Αφηρημένο

Εκκρίνεται microRNAs (miRNAs) που περικλείεται μέσα σε εξωκυττάριο κυστίδια (ΕΕΥ) να διαδραματίσει κεντρικό ρόλο στην ενδοκυτταρική επικοινωνία με τη ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης των κυττάρων του παραλήπτη και επηρεάζουν την λειτουργία των κυττάρων-στόχων. Εδώ, αναφέρουμε την απομόνωση τρεις διακριτούς υποτύπους EV από το ανθρώπινο καρκίνωμα του παχέος εντέρου LIM1863 κυτταρική σειρά – ρίξει μικροκυστίδια (sMVs) και δύο πληθυσμούς εξωσωμάτων (ανοσοσυγγένειας απομονωμένες Α33-εξωσώματα και EpCAM-εξωσώματα). Βαθιά αλληλουχίας των miRNA βιβλιοθηκών που παρασκευάζονται από μητρικά κύτταρα LIM1863 /προέρχεται EV υπότυπο RNA απέδωσε 254 ταυτοποιήσεις miRNA, εκ των οποίων 63 είναι επιλεκτικά εμπλουτισμένο σε EVs – miR-19a /b-3ρ, miR-378Α /c /d, και miR-577 και τα μέλη των οικογενειών ας-7 και miR-8 είναι το πιο σημαντικό. Ας-7α-3ρ *, αφήστε-7f-1-3p *, miR-451Α, miR-574-5p *, miR-4454 και miR-7641 είναι κοινά σε όλους τους υποτύπους EV, και 6 miRNAs (miR-320a /b /c /d, miR-221-3p, και miR-200c-3ρ) διακρίνουν εξωσώματα LIM1863 από sMVs? miR-98-5p εκλεκτικά εκπροσωπούνται μόνο σε sMVs. Αξιοσημείωτα, Α33-Exos περιείχε το μεγαλύτερο αριθμό (32) του αποκλειστικά εμπλουτισμένου miRNAs? 14 από αυτά τα miRNAs δεν έχουν αναφερθεί στο πλαίσιο της CRC ιστού /Βιορευστομηχανική αναλύσεις και απαιτεί περαιτέρω εξέταση ως πιθανοί διαγνωστικοί δείκτες της CRC. Παραδόξως, miRNA επιβατών σκέλη (αστέρι miRNAs) για miR-3613-3p *, -362-3p *, -625-3p *, -6842-3p * ήταν η κυρίαρχη πτυχή στην Α33-Exos, το αντίθετο με αυτό που παρατηρήθηκε στη γονική κύτταρα. Το εύρημα αυτό υποδηλώνει miRNA βιογένεση μπορεί να διασυνδέονται με την επεξεργασία ενδοσωμική /exosomal

Παράθεση:. Ji Η Chen Μ, Greening DW, Ο W, Rai Α, Zhang W, et al. (2014) Βαθιά αλληλουχίας του RNA από τρεις διαφορετικές Εξωκυττάρια Κύστη (EV) υπότυποι Κυκλοφόρησε από την ανθρώπινη LIM1863 γραμμής του καρκίνου του παχέος εντέρου κυττάρων αποκαλύπτει Ξεχωριστά Mirna-Εμπλουτισμός υπογραφές. PLoS ONE 9 (10): e110314. doi: 10.1371 /journal.pone.0110314

Επιμέλεια: Clark Chen, Πανεπιστήμιο της Καλιφόρνια, Σαν Ντιέγκο, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: May 29, 2014? Αποδεκτές: 11, Σεπτεμβρίου, 2014? Δημοσιεύθηκε: 17 του Οκτώβρη του 2014

Copyright: © 2014 Ji et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Η συγγραφείς επιβεβαιώνουν ότι όλα τα δεδομένα που διέπουν τα ευρήματα είναι πλήρως διαθέσιμα χωρίς περιορισμούς. Τα αρχεία FASTQ και για τις τέσσερις μικρές βιβλιοθήκες RNA (κύτταρα LIM1863, και προέρχεται sMVs, Α33-Exos και EpCAM-Exos) έχουν υποβληθεί στην Ακολουθία Διαβάστε Αρχείο (SRA) της NCBI με αριθμό ένταξης SRA106214

Χρηματοδοτήσεων.: Το ερευνητικό έργο χρηματοδοτήθηκε από το Εθνικό Σύστημα Υγείας και Ιατρικής Έρευνας του Συμβουλίου της Αυστραλίας προγράμματος (NHMRC) επιδότηση # 487922. MC και AR υποστηρίζονται από μια υποτροφία La Trobe University Research. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

