Αφηρημένο

Κατά τη διάρκεια της εξέλιξης του όγκου, η EphA2 υποδοχέα μπορούν να αποκτήσουν ανεξάρτητη συνδεσμικού pro-ογκογόνο λειτουργίες λόγω να Akt ενεργοποίηση και μειωμένη ephrin-Α δέσμευσης συνδέτη. Τα αποτελέσματα μπορούν να αντιστραφούν με διέγερση με συνδέτη, η οποία ενεργοποιεί την εγγενή κατασταλτική του όγκου οδούς της EphA2 περιλαμβάνει την αναστολή της ΡΙ3 /Akt και μονοπάτια /ERK σηματοδότησης Ras. Αυτές οι παρατηρήσεις υποστηρίζουν την ανάπτυξη των μικρών αγωνιστών μορίου για ΕρίιΑ2 ως πιθανοί παράγοντες παρέμβαση του όγκου. Μέσω εικονικής διαλογής και προσδιορισμοί με βάση κύτταρα, αναφέρουμε εδώ την ταυτοποίηση και το χαρακτηρισμό της δοξαζοσίνης ως νέου μικρού μορίου συναγωνιστή για EphA2 και EphA4, αλλά όχι για άλλους υποδοχείς Eph που δοκιμάστηκαν. NMR μελέτες αποκάλυψαν εκτεταμένες επαφές ντοξαζοσίνης με EphA2 /A4, ανακεφαλαιώνοντας τόσο υδρόφοβων και ηλεκτροστατικών αλληλεπιδράσεων βρέθηκε πρόσφατα στην EphA2 /ephrin-Α1 συγκρότημα. Κλινικά χρησιμοποιείται ως ανταγωνιστής α1-αδρενεργικών υποδοχέων (Cardura®) για τη θεραπεία της υπέρτασης και της καλοήθους υπερπλασίας του προστάτη, ενεργοποιείται doxazosin EphA2 ανεξάρτητη από α1-αδρενεργικών υποδοχέων. Παρόμοια με εφρίνης-Α1, doxazosin ανέστειλε δραστηριότητες κινάσης Akt και ERK σε EphA2-εξαρτώμενο τρόπο. Η θεραπεία με doxazosin ενεργοποιείται EphA2 εσωτερίκευση υποδοχέα και κατέστειλε απτοτακτική και χημειοτακτική μετανάστευση του καρκίνου του προστάτη, του καρκίνου του μαστού, και κύτταρα γλοιώματος. Επιπλέον, σε ένα ορθοτοπικό μοντέλο ξενομοσχεύματος, δοξαζοσίνη μειωμένη περιφερική μετάσταση ανθρώπινων κυττάρων καρκίνου του προστάτη και παρατεταμένη επιβίωση σε ποντικούς δέκτες. Για τις γνώσεις μας, η δοξαζοσίνη είναι το πρώτο μικρό μόριο αγωνιστής ενός υποδοχέα κινάσης τυροσίνης η οποία είναι ικανή να αναστέλλει κακοήθων συμπεριφορών

in vitro

και

in vivo

Η

Παράθεση:. Petty Α, Myshkin Ε, Τσιν Η, Guo Η, Miao Η Tochtrop GP, et al. (2012) Ένα μικρό μόριο αγωνιστή της EphA2 Υποδοχέα Κινάσης Τυροσίνης Αναστέλλει Μετανάστευση Tumor κύτταρο ίη vitro και καρκίνο του προστάτη μετάστασης σε βιολογικό περιβάλλον. PLoS ONE 7 (8): e42120. doi: 10.1371 /journal.pone.0042120

Συντάκτης: Μινγκ Tat Λινγκ, Queensland University of Technology, Αυστραλία

Ελήφθη: 22 του Φεβρουαρίου 2012? Αποδεκτές: 2 Ιούλη, 2012? Δημοσιεύθηκε: 15, Αυγούστου, 2012

Copyright: © Petty et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις από το Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας για να BW (CA155676-01, DK077876), BW και HM (CA152371), και τα βραβεία σε BW από FAMRI και προσευχή από Μαρία Ιδρύματα. JS υποστηρίχθηκε από τη Σιγκαπούρη Εθνικό Ιατρικό Κονδυλίων Έρευνας του Συμβουλίου NMRC /1216/2009. In silico εξέτασης υποστηρίχθηκε από μια επιχορήγηση από το Κέντρο Supercomputer Οχάιο. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα: Δρ. Π Page απασχολείται από Reichert, ανάλυση Δεσμευτική Inc. διεξήχθη με τη χρήση τυποποιημένων τσιπς βιοαισθητήρα και το SR7000DC Dual Channel SPR System, ένα προϊόν της Reichert Επιστημών ζωής. Δεν υπάρχουν άλλα διπλώματα ευρεσιτεχνίας, τα προϊόντα σε εξέλιξη ή άλλα εμπόριο προϊόντων να δηλώσει. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών, όπως περιγράφεται λεπτομερώς σε απευθείας σύνδεση στον οδηγό για τους συγγραφείς.

Εισαγωγή

Ως μέλος της ερυθροποιητίνης που παράγουν ηπατοκυτταρικό (Εφ) υποοικογένεια των κινασών τυροσίνης υποδοχέα (RTKs), EphA2 αρχικά ονομαζόταν επιθηλιακών κυττάρων κινάση, ή Eck, λόγω της ευρείας έκφρασης της στον επιθηλιακά κύτταρα

in vitro

και

in vivo

[ ,,,0],1]. Μετέπειτα μελέτες αποκάλυψαν ότι EphA2 υπερεκφράζεται σε ανθρώπινους καρκίνους, και ότι η υπερέκφραση συσχετίστηκε με κακοήθη εξέλιξη και φτωχή πρόγνωση [2], [3]. Ένας μεγάλος αριθμός μελετών έχουν καταδείξει ότι η υπερέκφραση της EphA2 και ενεργοποίηση προωθήσει ογκογένεση, υποδηλώνοντας έναν πιθανό ρόλο ως ένα ογκογονίδιο [4], [5], [6], [7], [8]. Η υπερέκφραση της EphA2 στα επιθηλιακά κύτταρα του μαστού που προκαλείται από μορφολογικό μετασχηματισμό [8], ενώ στον καρκίνο του προστάτη και γλοιώματος κυτταρικές γραμμές, η αυξημένη έκφραση της EphA2 προκάλεσε αυξημένη χημειοτακτική κυτταρική μετανάστευση και εισβολή [9].

Αντίθετες προ-ογκογόνο ρόλους, πολλές μελέτες έχουν δείξει ότι η ενεργοποίηση της EphA2 με τον συνδετήρα αυτού, εφρίνης-Α1, ρυθμίζει την κυτταρική συμπεριφορές κατά τρόπο πιο συνεπή με το που είναι ένας καταστολέας όγκων, συμπεριλαμβανομένων επαγωγή απόπτωσης, η αναστολή του πολλαπλασιασμού των κυττάρων, και την καταστολή της κυτταρικής μετανάστευσης [7], [ ,,,0],10], [11], [12].

