Αφηρημένο

ωοθηκών καρκίνωμα (OC) είναι η πιο θανατηφόρα γυναικολογική κακοήθεια. Παρά τις προόδους στη θεραπεία της OC με συνδυαστικές αγωγές, συμπεριλαμβανομένης της χειρουργικής επέμβασης και με βάση την πλατίνα χημειοθεραπεία, οι ασθενείς εμφανίζουν γενικά κακή πρόγνωση λόγω της υψηλής αντοχής χημειοθεραπεία. Στο παρόν, ελέγξαμε την υπόθεση ότι οι απόκρισης βλάβες στο DNA (DDR) οδών που εμπλέκονται στην αντίσταση των ασθενών OC σε χημειοθεραπεία πλατίνα. Επιλεγμένα σήματα DDR αξιολογήθηκαν σε δύο ανθρώπινες κυτταρικές γραμμές καρκινώματος ωοθηκών, ένας ευαίσθητος (Α2780) και ένα ανθεκτικό (Α2780 /C30) στη θεραπεία της πλατίνας, καθώς και σε μονοπύρηνα κύτταρα περιφερικού αίματος (PBMCs) από ασθενείς με OC, ευαίσθητη (

n

= 7) ή ανθεκτικές (

n

= 4) για τα επόμενα χημειοθεραπεία. PBMCs από υγιείς εθελοντές (

n

= 9) μελετήθηκαν παράλληλα. βλάβη στο DNA αξιολογήθηκε με χρώση ανοσοφθορισμού γH2AX και κομήτη δοκιμασία. Υψηλότερα επίπεδα των εγγενών βλάβη του DNA βρέθηκαν σε Α2780 ό, τι σε Α2780 κύτταρα /C30. Επιπλέον, τα ενδογενή επίπεδα βλάβη του DNA ήταν σημαντικά υψηλότερη στους ασθενείς OC σε σχέση με υγιείς εθελοντές, καθώς και σε ασθενείς με πλατίνα-ευαίσθητη σε σχέση με την πλατίνα ανθεκτικά όνες (όλα

P

& lt? 0,05). Μετά καρβοπλατίνη θεραπεία, τα κύτταρα Α2780 έδειξαν χαμηλότερη απόδοση επιδιόρθωση του DNA από κύτταρα Α2780 /C30. Επίσης, μετά την καρβοπλατίνη θεραπεία των PBMCs

ex vivo

, η αποτελεσματικότητα επιδιόρθωση του DNA ήταν σημαντικά υψηλότερη σε υγιείς εθελοντές σε σύγκριση με τους ασθενείς πλατίνα ανθεκτικά και χαμηλότερα στην πλατίνα-ευαίσθητων (t

1/2 για την απώλεια του γH2AX εστίες: 2,7 ± 0,5 ώρες, 8,8 ± 1,9 ώρες και 15,4 ± 3.2Η, αντίστοιχα? χρησιμοποιώντας κομήτη δοκιμασία, t

1/2 της πλατίνας που προκαλείται από την επισκευή ζημιών: 4.8 ± 1.4Η, 12,9 ± 1,9 ώρες και 21,4 ± 2,6 ωρών, αντίστοιχα? όλα

P

& lt? 0,03). Επιπλέον, ο ρυθμός της απόπτωσης καρβοπλατίνη επαγόμενη ήταν υψηλότερη σε σχέση με το Α2780 Α2780 κύτταρα /C30. Σε PBMCs, τα ποσοστά απόπτωσης ήταν αντιστρόφως ανάλογη με αποτελεσματικότητα επιδιόρθωση του DNA αυτών των κυττάρων, που είναι σημαντικά υψηλότερη σε πλατίνα ευαίσθητα σε σχέση με τους ασθενείς πλατίνα ανθεκτικά και χαμηλότερες σε υγιείς εθελοντές (όλα

P

& lt? 0,05). Καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι οι διαταραχές των μονοπατιών επιδιόρθωσης του DNA, όπως μετράται σε PBMCs από ασθενείς OC συσχετίζονται με την ευαισθησία των ναρκωτικών αυτών των κυττάρων και αντανακλούν την εξατομικευμένη απάντηση με βάση την πλατίνα χημειοθεραπεία

Παράθεση:. Στεφάνου DT, Bamias Α, Επισκόπου Η , Kyrtopoulos SA, Likka Μ, Καλαμπόκας T, et al. (2015) Η ανώμαλη Βλάβη DNA Response οδοί μπορεί να προβλέψει την έκβαση της Platinum χημειοθεραπεία στον καρκίνο των ωοθηκών. PLoS ONE 10 (2): e0117654. doi: 10.1371 /journal.pone.0117654

Ακαδημαϊκό Επιμέλεια: Goli Σαμίμι, Garvan Institute of Medical Research, ΑΥΣΤΡΑΛΙΑ

Ελήφθη: 16 Ιουλίου, 2014? Αποδεκτές: 12, Νοεμ 2014? Δημοσιεύθηκε: 6 Φεβ 2015

Copyright: © 2015 Στεφάνου et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Τα δεδομένα είναι διαθέσιμα από την Helios Digital Repository:. https://helios-eie.ekt.gr/EIE/handle/10442/14421