εξωκυτταρική κυστίδια (EV) είναι νανο-μεμβρανώδη σωματίδια που κυμαίνονται από 30-2,000 nm σε διάμετρο που απελευθερώνονται από περισσότερους τύπους κυττάρων εντός του εξωκυτταρικού περιβάλλοντος [1]. Οι ΕΕΥ πιστεύεται ότι αποτελείται από τρεις κύριες κατηγορίες ανάλογα με την προέλευσή τους – εξωσώματα (Exos, 50-150 nm), υπόστεγο μικροκυστίδια (sMVs, 400-1,500 nm), και αποπτωτικών σωμάτων (400-2,500 nm). Παρά το γεγονός ότι υπάρχει μια συνεχής πολεμική μεταξύ των ερευνητών σχετικά με την ονοματολογία, βιογένεση, βιοχημικές και λειτουργικές ιδιότητες των υποτύπων EV, τα διαθέσιμα στοιχεία δείχνουν ότι εξωσώματα προέρχονται από το εσωτερικό εκβλάστηση των διαμερισμάτων ενδοσωματιακής ονομάζεται πολυκυψελιδωτών φορείς (MVBs) και απελευθερώνονται από το κύτταρο στο μικροπεριβάλλον ακόλουθη σύντηξη MVBs με τη μεμβράνη του πλάσματος, sMVs (ectosomes, μικροκυστίδια, μικροσωματίδια, oncosomes) με προς τα έξω εκβλάστηση /διόγκωση από την μεμβράνη του πλάσματος, και αποπτωτικά σώματα μέσω της διαδικασίας της απόπτωσης /συρρίκνωση κυττάρου /πυρηνική κατάτμηση [2]. Και στα δύο λειτουργικά και βιοχημικό επίπεδο, εξωσώματα έχουν την πιο ευρέως μελετηθεί των ΕΕΥ. έχουν Εξωσώματα δειχθεί ότι περιέχουν διαφορετικές πρωτεΐνες (συμπεριλαμβανομένων ογκοπρωτεΐνες, πρωτεΐνες καταστολής όγκου, μετεγγραφικών ρυθμιστών, παράγοντες ματίσματος [1], [3], [4], [5], [6], λιπίδια [7], και RNAs (mRNAs , microRNAs (miRNAs) και άλλες μη-κωδικοποίησης RNAs) [8] – exosomal πληροφορίες μοριακό φορτίο μπορεί να προσεγγιστεί από δημόσια προσβάσιμες βάσεις δεδομένων, όπως ExoCarta [9] και EVPedia [10] Αν και καιρό θεωρηθεί ως κυτταρικά υπολείμματα, πρόσφατες μελέτες εξωσωμάτων. αποδείξουν ότι έχουν σημαντικές βιολογικές ρόλους στο ανοσοποιητικό, το καρδιαγγειακό, και το νευρικό σύστημα και στην παθογένεση ασθενειών όπως ο καρκίνος [11], [12], [13]. Κατά την τελευταία δεκαετία έχει διαπιστωθεί ότι τα ΗΟ διαδραματίζουν κεντρικό ρόλο στην εξέλιξη του καρκίνου και προ-μεταστατικό εξειδικευμένες αστάρωμα για εμφύτευση όγκου [14], [15], [16], [17].

είναι καλά αναγνωρισμένο ότι ο μικροπεριβάλλον του όγκου διαδραματίζει έναν κρίσιμο ρόλο στην έναρξη της καρκίνο , εξέλιξη και μετάσταση [18]. ενδοκυτταρική επικοινωνία μεταξύ του όγκου-στρώματος μπορεί να προκαλείται από διαλυτούς παράγοντες, συμπεριλαμβανομένων των κυτοκινών, χημειοκινών, και αυξητικούς παράγοντες [19]. Μια αναδυόμενη ιδέα είναι ότι οι αλληλεπιδράσεις με όγκο στρώμα μπορεί επίσης να περιλαμβάνει την άμεση ανταλλαγή γενετικών πληροφοριών, κυρίως με τη μορφή του miRNAs, μια κατηγορία μη κωδικεύουσες RNAs (18-25 νουκλεοτίδια σε μήκος) που ρυθμίζουν την έκφραση πολλαπλών γονιδίων στόχων με σύνδεση προς κωδικοποιείται mRNAs τους [13], [20], [21]. Αυτή η μεταφορά του γενετικού υλικού μπορεί να συμβεί όταν οι ΕΕΥ περιέχουν miRNA φορτίου που απελευθερώνεται από ένα κύτταρο δότη σε εξωκυτταρικό περιβάλλον και είναι λειτουργικά μεταφέρονται σε κύτταρα δέκτες. Μεταφέρεται miRNAs μπορεί να είναι λειτουργική και

in vitro

[8], [22], [23], [24], [25], και

in vivo

[26], [27] , [28]. Μελέτες έχουν αρχίσει να εξετάζουν τη σύνδεση των πολυμορφισμών microRNA που σχετίζονται και την ένωσή τους με την επίπτωση του καρκίνου και πρόγνωση, καθώς και το δυναμικό για την κυκλοφορία microRNAs ή κοπράνων έκφραση microRNA ως μη επεμβατική πρώιμων βιοδεικτών ανίχνευσης για καρκίνο του παχέος εντέρου [29], και τη χρησιμότητα των miRNAs σε υποτροπή, μετάσταση και θεραπευτικά αποτελέσματα [30]. Μία σημαντική πρόοδος στην κατανόηση της βιολογίας exosomal miRNA ήταν το εύρημα ότι sumoylated hnRNPA2B1 κατευθύνει τη φόρτωση ορισμένων miRNAs σε εξωσώματα μέσω της αναγνώρισης των ειδικών σύντομο μοτίβων που υπάρχουν στο miRNAs [31].

Πρόσφατα, περιέγραψε την απομόνωση της δύο πληθυσμοί εξωσωμάτων καθώς sMVs από το ίδιο ανθρώπινο κύτταρο καρκινώματος κόλου γραμμή LIM1863 [4]. Οι sMVs παρασκευάσθηκαν με διαφορική φυγοκέντρηση και εξωσώματα καθαρίστηκε με διαδοχική ανοσοσύλληψης χρησιμοποιώντας αντι-A33- και αντι-ΕρΟΑΜ συζευγμένα μαγνητικά σφαιρίδια. Ενώ οι πληθυσμοί εξωσωμάτων (Α33-Exos και EpCAM-Exos) δεν θα μπορούσαν να διακριθούν με τη χρήση ηλεκτρονικής μικροσκοπίας, η έντονη πυκνότητα ή στερεοτυπικές εξωσώματα δείκτες (TSG101, Alix και HSP70), πρωτεΐνη πληκτρολόγηση χρησιμοποιώντας GeLC-MS /MS [3], [6] αποκάλυψε ότι οι πρωτεϊνικές συνθέσεις τους ήταν αρκετά διακριτές – EpCAM-Exos που περιέχει την κλασική κορυφαία συστατικά της εμπορίας ανθρώπων και Α33-Exos, εμπλουτισμένο με πλαγιοβασική μόρια εμπορίας. Τα προφίλ πρωτεώματος των δύο εξωσωμάτων πληθυσμών, με τη σειρά του, ήταν αρκετά διαφορετική από την αρχική έκθεση του sMVs απελευθερώνεται μέσα στο ίδιο μέσο καλλιέργειας. Προκειμένου να προσδιοριστούν περαιτέρω αυτά τα υποτύπους EV, ερευνήσαμε μοριακή σύνθεση τους χρησιμοποιώντας ένα άλλο

-ωματικής

προσέγγιση, RNA πληκτρολόγηση.

