA χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη αντιδραστηρίου επιμόλυνσης 2000 (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA ) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν για westem αποτύπωση στις 48 ώρες μετά την επιμόλυνση.

κατασκευή πλασμιδίου και παροδική επιμόλυνση

φορέα έκφρασης EIF5A2 (PIRES2-EGFP-EIF5A2) συντέθηκε από την Life Technologies. Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με PIRES2-ΕΟΡΡ-EIF5A2 ή το πλασμίδιο ελέγχου χρησιμοποιώντας Lipofectamine 2000 (Life Technologies) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

πραγματικού χρόνου ποσοτική RT-PCR

Το ολικό RNA απομονώθηκε χρησιμοποιώντας ΤΚΙζοΙ αντιδραστήριο (ϋίβ Technologies) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. PCR πραγματοποιήθηκε με τη χρήση των αλληλουχιών για EIF5A2: προς τα εμπρός: 5′-AACTGCCAGAAGGTGAACTAGG-3 ‘? αντίστροφη: 5’-GTTTCCGTTTATTTGCAGGGT-3 ‘και οι ακολουθίες για MTA1: προς τα εμπρός: 5′-CCGGGCCTGCGAGAGCTGTTACAC-3′? αντίστροφη: 5’-CACGGCTTCCAGCGGCTTGCGTAC-3 ‘. PCR πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας UltraSYBR Μείγμα (CWbio.Co.Ltd) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Αντίστροφη μεταγραφή πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ένα κιτ PrimeScript RT Master Mix (TAKARA Βιοτεχνολογία Co Ltd., Dalian, Κίνα). Τα προϊόντα cDNA υποβλήθηκαν σε PCR πραγματικού χρόνου χρησιμοποιώντας κιτ SYBR Premix Ex Taq II (TAKARA Biotechnology Co. Ltd.). Real-time PCR πραγματοποιήθηκε σε ένα StepOnePlus PCR Πραγματικού χρόνου System (Applied Biosystems, Carlsbad, CA) χρησιμοποιώντας το ακόλουθο πρόγραμμα: 95 ° C για 10 λεπτά, ακολουθούμενη από 40 κύκλους των 95 ° C για 15 δευτερόλεπτα, και 60 ° C για 1 λεπτό.

GAPDH

mRNA σε κάθε δείγμα προσδιορίστηκε ποσοτικά ως ένας ενδογενής έλεγχος.

κηλίδωση Western

Η συγκέντρωση της πρωτεΐνης ποσοτικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ένα κιτ δοκιμασίας πρωτεΐνης BCA (Thermo Scientific Pierce). Νάτριο ηλεκτροφόρηση πηκτής πολυακρυλαμιδίου δωδεκυλ θειικού (SDS-PAGE) χρησιμοποιήθηκε για να διαχωρίσει τα προϊόντα λύσης κυττάρου. Οι πρωτεΐνες μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες PVDF και αποκλείστηκαν με τρις-ρυθμισμένο αλατούχο διάλυμα και 0.1% Tween 20 (TBST) που περιέχει 5% αλβουμίνη βόειου ορού, και στη συνέχεια επωάστηκαν με τα ακόλουθα πρωτογενή αντισώματα στους 4 ° C όλη τη νύκτα: κουνελιού αντι-EIF5A2 ή -C- MYC (1: 1000? Epitomics, USA, Catalog # 5.549 έως 1 ή 1472 – 1), αντι-MTA1 κουνέλι, -Ε-καντερίνη ή -vimentin (1: 1000? Cell Signaling, USA, Catalog # 5647, 3195 ή 5741 ), ή αντι-GAPDH ποντικού (1: 1000? Santa Cruz, Catalog # sc-25778). Οι μεμβράνες πλύθηκαν τρεις φορές με TBST και επωάστηκαν με υπεροξειδάση (HRP) αντι-κουνελιού ή αντι-ποντικού δευτερογενή αντισώματα (1: 3000? Santa Cruz, USA, Catalog # sc-2004 ή sc-2005) για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Οι πρωτεϊνικές ζώνες έγιναν ορατές χρησιμοποιώντας αντιδραστήρια ανίχνευσης ECL (Pierce, USA). Τα σχετικά επίπεδα έκφρασης πρωτεΐνης κανονικοποιήθηκαν προς GAPDH.

Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων

δοκιμασία

Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων HGC27 και ΜΚΝ45 εξετάστηκε χρησιμοποιώντας ένα κύτταρο Μετρώντας Kit-8 (CCK-8) (Dojindo, Ιαπωνία ) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Εν συντομία, 24 ώρες μετά την επιμόλυνση με siRNA ή πλασμίδιο, τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πυκνότητα 1 × 10

4 κύτταρα /φρεάτιο σε πλάκες 96 φρεατίων και καλλιεργήθηκαν για 0, 24, 48 και 72 ώρες. Στη συνέχεια, σε διάφορα χρονικά σημεία, 10μL CCK-8 το διάλυμα προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο και επωάστηκαν για 2 ώρες. Η απορρόφηση διαβάστηκε στα 450 nm σε αναγνώστη πλακός.

Transwell δοκιμασίες

Η μεταναστευτική και επεμβατική ικανότητα των κυττάρων GC ανιχνεύθηκε χρησιμοποιώντας 24 φρεατίων Transwell θαλάμων κυτταροκαλλιέργειας (μέγεθος πόρων 8.0μm, Costar , Cambridge, MA, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Για τον προσδιορισμό κυτταρικής εισβολής, το ένθετο μεμβράνες προ-επικαλύπτονται με Matrigel (BD, San Diego, CA, USA). Για τη δοκιμασία κυτταρική μετανάστευση, δεν Matrigel χρησιμοποιήθηκε. Σε 24 ώρες μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα σπάρθηκαν σε μια κατάλληλη πυκνότητα (HGC27, 5 × 10

5 /ml? ΜΚΝ45, 1 × 10

7 /ml) στον άνω θάλαμο και καλλιεργούνται σε ΟΡΤΙ-ΜΕΜ (GIBCO, USA) χωρίς FBS για περαιτέρω 24 ώρες. Τα κύτταρα αφέθηκαν να μεταναστεύσουν προς το 1640 RPMI που περιείχε 20% FBS στον κάτω θάλαμο. Τα μη-μεταναστευτικά κύτταρα στην επιφάνεια ανώτερη μεμβράνη απομακρύνθηκαν με μια άκρη βαμβάκι, και οι μεταναστευτικές κύτταρα που συνδέονται με την κάτω επιφάνεια της μεμβράνης μονιμοποιήθηκαν με 4% παραφορμαλδεΰδη και χρωματίστηκαν με Η &? Ε. Οι αριθμοί των εισέβαλαν κύτταρα μετρήθηκαν σε πέντε τυχαία επιλεγμένα πεδία κάτω από ένα μικροσκόπιο.

ανοσοϊστοχημεία (IHC) χρώση και εκτίμηση

χρώση

IHC διεξήχθη επί 5 μm πάχους τομές από δείγματα ενσωματωμένες σε παραφίνη. Τα μονοκλωνικά αντι-ανθρώπινο αντίσωμα EIF5A2 (Epitomics, USA, Catalog # 5549-1), αντι-ανθρώπινο αντίσωμα MTA1 κουνελιού (Cell Signaling, USA, Catalog # 5647) και PV-6000 Polymer Σύστημα Ανίχνευσης (ZSBG-BIO, Κίνα) ήταν χρησιμοποιείται για τη χρώση σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Εν συντομία, πλακίδια με παραφίνη τομές αποπαραφινώθηκαν με ξυλόλιο και επανυδατώθηκαν με αιθανόλη. Η ενδογενής δραστικότητα υπεροξειδάσης αποκλείστηκε με υπεροξείδιο του υδρογόνου 3% επί 10 λεπτά. Για ανάκτηση αντιγόνου, τα πλακίδια μικροκύματα επεξεργασμένου και βράζεται σε 0.01Μ κιτρικό ρυθμιστικό (ρΗ 6.0) για 10 λεπτά, και στη συνέχεια επωάζεται με 0,1% τρυψίνη στους 37 ° C για 5 λεπτά. Τα πλακίδια επωάστηκαν με μονοκλωνικό αντι-ανθρώπινο αντίσωμα EIF5A2 ή MTA1 (αραίωση 1: 100) επί 1,5 ώρες στους 37 ° C σε υγροποιημένο θάλαμο. Ως αρνητικός έλεγχος χρώση, πρωτογενές αντίσωμα αντικαταστάθηκε με μη ειδική IgG κουνελιού. Δύο ανεξάρτητες παθολόγους αξιολόγησε την ανοσοϊστοχημική χρώση των EIF5A2 και MTA1. Μία μέθοδος ημιποσοτική βαθμολόγησης χρησιμοποιήθηκε σε σχέση με την προηγούμενη μελέτη. [7]

