Abstract

Ο αυξητικός παράγοντας που προέρχεται από αιμοπετάλια (PDGF) μονοπατιού σηματοδότησης έχει βρεθεί να παίζει σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη και την εξέλιξη των ανθρώπινων καρκίνων ρυθμίζοντας τις διαδικασίες του πολλαπλασιασμού των κυττάρων, την απόπτωση, μετανάστευση, εισβολή, μετάσταση, και η απόκτηση του επιθηλιακά-μεσεγχυματικά μετάβασης (EMT) φαινότυπο. Επιπλέον, PDGF σηματοδότηση έχει επίσης βρεθεί να μεταβάλλουν το προφίλ έκφρασης του miRNAs, που οδηγεί στην αναστροφή του EMT φαινότυπο. Αν και ο ρόλος των miRNAs στον καρκίνο έχει τεκμηριωθεί, υπάρχουν πολύ λίγες μελέτες που τεκμηριώνουν τις κυτταρικές συνέπειες της στοχευμένης εκ νέου έκφραση συγκεκριμένων miRNAs. Συνεπώς, διερευνήσαμε κατά πόσον η θεραπεία ανθρώπινων καρκινικών κυττάρων του παγκρέατος με PDGF θα μπορούσαν να μεταβάλουν το προφίλ έκφρασης των miRNAs, και αξιολογήσαμε επίσης τα κυτταρικά συνέπειες. Η μελέτη μας δείχνει ότι miR-221 είναι απαραίτητη για την PDGF μεσολάβηση φαινότυπο EMT, μετανάστευση, και την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων του παγκρέατος. Κάτω ρύθμιση των TRPS1 με miR-221 είναι κρίσιμη για την PDGF-διαμεσολαβούμενη απόκτηση του φαινοτύπου EMT. Επιπλέον, ο PDGF-εξαρτώμενη αύξηση στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων φαίνεται να διαμεσολαβείται από την αναστολή ενός συγκεκριμένου στόχου miR-221 και προς τα κάτω ρύθμιση p27kip1

Παράθεση:. Su Α, Ο S, Tian Β, Hu W , Zhang Ζ (2013) microRNA-221 Μεσολαβεί τις δράσεις του PDGF-ΒΒ για τη μετανάστευση, τον πολλαπλασιασμό, και τα επιθηλιακά-μεσεγχυματικά μετάβαση σε κύτταρα καρκίνου του παγκρέατος. PLoS ONE 8 (8): e71309. doi: 10.1371 /journal.pone.0071309

Επιμέλεια: Takashi Tokino, Σαπόρο Ιατρικό Πανεπιστήμιο, την Ιαπωνία

Ελήφθη: 2η Απριλίου, 2013? Αποδεκτές: 27, Ιουνίου 2013? Δημοσιεύθηκε: 13 του Αύγ 2013

Copyright: © 2013 Su et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Οι συγγραφείς δεν έχουν καμία υποστήριξη ή χρηματοδότηση για να αναφέρετε

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος του παγκρέατος είναι η τέταρτη πιο κοινή αιτία του καρκίνου. -σχετικών θανάτου στις Ηνωμένες Πολιτείες [1], και την επιθετικότητα του καρκίνου του παγκρέατος είναι εν μέρει λόγω των εγγενών και εξωγενών χαρακτηριστικά αντοχής φαρμάκου της, τα οποία επίσης συνδέονται με την απόκτηση του επιθηλιακού-to-μεσεγχυματικά μετάβαση (ΕΜΤ) φαινότυπο [ ,,,0],2], [3]. Το EMT είναι μια διαδικασία που είναι ενδεικτικό των χαρακτηριστικών βλαστικών σαν καρκινικά κύτταρα », όπου τα επιθηλιακά κύτταρα με φαινότυπο λιθόστρωτο αποκτήσει χαρακτηριστικά μεσεγχυματικών κυττάρων με ένα σχήμα ατράκτου ινοβλάστη μορφολογία που μοιάζει [3], [4]. Αυτή η διαδικασία περιλαμβάνει την αποσυναρμολόγηση του κυττάρου-κυττάρου κόμβους, συμπεριλαμβανομένης της προς τα κάτω ρύθμιση των επιθηλιακών δεικτών κυτταρικού φαινοτύπου (Ε-καδερίνης, zonula Οοοίιιάεηδ-1), καθώς και την μετατόπιση της β-κατενίνης από την κυτταρική μεμβράνη προς τον πυρήνα, η αναδιοργάνωση του κυτταροσκελετού της ακτίνης, και αυξητική ρύθμιση των δεικτών μεσεγχυματικών φαινοτύπου των κυττάρων (βιμεντίνη, ινωδονεκτίνη και Ν-καδερίνης) [4]. Αυτή η διαδικασία μειώνει την συγκολλητική ικανότητα των μεσεγχυματικών φαινοτυπικών κυττάρων, η οποία οδηγεί σε αυξημένη κυτταρική μετανάστευση και εισβολή, με αποτέλεσμα την επιθετικότητα του όγκου [5].

αιμοπετάλια αυξητικός παράγοντας (PDGF) μπορεί να ρυθμίσει πολλές κυτταρικές διεργασίες, συμπεριλαμβανομένης της κυτταρικής πολλαπλασιασμός, μετασχηματισμός, μετανάστευση, εισβολή, αγγειογένεση και μετάσταση, ενεργοποιώντας τον συγγενή υποδοχέα της [6]. Τα τελευταία χρόνια, ΡϋΟΡ-ΒΒ και το συγγενές β-υποδοχέων κινάσης τυροσίνης έχουν βρεθεί να παίζουν σημαντικό ρόλο στην απόκτηση της μεταβάσεως επιθηλίου-μεσεγχύματος (ΕΜΤ) φαινότυπο των καρκινικών κυττάρων [5], [7]. Η θεραπεία της επιθηλιακής-όπως τα καρκινικά κύτταρα με καθαρισμένη πρωτεΐνη PDGF είχε ως αποτέλεσμα σημαντικά μειωμένη έκφραση της Ε-καδερίνης και αυξημένη έκφραση του ψευδαργύρου-δακτύλου E-box δέσμευσης homeo-box 2 (ZEB2) τόσο στο επίπεδο του mRNA και της πρωτεΐνης σε συνδυασμό με η επαγωγή της ΕΜΤ χαρακτηριστικών [8]. ZEB2 έχει δειχθεί ότι εμπλέκεται στη μειορύθμιση της έκφρασης πολλών γονιδίων που κωδικοποιούν για πρωτεΐνες κρίσιμο του φαινοτύπου επιθηλιακών κυττάρων, συμπεριλαμβανομένων των Ε-καδερίνης, η ταυτόχρονη με προς τα πάνω ρύθμιση της έκφρασης του βιμεντίνης [9]. Είναι σημαντικό να σημειωθεί ότι PDGF επίσης αύξησε σημαντικά την έκφραση της φιβρονεκτίνης, Ν-cadherin, και βιμεντίνη, με ταυτόχρονη απώλεια της Ε-καδερίνης. Ωστόσο, περαιτέρω σε βάθος οι μηχανιστικές μελέτες που απαιτούνται για την κατανόηση του πώς PDGF ρυθμίζει τις διαδικασίες που εμπλέκονται στην φαινότυπο EMT.