Σε αυτή τη μελέτη, δείχνουμε τη χρήση βαθιά αλληλουχίας ότι υπάρχουν συνολικά 254 miRNAs που προσδιορίζονται στις τέσσερις miRNA βιβλιοθήκες που παρασκευάζονται (Α33-Exos, EpCAM-Exos, sMVs και τα κύτταρα γονέα LIM1863), εκ των οποίων 63 είναι ιδιαίτερα εμπλουτισμένα σε ΕΕΥ. Οι τρεις υπότυποι EV LIM1863 προερχόμενο εμπλουτισμένο με ειδικά miRNAs υπογραφές, σε σύγκριση με την γονική κυτταρική σειρά LIM1863. Ειδικότερα, αναφέρουμε ότι το 32, 2 και 4 miRNAs που είναι εμπλουτισμένα αποκλειστικά σε Α33-Exos, EpCAM-Exos, και sMVs, αντίστοιχα – μερικά από τα οποία επιτρέπουν εξωσώματα πρέπει να διακρίνεται από sMVs. Από τις 32 miRNAs επιλεκτικά εμπλουτισμένο σε Α33-Exos, 13 δεν έχουν προηγουμένως εμπλακεί με ορθοκολικό καρκίνο (CRC) και συζητάμε πως αυτή η πληροφορία μπορεί να χρησιμοποιηθεί προς το δυναμικό για τη διάγνωση CRC. Ένα αξιοσημείωτο εύρημα της μελέτης μας ήταν η διαπίστωση των αλληλουχιών εμπλουτισμένο σε ΕΕΥ »σκέλος των επιβατών» miRNA (miRNA αστέρων) σε σύγκριση με το μητρικό LIM1863 κύτταρα.

Υλικά και Μέθοδοι

καλλιέργειας κυττάρων και απομόνωση της εξωκυττάριας κυστίδια

LIM1863 κύτταρα [32] αρχικά καλλιεργήθηκαν σε ~ 80% συρροή σε 175-cm

2 φιάλη σε μέσο RPMI-1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA) συμπληρωμένο με 5% ορό εμβρύου μόσχου ( FCS), 0,1% ινσουλίνη-τρανσφερίνης-σεληνίου (ITS, Invitrogen), 100 U /ml πενικιλλίνη και 100 μg /ml στρεπτομυκίνη σε 37 ° C και 5% CO

2. κύτταρα LIM1863 (~ 3 × 10

7 κύτταρα) συλλέχθηκαν (140

g

, 3 λεπτά), αιωρούνται σε 15 ml άνευ ερυθρού φαινόλης RPMI-1640 (που περιέχει 0,5% ITS, 100 U /ml πενικιλλίνη και 100 μg /ml στρεπτομυκίνη) και μεταφέρεται στο θάλαμο Καλλιέργεια ενός κυτταρική οικογένεια CL-1000 βιοαντιδραστήρα κλασική φιάλη (Integra Biosciences)? ο θάλαμος παροχή θρεπτικών συστατικών που περιέχονται 500 ml RPMI-1640 συμπληρωμένο με 5% FCS, 100 U /ml πενικιλλίνη και 100 μg /ml στρεπτομυκίνη. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν στους 37 ° C και 5% CO

2 ατμόσφαιρα. Το μέσο καλλιέργειας στο θάλαμο παροχή θρεπτικών συστατικών αντικαταστάθηκε δύο φορές την εβδομάδα και το κυτταρικό εναιώρημα από το θάλαμο καλλιέργειας συλλέχθηκε κάθε 48 ώρες. Μετά από κάθε συλλογή, το κυτταρικό εναιώρημα υποβλήθηκε σε φυγοκέντρηση σε 140

g

για 3 λεπτά για να καθιζάνουν organoids LIM1863 κύτταρο, το οποίο επαναιωρήθηκαν σε 15 ml μέσου καλλιέργειας και την εκ νέου seeded πίσω στο θάλαμο καλλιέργειας. Το υπερκείμενο υποβλήθηκε σε φυγοκέντρηση σε 2000

g

για 10 λεπτά για να απομακρυνθούν επιπλέοντα κύτταρα /κυτταρικών υπολειμμάτων και στη συνέχεια φυγοκεντρείται περαιτέρω σε 10,000

g

για 30 λεπτά στους 4 ° C για τη συλλογή ρίξει μικροκυστίδια (sMVs) . Το προκύπτον υπερκείμενο περαιτέρω φυγοκεντρήθηκε (100.000

g

, 1 ώρα) για να συλλέξει ακατέργαστο εξωσώματα. Ακατέργαστη εξωσώματα κλασματώθηκαν σε δύο διακριτές υποπληθυσμούς εξωσωμάτων (Α33-Exos και EpCAM-Exos) με διαδοχική ανοσοσύλληψης χρησιμοποιώντας Dynabeads (Invitrogen) φορτωμένο με αντι-ανθρώπινο-A33 μονοκλωνικών αντισωμάτων [33] σε συνδυασμό με αντι-EpCAM (CD326) -antibody δεσμευμένο μαγνητικά μικροσφαιρίδια (Miltenyi Biotec), όπως περιγράφεται [4].

Protein ποσοτικοποίηση

η περιεκτικότητα σε πρωτεΐνη εκτιμήθηκε με 1D-SDS-PAGE /SYPRO Ruby χρώση πρωτεΐνης πυκνομετρία, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [5] .

μικροσκοπία

μετάδοσης ηλεκτρονίου (ΤΕΜ)

Α33-Exos και EpCAM-Exos εκλούστηκαν από τις αντίστοιχες μαγνητικά σφαιρίδια τους με 0.2 Μ γλυκίνη, ρΗ 2.5 και συλλέχθηκαν με φυγοκέντρηση (100.000

g

, 1 h). Για ΤΕΜ, δείγματα (sMVs, A33- και EpCAM-Exos, 1 μg /10 μΙ PBS) εφαρμόστηκαν για 2 λεπτά έως 400 mesh πλέγματα χαλκού επικαλυμμένα με ένα λεπτό στρώμα του άνθρακα. Η περίσσεια υλικού απομακρύνθηκε με στύπωση με διηθητικό χαρτί, και τα δείγματα αρνητικά χρώση δύο φορές με 10 μΙ ενός διαλύματος οξικού ουρανυλίου 2% για 10 λεπτά (ProSciTech, Queensland, Australia). Πλέγματα ξηράνθηκαν στον αέρα και απεικονίζεται χρησιμοποιώντας ένα JEOL JEM-2010 μικροσκόπιο μετάδοσης ηλεκτρονίου λειτουργεί στα 80 kV.