Στατιστική ανάλυση

Όλες οι αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση SPSS 12.0 λογισμικού (Chicago, IL, USA). Το τεστ McNemar χρησιμοποιήθηκε για σύγκριση των EIF5A2 ή χρώση MTA1 στην ανθρώπινη GC και γειτονικά δείγματα μη-όγκου. Η chi-square test χρησιμοποιήθηκε για να συγκρίνει τις διαφορές μεταξύ των κατηγορικών μεταβλητών, ενώ η αντιστοιχισμένη, δύο ουρά του Student

t

-ΜΕΛΕΤΕΣ χρησιμοποιήθηκαν για να συγκριθούν οι διαφορές μεταξύ των κατηγορικών μεταβλητών. Η συσχέτιση μεταξύ EIF5A2 και MTA1 αναλύθηκε χρησιμοποιώντας τεστ κατάταξης του Spearman του. Για μονοπαραγοντική ανάλυση επιβίωσης, καμπύλες επιβίωσης κατασκευάστηκαν χρησιμοποιώντας τη μέθοδο Kaplan-Meier και συγκρίθηκαν με τη δοκιμασία log-rank. Η Cox μοντέλο αναλογικού κινδύνου με πολυπαραγοντική ανάλυση χρησιμοποιήθηκε για να διερευνήσει τους ανεξάρτητους προγνωστικούς παράγοντες. Όλα

P

τιμές ήταν δύο όψεων, και

P

τιμές των & lt? 0,05 θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές. Όλα τα πειράματα διεξήχθησαν τουλάχιστον σε τεχνικά και βιολογικά τριπλούν.

Αποτελέσματα

EIF5A2 έκφραση στα κύτταρα και τους ιστούς GC και την επικύρωση της

παρέμβαση

Ερευνήσαμε την έκφραση του EIF5A2 σε πέντε κυτταρικές GC γραμμές και το απαθανάτισε γαστρικού βλεννογόνου επιθηλιακά κυτταρική σειρά GES-1

in vitro

τόσο qRT-PCR (Εικ. 1Α) και κηλίδωση Western (Εικ. 1Β). EIF5A2 πρωτεΐνη σε ανθρώπινους ιστούς GC ήταν υψηλότερη από εκείνη των ζευγαρωμένων μακρινό μη καρκινικούς ιστούς (Σχ. 1 C). Λόγω του υψηλού επιπέδου έκφρασης ενδογενούς του EIF5A2 και της σχετικά υψηλής αποτελεσματικότητας επιμόλυνσης σε HGC27, επιλέξαμε αυτή η κυτταρική σειρά για την ανάλυση RNAi, και επιλέγονται ΜΚΝ45 κυττάρων για EIF5A2 πειράματα αυξορρύθμιση λόγω της σχετικά χαμηλής έκφρασης EIF5A2 και της υψηλής αποτελεσματικότητας της επιμόλυνσης.

(Α)

EIF5A2

έκφραση του mRNA εξετάστηκε με πραγματικού χρόνου ποσοτική RT-PCR με

GAPDH

υπηρετούν ως μάρτυρας φόρτωσης. (Β) Η έκφραση της πρωτεΐνης σε κυτταρικές σειρές επιβεβαιώθηκε με ανάλυση κηλίδας Western με GAPDH ως μάρτυρας φόρτωσης. (Γ) EIF5A2 πρωτεΐνη σε ανθρώπινους ιστούς GC ήταν υψηλότερη από εκείνη των ζευγαρωμένων μακρινό μη καρκινικούς ιστούς. (D) Και οι τρεις EIF5A2-siRNAs, ειδικά # 1, καταστέλλεται αποτελεσματικά