Χρηματοδότηση: το έργο υποστηρίχθηκε εν μέρει από τη χορήγηση Ιατρικής Σχολής Πανεπιστημίου Αθηνών ΕΛΚΕ 097, και από την ECNIS (Cancer Περιβάλλοντος, Διατροφή και Ατομική Ευαισθησία) Δίκτυο αριστείας της Ευρωπαϊκής Ένωσης (σύμβαση αριθ. 513 943). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος των ωοθηκών (OC) είναι η πέμπτη πιο κοινή μορφή καρκίνου στις γυναίκες και η κύρια αιτία θνησιμότητας για γυναικολογικές κακοήθειες, με επιθηλιακό καρκίνωμα είναι η πιο συχνή ποικιλία [1,2]. OC είναι συνήθως διαγιγνώσκεται σε προχωρημένο στάδιο και συχνά φέρνει μια θλιβερή πρόγνωση, παρόλο που οι τρέχουσες στρατηγικές θεραπείας, συμπεριλαμβανομένης της επιθετικής χειρουργικής cytoreduction και πλατίνα χημειοθεραπεία με πακλιταξέλη φαίνεται να έχει βελτιωθεί σημαντικά το σχετικό επιβίωση των ασθενών αυτών σε ποσοστό επιβίωσης 5 ετών πάνω από το 40% [3]. Ιδρύθηκε προγνωστικοί παράγοντες για OC περιλαμβάνουν στάδιο, ιστολογική υπότυπο, βαθμός του όγκου και ο όγκος του υπολειμματικού νόσου μετά από κυτταρομειωτική χειρουργική [4,5].

Τρεις διαφορετικές ενώσεις λευκοχρύσου, δηλαδή σισπλατίνη, καρβοπλατίνη και οξαλιπλατίνη, χρησιμοποιούνται σήμερα στην κλινική πρακτική, με τις πολυάριθμες ενδείξεις, οι οποίες καλύπτουν ένα ευρύ φάσμα συμπαγών όγκων [6]. κυτταροτοξική δράση τους ασκείται μέσω αντίδρασης με το DNA και στην ανάπτυξη της βλάβης του DNA από το σχηματισμό διασταυρούμενων δεσμών, Pt-d [GpG] (1,2-ενδοκλωνικά διασταυρούμενων δεσμών, 65%), Pt-d [ApG] ( 1,2-ενδοκλωνικά διασταυρούμενων δεσμών, 25%) και σε μικρότερο βαθμό Pt-d [GpNgG] (1,3-ενδοκλωνικά διασταυρούμενων δεσμών), διασταυρώσεις μεταξύ των κλάδων (ICLs, η πιο κυτταροτοξική) και μονού νουκλεοτιδίου βλάβη του γουανίνη [7]. επισκευή νουκλεοτιδίων εκτομή (NER) είναι η κύρια διαδικασία με την οποία επισκευάζονται διασταυρούμενες συνδέσεις ενδοκλωνικά πλατίνα και βλάβη μονού νουκλεοτιδίου γουανίνης [8,9]. Από την άλλη πλευρά, ICL επισκευής είναι περίπλοκη και απαιτεί ένα συνδυασμό των NER, Fanconi οδού επιδιόρθωσης Αναιμία, σύνθεση translesion και ομόλογο ανασυνδυασμό [10-12]. Είναι ενδιαφέρον, ICLs προχωρά επισκευής μέσω του σχηματισμού του DNA διπλό σκέλος διαλείμματα (DSBs) που αντιπροσωπεύουν την πιο θανατηφόρα μορφή της βλάβης του DNA [13]. Ο σχηματισμός των DSBs ακολουθείται πάντα από την φωσφορυλίωση του Η2ΑΧ ιστόνης, μία παραλλαγή της οικογένειας πρωτεϊνών Η2Α, η οποία είναι ένα συστατικό του οκταμερούς ιστόνης σε νουκλεοσώματα. Η Η2ΑΧ ιστόνης φωσφορυλιώνεται από κινάσες, όπως αταξία τηλαγγειεκτασία μεταλλαγμένη (ΑΤΜ) και ATM-Rad3 σχετίζονται (ATR) στην οδό ΡΙ3Κ [14]. Αυτό το πρόσφατα φωσφορυλιωμένη πρωτεΐνη, γH2AX, είναι το πρώτο βήμα για την πρόσληψη και την εντόπιση των πρωτεϊνών επιδιόρθωσης του DNA.

Το γονιδίωμα των θηλαστικών προστατεύεται από γενοτοξική προσβολές από ένα δίκτυο ανταπόκρισης βλάβες στο DNA (DDR) μονοπάτια, τα οποία προκαλούνται από την ανίχνευση του DNA βλάβες μέσω ειδικών αισθητήρων [15]. Το επόμενο βήμα είναι η έναρξη ενός καταρράκτη μεταγωγής σήματος, το οποίο ενεργοποιεί διάφορες οδούς γονιδίωμα-προστασία. Από DDR είναι μια ολοκληρωμένη διαδικασία σηματοδότησης που καθορίζει την τύχη των κυττάρων είτε με επιδιόρθωση της βλάβης του DNA ή υποβάλλονται σε απόπτωση, ο ρόλος του έχει εμπλακεί στη διαδικασία της νόσου και για την επιτυχία της χημειοθεραπείας. Πράγματι, έχει δειχθεί ότι οι ανωμαλίες στις οδούς επιδιόρθωσης του DNA διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στην κακοήθη μετασχηματισμό του OC [16]. Επίσης, η έκφραση των πρωτεϊνών επιδιόρθωσης του DNA, όπως ο καρκίνος του μαστού 1 (BRCA1) και την επισκευή εκτομή ομάδα σταυρό συμπλήρωσης 1 (ERCC1) έχουν συσχετιστεί με φτωχή επιβίωση σε προχωρημένο OC και βρέθηκαν να είναι δείκτες της αντίστασης στα φάρμακα με βάση την πλατίνα [17- 19]. Επιπλέον, προηγούμενες μελέτες μας επικεντρώθηκαν στα επίπεδα βλάβης του DNA σε μονοπύρηνα κύτταρα περιφερικού αίματος (PBMCs) από ασθενείς με πολλαπλό μυέλωμα έχουν δείξει ότι η βλάβη του DNA θα μπορούσαν προοπτικά διάκριση μεταξύ ασθενών με διαφορετικούς βαθμούς θεραπευτικής απόκρισης, παρέχοντας τη βάση για την προ-διαλογή και επιλογή των ασθενών περισσότερες πιθανότητες να επωφεληθούν από αυτή τη θεραπεία [20-24].