Ανάλυση Western Blot

συγκεντρώσεις πρωτεΐνης των δειγμάτων προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας μονοδιάστατη SDS-PAGE /SYPRO Ruby πρωτεΐνη χρώση /πυκνομετρία, όπως περιγράφεται [5], [6]. Εν συντομία, τα δείγματα υποβλήθηκαν σε λύση σε ρυθμιστικό διάλυμα δείγματος SDS για 20 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου, και πρωτεΐνες (10 μg /δείγμα) αναλύθηκαν με SDS-PAGE, ηλεκτρομεταφέρθηκαν σε μεμβράνες νιτροκυτταρίνης χρησιμοποιώντας το iBlot Dry Blotting System (Life Technologies), και οι μεμβράνες αποκλείστηκαν με 5 % (w /v) σκόνη αποβουτυρωμένου γάλακτος σε Tris-ρυθμισμένο αλατούχο διάλυμα που περιέχει 0,05% (ν /ν) Tween-20 (TTBS) για 30 λεπτά. Οι μεμβράνες ανιχνεύτηκαν για όλη τη νύχτα σε TTBS με πρωτογενές αντι-CD9 (στο 1:1000) και ποντικού αντι-TSG101 (σε 1:1,000) από BD Biosciences, ποντικού αντι-Alix (σε 1:1,000) από Σηματοδότηση Cell, ή αντι-ποντικού -A33 (1 μg /ml) (δώρο από τον Dr Α Scott, Ludwig Institute for Cancer Research, Μελβούρνη). Μετά από πλύση με TTBS (3 χ 10 λεπτά) οι μεμβράνες επωάστηκαν με υπεροξειδάση αρμορακίας (HRP) IgG αντι-ποντικού (Sigma) ή IRDye 800 αντι-ποντικού IgG (Li-COR Biosciences). Οι πρωτεΐνες έγιναν ορατές με επώαση των μεμβρανών με Western υπόστρωμα HRP (Merck-Millipore) που ακολουθείται από απεικόνιση με ChemiDocMP System (Bio-Rad) ή με την απεικόνιση απευθείας με το Infrared System Imaging Οδύσσεια (V3).

Σύνολο απομόνωση RNA

το συνολικό RNA από κύτταρα LIM1863, sMVs, A33- και EpCAM-Exos απομονώθηκε με ΤΚΙζοΙ (Technology Life), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Εν συντομία, τα δείγματα υποβλήθηκαν σε λύση σε 1 ml αντιδραστηρίου ΤΚΙζοΙ από επαναλαμβανόμενη χρήση πιπέτας για 5 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου (RT). Χλωροφόρμιο (0,2 ml /ml ΤπζοΙ Αντιδραστήριο) προστέθηκε σε διαλυτοποιημένη δείγματα και μίγματα στροβιλίζονται ζωηρά επί 15 δευτερόλεπτα, επωάστηκαν σε θερμοκρασία δωματίου για 2-3 λεπτά και στη συνέχεια φυγοκεντρήθηκε (12000

g

, 15 λεπτά, 4 ° C) . Η υδατική φάση συλλέχθηκε, αναμίχθηκαν με 5 μg γλυκογόνου (20 mg /ml υδατικού γλυκογόνο, Invitrogen) και ισοπροπυλική αλκοόλη (0.5 ml ισοπροπυλικής αλκοόλης /1 ml υδατικής φάσης) και επωάστηκαν για 10 λεπτά σε RT. Ολικό RNA ανακτήθηκε με φυγοκέντρηση στα 12.000 g για 10 λεπτά στους 4 ° C. Τα προκύπτοντα σφαιρίδια RNA πλύθηκαν μία φορά με 75% υδατική αιθανόλη, ξηραίνεται στον αέρα για 5 λεπτά και επανα-διαλύθηκε σε RNase-free νερό. Η ποσότητα, την ποιότητα και τη σύνθεση του RNA δείγματα αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, USA).

Μικρές RNA κατασκευή βιβλιοθήκης και αλληλούχιση

Τέσσερις μικρές βιβλιοθήκες RNA (από μητρικά κύτταρα LIM1863 και προέρχεται sMVs, A33- και EpCAM-Exos) κατασκευάστηκαν και η αλληλουχία με την τεχνολογία βαθιά αλληλουχίας Illumina TruSeq (Δείγμα Οδηγός Προετοιμασίας, Par # 15004197 Rev.A, Illumina, San Diego, CA). Εν συντομία, ολικό RNA δείγματα κλασματώθηκαν σε ένα πήκτωμα 15% Τρις-βορικού-ΕϋΤΑ (ΤΒΕ) πολυακρυλαμιδίου (Invitrogen) και ζώνες που αντιστοιχούν σε μικρές RNAs (18~30 nt) αποκόπηκαν και μικρά RNAs εκχυλίζεται με φυγοκέντρηση. Μετά τη σύνδεση του 5 ‘(5′-GUUCAGAGUUCUACAGUCCGACGAUC-3’) και 3 προσαρμογείς ‘(5′-UGGAAUUCUCGGGUGCCAAGG-3’), μικρά μόρια RNA μεταγράφηκαν ανάστροφα σε cDNA, στη συνέχεια ενισχύθηκε χρησιμοποιώντας τους εκκινητές προσαρμογέα για 14 κύκλους και τα θραύσματα ( -150 bps) απομονώθηκαν από 6% ΤΒΕ PAGE γέλης. Το καθαρισμένο cDNA χρησιμοποιήθηκε απ ‘ευθείας για την παραγωγή του συμπλέγματος και την αλληλουχία τους χρησιμοποιώντας μια πλατφόρμα Illumina HiSeq 2000. Τα αρχεία εικόνας που παράγεται από το sequencer υποβλήθηκαν σε επεξεργασία για την παραγωγή ψηφιακής ποιότητας των δεδομένων (αρχεία πρώτες FASTQ). Τα αρχεία FASTQ και για τις τέσσερις μικρές βιβλιοθήκες RNA (κύτταρα LIM1863, και προέρχεται sMVs, Α33-Exos και EpCAM-Exos) έχουν υποβληθεί στην Ακολουθία Διαβάστε Αρχείο (SRA) της NCBI με αριθμό ένταξης SRA106214.