EIF5A2

έκφραση mRNA σε HGC27 κύτταρα. (Ε) κηλίδωση Western αποκαλύπτει ότι EIF5A2 χτυπήθηκε κάτω από την επεξεργασία των EIF5A2- siRNAs στο HGC27 κύτταρα. (F)

EIF5A2

mRNA ήταν σημαντικά ρυθμισμένη προς τα πάνω με παροδική επιμόλυνση των πλασμιδίων EIF5A2 σε ΜΚΝ45 κύτταρα. (G) πρωτεΐνη EIF5A2 ήταν σημαντικά ρυθμισμένη προς τα πάνω με παροδική επιμόλυνση των πλασμιδίων EIF5A2 σε ΜΚΝ45 κύτταρα. (Η και Θ) Τ2-siRNA θα μπορούσε αποτελεσματικά να καταστείλει την έκφραση MTA1 στα κύτταρα HGC27.

Η

Και οι τρεις siRNA που θα μπορούσε αποτελεσματικά να καταστείλει την έκφραση EIF5A2 σε HGC27 κύτταρα (Εικ. 1D, E). Χρησιμοποιήσαμε siRNA # 1 ως EIF5A2 στοχευμένες siRNA (Τ1-siRNA) στα επόμενα πειράματα. EIF5A2 έκφραση ήταν σημαντικά ρυθμισμένη προς τα πάνω με παροδική επιμόλυνση των πλασμιδίων EIF5A2 σε ΜΚΝ45 κύτταρα (Σχ. 1 F, G). Τ2-siRNA θα μπορούσε αποτελεσματικά να καταστείλει την έκφραση MTA1 σε HGC27 κύτταρα (Εικ. 1, Ι).

EIF5A2 ή έκφραση MTA1 επίπεδα επηρέασαν την επιθετικότητα του GC κύτταρα in vitro

Νοκ ντάουν της EIF5A2 από Τ1 siRNA πολλαπλασιασμός ανέστειλε σημαντικά κυττάρων (Σχ. 2Α), τη μετανάστευση και εισβολή (Εικ. 2Β) σε HGC27 κυττάρων σε σύγκριση με εκείνα των γονικών κυττάρων. Προς τα πάνω ρύθμιση EIF5A2 με EIF5A2 πλασμίδιο έκφρασης προωθούνται αυξημένο πολλαπλασιασμό (Εικ. 2C), τη μετανάστευση και εισβολή (Σχ. 2D) των κυττάρων ΜΚΝ45. Εξόντωση MTA1 από Τ2-siRNA πολλαπλασιασμός ανέστειλε σημαντικά κυττάρων (Σχ. 2Ε), τη μετανάστευση και εισβολή (Σχ. 2F) σε HGC27 κυττάρων σε σύγκριση με εκείνα των γονικών κυττάρων.

(Α) Πολλαπλασιασμός EIF5A2 στόχευσης siRNA (Τ1-siRNA) και μη-στοχευμένες ελέγχου (NC) HGC27 κύτταρα μετρήθηκαν με CCK-8 δοκιμασία κάθε 24 ώρες μετά την επιμόλυνση siRNA. (Β) τη μετανάστευση κυττάρων και εισβολή μειώθηκαν μετά από επιμόλυνση των Τ1-siRNA σε κύτταρα HGC27 (Μαθητή

t-test

,

P

& lt? 0.001 και

P

= 0.001 , αντίστοιχα). Στήλη, σημαίνει? μπαρ, ± SD (από τριπλότυπα). (Γ) Πολλαπλασιασμός EIF5A2-πλασμιδίου και πλασμίδιο ελέγχου ΜΚΝ45 κύτταρα μετρήθηκαν με CCK-8 δοκιμασία κάθε 24 ώρες μετά την επιμόλυνση πλασμιδίου. (D) μετανάστευση κυττάρων και εισβολή αυξήθηκαν μετά από παροδική επιμόλυνση των EIF5A2-πλασμιδίου σε κύτταρα ΜΚΝ45 (Μαθητή

t-test

,

P

= 2,06 × 10

-5 και

P

= 7.65 × 10

-6, αντίστοιχα). Στήλη, σημαίνει? μπαρ, ± SD (από τριπλότυπα). Εισαγωγή εικόνας (δεξιά Β και D δεξιά) δείχνει ένα αντιπροσωπευτικό οπτικό πεδίο από κάθε θεραπεία. (Ε) Πολλαπλασιασμός MTA1 στόχευσης siRNA (Τ2-siRNA) και μη-στοχευμένες ελέγχου (NC2) HGC27 κύτταρα μετρήθηκαν με CCK-8 δοκιμασία κάθε 24 ώρες μετά την επιμόλυνση siRNA. (F) μετανάστευση κυττάρων και εισβολή μειώθηκαν μετά από επιμόλυνση του T2-siRNA σε HGC27 κύτταρα (Μαθητή

t-test

, τόσο

P

= 0,001). Στήλη, σημαίνει? μπαρ, ± SD (από τριπλότυπα).