Τα microRNAs (miRNAs) έχουν ταυτοποιηθεί ότι ενισχύσει διάφορες πτυχές του παγκρέατος παθογένεση του καρκίνου, συμπεριλαμβανομένης της μετάστασης, εισβολή, και αυτο-ανανέωση [10]. Αναδυόμενες στοιχεία δείχνουν ότι η έκφραση των γονιδίων που είναι θεμελιώδεις για την απόκτηση του φαινοτύπου EMT και καρκινικών κυττάρων επιθετικότητα ρυθμίζονται από miRNAs που οδηγούν είτε σε μεταφραστική καταστολή ή την υποβάθμιση των mRNA στόχου [11], [12]. Το miR-221 εκφράζεται έντονα σε διάφορες καρκινικές προερχόμενα κύτταρα, συμπεριλαμβανομένου του καρκινώματος του παγκρέατος, καρκίνωμα του προστάτη και κυττάρων καρκινώματος θυρεοειδούς [13], [14], [15]. Πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι το miR-221 ρυθμίζει την EMT στοχεύοντας TRPS1 (τριχοειδούς ρινόκερος-φαλάγγων σύνδρομο τύπου 1) και την ανακούφιση της αναστολής της ZEB2 [16]. Επιπλέον, τα υψηλά επίπεδα του miR-221 έχει δειχθεί ότι προάγει πολλαπλασιασμό αυτών των κυττάρων μέσω σύνδεσης προς το 3′-UTR του αναστολέα του κυτταρικού κύκλου και ογκοκατασταλτικό p27kip1 και αναστολή της έκφρασης του [13], [15]. Τα τελευταία χρόνια, PDGF σηματοδότηση έχει βρεθεί ότι μεταβάλλουν το προφίλ έκφρασης του miRNAs, που οδηγεί στην αντιστροφή του φαινοτύπου ΕΜΤ [17], [18].

Αν και ο ρόλος των miRNAs στον καρκίνο έχει τεκμηριωθεί, υπάρχουν πολύ λίγες μελέτες που τεκμηριώνουν την κυτταρική συνέπεια στοχευμένες εκ νέου έκφραση συγκεκριμένων miRNAs. Ως εκ τούτου, υποθέσαμε ότι η σηματοδότηση PDGF θα μπορούσαν να ρυθμίζουν το φαινότυπο EMT μέσω της ρύθμισης των miRNA βιογένεση. Σε αυτή τη μελέτη, διερευνήσαμε κατά πόσον η θεραπεία ανθρώπινων καρκινικών κυττάρων του παγκρέατος με PDGF θα μπορούσαν να μεταβάλουν το προφίλ έκφρασης των miRNAs, και αξιολογήσαμε επίσης τα κυτταρικά συνέπειες. Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι PDGF παρουσιάζει τα αποτελέσματά του επί αμφοτέρων των κυτταρικών πολλαπλασιασμού και του φαινοτύπου ΕΜΤ επάγοντας miR-221 έκφραση, η οποία οδηγεί σε μειορύθμιση p27kip1 και TRPS1 σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα.

Υλικά και Μέθοδοι

Cell Culture

Οι σταθερές ανθρώπινο καρκίνο του παγκρέατος AsPC-1 κυτταρικές σειρές που προέρχονται από τυπικές καλλιέργεια τράπεζα κυττάρων διατήρηση Επιτροπή, κινεζική Ακαδημία Επιστημών (Σαγκάη, Κίνα) καλλιεργήθηκαν σε μέσο DMEM (Invitrogen, CA) συμπληρωμένο με 5% ορό εμβρύου μόσχου (FBS), 2 mmol /l γλουταμίνη, 50 μονάδες /ml πενικιλίνη, και 50 μg /ml στρεπτομυκίνη. Όλα τα κύτταρα διατηρήθηκαν σε ένα CO2-υγροποιημένη ατμόσφαιρα 5% στους 37 ° C

αντιδραστήρια έρευνας και Αντισώματα

Η ανασυνδυασμένη ανθρώπινη ΡϋΟΡ-ΒΒ αγοράστηκε από την R & amp?. D Systems. Χημικώς συντίθενται αναστολείς miRNA, μιμείται, και ομελέτα έλεγχοι ελήφθησαν από Dharmacon ή Ambion. Τα συνθετικά μικρά RNAs παρεμβολές (siRNAs) με στόχο την ανθρώπινη TRPS1 ή p27kip1 ήταν Stealth Επιλέξτε RNAi (Invitrogen) και η HP Επικυρώθηκε siRNA (Qiagen). Τα κύτταρα σπάρθηκαν στα 100.000 έως 300.000 κύτταρα /ml και επιμολύνθηκαν με Oligofectamine (Invitrogen), DharmaFECT3 αντιδραστηρίου επιμόλυνσης (Dharmacon) ή RNAi MAX (Invitrogen) στις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις. Αντισώματα έναντι ZEB2, Ν-cadherin, και βιμεντίνη αγοράστηκαν από Cell Signaling Technology (Beverly, ΜΑ). Αντισώματα έναντι ZEB1, Snail1, Snail2, Twist, E47, E-cadherin και ΖΩ-1 αγοράστηκαν από την Santa Cruz. Αντισώματα έναντι TRPS1, p27kip1 και GAPDH αποκτήθηκαν από Abcam. FITC-συζευγμένο αντι-ποντικού IgG για χρώση βιμεντίνη και Ε-καδερίνης αγοράστηκε από την Invitrogen. Το κιτ απομόνωσης miRVANA miRNA και Taqman miRNA Αναλύσεις αγοράστηκαν από την Ambion και Applied Biosystems.