In vivo

μελέτες αποδεικνύουν ότι η ενεργοποίηση της EphA2 με συστημικά χορηγούμενη εφρίνης-A1 μειώνει ογκογονικότητα και διεισδυτικότητα των ξενομοσχευμάτων καρκινώματος [13], [14]. Επιπλέον, η EphA2 ποντίκια διαγραφή εμφανίζουν αυξημένη ευαισθησία σε καρκινογόνο που προκαλείται ογκογένεση του δέρματος [15].

Οι πρόσφατες μελέτες έχουν αρχίσει να ρίξει φως σχετικά με τις παράδοξες παρατηρήσεις [3], [16]. Αποκαλύπτεται ότι EphA2 υποδοχέας έχει διαμετρικά αντίθετες ρόλους στην ογκογένεση [9]. Κατά τη διέγερση συνδετήρα, EphA2 αναστέλλει την κυτταρική μετανάστευση σύμφωνα με τις καθιερωμένες απωστική ρόλων των υποδοχέων Eph στη ρύθμιση κυτταρική κινητικότητα [17], [18]. Σε άμεση αντίθεση, απουσία του συνδετήρα, EphA2 προάγει κυτταρική μετανάστευση, η οποία συσχετίζεται με το επίπεδο έκφρασης του. Μηχανιστικά, EphA2 βρίσκεται να είναι ένα υπόστρωμα της Akt που ενεργοποιείται σε διάφορους ανθρώπινους καρκίνους [9], [19]. Akt φωσφορυλιώνει EphA2 σε σερίνη 897 που βρίσκεται στην καλά-εκτεθειμένο βρόχο μεταξύ πεδίου κινάσης και μοτίβο αποστειρωμένο-α (SAM). Μεταλλαξογένεση, φαρμακολογικές και κυτταρικές μελέτες δείχνουν φωσφορυλίωση S897 είναι απαραίτητη για τη μετανάστευση-διεγερτικές επιδράσεις της EphA2 σε απουσία συνδέτη [9]. Η υπερέκφραση της EphA2 συχνά συνοδεύεται από απώλεια της έκφρασης ή ο εσφαλμένος εντοπισμός του εφρίνης-Α1 στον καρκίνο του μαστού [20], γλοίωμα [21] και όγκους του δέρματος [15]. Η μειωμένη εφρίνης-Α έκφραση σε συνδυασμό με την αυξημένη έκφραση της EphA2 και συχνή ενεργοποίηση Akt παρέχει ένα ανεκτικό περιβάλλον για την προώθηση της ανεξάρτητη συνδεσμικού προ-επεμβατική Akt-EphA2 στιχομυθία, που μπορεί να είναι εν μέρει υπεύθυνη για υπερέκφραση της EphA2 κατά την διάρκεια της προόδου του όγκου και τη συσχέτιση της έκφρασης EphA2 και δυσμενή πρόγνωση. Υποστηρίζοντας την έννοια αυτή, ανοσοϊστοχημική εξέταση των δειγμάτων ανθρώπινης γλοιώματος με ένα αντίσωμα κατά της φωσφο-S897 αποκάλυψε ότι η ενεργοποίηση του Akt-EphA2 σηματοδότηση συσχετίζεται με κακοήθη εξέλιξη [9].

Είναι σημαντικό ότι, η διέγερση προσδέματος των καρκινικών κυττάρων in vitro αδρανοποιεί Akt και προκαλεί αποφωσφορυλίωση της EphA2 για S897 [9], επισημαίνοντας την περίπλοκη διχοτόμηση των λειτουργιών EphA2, δηλαδή, η καταστολή του όγκου εξαρτώμενη από συνδετήρα και την προώθηση του όγκου συνδέτη-ανεξάρτητη. Άλλες λειτουργίες ογκοκατασταλτικό της EphA2 ενεργοποιούνται επίσης κατά την ενεργοποίηση EphA2 που επάγεται με συνδέτη, συμπεριλαμβανομένης αδρανοποίηση της οδού Ras /ERK. Η σηματοδότηση εξαρτώμενη από συνδέτη κορυφώνεται με την αναστολή της κυτταρικής μετανάστευσης και του πολλαπλασιασμού, αν και οι ειδικές αποκρίσεις που ρυθμίζονται από κυτταρική έννοια, όπως την κατάσταση ενεργοποίησης Ras σε ένα δεδομένο τύπο καρκινικού κυττάρου. Οι μελέτες μας κίνητρο για να προτείνουν ότι τα μικρά μόρια αγωνιστών για την EphA2 μπορεί να αξιοποιηθεί ως νέα θεραπευτικά μέσα του καρκίνου. Όπως απεικονίζεται στο Σχήμα 1Α, όπως αγωνιστές μπορεί όχι μόνο αποκόπτει το pro-ογκογόνο Akt-EphA2 στιχομυθία, αλλά και ενεργοποιήσει εκ νέου εγγενή εξαρτώμενη από συνδετήρα λειτουργίες καταστολής όγκου της EphA2.

(Α) Σχηματική απεικόνιση της προβλεπόμενης επιδράσεις των μικρά μόρια αγωνιστών στην επαγωγή σηματοδότησης εξαρτώμενη από τον υποκαταστάτη. (Β) δομή κρυστάλλου του τομέα δέσμευσης προσδέματος EphA2 (LBD) σε σύμπλοκο με εφρίνης-Α1. Υπογραμμιστούν αφορούν τις υδρόφοβο θύλακα και αργινίνη 103 της EphA2-LBD που αλληλεπιδρούν με το G-H του βρόχου εφρίνης-Α1 και γλουταμικού 119 εφρίνης-Α1, αντίστοιχα. EphA2-LBD περιστράφηκε -10 ° αριστερόστροφα για να αποκαλύψει καλύτερα την τσέπη δέσμευσης. (C) Μικρές διαλογής μορίου προσδιορίζει ντοξαζοσίνης (Ενωση 11) ως νέου συναγωνιστής EphA2. κύτταρα MDA-231-Α2 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ενώσεις 1-11 (50 μΜ σε 0,2% DMSO) για 30 λεπτά και τα προϊόντα λύσης κυττάρου υποβλήθηκαν σε ανοσοστυπώματος για το φωσφορυλιωμένο κινάσες EphA /Β (pEphA /Β) και το συνολικό EphA2. (Δ) Χημική δομή της δοξαζοσίνης (DZ). (Ε) Δόση-απόκριση της ενεργοποίησης EphA2 με DZ. κύτταρα MDA-231-Α2 υποβλήθηκαν σε αγωγή με τις υποδεικνυόμενες δόσεις DZ για 30 λεπτά και τα προϊόντα λύσης ανοσοκαταβυθίζονται με ένα επιλεκτικά της EphA2 αντισώματα και αποτυπώθηκαν όπως στο (C). Η αγωγή με 1 μg /ml εφρίνης-Α1-Ρο (EA1-Fc) για 10 λεπτά χρησίμευσε ως θετικός έλεγχος. Σημείωση μειούμενη ποσότητα EphA2 εξής εφρίνης-Α1 και θεραπεία doxazosin. (F) ανοσοστυπώματα για pEphA /Β σε λύματα από κύτταρα MDA-231-A2 προκατεργάζονται με 1 μΜ φαινοξυβενζαμίνη και στη συνέχεια κατεργάζεται για 1 ώρα με υποδεικνυόμενες δόσεις DZ. Η αγωγή με 1 μg /ml εφρίνης-Α1-Ρο (EA1-Fc) χρησίμευσε ως θετικός έλεγχος. Η θεραπεία με 0.2% DMSO είτε για 1 ώρα (αριστερά), ή 5 ώρες (δεξιά) χρησίμευσαν ως μάρτυρες όχημα. (G) Αντιπροσωπευτική οικόπεδο από την ανάλυση συντονισμού επιφανειακών πλασμονίων (SPR) του DZ σύνδεσης προς την ανασυνδυασμένη περιοχή της EphA2 σύνδεσης συνδετήρα. Καμπύλες από κάτω προς τα πάνω αντιπροσωπεύουν συγκεντρώσεις 1.56, 3.13, 6.25, 12.5, 25, 50 μΜ. Αποφασισμένος