Ποσοτική πραγματικού -Ώρα PCR

το συνολικό RNA (3 μλ που περιέχει 12 ng RNA /μl) που παρασκευάζονται από κύτταρα LIM1863 και προέρχονται ΕΕΥ μεταγράφηκε αντίστροφα χρησιμοποιώντας ένα TaqMan miRNA αντίστροφη μεταγραφή (RT) Κιτ από την Applied Biosystems /Life Technologies με Megaplex RT αστάρια (Human Pool Α και Β πισίνα, Applied Biosystems). συνθήκες της αντίδρασης RT, με βάση τις οδηγίες του κατασκευαστή, ήταν: 40 κύκλοι των 16 ° C για 2 λεπτά, 42 ° C για 1 λεπτό και 50 ° C για 1 s. προκύπτοντα προϊόντα Megaplex RT (2,5 μl) στη συνέχεια αναμιγνύεται με 22,5 μι του Megaplex προενισχυτή Mix αντίδραση που περιέχει 2.5 μλ Megaplex προενισχυτή Αστάρια Pool Α και Β (Applied Biosystems). συνθήκες κύκλου προ-ενίσχυσης ήταν: 95 ° C για 10 λεπτά, 55 ° C για 2 λεπτά, 75 ° C για 2 λεπτά που ακολουθείται από 12 κύκλους των 95 ° C για 15 s και 60 ° C για 4 λεπτά. Μετά την αραίωση των προ-ενισχυμένων cDNAs (25 μΙ) με 75 μΐ ρυθμιστικού Tris-EDTA (1 mM ρυθμιστικό Tris που περιέχει 0.1 mM EDTA, ρΗ 8,0), 15 μΙ αραιωμένου προϊόντος cDNA αναμίχθηκε με 450 μΐ TaqMan καθολική PCR Master Mix (Applied Biosystems) και 435 μΙ ύδατος άνευ νουκλεάσης. Για την επικύρωση των δεδομένων βαθιά αλληλουχίας το μείγμα υποβλήθηκε σε PCR ποσοτική ανάλυση σε πραγματικό χρόνο (qRT-PCR) χρησιμοποιώντας TaqMan πίνακα χαμηλής πυκνότητας (TLDA) κάρτες (σύνολο v3.0) που αντιπροσωπεύουν συνολικά 754 προσδιορισμούς ειδικά για τα ανθρώπινα miRNAs (σημερινό στο Sanger miRBase V14). qRT-PCR πραγματοποιήθηκε σε ένα 7900 ΗΤ Thermocycler (Applied Biosystems) χρησιμοποιώντας τις συνιστώμενες συνθήκες ποδηλασίας του κατασκευαστή: 50 ° C για 2 λεπτά, 95 ° C για 10 λεπτά που ακολουθείται από 40 κύκλους των 95 ° C για 15 s και 60 ° C για 1 λεπτό. δεδομένα qRT-PCR συλλέγονται στο τέλος του κάθε κύκλου. τιμές κατωφλίου κύκλου (Ct) υπολογίστηκαν με τη χρήση του λογισμικού v2.4 SDS? αυτόματες ρυθμίσεις βασική είχαν ανατεθεί μια ελάχιστη οριακή τιμή Ct 0.2. τιμές Ct και οι τρεις υποπληθυσμούς EV περιέχονται στερεοτυπικές δείκτες εξωσωμάτων (TSG101, Alix, CD9) (Σχήμα 1 Ε). Αυτή η προσέγγιση απέδωσε περίπου 20 mg της sMVs και ~ 3 mg της A33- και EpCAM-Exos. Για να προσδιορίσετε αν LIM1863 κυττάρων ΕΕΥ περιέχει RNA, καθαρισμένα ΕΕΥ εξήχθησαν για το ολικό RNA, συμπεριλαμβανομένης της μικρό κλάσμα RNA με τη χρήση πρότυπης μεθοδολογίας εκχύλισης RNA. Η ποιότητα και η ποσότητα του RNA που απομονώνονται προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας μια Agilent 2100 Bioanalyzer (Σχήμα 1 F). Η απόδοση του RNA: Α33-Exos 8,8 μg RNA /~ 3 mg πρωτεΐνης, EpCAM-Exos 9,2 μg RNA /~ 3 mg πρωτεΐνης, και SMV: 72 μg RNA /~ 20 mg πρωτεΐνης. Σύνολο προφίλ BioAnalyzer RNA έδειξαν ότι LIM1863 που προέρχεται από κύτταρα sMVs περιείχε 18S και 28S ριβοσωμικού RNA (rRNA), ενώ A33- και EpCAM-Exos στερούνται ανιχνεύσιμες ποσότητες αυτών των ειδών του RNA σε συμφωνία με εξωσώματα που προέρχονται από άλλες κυτταρικές γραμμές [22], [38 ], [39], [40].