Η επιμόλυνση των miRNA Μιμείται και ειδικά αντι-miRNAs

AsPC-1 κύτταρα σπάρθηκαν σε 3 × 10

5 κύτταρα ανά φρεάτιο σε πλάκες έξι φρεατίων και επιμολύνθηκαν με miR-221 μιμείται ή miRNA κωδικοποιημένα στοιχεία ελέγχου σε μια τελική συγκέντρωση 20 ηΜ χρησιμοποιώντας Oligofectamine (Invitrogen). κύτταρα AsPC-1 επιμολύνθηκαν με αντι-miR221 (αναστολείς miRNA) ή ένα στοιχείο ελέγχου αντι-miRNA σε τελική συγκέντρωση 200 ηΜ με τη χρήση του αντιδραστηρίου επιμόλυνσης DharmaFECT3 (Dharmacon). Μετά από 3 ημέρες από την επιμόλυνση, τα κύτταρα χωρίστηκαν και επιμολύνονται επανειλημμένα με miR-221, αναστολείς miRNA, ή τον έλεγχο κάθε 3-4 ημέρες για τους χρόνους που υποδεικνύονται.

μικρό παρεμβαλλόμενο RNA και διαμόλυνση

κύτταρα AsPC-1 επιμολύνθηκαν με 100 nmol /l ανθρώπινη TRPS1, p27kip1 μικρά παρεμβατικά (SI) RNA ή όργανα ελέγχου siRNA (Santa Cruz) χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο επιμόλυνσης RNAi MAX. Τα μέσα απομακρύνθηκαν μετά από την επιμόλυνση 24 ωρών, και στη συνέχεια τα κύτταρα επωάστηκαν σε μέσα που περιέχουν 5% FBS για άλλες 24 ώρες. Κυτταρολύματα παρασκευάστηκαν για ανάλυση κηλίδος Western και το ολικό RNA εκχυλίστηκε για τον πραγματικό χρόνο δοκιμασία ανάστροφης μεταγραφής αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης.

Δοκιμασία Κυτταρικού Πολλαπλασιασμού

Η δοκιμασία ΜΤΤ διεξήχθη όπως περιγράφεται προηγουμένως [19]. Συνολικά, 6 × 10

3 κύτταρα χωρίστηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ή χωρίς 20 ng /ml ΡϋΟΡ-ΒΒ επί 24 ώρες, ακολουθούμενη από μια δοκιμασία πολλαπλασιασμού των κυττάρων χρησιμοποιώντας ένα μη ραδιενεργό CellTiter96 δοκιμασία κυτταρικού πολλαπλασιασμού (Promega) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η απορρόφηση στα 490 nm διαβάστηκε με αναγνώστη ανοσοπροσροφητικό τρυβλίο προσδιορισμού συνδεδεμένου με ένζυμο. Για το πυρηνικό αντιγόνο πολλαπλασιαζόμενων κυττάρων (PCNA) κηλίδωση [20], τα κύτταρα AsPC-1 βάφτηκαν με αντίσωμα ΡΙΤΟ-συζευγμένο αντι-ΡΟΝΑ (κλώνος PC10) από Biolegend καθώς και DAPI. Τουλάχιστον 150 κύτταρα μετρήθηκαν ανά συνθήκη, και τα ποσοστά του PCNA-θετικών κυττάρων που παρουσιάζονται.

Επούλωση Δοκιμασία

Ένα επούλωσης πληγών δοκιμασία εκτελέστηκε για να εξεταστεί η ικανότητα της κυτταρικής μετανάστευσης και εισβολής , όπως περιγράφηκε προηγουμένως [21]. Εν συντομία, αφού τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε 90-95% συρροή σε πλάκες 6-φρεατίων, ένα ενιαίο μηδέν τραύμα παρήχθη με 200 μλ ρύγχος πιπέτας μίας χρήσης. Οι πληγές μηδέν φωτογραφήθηκαν πάνω από 7 ώρες με μια Nikon ανεστραμμένο μικροσκόπιο με ένα συνημμένο ψηφιακή φωτογραφική μηχανή, και τα πλάτη τους προσδιορίστηκαν ποσοτικά με το λογισμικό ImageJ. Τα δεδομένα παρίστανται γραφικώς ως το ποσοστό του κλεισίματος τραύματος, τον καθορισμό της αρχικής πλάτος μηδέν ως 100%. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως ο μέσος όρος των τριπλών μετρήσεων ανά κατάσταση σε τρία ανεξάρτητα πειράματα.

κυτταρική διείσδυση Δοκιμασία

Οι επεμβατική συμπεριφορές των κυττάρων ελέγχθηκαν χρησιμοποιώντας δοκιμασία διαμεμβρανική εισβολή Matrigel. Transwell θαλάμων (Millipore) (μέγεθος πόρων 8 μm) επικαλύφθηκαν με Matrigel (15 μg /φίλτρο). Τα κύτταρα (2.0 × 10

4) σε μέσο χωρίς ορό καλλιεργήθηκαν σε άνω θάλαμο και κάτω φρεάτια πληρώθηκαν με πλήρες μέσο. Τα κύτταρα αφέθηκαν να εισβάλουν σε όλη την Matrigel επικαλυμμένα μεμβράνη για 72 ώρες στους 37 ° C σε 5% CO2. Μετά την επώαση, τα κύτταρα απομακρύνθηκαν από την άνω επιφάνεια του φίλτρου με απόξεση με ένα βαμβάκι. Τα εισέβαλαν κύτταρα που προσκολλήθηκαν στον πυθμένα της μεμβράνης μονιμοποιήθηκαν με μεθανόλη και χρωματίστηκαν με ϋΑΡΙ. Ο αριθμός των κυττάρων τα οποία διείσδυσαν η μεμβράνη προσδιορίστηκε με μέτρηση του μέσου αριθμού των κυττάρων από πέντε τυχαίως επιλεγμένα πεδία υψηλής ισχύος.

ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR

RNA καθαρίστηκε χρησιμοποιώντας RNeasy (Qiagen) ή miRVANA (Ambion) σετ με πέψη DNase στις στήλες RNeasy. Συμπληρωματικό DNA (cDNA) δημιουργήθηκε με την υψηλής χωρητικότητας cDNA Reverse Transcription Kit (Roche). Η ποσοτική ανάλυση της αλλαγής στα επίπεδα έκφρασης ήταν υπολογίζονται σε πραγματικό χρόνο μηχανή PCR (iQ5, Bio-Rad). Οι συνθήκες των κύκλων PCR ήταν 94 ° C για 3 λεπτά και 40 κύκλους (94 ° C για 15 s, 60 ° C για 20 s και 72 ° C για 40 s). Real-time PCR χρησιμοποιήθηκε για την ποσοτικοποίηση της έκφρασης mRNA. Οι αντιδράσεις διεξήχθησαν εις διπλούν, και το όριο δέλτα-δέλτα-Cycle τιμές (ddCt) υπολογίστηκαν με βάση το μέσο όρο των γονιδίων κανονικοποίησης. δοκιμασίες Taqman miRNA χρησιμοποιήθηκαν για την ποσοτικοποίηση του miR-221, και τα αποτελέσματα κανονικοποιήθηκαν προς το μέσο όρο των αποτελεσμάτων που λαμβάνονται για RNU6B.