τιμή D K εμφανίζεται μέσα σε οικόπεδο. (H) Molecular μοντελοποίηση διάγραμμα εμβαδού επιφανείας που δείχνει αμινοξέα της EphA2 δυνητικά εμπλέκονται στην άμεση αλληλεπίδραση με doxazosin. Τα τέσσερα αμινοξέα του βρόγχου εφρίνης-Α1 φαίνεται στο κόκκινο. Εικόνες δημιουργήθηκαν χρησιμοποιώντας UCSF Χίμαιρα.

Η

Σε αυτή τη μελέτη, έχουμε επιδιώξει να εντοπίσει μικρά μόρια αγωνιστών χρησιμοποιώντας ένα συνδυασμό της δομής με βάση το εικονικό ελέγχου και δοκιμασίες με βάση κύτταρα. Αναφέρουμε την ανακάλυψη και το χαρακτηρισμό της δοξαζοσίνης ως νέου αγωνιστής για EphA2 και EphA4. Επιπλέον, σε ένα νεοσύστατο ορθοτοπικό μοντέλο ξενομοσχεύματος του μεταστατικού καρκίνου του προστάτη, η συστηματική χορήγηση δοξαζοσίνης κατέστειλε σημαντικά άπω μετάσταση και παρατεταμένη συνολική επιβίωση. Για τις γνώσεις μας, αυτό είναι το πρώτο παράδειγμα ενός μικρού μορίου RTK αγωνιστή με αποτελεσματικότητα κατά του καρκίνου

in vitro

και

in vivo

.

Αποτελέσματα

δομή-based εικονική διαλογή και προσδιορισμούς που βασίζονται σε κύτταρα ταυτοποιεί δοξαζοσίνης σαν ένας αγωνιστής ικανός να επάγει καταλυτική ενεργοποίηση της EphA2 κινάσης τυροσίνης υποδοχέα

για να ταυτοποιηθούν μικρά μόρια αγωνιστών για EphA2, πήραμε μια δομή που βασίζεται σε

σε silico

προσέγγιση διαλογής. μοριακή μοντελοποίηση μας της περιοχής δέσμευσης συνδέτη EphA2 (LBD) με βάση την κρυσταλλική δομή του EphB2 LBD [22] έδειξε ότι η δέσμευση τσέπη της EphA2 μπορεί να ενσωματώσει έως 4 αμινοξέα, υποδηλώνοντας ότι θα μπορούσε να φιλοξενήσει μικρά μόρια με μοριακό βάρος (MW) περίπου 500 Dalton [23]. Η έννοια αυτή επιβεβαιώθηκε πρόσφατα με προσδιορισμό της κρυσταλλικής δομής της EphA2 /εφρίνης-Α1 σύμπλοκο [24] (Εικόνα 1Β). Το μέγεθος πέφτει στην κλίμακα από κοινά φάρμακα [25], καθιστώντας EphA2 LBD ένας επιθυμητός στόχος για την ανακάλυψη φαρμάκων. Προς το σκοπό αυτό, ξεκινήσαμε

in silico

διαλογή για αναζήτηση για μικρά μόρια που αλληλεπιδρούν ευνοϊκά με το θύλακα δέσμευσης συνδέτη της EphA2 προέρχεται από μοριακή μοντελοποίηση [23] πριν από την κρυσταλλική δομή έγινε διαθέσιμη. Πολλαπλές διαμορφώσεις για κάθε δομή δημιουργήθηκαν με ΩΜΕΓΑ (OpenEye) και κάθε διάπλασης ήταν αγκυροβολημένο ξεχωριστά χρησιμοποιώντας DOCK [26]. Η αρχική μας διαλογή πάνω από 750.000 ενώσεις που ταυτοποιούνται έναν αριθμό μικρών μορίων που θα μπορούσαν δυνητικά να αλληλεπιδράσουν με το θύλακα σύνδεσης συνδετήρα.

Οι εμπορικά διαθέσιμες ενώσεις top-βαθμολόγησης σαρώθηκαν για την ικανότητά τους να επάγουν την ενεργοποίηση EphA2 σε ΜΟΑ-ΜΒ -231 κύτταρα καρκίνου του μαστού. Επειδή MDA-MB-231 κύτταρα εκφράζουν ενδογενή EphA2 καθώς και άλλους υποδοχείς Eph, συμπεριλαμβανομένων EphA1, υπερεκφράσαμε EphA2 (Σχήμα S1), προκειμένου να ελαχιστοποιηθεί η συνεισφορά από άλλους υποδοχείς Eph στην ανάλυσή μας. Τα κύτταρα διεγέρθηκαν με τις ενώσεις στα 50 μΜ. Σύνολο κυτταρολύματα ανιχνεύθηκαν με μία προηγουμένως περιγραφείσα αντίσωμα που αναγνωρίζει τον ενεργοποιημένους υποδοχείς Eph [27]. Το σχήμα 1C δείχνει τα αποτελέσματα από ένα αντιπροσωπευτικό υποσύνολο των ενώσεων με δομές που δίδονται στο σχήμα S2. Μεταξύ των μικρών μορίων που δοκιμάστηκαν, η ένωση 11, ή δοξαζοσίνη, ενεργοποιείται EphA2 στο μεγαλύτερο βαθμό. Αρχικά αναπτύχθηκε ως ανταγωνιστής για α1-αδρενεργικών υποδοχέων, η δοξαζοσίνη (Σχήμα 1D) είναι ένα FDA εγκεκριμένο φάρμακο (Cardura®) που χρησιμοποιούνται συνήθως κλινικά για τη θεραπεία της υπέρτασης και της καλοήθους υπερπλασίας του προστάτη (ΒΡΗ). Για να επιβεβαιωθεί ειδική ενεργοποίηση EphA2 με doxazosin, αναλύσαμε τα επίπεδα του ενεργοποιημένου υποδοχέα Eph σε κύτταρα MDA-231-Α2 μετά από θεραπεία με πολλαπλές δόσεις δοξαζοσίνης και EphA2 ανοσοκαθίζησης. Δοξαζοσίνη ενεργοποιημένου υποδοχέα EphA2 σε έναν δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. Η ενεργοποίηση ήταν ανιχνεύσιμη σε 25 μΜ και έγινε ισχυρότερη στα 50 μΜ ή υψηλότερη (Σχήμα 1 Ε). Παρόμοια με τα εγγενή συνδέτες, υπήρχε επίσης αποικοδόμηση της EphA2 μετά από έκθεση σε υψηλές δόσεις δοξαζοσίνης, η οποία είναι χαρακτηριστικό των περισσότερων RTKs κατά την ενεργοποίηση που επάγεται με συνδέτη συμπεριλαμβανομένων Ephs [42].