Εδώ, πραγματοποιήσαμε μια μελέτη για να ελεγχθεί η υπόθεση ότι DDR, ζωτικής σημασίας μηχανισμό για την επιβίωση των κυττάρων, εμπλέκεται στην αντίσταση στη χημειοθεραπεία πλατίνα . Βρήκαμε ότι οι ασθενείς OC χαρακτηρίζεται από υψηλότερη εγγενή βλάβη του DNA σε σύγκριση με υγιείς εθελοντές, και ότι η αποτελεσματικότητα της επιδιόρθωσης του DNA όπως μετράται σε ΜΚΠΑ από ασθενείς OC συσχετίζεται με την ευαισθησία φαρμάκου αυτών των κυττάρων και αντανακλά την εξατομικευμένη απόκριση σε βάση την πλατίνα χημειοθεραπεία.

Υλικά και Μέθοδοι

ασθενείς

Όλοι οι ασθενείς που συμπεριλήφθηκαν σε αυτή την ανάλυση αντιμετωπίστηκαν σε ένα μόνο φορέα (νοσοκομείο Αλεξάνδρα, Αθήνα, Ελλάδα). Δείγματα αίματος ελήφθησαν από δεκαοχτώ (

n

= 18) των ασθενών που υποβάλλονται σε χειρουργική επέμβαση για ύποπτο καρκίνο των ωοθηκών (μέση ηλικία 62 έτη, εύρος 34-77) (Πίνακας 1) πριν από οποιαδήποτε θεραπευτική αγωγή. Εννέα (

n

= 9) υγιή άτομα, την ηλικία και το φύλο-συμφωνημένα με τους ασθενείς (όλες οι γυναίκες, μέσης ηλικίας 60 χρόνων, εύρος 29-73) έχουν χρησίμευσαν ως μάρτυρες. Όλοι οι ασθενείς είχαν ανεβεί σύμφωνα με το σύστημα στάσης FIGO. Η χημειοθεραπεία ξεκίνησε μέσα σε ένα μήνα από τη χειρουργική επέμβαση. Η πακλιταξέλη σε 175mg /m

2 σε διάστημα 3 ωρών ακολουθούμενη αμέσως από καρβοπλατίνης 5-6 AUC πάνω από 60 λεπτά χορηγήθηκαν κάθε 3 εβδομάδες. Έξι κύκλοι χημειοθεραπείας χορηγήθηκαν. Επτά ασθενείς δεν λαμβάνουν μετά την εγχείρηση χημειοθεραπεία: 3 είχαν οριακά όγκους, 1 ασθενής απεβίωσε κατά τη μετεγχειρητική περίοδο, ενώ 3 ασθενείς αρνήθηκε οποιαδήποτε θεραπεία μετά τη χειρουργική επέμβαση. ευαισθησία Platinum για τους 11 ασθενείς που έλαβαν χημειοθεραπεία πρώτης γραμμής αξιολογήθηκε σύμφωνα με τα κριτήρια [25] Γυναικολογικής Καρκίνος διακομματικής επιτροπής (GCIC). Με αυτά τα κριτήρια, υπήρχαν 4 πλατίνα ανθεκτικά και 7 ασθενείς πλατίνα-κεφαλαίων. Surviving ασθενείς θα πρέπει να έχουν μια ελάχιστη παρακολούθηση των 2 ετών. Όλοι οι συμμετέχοντες έδωσαν γραπτή συγκατάθεση σύμφωνα με τη Διακήρυξη του Ελσίνκι Αρχές, και η μελέτη εγκρίθηκε από το Διοικητικό Συμβούλιο Institutional Review του νοσοκομείο Αλεξάνδρα.

Η

θεραπεία κυττάρων

Η πλατίνα ευαίσθητο Α2780 και οι πλατίνα-ανθεκτικές κυτταρικές σειρές Α2780 /C30 [26] ευγενικά από τον Dr. George Κούκος (Καρκίνος των ωοθηκών Research Center, University of Pennsylvania School of Medicine, Philadelphia, Pennsylvania, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής). Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε μονοστιβάδα χρησιμοποιώντας RPMI 1640 που περιέχει 10% ορό εμβρύου μόσχου, 100 μg /ml στρεπτομυκίνη, 100 μονάδες /ml πενικιλλίνη, 0,3 mg /ml γλουταμίνη και 0.3unit /ml ινσουλίνης σε ένα επωαστή 37 ° C συνεχώς αέριο με 5% CO

2. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή με σισπλατίνη (0-100μg /ml για 0-24h), ακολουθούμενο από επώαση σε μέσο ελεύθερο φαρμάκου για 0-24 ώρες ή καρβοπλατίνη (0-300μg /ml για 0-24h), που ακολουθείται από μετα-επώαση σε φάρμακο -δωρεάν μέσο για 0-24h.

PBMCs απομονώθηκαν από πρόσφατα ληφθέν περιφερικό αίμα χρησιμοποιώντας τυποποιημένες μεθόδους [23]. Στη συνέχεια, τα κύτταρα διεγέρθηκαν σε πολλαπλασιασμού χρησιμοποιώντας 10 μg /ml φυτοαιμαγλουτινίνη (ΡΗΑ) επί 48 ώρες στους 37 ° C σε RPMI 1640 συμπληρωμένο με 10% FCS, 50 mg /l πενικιλλίνη, 50.000lU /l στρεπτομυκίνη και στη συνέχεια κατεργάζεται με σισπλατίνη (0-300μg /ml έως 3Η), που ακολουθείται από επώαση σε μέσο ελεύθερο φαρμάκου για 0-24 ώρες ή καρβοπλατίνη (0-1800μg /ml έως 24 ώρες), που ακολουθείται από μετα-επώαση σε μέσο ελεύθερο φαρμάκου για 0-24 ώρες.