Ανάλυση Western Blot

ανάλυση στυπώματος Western εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας συνολική κυτταρικά λύματα. Σύνολο κυτταρολύματα από διαφορετικά πειράματα ελήφθησαν με λύση των κυττάρων σε ρυθμιστικό RIPA που περιέχει 50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 1% ΝΡ-40, 0.1% SDS, 0.5% δεοξυχολικό νάτριο, 2 mM φθοριούχο νάτριο, 2 mM Na3VO42, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, και 1 mM αναστολέα πρωτεάσης κοκτέιλ. Τα συνολικά κυτταρολύματα διαχωρίστηκαν σε πηκτώματα SDS-PAGE, μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες PVDF (Millipore), ανοσοστυπώθηκαν με αντισώματα, και οπτικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ένα ενισχυμένο σύστημα ανίχνευσης χημειοφωταύγειας (Amersham Biosciences). Οι ζώνες πρωτεΐνης ποσοτικοποιήθηκαν με πυκνομετρία χρησιμοποιώντας ImageJ λογισμικό ανάλυσης γέλης (rsbweb.nih.gov/ij). Όλες οι τιμές ομαλοποιήθηκαν προς GAPDH.

μικροσκοπία ανοσοφθορισμού

Εν συντομία, τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν με 4% παραφορμαλδεΰδη, κατέστησαν διαπερατά σε 0.5% Triton Χ-100 και στη συνέχεια αποκλείστηκαν με 10% ορό κατσίκας. Τα κύτταρα επωάστηκαν για 1 ώρα με αντισώματα έναντι Ε-καδερίνης (1:200) ή βιμεντίνη (προ-αραιωμένο) σε 5% ορό κατσίκας, και στη συνέχεια χρωματίστηκαν για 1 ώρα με συζευγμένο με FITC δεύτερο αντίσωμα (1:250 ). Τα κύτταρα παρατηρήθηκαν με μικροσκοπία φθορισμού και οι εικόνες αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό Σύνθετη Αθλητισμού (Diagnostic Instruments, Sterling Heights, MI).

Στατιστική Ανάλυση

Τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται είναι ο μέσος όρος τουλάχιστον τρία πειράματα, έκαστο πραγματοποιήθηκε εις τριπλούν με τυπικά σφάλματα. Οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με ανάλυση της διακύμανσης ακολουθούμενη από τεστ πολλαπλής σύγκρισης Tukey ή δοκιμασία t του Student χρησιμοποιώντας SPSS15.0. σ τιμές των 0,05 θεωρήθηκαν σημαντικές και επισημαίνονται με αστερίσκο.

Αποτελέσματα

PDGF Προώθησε μετανάστευση των κυττάρων και τον πολλαπλασιασμό και μετέβαλε τις Epithelial- μεσεγχυματικά μετάβαση φαινότυπο σε AsPC-1 κύτταρα

Θα εξεταστεί, πρώτον, αν PDGF προωθεί τη μετανάστευση των κυττάρων χρησιμοποιώντας μια δοκιμασία πληγή in vitro το μηδέν και δοκιμασία διαμεμβρανική εισβολή Matrigel. Σε κύτταρα AsPC-1, η θεραπεία με PDGF προωθηθούν δυναμικά μετανάστευση κυττάρων (Σχ. 1Α, Β). Μπορούμε επίσης καθοριστεί αν πολλαπλασιασμό των κυττάρων ενισχύθηκε με PDGF-ΒΒ (20 ng /ml, 24 ώρες) σε κύτταρα AsPC-1. Τα αποτελέσματα της δοκιμασίας πολλαπλασιασμού των κυττάρων ΜΤΤ έδειξαν ότι PDGF αύξησε τον αριθμό των βιώσιμων κυττάρων 1.9 φορές σε σύγκριση με τον έλεγχο (Εικ. 1 C). Στη συνέχεια επιβεβαίωσε αυτά τα αποτελέσματα χρησιμοποιώντας ποσοτική ανάλυση της χρώσης PCNA. AsPC-1 κύτταρα επεξεργασμένα με όχημα ή PDGF-ΒΒ (20 ng /ml) για 24 ώρες βάφτηκαν με PCNA για τη μέτρηση του αριθμού των πολλαπλασιαζόμενων κυττάρων (Σχ. 1D). Το αποτέλεσμα έδειξε ότι η PDGF μεσολάβηση αύξηση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων (1,6 φορές) ήταν σύμφωνο με τα αποτελέσματα της δοκιμασίας ΜΤΤ στο Σχ. 1Β.

AsPC-1 κύτταρα επωάζονται με όχημα ή PDGF-ΒΒ (20 ng /ml) υποβλήθηκαν σε δοκιμασία μηδέν τραύμα (Α) και δοκιμασία διαμεμβρανική εισβολή Matrigel (Β). Τα αποτελέσματα είναι η μέση τιμή ± SD. τριπλών μετρήσεων τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. AsPC-1 κύτταρα επωάζονται με όχημα ή PDGF-ΒΒ (20 ng /ml) για 24 ώρες υποβλήθηκαν σε δοκιμασία πολλαπλασιασμού των κυττάρων ΜΤΤ (Τα αποτελέσματα υποδεικνύονται ως τις ενδείξεις απορρόφησης στα 490 nm) (C) ή βάφονται με FITC- συζευγμένο αντίσωμα κατά του PCNA δείκτη πολλαπλασιασμού και DAPI (150 κύτταρα μετρήθηκαν ανά συνθήκη, και το ποσοστό των PCNA-θετικών κυττάρων παρουσιάζεται.) (D). Τα αποτελέσματα είναι η μέση τιμή ± SD. για τριπλούν προσδιορισμούς των τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. Real time-PCR χρησιμοποιήθηκε για να προσδιοριστούν τα επίπεδα mRNA για να αξιολογηθεί η υπερέκφραση των μεταγραφικών παραγόντων (Ε) και ΕΜΤ-ειδικά γονίδια (F) στα κύτταρα AsPC-1 επωάστηκαν με όχημα ή PDGF-ΒΒ (20 ng /ml, 24 ώρες ). Τα σχετικά επίπεδα mRNA κανονικοποιήθηκαν προς GAPDH. Όλες οι θεραπείες σε αυτό το σχήμα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν, και τα αποτελέσματα εμφανίζονται ως το μέσο ± SD. G: Μικροφωτογραφίες AsPC-1 κύτταρα επωάζονται με όχημα ή PDGF-ΒΒ (20 ng /ml, 24 ώρες). Πρωτότυπη μεγέθυνση, 200Χ.