Η

Πιθανή έκφραση του γονιδίου-στόχου μετά EIF5A2 νοκ ντάουν ή υπερέκφραση

Μετά την εξουδετέρωση των EIF5A2 στο HGC27 κύτταρα, τα επίπεδα της επιθηλιακής δείκτη E-cadherin ήταν ρυθμισμένη προς τα πάνω, ενώ τα επίπεδα των μεσεγχυματικών βιμεντίνης δείκτη ρυθμίστηκαν προς τα κάτω και να συνοδεύεται από πρωτεΐνες που σχετίζονται με τον πολλαπλασιασμό κυκλίνης D1 και κυκλίνη D3 και μετάσταση σχετιζόμενη C-MYC και MTA1 μειορύθμιση (Εικ. 3Α). Σε αντίθεση, μετά EIF5A2 υπερέκφραση ΜΚΝ45 κύτταρα, η έκφραση της Ε-καδερίνης ήταν μειωτικά, ενώ το επίπεδο της βιμεντίνης ρυθμίζεται αυξητικά και συνοδευόμενη από κυκλίνη D1, κυκλίνη D3, C-MYC και MTA1 αυξορρύθμιση (Σχ. 3Β). Νοκ ντάουν ή υπερέκφραση του EIF5A2 δεν είχε σημαντική επίδραση στην έκφραση ΜΜΡ9 σε κύτταρα HGC27 και ΜΚΝ45 (Εικ. 3Α, Β).

(Α) Μετά την εξουδετέρωση των EIF5A2 στο HGC27 κύτταρα, τα επίπεδα E-cadherin ήταν ρυθμισμένη προς τα πάνω, ενώ βιμεντίνης ήταν μειωτικά συνοδεύεται από κυκλίνη D1, κυκλίνη D3 και C-MYC, και MTA1 αρνητική ρύθμιση. (Β) Η έκτοπη υπερέκφραση της EIF5A2 μετά από παροδική επιμόλυνση των EIF5A2-πλασμιδίου ουσιαστικά απορυθμίζεται κυκλίνη D1, κυκλίνη D3, C-MYC και MTA1, που συνοδεύεται από ρύθμιση προς τα κάτω της Ε-καδερίνης, ενώ βιμεντίνη ρυθμίζεται αυξητικά.

Η

Σύνδεσμος EIF5A2 και έκφραση MTA1 με κλινικοπαθολογικά χαρακτηριστικά σε ασθενείς με GC

Θετικά σήματα EIF5A2 ήταν κατά κύριο λόγο βρίσκεται στο κυτταρόπλασμα και στον πυρήνα των κυττάρων του όγκου, ενώ τα σήματα MTA1 είχαν εντοπίζεται κυρίως στον πυρήνα των κυττάρων του όγκου (Σχ. 4). Ορίσαμε τις τιμές ανοσοχρώση 0-3 ως το κανονικό επίπεδο έκφρασης του EIF5A2 ή MTA1, ενώ ανοσοχρώση τιμές των 4-12 ορίστηκε ως υπερέκφραση του EIF5A2 ή MTA1. EIF5A2 υπερέκφραση βρέθηκε σε 75 από τα δείγματα όγκου, σε σύγκριση με μόνο επτά από 160 συμφωνημένα παρακείμενους ιστούς του βλεννογόνου μη-όγκου (