δοξαζοσίνη επάγει καταλυτική ενεργοποίηση της EphA2 ανεξάρτητων των α1-αδρενεργικών υποδοχέων ανταγωνισμό

Επειδή δοξαζοσίνη είναι ένα καλά χαρακτηρισμένο ανταγωνιστής των α1-αδρενεργικών υποδοχέων, ένα ζήτημα αν η EphA2 καταλυτική ενεργοποίηση από το doxazosin μπορεί να οφείλεται σε μια έμμεση επίδραση της α1-αδρενεργικών υποδοχέων ανταγωνισμό της. Για να απαντηθεί αυτό το ερώτημα, μπορούμε προεπεξεργασμένων κύτταρα MDA-231-Α2 με το καλώς χαρακτηρισμένο μη αναστρέψιμο αναστολέα α1-αδρενεργικών υποδοχέων, φαινοξυβενζαμίνη [28], [29], [30], και στη συνέχεια αναλύθηκαν για την επαγωγή της φωσφορυλίωσης EphA2 με doxazosin. κύτταρα MDA-231-Α2 επιλέχθηκαν επειδή έχουν προηγουμένως δειχθεί ότι εκφράζουν τόσο α1 a και α1b-αδρενεργικών υποδοχέων [31]. Δεν παρατηρήθηκε διαφορά στην ενεργοποίηση της EphA2 από ντοξαζοσίνης παρατηρήθηκε μετά φαινοξυβενζαμίνη προεπεξεργασίας έναντι καμία προεπεξεργασία (Σχήμα 1 F), αποδεικνύοντας ότι η δοξαζοσίνη ενεργοποιεί άμεσα ΕρίιΑ2 ανεξάρτητη των α1-αδρενεργικών υποδοχέων ανταγωνισμό της.

Δύο ενώσεις άλλες top-βαθμολόγησης, δοβουταμίνη και λαβηταλόλη (Ενώσεις 9 και 10), λειτουργεί ως αγωνιστής β1-αδρενεργικών υποδοχέων και έναν ανταγωνιστή α /β-αδρενεργικών υποδοχέων, αντίστοιχα. Η θεραπεία με δοβουταμίνη απέτυχε να ενεργοποιήσει EphA2 μέχρι 500 μΜ, ενώ λαβεταλόλη απέτυχε να ενεργοποιήσει ακόμη και στα 500 μΜ, επιβεβαιώνοντας ότι δοξαζοσίνη είναι πράγματι πιο ισχυρή και ότι η ενεργοποίηση δεν είναι ένα άμεσο αποτέλεσμα του γενικού αδρενοϋποδοχέα δέσμευσης (Σχήμα S3A).

δοξαζοσίνη αλληλεπιδρά άμεσα με την EphA2 LBD

Επειδή doxazosin ανακαλύφθηκε μέσω εικονικής διαλογής στόχευση του θύλακα δέσμευσης συνδέτη της EphA2, αναμενόταν να δεσμεύονται άμεσα με τον τομέα. Για να ελεγχθεί αυτό, η σύνδεση του doxazosin στο περιγράφηκε προηγουμένως ανασυνδυασμένο LBD της EphA2 [24] αναλύθηκε χρησιμοποιώντας επιφανειακού συντονισμού ιονισμού (SPR). Βρήκαμε ότι η δοξαζοσίνη συνδέεται άμεσα με την EphA2 LBD με σταθερά διάστασης (Κ

D) του 47,6 μΜ (Σχήμα 1G). Η σύνδεση των δύο δοβουταμίνης και λαβεταλόλη ελέγχθηκε επίσης και φαίνεται να συμβαίνουν με πολύ χαμηλότερη συγγένεια από δοξαζοσίνης (K

D = 1,5 mm και 0,44 mM, αντιστοίχως) (Σχήμα S3b). Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα αποτελέσματα καταδεικνύουν ότι η δοξαζοσίνη συνδέεται άμεσα με την EphA2 LBD.

Με την πρόσφατη προσδιορισμό της κρυσταλλικής δομής με ακτίνες Χ της EphA2-LBD σε σύμπλοκο με εφρίνης-Α1 [24], μπορούμε να συγκρίνεται με το μοντέλο ομολογίας της EphA2 [23] που χρησιμοποιήθηκε στην αρχική διαλογή. Παρά ορισμένες αναμενόμενες διαφορές, η θέση σύνδεσης EphA2 του μοντέλου ομολογίας ήταν συνολικά παρόμοιο με εκείνο της κρυσταλλικής δομής (Σχήμα S4), υποστηρίζοντας γενική εγκυρότητα του μοριακού μοντέλου για την εικονική εξέταση. Στη συνέχεια, επαναλαμβάνεται η βάση σύνδεσης του doxazosin στη θέση σύνδεσης συνδετήρα από την EphA2 κρυσταλλική δομή. Το Σχήμα 1 δείχνει doxazosin αγκυροβολημένο στη δομή κρυστάλλου EphA2, σε ένα προσανατολισμό παρόμοια με εκείνη στη δομή NMR της EphA2-δοξαζοσίνη σύμπλοκο (παρακάτω). Ένας νέος γύρος της εικονικής διαλογής διεξήχθη επίσης χρησιμοποιώντας την κρυσταλλική δομή της EphA2 LBD. Ωστόσο, από τα 30 νέα ενώσεις top-βαθμολόγησης δοκιμαστεί, δεν βρήκαμε αγωνιστές που εμφανίζεται καλύτερα τις δραστηριότητες από ντοξαζοσίνης (δεν φαίνεται).