Η

Σε αυτή τη μελέτη, με τη χρήση πραγματικού χρόνου PCR, βρήκαμε επίσης ότι το PDGF-ΒΒ θεραπεία (20 ng /ml, 24 ώρες) προς τα πάνω ρυθμισμένη σημαντικά την έκφραση του μεταγραφικοί καταστολείς στην διεργασίες της ΕΜΤ, επάγοντας γονίδια όπως ZEB2 σε κύτταρα AsPC-1 (Σχ. 1Ε). Βρήκαμε ότι δεν έχει καμία αλλαγή στην έκφραση των Σαλιγκάρι 1, Σαλιγκάρι 2, Twist και Ε47. Αυτές οι αλλαγές στην έκφραση ήταν ταυτόχρονη με την απώλεια της Ε-καδερίνης και zonula Οοοίιιάεηδ-1 και με το κέρδος της βιμεντίνης, ινονεκτίνη και η έκφραση Ν-καδερίνης (Εικ. 1 F). Το πιο σημαντικό, AsPC-1 κύτταρα κατεργασμένα με PDGF-ΒΒ εμφανίζεται ένα επίμηκες /ακανόνιστη ινοβλαστοειδή μορφολογία, η οποία έδειξε μια επιθηλιακή εμφάνιση λιθόστρωτα (Εικ. 1 G). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι PDGF οδήγησε στην απόκτηση του φαινοτύπου EMT.

Κανονισμός του miRNA έκφραση από PDGF-ΒΒ θεραπεία σε AsPC-1 κύτταρα

Σε πραγματικό χρόνο χρησιμοποιήθηκε PCR για να καθοριστεί αν η θεραπεία των κυττάρων με PDGF-ΒΒ (20 ng /ml, 24 ώρες) θα μπορούσε να μεταβάλλει την έκφραση των miRNA σύγκριση με μη επεξεργασμένα κύτταρα. Βρήκαμε ότι miR-221-3p και miR-221-5p ήταν δύο στα λίγα miRNAs εμπλουτισμένο σε AsPC-1 κύτταρα κατεργασμένα με PDGF-ΒΒ (Εικ. 2Α), προτείνοντας ότι miR-221 έκφραση μπορεί να ενεργοποιηθεί από PDGF σηματοδότηση. Μια χρονική πορεία της έκφρασης του miR-221-3p, miR-221-5p, miR-222-3p και miR-222-5p εξετάστηκε μετά τη θεραπεία PDGF-ΒΒ στα κύτταρα AsPC-1. MiR-221-3p και miR-221-5p επάχθηκαν 2,4 φορές και 1,7 φορές αντιστοίχως μετά από 4 ώρες από τη θεραπεία με PDGF και βαθμιαία μειώθηκε κατά 10 h (Σχ. 2Β). Σημαντικά, ισχυρή επαγωγή τόσο των πρωτογενών μεταγραφών (Pri-miR-221) και του ενδιάμεσου προϊόντος (Pre-miR-221) του miR-221 παρατηρήθηκε ήδη 2 ώρες μετά τη θεραπεία PDGF, γεγονός που υποδηλώνει ότι miR-221 είναι πιθανό να να επάγεται μεταγραφικά από PDGF σηματοδότηση (Εικόνα 2C).

Α:. Τα σχετικά επίπεδα miRNA σε AsPC-1 κύτταρα επεξεργασμένα με όχημα ή PDGF-ΒΒ (20 ng /ml, 24 ώρες) B, C: Ώρα -course έκφραση της σχετικής έκφρασης του miR-221-3p, miR-221-5p, miR-222-3p και miR-222-5p (Β), και miR-221 μεταγραφές (Pri-miR-221), Προ- miR-221 ή λήγουν miR-221 (C) κανονικοποιημένη σε GAPDH (για Pri-miR-221 ή προ-miR-221), ή U6 μικρό πυρηνικό RNA (για miR-221-3p, miR-221-5p, ΜΙΚ 222-3p, miR-222-5p και ώριμη miR-221) σε AsPC-1 κύτταρα επεξεργασμένα με όχημα ή PDGF-ΒΒ (20 ng /ml, 24 ώρες). D: κύτταρα AsPC-1 υποβλήθηκαν σε αγωγή με όχημα ή PDGF-ΒΒ (20 ng /ml), ή διαμολυσμένα με αρνητικό μάρτυρα, ο miR-221 μιμούνται, αντι-MIR-221, ή αντι-MIR-221 και ακολουθείται από PDGF -BB θεραπεία., και υποβλήθηκε σε qRT-PCR του miR221. Όλες οι θεραπείες σε αυτό το σχήμα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν, και τα αποτελέσματα εμφανίζονται ως το μέσο ± SD.

Η

miR-221 είναι απαραίτητη για την PDGF-μεσολάβηση μεταβάσεως επιθηλίου-μεσεγχύματος φαινότυπο, Μετανάστευση και την ανάπτυξη των AsPC-1 κύτταρα

επιμολυσμένα κύτταρα AsPC-1 με συνθετικό miR-221 (miR-221 μιμούνται) ή τον έλεγχο μιμούνται (που περιέχει μια σειρά από GFP) και εξέτασε το φαινότυπο EMT. Η εξωγενής miR-221 απορυθμίζεται την έκφραση του mRNA ZEB2 και βιμεντίνη και πρωτείνη, και μείωσε την έκφραση της Ε-καδερίνης mRNA και η πρωτεΐνη, παρόμοια με την επίδραση του PDGF (Σχ. 3Α, Β, C). Στη συνέχεια, το RNA ολιγονουκλεοτίδια έναντι miR-221 (αντι-miR-221) επιμολύνθηκαν σε κύτταρα AsPC-1 να αναστέλλει miR-221 λειτουργία. Αντι-miR-221 διαμόλυνση μειωμένη τόσο την βασική όσο και PDGF-επαγόμενη έκφραση του miR-221 κατά περισσότερο από 70% (Σχ. 2C). Ανάλυση κηλίδας Western (Σχ. 3Β) και PCR πραγματικού χρόνου (Σχ. 3C) έδειξε ότι το PDGF-BB-μεσολάβηση φαινότυπο EMT ήταν σημαντικά μειωμένη όταν miR-221 ανεστάλη. Αυτά τα αποτελέσματα επιβεβαιώνουν ότι miR-221 παίζει ουσιαστικό ρόλο στην PDGF μεσολάβηση φαινότυπο EMT.