P

& lt? 0.001). Αντιπροσωπευτικά IHC χρώση EIF5A2 σε μετρίου ή ανεπαρκώς διαφοροποιημένο αδενοκαρκίνωμα στομάχου, κύτταρα όγκου εισβολή σκάφος και μη καρκινικό ιστό φαίνεται στο Σχ. 4Α, Β, C και D, αντίστοιχα. Από τις 160 περιπτώσεις που αναλύθηκαν, 70 (43,75%) ήταν θετικά για MTA1 Στατιστική ανάλυση των προτύπων έκφρασης έδειξε ότι υπήρχε θετική συσχέτιση μεταξύ EIF5A2 και της έκφρασης MTA1 (r = 0.510,

P

& lt? 0.001) . Οι τυπικές εικόνες χρώσης για υπερέκφραση EIF5A2 και MTA1 σε αδενοκαρκίνωμα στομάχου υποβλήθηκαν φαίνεται στο Σχ. 4Ε και 4F.

(Α) Εκπρόσωπος εικόνες ανοσοϊστοχημεία δείχνει EIF5A2 υπερέκφραση σε μέτρια-διαφοροποιημένο αδενοκαρκίνωμα (× 200). (Β) Η υπερέκφραση του EIF5A2 στο αδενοκαρκίνωμα στομάχου ελάχιστα διαφοροποιημένο (× 200). (Γ) Η υπερέκφραση του EIF5A2 σε καρκινικά κύτταρα εισβάλλουν σκαφών (χ 200). (D) Η κανονική έκφραση EIF5A2 σε μη καρκινικό ιστό (χ 100). (Ε) Οι χαρακτηριστικές εικόνες χρώσης που δείχνουν τόσο EIF5A2 και MTA1 υπερέκφραση στο ίδιο αδενοκαρκίνωμα στομάχου? (G) Σε γενικές γραμμές καμπύλες επιβίωσης για 160 ασθενείς με γαστρικό καρκίνο που λαμβάνουν γαστρεκτομή, ομαδοποιούνται σύμφωνα με την έκφραση EIF5A2 (

P

& lt? 0.001). (H) Νόσος χωρίς καμπύλες επιβίωσης για 145 ασθενείς με γαστρικό καρκίνο που λαμβάνουν θεραπευτική χειρουργική επέμβαση, ομαδοποιούνται σύμφωνα με την έκφραση EIF5A2 (

P

= 0,001).

Η

Όπως φαίνεται στον Πίνακα 1, τόσο EIF5A2 και MTA1 υπερέκφραση σχετίστηκαν θετικά με πιο προχωρημένο στάδιο pt (

P

= 0.018 και

P

= 0,042), το στάδιο ρΝ (

P

= 0.037 και

P

= 0,020) και θετική lymphovascular εισβολή (

P

= 0.016 και

P

= 0,044), ενώ δεν συνδέθηκαν με άλλα κλινικοπαθολογοανατομικές χαρακτηριστικά.

Η

Αυξημένη EIF5A2 ή έκφραση MTA1 συσχετίζεται με φτωχότερη επιβίωση σε ασθενείς GC

κατά την τελευταία παρακολούθηση, 75, 160 ασθενείς είχαν πεθάνει. Από αυτούς, 73 άνθρωποι έχασαν τη ζωή τους υποτροπής του όγκου. Η ανάλυση Kaplan-Meier έδειξε ότι τόσο η 5-ετή συνολική επιβίωση (OS) και την ελεύθερη νόσου επιβίωση (DFS) για την ομάδα υπερέκφραση EIF5A2 ήταν μικρότερη από ό, τι εκείνες για την κανονική ομάδα έκφρασης EIF5A2 (

P

& lt? 0.001 και

P

= 0.001, Σχ. 4G, Η). Με συνέπεια, οι ασθενείς με MTA1 υπερέκφραση εμφανίζεται μια κακή πρόγνωση για το OS και DFS (

P

& lt? 0.001 και

P

= 0.001)

Οι μεταβλητές που έχουν σημασία στην μονοπαραγοντική ανάλυση. οι μέθοδοι Kaplan-Meier συμπεριλήφθηκαν στην πολυπαραγοντικές αναλύσεις Cox παλινδρόμησης. Όπως φαίνεται στον Πίνακα S1 και S2 πίνακα, πολυπαραγοντική ανάλυση διαπίστωσε ότι η υπερέκφραση της EIF5A2 ήταν ένας ανεξάρτητος παράγοντας που επηρεάζει τόσο OS (αναλογία κινδύνου 1.831, 95% CI 1,135 έως 2,857,

P

= 0,012, S1 πίνακα) και DFS (αναλογία κινδύνου 1.880, 95% CI1.177 σε 3.002,

P

= 0,008, S2 πίνακας) των ασθενών που έλαβαν θεραπευτική εκτομή για GC. Ωστόσο, η υπερέκφραση του MTA1 δεν παράγουν ανεξάρτητη προγνωστική σημασία για το OS και DFS στην πολυπαραγοντική ανάλυση.