(Α) κύτταρα LIM1863 αναπτύχθηκαν σε μέσο RPMI-1640 συμπληρωμένο με 5% FCS (εξωσωμάτων εξαντλημένο), 100 U /ml πενικιλλίνη και 100 μg /ml στρεπτομυκίνη στην κυτταρική σειρά βιοαντιδραστήρα κλασικό φιάλες και το μέσο καλλιέργειας (CM) συλλέγονται. sMVs πρώτα απομονώνεται από το CM (απόδοση: ~ 20 mg πρωτεΐνης, 72 μg RNA). Στη συνέχεια, Α33-Exos απομονώθηκαν από το SMV-free CM μέσω αντι-A33 σύλληψης αντισώματος (απόδοση: ~ 3 mg πρωτεΐνης, 8,8 μg RNA) και EpCAM-Exos απομονώθηκαν από το A33-Exos-εξαντλημένο CM χρησιμοποιώντας EpCAM-συζευγμένο μαγνητικά σφαιρίδια (απόδοση: ~ 3 mg πρωτεΐνης, 9,2 μg RNA). (BD) με ηλεκτρονικό μικροσκόπιο εικόνες sMVs (Β), Α33-Exos (C) και EpCAM-Exos (D) δείχνει ένα μέγεθος 150-300 nm διάμετρο και διάμετρο 40-100 nm για sMVs και A33- /EpCAM-Exos, αντίστοιχα. Ράβδος κλίμακας: 100 nm (η = 3). (Ε) Western blot των ΗΟ (10 μg πρωτεΐνης) για Α33, Alix (PDCD6IP), TSG101, και CD9. (F) Ολικό RNA ηλεκτροφόρημα ανάλυση (Agilent Bioanalyzer) από τα κύτταρα LIM1863 και προέρχονται ΕΕΥ. Υ άξονα ηλεκτροφόρημα είναι αυθαίρετη ένταση φθορισμού μονάδα (FU) και άξονα x είναι ο χρόνος μετάβασης σε δευτερόλεπτα (s) και νουκλεοτίδια (nt).

Η

Μια σύντομη επισκόπηση των μικρών RNA

δεδομένα αλληλουχίας

για να χαρακτηρίσουμε μικρές RNAs σε LIM1863 που προέρχονται ΕΕΥ, Illumina HiSeq 2000 τεχνολογία υψηλής απόδοσης χρησιμοποιήθηκε για την ακολουθία τέσσερις μικρές βιβλιοθήκες RNA (κύτταρα LIM1863 (CL), sMVs, Α33-Exos και EpCAM-Exos). Αρχικά, 20330356, 25388242, 22512338, και 24096270 πρώτες διαβάζει παρήχθησαν. Μετά το κλάδεμα χαμηλής ποιότητας διαβάζει, ακολουθίες προσαρμογέα και διαβάζει όπου μήκη ήταν μικρότερα από 18 nt (BGI λογισμικού in-house), που αντιστοιχεί 18.850.584, 22.762.038, 16.407.260 και 18.195.289 συνολικό καθαρό διαβάζει ελήφθησαν. Είμαστε δίπλα χαρτογραφηθεί όλα καθαρά διαβάζει miRBase (V.20) για να σχολιάσετε γνωστό miRNAs σε κάθε βιβλιοθήκη. Τα αποτελέσματα έδειξαν 15367876, 152815949, 12771308 και 13611284 σχολιασμένη καθαρό διαβάζει αντιστοιχεί στο CL, sMVs, Α33-Exos, και EpCAM-Exos, αντίστοιχα? καθαρό διαβάζει προσδιοριστεί για τις άλλες κατηγορίες μικρών RNA (rRNA, tRNA, snRNA, snoRNA, srpRNA, επαναλάβετε σχετιζόμενη RNAs, αποικοδόμηση mRNA) και σχολιαζομένων RNAs φαίνονται στον Πίνακα 1. Το ποσοστό της miRNAs στο συνολικό RNA που απομονώθηκε από κάθε δείγμα αντιστοιχούσε σε 77.84, 74.81, 67.14 και 81.52 για την Α33-Exos, EpCAM-Exos, sMVs, και CL, αντίστοιχα.

η

επόμενο εξέτασε τα τέσσερα LIM1863 κυττάρων που προέρχονται από βιβλιοθήκες miRNA να διαπιστωθεί πόσοι από το 2578 γνωστό miRNAs σε miRBase V20 ήταν ανιχνεύσιμα. Χωρίς ένα cut-off 891, 863, 770, και 759 miRNAs εκπροσωπήθηκαν στο CL, sMVs, Α33-Exos και EpCAM-Exos, αντίστοιχα. Ωστόσο, για αυτή τη μελέτη, αποφασίσαμε να χρησιμοποιήσουμε ένα πιο αυστηρό όριο (& gt? 5 TPM cut-off) για να μας επιτρέψει να επικεντρωθεί σε μεγάλο βαθμό εκπροσωπούνται miRNAs. Αυτό οδήγησε σε ένα σύνολο 254 miRNAs για περαιτέρω ανάλυση (Πίνακας S1), συμπεριλαμβανομένης της ιεραρχικής ομαδοποίησης των επιπέδων έκφρασης (Σχήμα S1).

LIM1863 που προέρχονται ΕΕΥ περιέχει 254 διακριτές miRNAs

Μια επιθεώρηση Πίνακας S1 δείχνει ότι οι 254 miRNAs εκπροσωπούνται σε όλες τις τέσσερις βιβλιοθήκες, αν και σε διαφορετικά επίπεδα εμπλουτισμού. Σημαντικά, περισσότερο από το 75% αυτών των 254 miRNAs είναι εξαιρετικά εκπροσωπούνται σε κάθε βιβλιοθήκη (& gt? 10 TPM) (Εικόνα 2Α), και οι 20 κορυφαίες miRNAs στην Α33-Exos, EpCAM-Exos, sMVs και CL βιβλιοθήκες αντιπροσωπεύουν 91.02%, 90,72%, 91,02% και 91,42% του αντίστοιχου συνολικού διαβάζει των miRNAs. Είναι ενδιαφέρον ότι, οι τρεις πρώτες πιο πολύ-εκπροσωπούνται miRNAs που προσδιορίζονται στο LIM1863 που προέρχονται EVs – miR-192-5p, miR-10a-5P και miR-191-5p – έχουν αναφερθεί προηγουμένως σε ιστούς και στον ορό των ασθενών με CRC ως πιθανά διαγνωστικά βιοδείκτες. Για παράδειγμα, miR-192 έχει παρατηρηθεί σε ιστούς [41] και ορού /πλάσματος [42] από ασθενείς CRC, miR-191 σε ιστό [41], [43] και ορού /πλάσματος [44], και miR-10a σε ιστού [45] και στον ορό /πλάσμα [42] από ασθενείς CRC. Επιπλέον, miR-192 αναφέρεται ότι καταστέλλει τη μετάσταση των CRC [46] και της σύνθεσης αυτού, μαζί με εκείνη του miR-215 (επίσης εξαιρετικά εκπροσωπείται σε 254 miRNA σύνολο δεδομένων μας), επάγεται από ρ53 και φαίνεται να παίζουν ένα σημαντικό ρυθμιστικό ρόλο του γονίδια που εμπλέκονται στην οδό σηματοδότησης ΤΟΡ-β [47], [48].