δοξαζοσίνη ενεργοποιεί τον υποδοχέα της EphA2 σε διαφορετικούς τύπους κυττάρων

Για να προσδιορίσετε αν η δραστηριότητα συναγωνιστής EphA2 δοξαζοσίνης είναι κυττάρου-πλαίσιο ειδικών, αξιολογήσαμε τα αποτελέσματα της δοξαζοσίνης σε πρόσθετους τύπους κυττάρων. Αρχικά χρησιμοποιήθηκαν κύτταρα ΗΕΚ 293 που υπερεκφράζουν την EphA2 (ΗΕΚ 293-Α2) που περιγράφηκε προηγουμένως [9]. Τα κύτταρα ΗΕΚ 293 εκφράζουν χαμηλά επίπεδα ενδογενών υποδοχέων EphA [12]? υπερέκφραση της EphA2 στα κύτταρα αυτά επιτρέπει περαιτέρω απόδειξη της επιλεκτικής ενεργοποιήσεως του εξωγενούς κινάσης. Παρόμοια με κύτταρα MDA-231-Α2, σημαντική ενεργοποίηση της EphA2 παρατηρήθηκε σε κύτταρα ΗΕΚ 293-Α2 κατά την κατεργασία με doxazosin ξεκινούν από 25 μΜ (Σχήμα 2Α). Στη συνέχεια εξετάσαμε κύτταρα PC-3 που εκφράζουν υψηλά επίπεδα ενδογενούς υποδοχέα EphA2 [32]. Δοξαζοσίνη ενεργοποιείται επίσης ενδογενείς EphA2 σε κύτταρα PC-3, αν και δεν ήταν εμφανές μέχρι 50 μΜ. Οι διαφορετικές κινητικές μεταξύ αυτών των τύπων κυττάρων μπορεί να οφείλεται, εν μέρει, με τα διαφορετικά επίπεδα έκφρασης της EphA2 σε τρεις διαφορετικές κυτταρικές γραμμές ή την ειδική κυτταρική έννοια. Επιπλέον, η ενεργοποίηση EphA2 σε PC-3 κύτταρα, ενισχύει περαιτέρω το μηχανισμό α1-αδρενεργικών υποδοχέων-ανεξάρτητη, καθώς αυτά τα κύτταρα στερούνται ανιχνεύσιμη έκφραση α1 a-αδρενεργικών υποδοχέων [33].

(Α) ανοσοστυπώματα για pEphA /Β σε λύματα από PC-3 και ΗΕΚ 293-Α2 (293-Α2) κυτταρικές σειρές αγωγή για 30 λεπτά με υποδεικνυόμενες δόσεις δοξαζοσίνης (DZ). (Β) Τα ανοσοστυπώματα για pEphA /Β σε λύματα από MDA-231-Α2 (231-Α2) και κυτταρικές σειρές 293-Α2 επεξεργασία με 50 μΜ DZ σε 0.2% DMSO για υποδεικνυόμενους χρόνους. (C) Δοξαζοσίνη ενεργοποιεί επιλεκτικά την EphA2 και EphA4 υποδοχείς. Ανοσοστυπώματα για pEphA /Β σε λύματα από κυτταρικές σειρές ΗΕΚ 293 που εκφράζουν υποδοχείς Eph δίδεται μετά τη θεραπεία με υποδεικνυόμενες δόσεις δοξαζοσίνης (DZ) για 60 λεπτά. Η αγωγή με 1 μg /ml προσδέματος εφρίνης-Α1-Ρο (EA1-Fc) για 10 λεπτά (EphA2) και 30 λεπτά (Vector, EphA1, EphA4), καθώς και την επεξεργασία 30 λεπτό με εφρίνης-A5-Fc (ΕΑ5-Fc ) (EphA3) και εφρίνης-Β1-Ρο (EB1-Fc) (EphB3) χρησίμευσαν ως θετικοί έλεγχοι. Blotting για συνολική Eph κινάσες χρησίμευσαν ως μάρτυρες φόρτωσης.

Η

Αξιολογήσαμε την επόμενη τη χρονική πορεία της ενεργοποιήσεως στους δύο MDA-231-Α2 και ΗΕΚ 293-A2 κυττάρων κατά την κατεργασία με μία μόνο δόση των 50 μΜ δοξαζοσίνης. Σημαντική ενεργοποίηση EphA2 μπορούσε να ανιχνευθεί ως νωρίς όσο 5 λεπτά μετά την αγωγή στην κυτταρική σειρά MDA-231-Α2, η οποία κορυφώθηκε περίπου 30 λεπτά (Σχήμα 2Β). ενεργοποίηση της EphA2, επίσης, έγινε εμφανής μετά από 10 λεπτά θεραπείας με δοξαζοσίνη σε ΗΕΚ 293-Α2 κύτταρα, αν και ακολούθησε μια πιο αργή κινητική.

δοξαζοσίνη ενεργοποιεί επιλεκτικά την EphA2 και EphA4 κινάσες

Υπάρχουν 14 υποδοχείς Εφεσ θηλαστικών ότι η ομολογία μερίδιο σημαντική ακολουθία [34]. Αυτό μας οδήγησε να διερευνήσει κατά πόσον doxazosin μπορεί επίσης να ενεργοποιήσει άλλους υποδοχείς Εφεσ. Για το σκοπό αυτό, ΗΕΚ 293 κυτταρικές σειρές που υπερεκφράζουν EphA1, EphA2, EphA3, EphA4, και κινάσες EphB3 χρησιμοποιήθηκαν. Βρήκαμε ότι η δοξαζοσίνη ενεργοποιούνται τόσο EphA2 και EphA4 κινασών ακολουθώντας μια παρόμοια σχέση δόσης-απόκρισης (Σχήμα 2C). Ωστόσο, καμία ενεργοποίηση EphA1 παρατηρήθηκε στις ίδιες συγκεντρώσεις, και την ενεργοποίηση των EphA3 ήταν χαμηλή σε σύγκριση με εκείνη της EphA2 και EphA4. EphB3 έχει υψηλότερα βασικά επίπεδα της ενεργοποίησης (Σχήμα 2C), το οποίο δεν ενεργοποιήθηκε περαιτέρω. Στην πραγματικότητα, υπήρξε μια αξιοσημείωτη μείωση στην ενεργοποίηση EphB3 κατά την έκθεση doxazosin. Υπάρχει επίσης ένα μέτριο επίπεδο έκφρασης ενδογενούς EphB4 σε ΗΕΚ 293 κύτταρα? η έλλειψη των ενεργοποιημένων σημάτων κινάσης Eph μετά την έκθεση δοξαζοσίνης σε κύτταρα ελέγχου φορέα έδειξαν ότι η ενδογενής EphB4 δεν ενεργοποιήθηκε είτε (Σχήμα 2C). Αυτά τα δεδομένα δείχνουν ότι η δοξαζοσίνη ενεργοποιεί επιλεκτικά την EphA2 και EphA4 μεταξύ των διαφόρων υποδοχέων Εφεσ δοκιμαστεί.