Συζήτηση

Οι ευκαρυωτικοί παράγοντα έναρξης 5Α 2 (EIF5A2) εντοπίζεται σε μια χρωμοσωμική περιοχή συχνά σημειώνεται για χρωμοσωμική αστάθεια σε GC και πολλούς άλλους καρκίνους, 3ο τρίμηνο. [17-20] EIF5A2, ως ένα από τα μόλις δύο ισομορφές της οικογένειας EIF5A, επιβεβαιώνεται ως ογκογόνο πρωτεΐνη και μπορεί επίσης να είναι ένας σημαντικός βιολογικός δείκτης για την πρόγνωση και θεραπευτικό στόχο της πολλά είδη ανθρώπινων όγκων. [21] Αν και μια προηγούμενη μελέτη είχε εξετάσει

EIF5A2

γονιδιακής έκφρασης στην πρωτοβάθμια GC, η παρούσα μελέτη παρέχει την πρώτη απόδειξη της κλινικής σημασίας της έκφρασης EIF5A2 στην ανθρώπινη GC και ο ρόλος της στην η ρύθμιση της κυτταρικής GC επιθετικότητα. [22]

Πραγματοποιήσαμε το πρώτο EIF5A2 νοκ ντάουν και πειράματα υπερέκφραση

in vitro

. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η καταστολή της EIF5A2 σε HGC27 κύτταρα οδήγησε σε σημαντική μείωση στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, τη μετανάστευση και την εισβολή, ενώ ρύθμιση προς τα άνω της στα κύτταρα ΜΚΝ45 είχε ως αποτέλεσμα την αντίστροφο. Αυτά τα αποτελέσματα είναι σύμφωνα με προηγούμενα ευρήματα σε άλλα καρκινώματα. [8, 10, 23] Βρήκαμε επίσης ότι MTA1 knockdown σε HGC27 κύτταρα ανέστειλε σημαντικά τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, τη μετανάστευση και εισβολή. Αλλά ο μηχανισμός με τον οποίο EIF5A2 ενισχύει την επιθετικότητα των κυττάρων GC είναι ακόμα άγνωστη.

Ως εκ τούτου, πραγματοποιήσαμε περαιτέρω μελέτες των πιθανών στόχων του EIF5A2

in vitro

. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι EIF5A2 θετικά ρυθμιζόμενων κυκλίνη D1 και κυκλίνη D3, οι οποίες παίζουν σημαντικό ρόλο στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων GC και ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου. [24, 25] Όλα αυτά τα αποτελέσματα υποστηρίζουν την υπόθεση ότι EIF5A2 προάγει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων GC μέσω προς τα πάνω ρύθμιση της κυκλίνης D1 και κυκλίνη D3. Ταυτόχρονα, προηγούμενες μελέτες έδειξαν ότι EIF5A2 προάγει κυτταρική εισβολή /μετάσταση και επιθηλιακά-μεσεγχυματικά μετάβαση (ΕΜΤ) μέσω ενεργοποίησης MTA1 /C-MYC σε καρκίνο του παχέος εντέρου. [8] MTA1 και C-MYC, καθώς και το πρόγραμμα EMT, συμμετείχαν επίσης στη ρύθμιση της μετάστασης GC. [26-28] κατά συνέπεια, εξετάσαμε MTA1, c-myc και δύο EMT που σχετίζονται με δείκτες, E-cadherin και βιμεντίνης. Οι μελέτες μας έδειξαν ότι EIF5A2 θετικά ρυθμίζονται MTA1, c-myc και βιμεντίνης και αρνητικά ρυθμιζόμενη E-cadherin. Όλα αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι EIF5A2 μπορεί να ρυθμίζει τη μετανάστευση των κυττάρων και εισβολή ρύθμιση των MTA1, c-myc και EMT

in vitro

, αλλά απαιτούνται περαιτέρω μελέτες για να διερευνήσει τις ακριβείς μηχανισμούς.