κυτταροτοξικότητας

δοκιμασία

Μετά την αγωγή του φαρμάκου, τα βιώσιμα κύτταρα μετρήθηκαν με trypan blue dye-αποκλεισμού [27]. Εν συντομία, μετά την επώαση με το φάρμακο, τα κύτταρα πλύθηκαν και επαναιωρήθηκαν σε πλήρες μέσο. Ένας ίσος όγκος του 0,4% trypan blue αντιδραστήριο προστέθηκε στο κυτταρικό εναιώρημα και το ποσοστό των βιώσιμων κυττάρων αξιολογήθηκε. Οι δοκιμασίες διεξήχθησαν εις τριπλούν.

ηλεκτροφόρηση γέλης Single-κυττάρων (Comet δοκιμασία)

Η δοκιμασία ηλεκτροφόρηση γέλης μονοκύτταροι πραγματοποιήθηκε υπό αλκαλικές συνθήκες, όπως περιγράφεται προηγουμένως [28]. Εν συντομία, δείγματα 5×10

4 μη επεξεργασμένα ή πλατίνα κύτταρα επεξεργασμένα φάρμακο εναιωρήθηκαν σε αγαρόζη χαμηλού σημείου τήξεως (1%) σε PBS (135 mmol /l NaCl, 2,5 mmol /l ΚΟΙ, ρΗ 10) στους 37 ° C, και την εξάπλωση επάνω σε πλήρως παγωμένος πλάκες μικροσκοπίου προεπικαλυμμένα με ένα λεπτό στρώμα από το 1% της κανονικής αγαρόζης τήξεως (Biozyme, Hameln, Γερμανία). Το κυτταρικό εναιώρημα αμέσως καλύπτεται με ένα coverglass και τα πλακίδια διατηρήθηκαν στους 4 ° C για 1 ώρα για να επιτρέψει στερεοποίηση της αγαρόζης. Μετά την απομάκρυνση του coverglass, τα κύτταρα εκτέθηκαν σε ρυθμιστικό λύσης (2,5 Μ NaCl, 100 mM EDTA, 10 mM Tris-HCI, ρΗ 10, 1% Triton Χ-100) στους 4 ° C για 1 ώρα. Στη συνέχεια, τα πλακίδια τοποθετούνται σε ένα οριζόντιο θάλαμο ηλεκτροφόρηση γέλης. Ο θάλαμος πληρώθηκε με ψυχρό ρυθμιστικό ηλεκτροφόρησης (1 mM EDTA, 300mM ΝβΟΗ, ρΗ 13) και τα πλακίδια διατηρήθηκαν στους 4 ° C για 40 λεπτά για να επιτρέψει το DNA να χαλαρώσουν. Διεξήχθη ηλεκτροφόρηση για 40 λεπτά (1V /cm, 255mA). Μετά την ηλεκτροφόρηση, τα πλακίδια πλύθηκαν με ρυθμιστικό εξουδετέρωσης (0.4Μ Tris-HCl, ρΗ 7.5) για 10 λεπτά και στη συνέχεια με H

2O για 10 λεπτά. Όλα τα προπαρασκευαστικά στάδια διεξήχθησαν σε σκοτάδι για την πρόληψη της επιπλέον βλάβη του DNA. Τα πλακίδια χρωματίστηκαν με 20 μΐ 1 μg /ml DAPI και αναλύθηκαν με ένα μικροσκόπιο φθορισμού (Nikon Eclipse 400) εξοπλισμένο με μια βιντεοκάμερα CCD-4230A. Ψηφιακές εικόνες ελήφθησαν χρησιμοποιώντας ένα σύστημα ανάλυσης εικόνας (Κινητική Ανάλυση, Wirral, UK). Στιγμές της ελιάς Ουρά [ΑΥΤ = (Tail Μέση-Head Μέση) x (% του DNA) /100] από 100 κύτταρα /κατάστασης θεραπείας αξιολογήθηκαν.