AsPC-1 κύτταρα επιμολύνθηκαν με ένα αρνητικό έλεγχο, ΜΙΚ-221 μιμούνται, ή αντιπληροφοριακά ολιγονουκλεοτίδια για να miR-221 ( αντι-MIR-221). Τα κύτταρα μετά υποβλήθηκαν σε αγωγή με PDGF-ΒΒ (20 ng /ml) για 24 ώρες και υποβλήθηκε σε qRT-PCR (A, C) ή ανάλυση Western blot (Β) των παραγόντων μεταγραφής και ΕΜΤ-ειδικούς δείκτες γονιδίου. κύτταρα AsPC-1 επιμολύνθηκαν με ένα αρνητικό έλεγχο, ΜΙΚ-221 μιμούνται, ή αντιπληροφοριακά ολιγονουκλεοτίδια για να miR-221 (αντι-MIR-221) και υποβλήθηκε σε δοκιμασία διαμεμβρανική εισβολή Matrigel (D) παρουσία ή απουσία 20 ng /ml ΡϋΟΡ-ΒΒ. κύτταρα AsPC-1 επιμολύνθηκαν με ένα αρνητικό έλεγχο, ΜΙΚ-221 μιμούνται, ή αντιπληροφοριακά ολιγονουκλεοτίδια για να miR-221 (αντι-MIR-221), ακολουθούμενη από επεξεργασία του PDGF-ΒΒ επί 24 ώρες, και στη συνέχεια βάφτηκαν με FITC- συζευγμένο αντίσωμα έναντι του PCNA δείκτη πολλαπλασιασμού και DAPI. Συνολικά, 150 κύτταρα μετρήθηκαν ανά συνθήκη, και το ποσοστό των PCNA-θετικών κυττάρων (Ε) παρουσιάζεται. Όλα τα πειράματα θεραπείας σε αυτό το σχήμα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν, και τα αποτελέσματα εμφανίζονται ως το μέσο ± SD.

Η

PDGF όχι μόνο μπορεί να μεσολαβήσει το φαινότυπο EMT αλλά επίσης μπορεί να προωθήσει την κυτταρική μετανάστευση και πολλαπλασιασμό. Ως εκ τούτου, AsPC-1 κύτταρα επιμολύνθηκαν με ένα miR-221 μιμούνται, αντι-miR-221, ή αντι-GFP (έλεγχος) για να εξετάσει εάν η επαγωγή του miR-221 με PDGF παίζει ρόλο στην κυτταρική μετανάστευση και πολλαπλασιασμό. Όταν miR-221 λειτουργία παρεμποδίστηκε με αντι-miR-221, PDGF δεν μεταβάλλουν το επίπεδο της κυτταρικής μετανάστευσης και του πολλαπλασιασμού, γεγονός που υποδηλώνει ότι η επαγωγή του miR-221 είναι απαραίτητη για την εξαρτώμενη από τον PDGF μετανάστευση κυττάρων (Σχ. 3D) και τον πολλαπλασιασμό (Εικ . 3Ε). Αντιστρόφως, η επιμόλυνση του miR-221 μιμητικό μόνος σημαντικά αυξημένα μετανάστευση κυττάρων (Σχ. 3D) και τον πολλαπλασιασμό (Εικ. 3Ε) σε ένα επίπεδο παρόμοιο με αυτό του μη επιμολυσμένα κύτταρα κατεργασμένα με PDGF. Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι το PDGF-εξαρτώμενη επαγωγή miR-221 είναι απαραίτητη για την προώθηση της μετανάστευσης των κυττάρων και τον πολλαπλασιασμό.

Έτσι, miR-221 μεσολαβεί τις δράσεις του PDGF για τη μετανάστευση, τον πολλαπλασιασμό και τη διαφοροποίηση των AsPC-1 κύτταρα . Το αποτέλεσμα αυτό εγείρει το ερώτημα κατά πόσον ένα ενιαίο στόχο miR-221 μπορεί να είναι υπεύθυνη για όλα αυτά τα φαινόμενα ή αν miR-221 μπορεί να αποστέλλει το σήμα μέσω πολλαπλών λειτουργικά και φυσικά διακριτές στόχους.

MiR-221 Προωθεί την EMT από Στόχευση TRPS1

Μια προηγούμενη μελέτη έχει δείξει ότι η οικογένεια GATA μεταγραφικό καταστολέα TRPS1 μπορεί να εμποδίσει την EMT με τη μείωση της έκφρασης ZEB2 [16], [22]. MiR-221 έχει προηγουμένως δειχθεί για στόχευση TRPS1 mRNA, οδηγώντας σε μειωμένη έκφραση των προϊόντων γονιδίου μέσω αποικοδόμησης mRNA ή /και την αναστολή της μεταφράσεως [16]. Ερευνήσαμε, πρώτον, αν το mRNA TRPS1 ή τα επίπεδα της πρωτεΐνης διαμορφώνονται από PDGF-ΒΒ στα κύτταρα AsPC-1. Το επίπεδο TRPS1 mRNA μειώθηκε κατά περίπου 55% (Σχ. 4Α) κατά την κατεργασία των κυττάρων AsPC-1 με PDGF-ΒΒ επί 24 ώρες κάτω από συνθήκες που ανέστειλε σημαντικά την έκφραση των δεικτών EMT (Σχ. 3Β, C). Ως εκ τούτου, TRPS1 ρυθμίζεται από PDGF σηματοδότηση. Για να εκτιμηθεί εάν miR-221 είναι υπεύθυνο για το PDGF-εξαρτώμενη ρύθμιση προς τα κάτω του TRPS1, ΜΙΚ-221 μιμητικό επιμολύνθηκε σε AsPC-1 κύτταρα, και στη συνέχεια τα επίπεδα πρωτεΐνης και mRNA του TRPS1, ZEB2, Ε-καδερίνη και βιμεντίνης ήταν εξετάστηκε με ανάλυση κηλίδος Western και σε πραγματικό χρόνο PCR. Η εξωγενής miR-221 μείωσε σημαντικά την έκφραση του TRPS1 και Ε-καδερίνης και αύξησε την έκφραση του ZEB2 και βιμεντίνης (Σχ. 4Β, C, D, E). Αντίθετα, όταν περισσότερο από το 70% του ενδογενούς miR-221 ήταν εξαντλημένο από αντι-miR-221, τα επίπεδα του TRPS1 mRNA και της πρωτεΐνης ήταν αυξημένα (Εικ. 4Α, Β), και τα κύτταρα AsPC-1 παρουσίασε το φαινότυπο EMT (Σχ. 4F, G). Επιπλέον, παρατηρήσαμε ότι η εξωγενής miR-221 δεν μετέβαλε περαιτέρω την έκφραση του φαινοτύπου ΕΜΤ αφού TRPS1 knockdown με siRNA. Το πιο σημαντικό, θεραπεία ΡϋΟΡ-ΒΒ δεν καταστέλλει TRPS1 παρουσία αντι-miR-221 (Σχ. 4Α). Αυτά τα αποτελέσματα κατέδειξαν ότι miR-221 στοχεύει άμεσα TRPS1 mRNA, όπως παρατηρήθηκε προηγουμένως [16].