Τα αποτελέσματα της τρέχουσας μελέτη έδειξε επίσης ότι EIF5A2 πρωτεΐνης συσχετίστηκε θετικά με το στάδιο pt και το στάδιο pn. Παρόμοια αποτελέσματα παρατηρήθηκαν επίσης σε ανθρώπινο καρκίνο των ωοθηκών. [5] Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι EIF5A2 μπορεί να σχετίζεται με την εισβολή και μετάσταση όγκου λεμφαδένων σε ορισμένους τύπους ανθρώπινων καρκίνων, συμπεριλαμβανομένων GC. Ακόμη πιο ενδιαφέρον, στην παρούσα μελέτη, EIF5A2 υπερέκφραση βρέθηκε επίσης σε καρκινικά κύτταρα εισβάλλουν (εισβολή σκάφους), και η υπερέκφραση της πρωτεΐνης σε EIF5A2 πρωτογενούς ιστού GC συσχετίζεται με την παρουσία του lymphovascular εισβολής. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα που βρέθηκαν σε προηγούμενες μελέτες των άλλων ανθρώπινων κακοηθειών συμπεριλαμβανομένων των επιθηλιακών όγκων των ωοθηκών, καρκίνωμα της ουροδόχου κύστης, καρκίνο του πνεύμονα, και καρκίνο του παχέος εντέρου, η υπερέκφραση του EIF5A2 στην τρέχουσα μελέτη αποτελεσμάτων συσχετίστηκε με κακή επιβίωση των ασθενών με GC. [5, 8, 29] Επιπλέον, πολυπαραγοντική ανάλυση έδειξε ότι EIF5A2 πρωτεΐνη είναι ένας ανεξάρτητος προγνωστικός παράγοντας για την κακή επιβίωση σε ασθενείς που υποβάλλονται σε χειρουργική επέμβαση για GC.

MTA1, ως γονίδιο μετάστασης που σχετίζεται με υποψήφιο, έχουν αποδειχθεί για να παίξει τον κρίσιμο ρόλο στην γαστρικού καρκίνου κυτταρική επιθετικότητα. [27] Η υπερέκφραση του MTA1 συνδέεται σημαντικά με κακή πρόγνωση σε ασθενείς PN0 GC. [30] Η παρούσα μελέτη έδειξε ότι η έκφραση EIF5A2 συσχετίστηκε θετικά με την έκφραση MTA1 σε ανθρώπινους ιστούς GC. Ανοσοϊστοχημική ανάλυση συνδυάζονται σε vitro μελέτες έδειξαν ότι η EIF5A2-MTA1 άξονα μπορεί να παίζει ένα σημαντικό ρόλο στην επιθετικότητα του γαστρικού καρκίνου.

Συνοπτικά, τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης έδειξαν ότι η υπερέκφραση του EIF5A2 ήταν στενά συνδεδεμένο με GC κυτταρικό πολλαπλασιασμό, τη μετανάστευση και εισβολή μέσω της μετάστασης που σχετίζονται πρωτεΐνες MTA1. Ταυτόχρονα, EIF5A2 μπορεί να είναι σημαντική στη ρύθμιση EMT στο GC. Η υπερέκφραση του EIF5A2 θα μπορούσε να είναι ένας ανεξάρτητος παράγοντας πρόβλεψης κακή επιβίωση και ένα ελκυστικό θεραπευτικό στόχο για GC, αλλά απαιτούνται περαιτέρω μελέτες.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Πίνακα S1. Ανάλυση των παραγόντων που σχετίζονται με τη συνολική επιβίωση (OS)

doi:. 10.1371 /journal.pone.0119229.s001

(DOC)

S2 πίνακα. Ανάλυση των παραγόντων που συνδέονται με την ελεύθερη νόσου επιβίωση (DFS)

doi:. 10.1371 /journal.pone.0119229.s002

(DOC)

Ευχαριστίες

Οι συγγραφείς θα ήθελαν να ευχαριστήσω τον κ De-Tian Wang, κα Yu-Feng Luo και τον καθηγητή Πέι Gu για την τεχνική υποστήριξη τους.