δομή NMR αποκαλύπτει εκτεταμένη άμεσες αλληλεπιδράσεις ντοξαζοσίνης με EphA4

Η διπλή επιλεκτικότητα των ντοξαζοσίνης για EphA2 και EphA4 ανοίξει η δυνατότητα να ερευνήσει την δομική βάση των αλληλεπιδράσεων χρησιμοποιώντας φασματοσκοπία NMR. Επειδή η EphA2 LBD εκφράζεται σε

Ε. coli

ήταν εντελώς αδιάλυτα και δεν μπορούσε να αναδιπλωθεί μετά από επανειλημμένες προσπάθειες, που επικεντρώθηκε στις αλληλεπιδράσεις του EphA4 LBD με doxazosin. Πρώτον, αξιολογείται δέσμευση σε doxazosin με ισοθερμική θερμιδομετρία EphA4. Η σταθερά διαστάσεως (Κ

D) υπολογίστηκε ότι είναι 12,4 μΜ (Σχήμα S5A), παρόμοια με εκείνη της EphA2 αλληλεπιδράσεων /doxazosin μετράται με SPR (Σχήμα 1G). Far-UV κυκλικού διχρωϊσμού έδειξαν ότι η δέσμευση doxazosin δεν προκαλεί σημαντική δευτερογενή αλλαγή δομής του EphA4 LBD (Σχήμα S5B).

Για να χαρακτηρίζουν το περιβάλλον δεσμευτική, έχουμε αποκτήσει μια σειρά

1 Η-

15N ετεροπυρηνικών ενιαία κβαντική συνοχή (HSQC) φάσματα του EphA4 LBD μετά την προσθήκη doxazosin σε διαφορετικές μοριακές αναλογίες. Μια σταδιακή προσθήκη δοξαζοσίνης κατέληξε σε προοδευτικό μετατοπίσεις ενός υποσυνόλου HSQC κορυφές (Σχήμα 3Α), σύμφωνο με την αλληλεπίδραση σχετικά χαμηλή συγγένεια. Οι περισσότερες από αυτές τις κορυφές HSQC δεν παρουσίασαν περαιτέρω μεταβολές σε μοριακές αναλογίες πέρα ​​από 1:05. Ως εκ τούτου, ο δείκτης χημική μετατόπιση (CSI) σε αυτήν την αναλογία υπολογίστηκε (Σχήμα 3Β). Μετά την σύνδεση με doxazosin, πολλαπλά συμπλέγματα των υπολειμμάτων υπέστη δραματικές αλλαγές. Ενώ μερικές από τις μετατοπίσεις συμπίπτουν με τα προηγουμένως περιγραφέντα C1 ανταγωνιστές EphA4 [35], πολλές από τις μετατοπίσεις ήταν μοναδική για δοξαζοσίνης (Σχήμα 3Β). Οι πρόσθετες βάρδιες κατανεμημένη σε όλη την κυρτή επιφάνεια του καναλιού ephrin δέσμευσης, συμπεριλαμβανομένων των Val72-Cys73-Asn74 στο E-σκέλος, Thr104-Leu105-Arg106 στο G-σκέλος, Leu166 στο K-κλώνο και Ile192-Ala193 στο M-κλώνου . Η μεγαλύτερη επιφάνεια επαφής μπορεί να ευθύνεται για την υψηλότερη συγγένεια ντοξαζοσίνης για EphA4 από εκείνη του C1.

(Α)

1 Η-

15N NMR HSQC φάσματα της EphA4 LBD απουσία (μπλε) και υπό την παρουσία (κόκκινο) του δοξαζοσίνης (DZ) σε γραμμομοριακή αναλογία 1:05 (EphA4:DZ). Πολλά υπόλοιπα που βρίσκονται πάνω από την κυρτή επιφάνεια του EphA4 κανάλι εφρίνης δέσμευσης επισημασμένο. δείκτης (Β) Υπόλειμμα-ειδική χημική μετατόπιση (CSI) του EphA4 LBD παρουσία δοξαζοσίνης σε γραμμομοριακή αναλογία 1:05 (EphA4:DZ). Τα σημαντικά μετατοπισμένη υπολείμματα από κοινού με C1 χρώμα σε φωτεινό καφέ, ενώ τα υπολείμματα αισθητά μόνο μέσω σύνδεσης είναι στο κόκκινο δοξαζοσίνης. (Γ) Το μοντέλο σύνδεσης του EphA4-δοξαζοσίνη συγκρότημα στην κορδέλα. Περιοχές σύνδεσης ταυτόσημες με αυτές για το C1-πρόσδεσης χρωματισμένο σε καφέ, ενώ εκείνες για την μοναδική doxazosin δεσμευτικός κόκκινο. G, Κ, Μ και Ε χρησιμοποιούνται για να δωρίσουν β-κλώνους της κυρτής επιφάνειας του EphA4 /κανάλι εφρίνης-δεσμευτική. υπολειμμάτων (D) EphA4 έχει άμεσες επαφές με doxazosin. Υπολείμματα για την D-Ε και J-K βρόχοι είναι σε καφέ, εκείνοι στην κυρτή επιφάνεια σε βιολετί, και Arg106 σε κυανό. Πράσινο διακεκομμένες γραμμές δείχνουν δεσμούς υδρογόνου μεταξύ ντοξαζοσίνης και EphA4 υπολείμματα. (Ε) – (ΣΤ) Το ίδιο μοντέλο σύνδεσης με το ηλεκτροστατικό δυναμικό της EphA4 LBD εμφανίζονται. (G) EphA4 LBD σε ελεύθερες και doxazosin δεσμεύεται κράτη εμφανίζουν διαφορετικό τετράγωνο παράμετρος γενικευμένη προκειμένου S

2 (Σχήμα S6a). Μπλε: S

2 διαφορά ≤-0,01? κόκκινο: S

2 διαφορά ≥0.01? καφέ: καμία σημαντική αλλαγή ή S

2 τιμές δεν προσδιορίζονται. (H) Διαμορφωτική ανταλλαγές EphA4 σε ελεύθερο (αριστερό πάνελ) και doxazosin δεσμεύεται κράτη (δεξιά πλευρά). Υπολείμματα με R

ex & gt? Οι 5 (Σχήμα S6B) εμφανίζεται σε μπάλες και χρωματισμένο με κόκκινο χρώμα. (Ι) Ένα μοντέλο σύνδεσης του συμπλόκου EphA2-doxazosin. Τα υπολείμματα επαφής στη Δ-Ε και J-K βρόχους επισημανθεί καφέ, στην κυρτή επιφάνεια σε κυανό, και Arg103 σε βιολετί. Το ιώδες παύλα χρησιμοποιείται για να δείξει τους δεσμούς υδρογόνου μεταξύ ντοξαζοσίνης και EphA2 υπολείμματα.