Χρώση

αντιγόνο ανοσοφθορισμού και συνεστιακό λέιζερ σάρωσης ανάλυση μικροσκόπιο

Δείγματα των 2×10

4 μη επεξεργασμένα ή πλατίνα κύτταρα επεξεργασμένα φάρμακο τηρήθηκαν καλυπτρίδα επικαλυμμένο με 1Μ HCl και 50 mg /ml πολυ-D-λυσίνη πριν από τη χρήση, που καθορίζεται από την προσθήκη ενός διαλύματος παραφορμαλδεΰδης 4% για 6min σε θερμοκρασία δωματίου και φυλάχθηκαν στους -70 ° C μέχρι την ανάλυση των Patm (σερίνη-1981, Santa Cruz), Πατρ (σερίνη-428, Cell Signaling), pChk1 (σερίνη-345, Santa Cruz), pChk2 (θρεονίνη-68, Abcam) και γH2AX (σερίνη-139, Cell Signaling) [29]. Τα κύτταρα πλύθηκαν με ψυχρό PBS και αποκλείστηκαν με 0.5 ml ανά φρεάτιο ρυθμιστικό αποκλεισμού (0.1% Triton Χ-100, 0.2% αποβουτυρωμένο ξηρό γάλα σε PBS) για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου σε ένα υγροποιημένο κουτί. Αποκλεισμένοι κύτταρα επωάστηκαν με αντισώματα έναντι Patm, Πατρ, pChk1, pChk2 ή γH2AX σε ρυθμιστικό διάλυμα παρεμπόδισης στους 4 ° C για μια νύχτα. Μετά από πλύση με ρυθμιστικό διάλυμα αποκλεισμού, τα κύτταρα επωάστηκαν με αντίσωμα κατσίκας αντι-ποντικού, FITC επισημασμένο, σε συνδυασμό με γίδινο αντι-κουνελιού, TRITC επισημασμένο, για διπλή επισήμανση (Invitrogen) σε αραίωση 1: 4000 σε ρυθμιστικό αποκλεισμού για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου στο σκοτάδι. εφαρμόστηκαν καλυπτρίδες, και τα άκρα σφραγίστηκαν με σαφή βερνίκι νυχιών. Εικόνες οπτικοποιήθηκαν με Leica TCS SP-1 συνεστιακό λέιζερ μικροσκόπιο σάρωσης. Εστίες χειροκίνητα μετρήθηκαν σε 200 κύτταρα κατάσταση /θεραπεία και τα αποτελέσματα εκφράζονται ως το% των θετικών κυττάρων γH2AX (μέση ± SD) από τρία ανεξάρτητα πειράματα? Τα θετικά κύτταρα ορίζονται ως κύτταρα με περισσότερο από 5 εστιών ανά κύτταρο.

Προσδιορισμός απόπτωσης

Η απόπτωση εκτιμήθηκε με χρήση του κυττάρου Death Detection ELISA-PLUS κιτ (Roche Applied Sciences), σύμφωνα με του κατασκευαστή οδηγίες. Εν συντομία, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διάφορες δόσεις της καρβοπλατίνης (κυτταρικές σειρές, 0-300μg /ml? PBMCs, 0-1800μg /ml) για 24 ώρες και ακολούθησε επώαση σε μέσο ελεύθερο φαρμάκου για 24 ώρες. Στη συνέχεια, τα κύτταρα συλλέχθηκαν για την παρασκευή των κυτοσολικά κλάσματα που περιείχαν θραύσματα DNA. Ίσοι όγκοι αυτών των κυτοσολικά κλάσματα επωάστηκαν σε φρεάτια αντι-ιστόνης επικαλυμμένο με αντίσωμα (πλάκες 96 φρεατίων) και οι ιστόνες των θραυσμάτων DNA αφέθηκαν να συνδεθούν με τα αντισώματα αντι-ιστόνης αντισώματα. Τα αντισώματα DNA ποντικού μονοκλωνικό σημασμένο με υπεροξειδάση χρησιμοποιήθηκαν για τον εντοπισμό και την ανίχνευση του δεσμευμένου κατακερματισμένο DNA φωτομετρική ανίχνευση με 2,29-αζινο-δι- (3-αιθυλβενζθειαζολινο σουλφονικό) ως υπόστρωμα. Η δοκιμή ποσοτικοποιεί απόπτωση ως πολλαπλάσια αύξηση (εκφρασμένη ως Εμπλουτισμός Factor, EF) στο επίπεδο της απόπτωσης σε κατεργασμένα δείγματα με τα μη επεξεργασμένα δείγματα. Υπολογίσαμε την ειδική εμπλουτισμό των μονο- και ολιγο-νουκλεοσωμάτων που απελευθερώνεται στο κυτταρόπλασμα με τον ακόλουθο τύπο: (EF) = [(απορρόφηση των κατεργασμένων κυττάρων) /(απορρόφηση των κυττάρων χωρίς αγωγή φαρμάκου)]. Τέλος, το ατομικό ποσοστό απόπτωσης εκφράστηκε ως η δόση καρβοπλατίνης επαρκής για να προκαλέσει την επαγωγή ενός συγκεκριμένου Εμπλουτισμού Παράγοντα (EF = 3).

Στατιστική ανάλυση

Η αποτελεσματικότητα της επιδιόρθωσης του DNA και την επαγωγή της απόπτωσης συγκρίθηκαν μεταξύ των ομάδων των ατόμων που χρησιμοποιούν μη-παραμετρικά τεστ. Συγκεκριμένα, η ανάλυση Kruskal Wallis χρησιμοποιήθηκε για συγκρίσεις μεταξύ των τριών ομάδων, και δοκιμή αθροίσματος Wilcoxon rank για το ζεύγος σοφός συγκρίσεις. Οι συσχετίσεις μεταξύ των τιμών των διαφόρων παραμέτρων που σχετίζονται με DDR εντός των κυτταρικών σειρών ή PBMCs από τους διαφορετικούς ασθενείς OC αξιολογήθηκαν με τον συντελεστή συσχέτισης Spearman (όλες οι ομάδες μαζί). Για να εκτιμηθεί η γραμμική συσχέτιση μεταξύ της βλάβης του DNA και της δόσης φαρμάκου πλατίνα, απόπτωση και βλάβη του DNA, καθώς και την απόπτωση και παν-πυρηνική χρώση, γραμμική παλινδρόμηση από αυτές τις παραμέτρους διεξήχθη. Ένα

P

-τιμή μικρότερη από 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική. Για να ληφθεί υπόψη για πολλαπλές συγκρίσεις χρησιμοποιήθηκε η διόρθωση Bonferonni.