AsPC-1 κύτταρα επιμολύνθηκαν με ένα αρνητικό έλεγχο μιμητικό, ΜΙΚ-221 μιμούνται, αντινοηματικά ολιγονουκλεοτίδια να miR-221 ( αντι-MIR-221) ή TRPS1 siRNA. Τα κύτταρα μετά υποβλήθηκαν σε αγωγή με PDGF-ΒΒ (20 ng /ml) για 24 ώρες και υποβλήθηκε σε qRT-PCR του TRPS1. κύτταρα AsPC-1 επιμολύνθηκαν με ένα αρνητικό έλεγχο μιμητικό, ΜΙΚ-221 μιμούνται, αντινοηματικά ολιγονουκλεοτίδια να miR-221 (αντι-MIR-221) ή TRPS1 siRNA για 3 ημέρες και υποβλήθηκαν σε ανάλυση κηλίδος Western του TRPS1, ZEB2, Ε- cadherin και βιμεντίνης. κύτταρα AsPC-1 επιμολύνθηκαν με αντιπληροφοριακά ολιγονουκλεοτίδια για να miR-221 (αντι-MIR-221). Τα κύτταρα στη συνέχεια σε επεξεργασία με ένα αρνητικό μάρτυρα ή miR-221 μιμητικό για 3 ημέρες και υποβάλλεται σε qRT-PCR για ZEB2 (C), Ε-καδερίνης (D) και βιμεντίνης (Ε). κύτταρα AsPC-1 επιμολύνθηκαν με ένα αρνητικό έλεγχο μιμούνται, ΜΙΚ-221 μιμούνται ή αντιπληροφοριακά ολιγονουκλεοτίδια για να miR-221 (αντι-MIR-221). Τα κύτταρα μετά υποβλήθηκαν σε αγωγή με PDGF-ΒΒ (20 ng /ml) για 24 ώρες και υποβλήθηκαν σε χρώση ανοσοφθορισμού για βιμεντίνη (F) και Ε-καδερίνης (G) Όλες οι αγωγές στο σχήμα αυτό πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν, και τα αποτελέσματα είναι εμφανίζεται ως το μέσο ± SD.

η

PDGF-μεσολάβηση αναστολή της p27kip1 από miR-221 προωθεί τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων

p27kip1 είναι ένα μέλος της οικογένειας CIP /Kip της κυκλίνης-εξαρτώμενη κινάση (CDK) αναστολείς που λειτουργούν για να ρυθμίζουν αρνητικά την πρόοδο του κυτταρικού κύκλου από G1 σε φάση S με σύνδεση προς CDK2 και τα σύμπλοκα κυκλίνης Ε [23]. Για να ελεγχθεί ο ρόλος των p27kip1 στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων AsPC-1, μειώσαμε το p27kip1 ενδογενές επίπεδο με siRNA (si-p27kip1) (Σχ. 5Α, Β) και μετρήθηκε ανάπτυξη των κυττάρων επί 4 ημέρες (σχ. 5C). Ο πολλαπλασιασμός των si-p27kip1-επιμολυσμένων κυττάρων αυξήθηκε σημαντικά σε σύγκριση με κύτταρα ελέγχου, γεγονός που υποδηλώνει ότι μειωμένη έκφραση του p27kip1 μπορεί να προωθήσει την ανάπτυξη των κυττάρων σε κύτταρα AsPC-1. Ως εκ τούτου, υποθέσαμε ότι PDGF-εξαρτώμενο προαγωγή του κυτταρικού πολλαπλασιασμού AsPC-1 μπορεί να προκαλείται μέσω ρύθμισης προς τα κάτω του p27kip1. Ποσοτική ανάλυση της χρώσης PCNA έδειξαν ότι η έκφραση p27kip1 ανεστάλη από PDGF-ΒΒ (20 ng /ml) μετά από 24 ώρες θεραπείας, και την επιμόλυνση των si-p27kip1 αύξησε τον αριθμό των πολλαπλασιαζόμενων κυττάρων σε παρόμοια έκταση, όπως θεραπεία PDGF (Εικ. 5 C, D, E). MiR-221 έχει προηγουμένως δειχθεί ότι αναστέλλουν p27kip1 και προάγουν τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων [13], [24], [25]. Ως εκ τούτου, ερευνήσαμε αν PDGF-μεσολάβηση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων AsPC-1 επηρεάζεται από miR-221-μεσολάβηση αναστολή της p27kip1. Η επιμόλυνση του miR-221 μιμούνται μείωσε σημαντικά την έκφραση του p27kip1 (Εικ. 5Α, Β) και τον πολλαπλασιασμό αυξημένα κυττάρων (Σχ. 5D, E), παρομοίως σε κύτταρα επιμολυσμένα με SI-p27kip1 (Σχ. 5Α, Β, D, Ε ). Όταν ενδογενή miR-221 ήταν εξαντλημένο από αντι-miR-221, θεραπεία ΡϋΟΡ-ΒΒ δεν καταστέλλουν την έκφραση του p27kip1 (Σχ. 5Α, Β). Έτσι, ο PDGF-εξαρτώμενη αύξηση στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων φαίνεται να διαμεσολαβείται από την αναστολή ενός συγκεκριμένου στόχου miR-221 και προς τα κάτω ρύθμιση p27kip1