Η

Για να απεικονίσει το EphA4-ντοξαζοσίνης διεπαφή αλληλεπίδρασης, κατασκευάσαμε τα μοντέλα της EphA4-doxazosin συγκρότημα με το λογισμικό τον μπακαλιάρο σε συνδυασμό με ΚΝΣ, όπως περιγράφηκε προηγουμένως για την EphA4-C1 σύμπλοκο [35]. Οι πέντε χαμηλότερη ενεργειακή μοντέλα φαίνεται στα σχήματα S5c και S5D. Δοξαζοσίνη έχει εκτεταμένες αλληλεπιδράσεις με τα υπολείμματα EphA4 για το D-E και J-K βρόχων, καθώς και τις επαφές με τα κυρτά β-κλώνους που αποτελούνται από Val72-Cys73-Asn74, Thr104-Leu105-Arg106 και Ile192-Ala193 (Σχήμα 3C, ΡΕ). Σχήμα 3Ε υπογραμμίζει τις αλληλεπιδράσεις μεταξύ των δύο ομάδων ντοξαζοσίνης μεθοξυ και EphA4 υδρόφοβα κατάλοιπα Met60 και Ile159. Είναι ενδιαφέρον, EphA4 έχει ένα επιπλέον δεσμευτική τσέπη χαρακτηρίζεται από ένα θετικά φορτισμένο Arg106 που περιβάλλει τα ηλεκτραρνητικά άτομα οξυγόνου σε βενζοδιοξιν και καρβονυλ ομάδες επί δοξαζοσίνης (Σχήμα 3D, E, F). Μαζί τα δομικές μελέτες αποδεικνύουν τις άμεσες αλληλεπιδράσεις μεταξύ EphA4 και doxazosin, και το KD είναι σε παρόμοιο εύρος συγκέντρωσης που απαιτείται για την κυτταρική ενεργοποίηση του υποδοχέα (Εικόνα 2).

Η σύνδεση με doxazosin σταθεροποιεί τη ραχοκοκαλιά της EphA4 LBD

Πρόσφατα στοιχεία δείχνουν ότι η δυναμική πρωτεΐνη πέρα ​​από την στατική δομή διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο σε διάφορες βιολογικές διεργασίες, συμπεριλαμβανομένης της μετάδοσης σήματος [36], [37], [38], [39]. Να αποκτήσουν διαρθρωτική εικόνα για το πώς δοξαζοσίνη μπορεί να λειτουργεί ως συναγωνιστής EphA2, χαρακτηρίσαμε τη δυναμική ραχοκοκαλιά της EphA4 LBD σε ελεύθερη κατάσταση vs. ότι σε συγκρότημα με δοξαζοσίνης (βλέπε Μέθοδοι S1). Εν συντομία, μετρήσαμε τη ραχοκοκαλιά

15Ν χαλάρωση Τ1 δεδομένων, Τ2 και ετεροπυρηνικής ΝΟΕ αξίες, τα οποία στη συνέχεια αναλύθηκαν με «Model-free» formulism [40], [41], [42]. Η ανάλυση που δημιουργείται «τετράγωνο γενικευμένες παραμέτρους τάξης», S

2, η οποία αντικατοπτρίζει την ακαμψία ραχοκοκαλιά της κλίμακας χρόνου ps-ns. Σχήμα S6a καταδεικνύουν αυξημένη S

2 τιμές για ένα μεγαλύτερο αριθμό υπολειμμάτων κατά τη δέσμευση EphA4 να δοξαζοσίνης σε σύγκριση με το ελεύθερο EphA4. Πολλά από τα υπολείμματα με σημαντικά υψηλότερο S

2 τιμές χαρτογραφήθηκαν με τη σπονδυλική στήλη του EphA4 (Εικόνα 3G). Η παρατήρηση αυτή δείχνει ότι η δοξαζοσίνη σταθεροποιηθεί η σπονδυλική στήλη της EphA4 LBD στην κλίμακα χρόνου ps-ns.

Περαιτέρω ενδείξεις που υποστηρίζουν τη σταθεροποίηση της EphA4 LBD από ντοξαζοσίνης προήλθε από το ποσοστό χημικής ανταλλαγής, R

ex, ότι αντανακλά τις δομικές αλλαγές στο χρόνο κλίμακας μs-ms μεμονωμένων υπολειμμάτων. Όπως φαίνεται στο Σχήμα S6B, πολλά υπολείμματα σε όλη την EphA4 LBD στην ελεύθερη κατάσταση εμφάνισαν σημαντική R

ex τιμές, υποδεικνύοντας ότι υφίστανται εκτεταμένες μεταβολές διαμόρφωσης. Αντίθετα, η σύνδεση με doxazosin μείωσε σημαντικά R

ex τιμές για τις περισσότερες κατάλοιπα, εκτός από Asn74-Val75 και Thr121. Οι αλλαγές στον τομέα της Ε

ex τιμές στη συνέχεια αντιστοιχίζονται πίσω στη δομή EphA4 (Σχήμα 3Η), αποδεικνύοντας δραματικές μειώσεις στις διαμορφωτικές αλλαγές στην δοξαζοσίνη-δεσμεύεται έναντι ελεύθερο κράτος. Συνολικά, δομική ανάλυση και πρωτεΐνες δυναμική μας μοντέλα δείχνουν ότι η δοξαζοσίνη προκαλεί σημαντική σταθεροποίηση της EphA4 LBD, η οποία μπορεί να συμβάλει στις αγωνιστικές λειτουργίες της δοξαζοσίνης.

Ένα νέο μοντέλο για το συγκρότημα EphA2-ντοξαζοσίνης προβλέπει επιπλέον αγωνιστές

Στη συνέχεια, διαμορφώνεται EphA2-ντοξαζοσίνης αλληλεπιδράσεις ενσωμάτωση των περιορισμών από την EphA4-δοξαζοσίνη δομή. Ακολουθία και διαρθρωτικές ευθυγραμμίσεις αποκάλυψαν υπολείμματα συντηρημένα μεταξύ ΕρίιΑ2 και EphA4 LBDs που έδειξε σημαντικές αλλαγές κορυφής στο EphA4 κατά την σύνδεση με doxazosin. Αυτά αντιστοιχούν σε Ile58, Met59, Val69, Cys70, Asn71, Thr101, Val102, Arg103, Arg159, Leu163, Val189 και Ala190 της EphA2. Εικόνα 3I απεικονίζει τη δομή του συμπλόκου EphA2-ντοξαζοσίνης χτισμένο με το λογισμικό τον μπακαλιάρο. Παρόμοια με το σύμπλοκο EphA4-doxazosin, οι μεθοξυ ομάδες δοξαζοσίνης αλληλεπιδρούν με την υδρόφοβη επιφάνεια που σχηματίζεται από Ile58, Met59 και Ala158, ενώ Arg103 της EphA2 αλληλεπιδρά με την ομάδα καρβονυλίου και τα άτομα οξυγόνου του τμήματος βενζοδιοξιν δοξαζοσίνης (Σχήμα 3θ). Επιπλέον, ο δακτύλιος βενζυλίου του βενζοδιοξιν κάθεται σε ένα υδρόφοβο κοιλότητα της EphA2 αποτελείται κυρίως από Cys70, Thr101 και πλευρικές αλυσίδες Ala190 (Σχήμα 3θ). Αξίζει να σημειωθεί ότι, στο προσδιορίστηκε πρόσφατα ακτίνων-Χ συν-κρυσταλλική δομή της EphA2-εφρίνης-Α1 σύμπλοκο [24], εφρίνης-A1 αλληλεπιδρά επίσης με την υδρόφοβη τσέπη και Arg103 του EphA2 (Σχήμα 1Β), προτείνοντας ότι η δοξαζοσίνη μπορεί ανακεφαλαίωση δύο διακριτές τρόπων αλληλεπιδράσεις υποδοχέα από τον φυσικό συνδέτη.