(Α) Κατανομή των γνωστών αλληλουχιών miRNA στην CL, sMVs, A33- και EpCAM-Exos βασίζεται σε κανονικοποιημένες τιμές έκφρασης (μεταγραφές ανά εκατομμύρια διαβάζει, TPM). (Β) Top 10 miRNA συσπειρώσεων που θα βασίζονται στην ανάλυση των 254 miRNAs που προσδιορίζονται σε σχέση με τη θέση τους στο γονιδίωμα του ανθρώπου αναφοράς (hg19). (Γ) Κατανομή σε σύμπλεγμα miRNAs σε διαφορετικά ανθρώπινα χρωμοσώματα. Σύμπλεγμα miRNAs (συμπεριλαμβανομένου του αριθμού των miRNAs) ήταν προσδιορίζονται σύμφωνα με χρωμοσωμικές θέσεις τους, οι οποίες θα πρέπει να είναι μέσα σε 10 k bp στο χρωμόσωμα? miRNAs από τον ίδιο πρόδρομο (-5p, -3p) θεωρήθηκαν μόνο μία φορά. (Δ) Τρία-τρόπο Venn διάγραμμα που απεικονίζει τα 63 miRNAs εμπλουτισμένο σε sMVs, A33- και EpCAM-Exos, σε σχέση με το CL. 6 miRNAs είναι κοινά σε όλες τις ΕΕΥ, ενώ το 22 miRNAs είναι κοινά και για τα δύο σύνολα δεδομένων exosomal. miRNAs επιλεκτικά εμπλουτισμένα σε κάθε σύνολο δεδομένων EV miRNA:. Α33-Exos 32/56, EpCAM-Exos 2/25 και 4/13 sMVs

Η

επόμενο πραγματοποιηθεί μια λεπτομερής ανάλυση διασποράς miRNA (δηλαδή, τον εντοπισμό ομάδες των miRNAs που κωδικοποιούνται από polycistronic μεταγραφές, σκέφτηκε να συν-εκφράζεται [49]) των 254 σύνολα δεδομένων miRNA. Από τα 153 γνωστά συμπλέγματα miRNA που βρίσκονται μέσα σε 10 K απόσταση bp για το ανθρώπινο γονιδίωμα 34 εντοπίστηκαν. Αρκετά από αυτά τα συμπλέγματα είναι στατιστικά εμπλουτισμένη (Εικόνα 2Β, Πίνακας S2). Σύμφωνα με

σ

-τιμές υπολογίστηκαν με την ακριβή δοκιμή του Fisher οι πέντε πρώτες συστάδες miRNA εντοπίζονται οι

σύμπλεγμα 6

(6/6 των μελών που προσδιορίζονται? MiR-17, -18a, -19a, -19β -1, -20a και -92a-1),

συμπλέγματος 4

(6/8 των μελών που προσδιορίζονται? miR-532, -188, -500a, -362, -501, -500b, -660, και -502),

σύμπλεγμα 16

(4/4, miR-941-1, -941-2, -941-3, και 941-4),

σύμπλεγμα 21

(3 /3 μέλη εντοπιστεί? miR-200a /200b /429), και

σύμπλεγμα 28

(3/3 των μελών που προσδιορίζονται? miR-23a, -27a, και 24-2). Από αυτές,

συστάδα 6

miRNAs (οικογένεια miR-17~92a) έχουν αναφερθεί ότι είναι εξαιρετικά χαμηλό ποσοστό σε πολλά συμπαγείς όγκους, συμπεριλαμβανομένων του μαστού, του πνεύμονα, του παχέος εντέρου, του προστάτη και του στομάχου [50]. Έκφραση του

συμπλέγματος 4

Τα miRNAs ρυθμίζονται από E2F1 [50], μπορεί να στοχεύσει απευθείας BCL2 /11 /Bim να καταστείλει Myc που προκαλείται από Β κύτταρα λέμφωμα γένεση [51] και τη ρύθμιση πολλών γονιδίων στην οδό TGF-β [ ,,,0],52]. Η χρωμοσωμική κατανομή αυτών των clusters (Σχήμα 2C) έδειξε χρωμοσώματα-X (8 clusters), -1 (5 clusters), και -9 (3 συστάδες) να είναι το πιο σημαντικό.

Στη συνέχεια εξετάσαμε την εκπροσώπηση των διαφόρων miRNA μελών της οικογένειας σε 254 miRNA σύνολο δεδομένων (Πίνακας S3). Αυτή η ανάλυση αποκάλυψε την εξέχουσα θέση σε όλες τις τρεις ΕΕΥ των μελών από τις ακόλουθες οικογένειες: ας-7 (12/12 μέλη παρατηρείται, αφήστε-7a /b /c /d /e /f /g /i, miR-98-5p) , miR-181 (6/6, miR-181-1 /α-2 /b-1 /b-2 /c /d), miR-30 (6/6, miR-30a /b /c-1 /C-2 /d /e), miR-320 (7/8, miR-320a /b-1 /b-2 /C-1 /C-2 /d-1 /d-2), miR-8 ( 5/5, miR-141, miR-200a /b /c και miR-429), miR-17 (6/8, miR-106a /b, miR-17, miR-18a, miR-20a και miR-93 ), miR-192 (2/2, miR-192 και miR-215) και miR-25 (3/4, mir-25 και mir-92α /β).