Αποτελέσματα

επιδιόρθωσης του DNA της πλατίνας που προκαλείται από βλάβη σε κυτταρικές σειρές καρκίνου των ωοθηκών συσχετίζεται με την ευαισθησία των ναρκωτικών αυτών των κυττάρων

Για την εξέταση των μοριακών μηχανισμών που εμπλέκονται στην ευαισθησία φαρμάκου χημειοθεραπείας πλατίνα, μεταβολές των βασικών μορίων του μονοπατιού κυτταρικής DDR (Patm, Πατρ, pChk1, pChk2, γH2AX) αξιολογήθηκαν σε δύο κυτταρικές γραμμές καρκινώματος των ωοθηκών: ένα ευαίσθητο στην πλατίνη (Α2780) και μία πλατίνα ανθεκτικά (Α2780 /C30) [26]. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή με διάφορες δόσεις σισπλατίνης (0-100μg /ml) για 0-24 ώρες και ακολούθησε επώαση σε μέσο ελεύθερο φαρμάκου για 0-24 ώρες. Αμφότερες οι κυτταρικές γραμμές έδειξαν μία εξαρτώμενη από τη δόση αύξηση στο σχηματισμό όλων των βασικών μορίων υπό μελέτη (Εικ. 1Α, D). Μέγιστα επίπεδα αυτών των μορίων παρατηρήθηκαν σε 6 ώρες μετά την αγωγή, παραμένοντας σταθερή ή μειώνεται ελαφρώς στη συνέχεια (Εικ. 1Β). Είναι ενδιαφέρον, γH2AX έδειξε τα υψηλότερα ποσοστά επαγωγής μεταξύ των βασικών μορίων που εξετάστηκαν. Η χαμηλότερη συγκέντρωση σισπλατίνης στην οποία θα μπορούσε να ανιχνευθεί επαγωγή γH2AX ήταν 2.5 μ§ /ml για 1 ώρα (Εικ. 1 C). Επιπλέον, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με καρβοπλατίνη (0-300μg /ml) για 0-24 ώρες ακολουθούμενο από μετα-επώαση σε μέσο ελεύθερο φαρμάκου για 0-24 ώρες. Παρόμοια αποτελέσματα με αυτά που λήφθηκαν από τα πειράματα σισπλατίνη βρέθηκαν. Δηλαδή, και στις δύο κυτταρικές σειρές μια δοσοεξαρτώμενη αύξηση στο σχηματισμό όλων των βασικών μορίων παρατηρήθηκε (Εικ. 1 Ε, F). Επίσης, μέγιστα επίπεδα αυτών των μορίων παρατηρήθηκαν στο τέλος της θεραπείας 24 ώρες, μειώνοντας στη συνέχεια. Και πάλι, η γH2AX έδειξε τα υψηλότερα ποσοστά επαγωγής μεταξύ των βασικών μορίων που εξετάστηκαν. Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι ανοσοφθορισμό ποσοτικοποίηση των γH2AX εστιών είναι μια ισχυρή προσέγγιση για τη μέτρηση της βλάβης του DNA που προκαλείται από φάρμακα λευκόχρυσου.

Α2780 /C30 κύτταρα (εκπρόσωπος των δύο OC κυτταρικές γραμμές) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία (Α) με σισπλατίνη (0-100μg /ml) για 3 ώρες, ή (Β) με 100 μg /ml σισπλατίνης, στη συνέχεια επωάστηκαν σε μέσο ελεύθερο φαρμάκου για διάφορες χρονικές περιόδους (0-24 ώρες), ή (C) με σχετικά μικρές δόσεις (0- 15 μg /ml) της σισπλατίνης για μέχρι 3η, και αναλύεται στο τέλος της θεραπείας με τη χρήση ομοεστιακού μικροσκοπίου. Θετικά κύτταρα: κύτταρα με περισσότερο από 5 εστίες ανά κύτταρο. Οι μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν την τυπική απόκλιση. Στο (Α) χαρακτηριστικές εικόνες που δείχνουν τα βασικά μόρια υπό μελέτη χρησιμοποιώντας ανάλυση μικροσκόπιο Α2780 /κυττάρων C30 που έλαβαν θεραπεία με 100 μg /ml σισπλατίνης για 3 ώρες? ανώτερη εικόνες, χρώση αντιγόνο ανοσοφθορισμού? κάτω εικόνες, πυρήνες κυττάρων επισημαίνονται με DAPI. (Ε) Α2780 /κύτταρα C30 υποβλήθηκαν σε αγωγή με καρβοπλατίνη (0-300μg /ml) για 24 ώρες ή (F) με 100 μg /ml καρβοπλατίνη για διάφορες χρονικές περιόδους (0-24 ώρες) και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας συνεστιακή μικροσκοπία. Οι μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν την τυπική απόκλιση. Όλες οι δοκιμασίες πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν.

Η

Τα επίπεδα του λευκόχρυσου που προκαλείται βλάβη του DNA σε δύο κυτταρικές σειρές αξιολογήθηκαν επίσης χρησιμοποιώντας δοκιμασία αλκαλικής κομήτη. Αυτή η έκδοση του κομήτη δοκιμασία ανιχνεύει τη μετανάστευση DNA που προκαλείται από τα διαλείμματα σκέλος, αλκαλική ασταθή sites, και παροδικές χώρους επισκευής [30]. Μετά την κατεργασία των κυττάρων με 0-150μg /ml σισπλατίνης για 3 ώρες (Σχ. 2Α, C) ή 0-300μg /ml καρβοπλατίνη για 24 ώρες (Εικ. 2Β, C), ένας γραμμικός δοσοεξαρτώμενη αύξηση των επιπέδων της βλάβης του DNA ελήφθη με και οι δύο κυτταρικές σειρές, που δείχνει ότι η μέθοδος έχει την ευαισθησία και την ακρίβεια για την ανίχνευση και τον ποσοτικό προσδιορισμό της πλατίνας που προκαλείται από βλάβη του DNA.