δοξαζοσίνη ενεργοποιεί EphA2-εξαρτώμενη αναστολή της ERK και Akt κινάσης δραστηριότητες

η ενεργοποίηση του υποδοχέα από το πρόσδεμα EphA2 εφρίνης-A1 αναστέλλει τόσο ERK1 /2 και Akt κινάσης δραστηριότητες στα περισσότερα φυσιολογικά κύτταρα και ένα υποσύνολο των καρκινικών κυττάρων [9], [12], [43]. Έχει αποδείξει ότι η δοξαζοσίνη μπορούσε να μιμηθεί εφρίνης-A1 στη σύνδεση προς και ενεργοποίηση του υποδοχέα EphA2, ζητήσαμε εάν η θεραπεία θα μπορούσε να αναστείλει doxazosin ERK1 /2 και ενεργοποίηση Akt επίσης. Εμείς δοκιμάστηκε για πρώτη φορά αυτή με τη χρήση των κυττάρων γλοιώματος Α172 τροποποιημένα ώστε να υπερεκφράζουν τον υποδοχέα EphA2 (Α172-Α2). Σε αντίθεση με MDA-MB-231 κύτταρα τα οποία έχουν ενεργοποιημένο Ras και είναι ανθεκτικά σε εφρίνης-Α1-Ρο επαγόμενη αναστολή της ERK1 /2, κύτταρα Α172 φιλοξενούν άγριου Ras τύπου και επιδεικνύουν υψηλή βασικά επίπεδα ενεργοποίηση του ERK1 /2 και της Akt, οι οποίες ευαίσθητα σε εφρίνης Α1-επαγόμενη αναστολή (Σχήμα 4Α, μακριά καταπολεμήσει λωρίδα). Παρόμοια με άλλους τύπους κυττάρων που δοκιμάστηκαν (Σχήματα 1 και 2), η δοξαζοσίνη επίσης ενεργοποιημένα EphA2 σε κύτταρα γλοιώματος Α172 με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο ξεκινώντας περίπου 25 μΜ (Σχήμα 4Α). Επιπλέον, η θεραπεία με 50 μΜ και 100 μΜ doxazosin ήταν αρκετή για να προκαλέσει σημαντική αναστολή της ενεργοποίησης Akt και ERK1 /2. Οι επιδράσεις επί της αναστολής της Akt συνέπεσε με την ενεργοποίηση EphA2 σε αυτά τα κύτταρα, και ήταν απαραίτητη μια υψηλότερη συγκέντρωση για ERK1 /2 αναστολής (Σχήμα 4Α). Παρόμοια με κύτταρα MDA-231-Α2 (σχήμα 1 Ε), παρατηρήθηκε αποικοδόμηση της EphA2 μετά την αγωγή δοξαζοσίνης σε κύτταρα Α172.

(Α) Ανοσοστύπωμα προϊόντων λύσης από κύτταρα Α172-A2 σε επεξεργασία με υποδεικνυόμενες δόσεις της δοξαζοσίνης (DZ ) σε 0.2% DMSO για 90 λεπτά. Η αγωγή με 1 μg /ml εφρίνης-Α1-Ρο συνδέτη επί 10 λεπτά χρησίμευσε ως θετικός έλεγχος. Κυτταρολύματα ανοσοκατακρημνίστηκαν με εφρίνης-Α1-Ρο (IP: EA1-Fc) όπως δίδεται στο Methods, και ανιχνεύθηκαν για pEphA /Β και συνολικό EphA2. Σύνολο κυτταρολύματα ανιχνεύθηκαν για φωσφορυλιωμένες μορφές των ERK1 /2 και της Akt, καθώς και το σύνολο ERK1 /2 και της Akt. (Β) Ανοσοστύπωμα συνολικά κυτταρολύματα από κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με υποδεικνυόμενες δόσεις δοξαζοσίνης (DZ) σε 0.2% DMSO για 90 λεπτά LK133A-Vec και LK133A-A2. Η αγωγή με 1 μg /ml εφρίνης-Α1-Ρο επί 10 λεπτά χρησίμευσε ως θετικός έλεγχος. Τα λύματα ανιχνεύθηκαν για φωσφορυλιωμένες μορφές EphA /B, Akt, και ERK1 /2, καθώς και της συνολικής EphA2, Akt, και ERK1 /2.

Η

Ενώ τα παραπάνω αποτελέσματα έδειξαν ότι η θεραπεία θα μπορούσε να καταστείλει doxazosin Akt και ενεργοποίηση ERK, ένα βασικό ερώτημα παραμένει κατά πόσο αυτό το αποτέλεσμα προκύπτει συγκεκριμένα από την ενεργοποίηση της EphA2. Για να απαντηθεί αυτό το ερώτημα, θα χρησιμοποιηθεί ένα απαθανάτισε ήπατος επιθηλιακά κυτταρική γραμμή, LK133A, απομονωμένη από ένα ηπάτωμα που προκαλείται από DEN σε ποντίκια EphA2 νοκ-άουτ. ρετροϊικού φορέα χρησιμοποιήθηκε για να αποκατασταθεί η έκφραση της EphA2 σε αυτά τα κύτταρα (LK133A-Α2), και τα κύτταρα μεταδιεγείρονται με ένα άδειο φορέα χρησιμοποιήθηκαν ως μάρτυρες (LK133A-Vec). Το Σχήμα 4Β δείχνει ότι, απουσία της EphA2, ούτε δοξαζοσίνη ούτε εφρίνης-Α1-Ρο ήταν ικανή να αναστείλει ERK και Akt δραστηριότητες σε LK133A-Vec κύτταρα (Σχήμα 4Β). Στην πραγματικότητα, υπήρξε μια αξιοσημείωτη αύξηση της ERK και Akt ενεργοποίηση με doxazosin. Επαναφορά η έκφραση της EphA2 αποκατασταθεί ERK και Akt αναστολή όχι μόνο από εφρίνης-Α1-Ρο, αλλά και από δοξαζοσίνη, η οποία συνοδεύτηκε από την ενεργοποίηση EphA2.