63 miRNAs είναι κατά προτίμηση εμπλουτισμένη σε LIM1863 που προέρχονται ΕΕΥ

για να εκτιμηθεί κατά πόσον ορισμένες miRNAs ταξινομούνται ειδικά σε ΕΕΥ πραγματοποιήσαμε μια ανάλυση miRNA-εμπλουτισμού για A33-Exos, EpCAM-Exos και sMVs. MiRNAs με & lt? 2 φορές αλλάζει σε σχέση με το CL miRNAs φιλτραρίστηκαν, αποδίδοντας 63 miRNAs για σύγκριση (Πίνακας 2). MiRNA παράσταση ήταν περισσότερο εμφανής σε καθαρισμένο Α33-Exos (56 miRNAs αντιπροσωπεύονται, από τα οποία 32 είναι επιλεκτικά εμπλουτισμένο σε σύγκριση με άλλα EV), που ακολουθείται από EpCAM-Exos (25 miRNAs, 2 εμπλουτισμένο επιλεκτικά) και sMVs (13 miRNAs, 4 επιλεκτικά εμπλουτισμένο) (Πίνακας 2, Εικόνα 2D). Υπάρχουν μόνο 6 σειρές miRNA κοινή σε όλες τις τρεις υποτύπους EV, μεταξύ των οποίων τρεις miRNAs ‘σκέλος των επιβατών »(miRNA * ακολουθίες) (miR-451Α, miR-4454, miR-7641, αφήστε-7α-3ρ *, αφήστε-7f-1 -3p * και miR-574-5p *). Μέχρι σήμερα, μόνο miRNA-451Α έχει ήδη παρατηρηθεί σε ΕΕΥ (ΕΕΥ εμβρυϊκών βλαστικών κυττάρων που προέρχονται, [53]). Η σημασία του τρία miRNA * αλληλουχίες που είναι κοινές σε όλες τις τρεις υποτύπους EV δεν είναι σαφές σε αυτό το στάδιο και πρέπει να αναμείνει ανάλυση ενός στατιστικά σημαντικό αριθμό δειγμάτων EV που προέρχονται από άλλες πηγές CRC κυτταρική γραμμή. Συνολικά, στο εμπλουτισμένο 63 miRNA σύνολο δεδομένων παρατηρούμε 12 ορισμένα miRNA * ακολουθίες, τρεις εκ των οποίων (ας-7α-3ρ *, αφήστε-7f-1-3p *, miR-574-5p *), είναι ιδιαίτερα εκπροσωπούνται σε όλα τα EV υποπληθυσμών (Πίνακας 2).

η

Στη συνέχεια εξετάσαμε το 63 miRNA σύνολο δεδομένων (Πίνακας 2) να διαπιστωθεί κατά πόσον υπήρχαν miRNAs που επέτρεψε διάκριση μεταξύ εξωσώματα (Α33-Exos και EpCAM-Exos) και sMVs. Αυτή η ανάλυση αποκάλυψε 7 miRNAs σημαντικά εμπλουτισμένο σε εξωσώματα (HSA-miR-320a 320b, -320c, -320d 221-3p, -374-5p, και -200 ° C-3ρ), σε σύγκριση με sMVs. Εντυπωσιακά, Mirs-320a /b, -221-3p και -200 ° C-3pc είχε πάνω από 1000 TPM σε κάθε βιβλιοθήκη εξωσωμάτων με 1.18 – 2.28 log

αναλογία 2 φορές αλλαγές σε σύγκριση με τις αντίστοιχες τιμές στο εύρος 500-800 TPM ( -0,33 έως 1,88 log αλλαγές

2 φορές) σε sMVs και βιβλιοθήκες CL. MiR-320a εμπλέκεται στην CRC λόγω της ικανότητάς της να καταστέλλει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων με τη στόχευση β-κατενίνης [54]. Η έκφραση του miR-320a μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την αξιολόγηση του κινδύνου CRC μετάστασης λόγω της ικανότητάς του να συνδέεται άμεσα με την 3′-UTR του νευροφιλίνης (ΕΠΜ-1), έναν συν-υποδοχέα του αγγειακού επιθηλιακού αυξητικού παράγοντα [55]. Η παρουσία του miR-320a στο πλάσμα έχει αναφερθεί ως ένα πιθανό βιοδείκτη για την έγκαιρη ανίχνευση του CRC [44]. miR-221-3p, μαζί με miR-222 το οποίο βλέπουμε επίσης στην πολύ-εκφράζεται 254 miRNA σύνολο δεδομένων (Πίνακας S1), έχει επικυρωθεί πειραματικά για τη ρύθμιση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού με τη στόχευση p27 /Kip1, έναν αναστολέα του κυτταρικού κύκλου και ογκοκατασταλτικά, για την προώθηση της ογκογένεσης [56], [57]. Είναι ενδιαφέρον ότι, τα αυξημένα επίπεδα του miR-222, μαζί με miR-17-3p, -135b, -92 και -95, έχουν αναφερθεί σε CRC πλάσμα του ασθενούς και του ιστού του όγκου [58]. miR-200c, η οποία μαζί με miR-141 είναι ένα μέλος του συμπλέγματος miR-141~200c (cluster 59, Πίνακας S2), καθώς και το miR-8 οικογένειας (Πίνακας S3) στοχεύει το μεταγραφικό καταστολέα ψευδαργύρου-δακτύλου E-box ομοιοακολουθίας 1/2 (ZEB1 /2) [59] και SIP1 [60] σύνδεσης είναι ένας κρίσιμος επαγωγέας EMT σε αρκετούς τύπους καρκίνου, συμπεριλαμβανομένου του ορθοκολικού [61]. Κυκλοφορούν miR-141 είναι ένα δυναμικό βιοδείκτη για CRC μετάσταση [62]

Ένα εξέχον χαρακτηριστικό των 63 miRNAs (TPM & gt? 5). Εμπλουτισμένο σε LIM1863 που προέρχονται ΕΕΥ (Πίνακας 2) ήταν η παρατήρηση ότι το 38 ήταν αντιπροσωπεύεται αποκλειστικά στην

ένα

ή

άλλα

από τις τρεις βιβλιοθήκες EV, σε σχέση με τη βιβλιοθήκη CL. Απ ‘όλα, ήταν η διαπίστωση ότι 32/38 εντοπίστηκαν miRNAs ήταν αποκλειστικά για Α33-Exos. Από αυτά, Mirs-19α-3ρ, -19β-3ρ, η οικογένεια του miR-378 (Mirs-378Α-3ρ, -378c και -378d), -107 και το miR-320a /b κυριαρχούν.