Α2780 κύτταρα /C30 (εκπρόσωπος των δύο OC κυτταρικές γραμμές) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με (Α) σισπλατίνης ( 0-150μg /ml) για 3 ώρες ή (Β) καρβοπλατίνη (0-300μg /ml) για 24 ώρες, και αναλύθηκαν στο τέλος της θεραπείας χρησιμοποιώντας κομήτη δοκιμασίας. Οι μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν την τυπική απόκλιση. Στο (C) τυπικά κομήτη εικόνες δοκιμασία Α2780 κύτταρα /C30 μη-επεξεργασμένα (ΝΤ), υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 50 μg /ml σισπλατίνης (cis-50), 100 μg /ml σισπλατίνης (cis-100), 150 μg /ml καρβοπλατίνη (καρβο-150 ) ή 300 μg /ml καρβοπλατίνη (καρβο-300). Όλες οι δοκιμασίες πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν.

Η

Επιπλέον, με τη χρήση των δύο ισχυρές προσεγγίσεις επικυρωθεί ανωτέρω, τα επίπεδα της ενδογενούς βλάβης του DNA εκτιμήθηκαν σε ακατέργαστο κυτταρικές σειρές. Τόσο χρώση ανοσοφθορισμού γH2AX και δοκιμασία αλκαλικής κομήτη έδειξαν σημαντικές διαφορές μεταξύ των δύο κυτταρικών σειρών, με την εγγενή βλάβη του DNA είναι υψηλότερο σε σχέση με το Α2780 Α2780 /κύτταρα C30. Ιδιαίτερα, χρησιμοποιώντας χρώση ανοσοφθορισμού γH2AX, τα κύτταρα Α2780 παρουσίασαν 28,8 ± 3,4% θετικά κύτταρα (δηλαδή κύτταρα με περισσότερο από 5 εστίες ανά κύτταρο) και Α2780 /C30 17,4 ± 3,4% θετικά κύτταρα (

P

= 0,01? Πίνακας 2 ). Επιπλέον, με τη χρήση κομήτη δοκιμασία, τα κύτταρα Α2780 έδειξαν τιμές ΟΤΜ 33,9 ± 5,5 αυθαίρετες μονάδες, ενώ Α2780 κύτταρα /C30 έδειξε 14,4 ± 2,9 μονάδες (

P

& lt? 0,001? Πίνακας 2).

για να επιδεικνύουν την αποτελεσματικότητα επιδιόρθωσης του DNA σε αυτά τα δύο κυτταρικές σειρές, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με καρβοπλατίνη (0-300μg /ml) για 24 ώρες που ακολουθείται από μετα-επώαση σε μέσο ελεύθερο φαρμάκου για 0-24 ώρες και της βλάβης που προκαλείται από DNA ( δηλαδή συνολική βλάβη του DNA ομαλοποιήθηκαν με την εγγενή βλάβη του DNA) αναλύθηκε στο τέλος της φαρμακευτικής αγωγής. Τόσο χρώση ανοσοφθορισμού γH2AX και Comet δοκιμασία έδειξαν σημαντικές διαφορές μεταξύ των δύο κυτταρικών σειρών. Δηλαδή, και στις δύο κυτταρικές σειρές βλάβη του DNA φθάσει υψηλότερα επίπεδα στο τέλος της θεραπείας φαρμάκου, με βλάβες στο DNA που είναι σημαντικά υψηλότερη σε σχέση με το Α2780 Α2780 /κύτταρα C30 (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Στη συνέχεια, καρβοπλατίνη επαγόμενη επίπεδα βλάβης του DNA μειώθηκαν και η έκταση της επισκευής ήταν σημαντικά χαμηλότερη σε σχέση με το Α2780 Α2780 /κύτταρα C30 (

P

& lt? 0,03). Ιδιαίτερα, χρησιμοποιώντας συνεστιακή μικροσκοπία οι εστίες γH2AX απομακρύνθηκαν με t

1/2 = 5.2 ± 0.7 ώρες σε Α2780 /κύτταρα C30 και 11,7 ± 2,6 ωρών στα κύτταρα Α2780. Με τη χρήση του κομήτη δοκιμασία, η t

1/2 τιμές για καρβοπλατίνη που προκαλείται από την επισκευή βλάβης σε Α2780 κύτταρα /C30 και Α2780 ήταν 9,9 ± 1,3 ώρες και 16,7 ± 3.4Η, αντίστοιχα.

Επίσης, ο Τομέας Κάτω από την καμπύλη (AUC) για καρβοπλατίνη προκαλούμενη βλάβη του DNA, μια παράμετρος που αντανακλά τη συνολική επιβάρυνση βλάβη του DNA που προκύπτει από τον αρχικό σχηματισμό βλάβη και επιδιόρθωση του DNA υπολογίστηκε (Πίνακας 2). Με τη χρήση χρώση ανοσοφθορισμού γH2AX, τα κύτταρα Α2780 παρουσίασαν τιμές AUC [εκφράζονται ως (% του γH2AX θετικών κυττάρων χρώση) χ (δόση καρβοπλατίνη)] των 17200 ± 3650, και Α2780 /κύτταρα C30 12400 ± 2140 (

P

= 0,01). Επιπλέον, κομήτης δοκιμασία επιβεβαίωσε τα παραπάνω ευρήματα με κύτταρα Α2780 δείχνει τιμές AUC [εκφράζονται ως (OTM χ δόση καρβοπλατίνη)] των 14900 ± 3280, ενώ τα κύτταρα Α2780 /C30 έδειξε τιμές AUC του 9400 ± 1150 (

P

= 0,01 ).