(Α, Β):. AsPC-1 κύτταρα επιμολύνθηκαν με αρνητικό έλεγχο μιμούνται, τα miR-221 μιμούνται, αντινοηματικά ολιγονουκλεοτίδια να miR-221 (αντι-MIR-221) ή p27kip1 siRNA. Τα κύτταρα μετά υποβλήθηκαν σε αγωγή με PDGF-ΒΒ (20 ng /ml) για 24 ώρες και υποβλήθηκε σε qRT-PCR (Α) και Western ανάλυση στυπώματος (Β) για p27kip1. (C): κύτταρα AsPC-1 επιμολύνθηκαν με αρνητικό μάρτυρα ή p27kip1 siRNA και υποβλήθηκαν σε δοκιμασία πολλαπλασιασμού των κυττάρων ΜΤΤ (Τα αποτελέσματα υποδεικνύονται ως οι αναγνώσεις απορρόφησης στα 490 nm). (C) (D, E): κύτταρα AsPC-1 επιμολύνθηκαν με ένα αρνητικό έλεγχο μιμητικό, ΜΙΚ-221 μιμούνται, αντινοηματικά ολιγονουκλεοτίδια να miR-221 (αντι-MIR-221) ή p27kip1 siRNA. Τα κύτταρα μετά υποβλήθηκαν σε αγωγή με PDGF-ΒΒ (20 ng /ml) για 24 ώρες και υποβλήθηκαν σε χρώση με FITC-συζευγμένο αντίσωμα έναντι του PCNA δείκτη πολλαπλασιασμού και ϋΑΡΙ (Ε). Συνολικά, 150 κύτταρα μετρήθηκαν ανά συνθήκη, και το ποσοστό των PCNA-θετικών κυττάρων παρουσιάζεται (D). Όλα τα πειράματα σε αυτό το σχήμα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν, και τα αποτελέσματα εμφανίζονται ως μέσο ± SD.

Η

Συζήτηση

Ένα αυξανόμενο σώμα της βιβλιογραφίας υποδηλώνει σαφώς ότι PDGF μπορεί να λειτουργήσει ως ένας βασικός παράγοντας στην ανάπτυξη και την πρόοδο των ανθρώπινων καρκίνων ρυθμίζοντας τις διαδικασίες του πολλαπλασιασμού των κυττάρων, την απόπτωση, μετανάστευση, εισβολή, την αγγειογένεση, και μετάσταση. Έχει αναφερθεί ότι PDGF σηματοδότηση συχνά απορυθμισμένη σε ανθρώπινες κακοήθειες, και ρυθμίζεται προς τα πάνω την έκφραση του PDGF βρέθηκε στην παγκρέατος, του προστάτη, των πνευμόνων, νεφρών, των ωοθηκών και του εγκεφάλου [6]. Τα τελευταία χρόνια, PDGF σηματοδότηση έχει βρεθεί να παίζει σημαντικό ρόλο στην απόκτηση του φαινοτύπου ΕΜΤ σε καρκινικά κύτταρα [6], [8], [26]. Επιπλέον, έχει γίνει όλο και πιο σαφές ότι η EMT παίζει σημαντικό ρόλο στην εξέλιξη του καρκίνου και είναι επίσης υπεύθυνη για την αντίσταση των καρκινικών κυττάρων με τα συμβατικά χημειοθεραπευτικά. Ως εκ τούτου, PDGF σηματοδότηση έχει θεωρηθεί ότι είναι σημαντική στην ανθρώπινες κακοήθειες, και ως εκ τούτου, PDGF σηματοδότηση μπορεί να αντιπροσωπεύει ένα νέο θεραπευτικό στόχο, γεγονός που υποδηλώνει ότι η ανάπτυξη παραγόντων που στοχεύουν PDGF σηματοδότηση είναι πιθανό να έχει σημαντική θεραπευτική επίδραση επί ανθρώπινων καρκίνων. τρέχουσα μελέτη μας έδειξε σαφώς ότι η θεραπεία ΡϋΟΡ-ΒΒ προωθείται μετανάστευση των κυττάρων και τον πολλαπλασιασμό και είχε ως αποτέλεσμα την απόκτηση του φαινοτύπου ΕΜΤ μέχρι ρύθμιση των δεικτών μεσεγχυματικών κυττάρων (ZEB1, ZEB2, Snail2, και βιμεντίνη) και προς τα κάτω ρύθμιση ενός επιθηλιακού κυττάρου δείκτη (Ε-καδερίνη) σε κύτταρα AsPC-1. Έτσι, η στόχευση σηματοδότηση PDGF μπορεί να αναστείλει την απόκτηση του φαινοτύπου EMT, η οποία θα έχει ως αποτέλεσμα την αναστροφή της αντίστασης φαρμάκου για τη θεραπεία της μεταστατικής νόσου.

Στην παρούσα μελέτη, δείξαμε επίσης ότι miR-221 γονίδιο μεταγραφή ρυθμίζεται από PDGF σηματοδότηση. Η οδός PDGF είναι γνωστή ως διαμορφωτής της έκφρασης διαφόρων γονιδίων που κωδικοποιούν πρωτεΐνες, αλλά miR-221 είναι το πρώτο γονίδιο miRNA βρέθηκε να ρυθμίζεται από PDGF. Είναι ενδιαφέρον να προβούμε σε εικασίες ότι PDGF μπορεί να ενεργοποιήσει το miR-221 μεταγραφή μέσω της πρόσληψης του μεταγραφικού παράγοντα μικροφθαλμίας που σχετίζονται ή άλλες πρωτεΐνες δέσμευσης E-box. Βρήκαμε ότι miR-221 προκλήθηκε 2,5-φορές μετά από 4 ώρες από τη θεραπεία με PDGF, και τόσο οι πρωτογενείς μεταγραφές και ενδιάμεσα προϊόντα της miR-221, παρατηρήθηκαν ήδη 2 ώρες μετά τη θεραπεία PDGF, γεγονός που υποδηλώνει ότι miR-221 έκφραση ενεργοποιείται από PDGF σηματοδότηση. miR-221 εκφράζεται έντονα σε διάφορες καρκινικές προερχόμενα κύτταρα, συμπεριλαμβανομένου του καρκινώματος του παγκρέατος, καρκίνωμα προστάτη, και τα κύτταρα καρκίνωμα του θυρεοειδούς [14], [15]. Επιπλέον, miR-221 έχει δειχθεί ότι διεγείρει διάφορες πτυχές της παθογένεσης καρκίνου, συμπεριλαμβανομένης μετάστασης, εισβολή, και αυτο-ανανέωση [27], [28], [29]. Όταν miR-221 λειτουργία έχει αποκλειστεί από αντι-miR-221, βρήκαμε ότι PDGF δεν μεταβάλλουν το επίπεδο της μετανάστευσης των κυττάρων και τον πολλαπλασιασμό και να οδηγήσει στην απόκτηση του φαινοτύπου EMT. Αυτά τα αποτελέσματα επιβεβαιώνουν ότι miR-221 παίζει ουσιαστικό ρόλο στην PDGF μεσολάβηση επιθηλιακά-μεσεγχυματικά μετάβαση φαινότυπο, μετανάστευση, και την ανάπτυξη των κυττάρων AsPC-1. MiR-221 και miR-222 μοιράζονται την ίδια αλληλουχία σπόρο, υποδεικνύοντας ένα μεγάλο βαθμό λειτουργικής επικάλυψη μεταξύ αυτών των δύο mRNAs.