Επιπλέον, και οι δύο τύποι κυττάρων υποβλήθηκαν σε θεραπεία με διάφορες δόσεις της καρβοπλατίνης (0-300μg /ml) για 24 ώρες και την επαγωγή της απόπτωσης μετρήθηκε 24 ώρες μετά τη θεραπεία. Βρήκαμε ότι τα ποσοστά απόπτωσης ήταν υψηλότερα στα κύτταρα Α2780 ό, τι σε Α2780 /κύτταρα C30 (

P

= 0.001? Πίνακας 2). Ειδικότερα, τα κύτταρα Α2780 παρουσίασαν στοιχεία της απόπτωσης σε δόσεις καρβοπλατίνη τόσο χαμηλά όσο 43,8 ± 5.6μg /ml, ενώ Α2780 κύτταρα /C30 απαιτείται μια δόση 78.5 ± 9.2μg /ml, υποδεικνύοντας ότι η ευαισθησία των κυττάρων φάρμακο αντιστρόφως ανάλογη με το DNA τους επιδιορθωτική ικανότητα (Πίνακας 2).

ένα αξιοσημείωτο εύρημα ήταν ότι μετά καρβοπλατίνη θεραπεία, ένα κλάσμα των κυττάρων έδειξαν διάχυτη, φωτεινό χρώση παν-πυρηνικά γH2AX. Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι η χρώση παν-πυρηνικό γH2AX αντιπροσωπεύει ένα προ-αποπτωτικό σήμα που σχετίζεται με ATM- και JNK εξαρτώμενη απόπτωση κατά τη διάρκεια της αντιγραφής του [31]. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα από τα πειράματα αποτελεσματικότητας επιδιόρθωσης του DNA, παρατηρήσαμε υψηλότερα επίπεδα χρώσης παν-πυρηνικά γH2AX [εκφράζονται ως AUC (% των κυττάρων παν-πυρηνική χρώση) χ (δόση καρβοπλατίνη)] στα κύτταρα Α2780 (13400 ± 2850) από ό, τι σε Α2780 /κυττάρων C30 (7500 ± 1760) (

P

= 0,001, Πίνακας 2).

Ελλιπής επιδιόρθωσης του DNA του λευκόχρυσου που προκαλείται βλάβη σε ΜΚΠΑ ασθενών OC συσχετίζεται με καλύτερη κλινική έκβαση

Όσον αφορά PBMCs, σε συμφωνία με προηγούμενες μελέτες [32], βρήκαμε ότι παρατηρήθηκαν μετά τη θεραπεία της μη-διαιρούμενα PBMCs με φάρμακα λευκόχρυσου, πολύ χαμηλή ή μηδενική ποσοστά επαγωγής από τα βασικά μόρια υπό μελέτη. Ως εκ τούτου, πρώτα επεξεργασία PBMCs από εννέα υγιείς εθελοντές με διάφορες δόσεις ΡΗΑ για μέχρι 72 ώρες για την επαγωγή του πολλαπλασιασμού των κυττάρων. Βέλτιστη αποτελέσματα ελήφθησαν ακόλουθη 48h επώαση των PBMC με 10 μg /ml ΡΗΑ (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Στη συνέχεια, PBMCs υποβλήθηκαν σε θεραπεία με σισπλατίνη (0-300μg /ml έως 3η) που ακολουθείται από επώαση σε μέσο ελεύθερο φαρμάκου για 0-24 ώρες ή με καρβοπλατίνη (0-1800μg /ml έως 24 ώρες) που ακολουθείται από μετα-επώαση σε μέσον άνευ φαρμάκου για 0-24 ώρες. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα από τα πειράματα κυτταρικές γραμμές, είτε των φαρμάκων πλατίνας, μία επαγωγή δοσο-εξαρτώμενη όλων των βασικών μορίων παρατηρήθηκε (Εικ. 3Α, C), με το γH2AX δείχνει πάλι τα υψηλότερα ποσοστά επαγωγής (Εικ. 3Β , D). Επιπλέον, τα επίπεδα της πλατίνας που προκαλείται βλάβη στο DNA σε ΜΚΠΑ από τους ίδιους εννέα υγιείς εθελοντές μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας δοκιμασία αλκαλικής κομήτη. Βρήκαμε επίσης ότι η

ex vivo

θεραπεία των PBMCs με σισπλατίνη (Σχ. 3Ε) ή η καρβοπλατίνη (Σχ. 3F) έδειξε μια δοσοεξαρτώμενη αύξηση των επιπέδων βλάβης του DNA. Λαμβανόμενα μαζί, τα αποτελέσματα από τις δύο κυτταρικές σειρές και τα πειράματα δείχνουν ότι PBMCs ανοσοφθορισμό ποσοτικοποίηση γH2AX εστιών και αλκαλικών κομήτη προσδιορισμού είναι δύο ισχυρές προσεγγίσεις για τον ποσοτικό προσδιορισμό της πλατίνας που προκαλείται βλάβη στο DNA σε κλινικά δείγματα.

PBMCs από εννέα υγιείς εθελοντές ήταν

ex vivo

αγωγή (Α) με σισπλατίνη (0-300μg /ml) για 3 ώρες ή (Β) με 150 μg /ml σισπλατίνης, στη συνέχεια επωάστηκαν σε μέσο ελεύθερο φαρμάκου για διάφορες χρονικές περιόδους (0- 24h), και αναλύθηκαν εν συνεχεία με τη χρήση ομοεστιακού μικροσκοπίου. Επίσης, PBMCs από τους ίδιους υγιείς εθελοντές υποβλήθηκαν σε αγωγή (C) με καρβοπλατίνη (0-1800μg /ml) για 24 ώρες ή (D) με 1400μg /ml καρβοπλατίνη για διάφορους χρόνους (0-24 ώρες) και αναλύθηκαν στο τέλος της θεραπείας με τη χρήση ομοεστιακό μικροσκόπιο. Οι μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν την τυπική απόκλιση. Τέλος, PBMCs υποβλήθηκαν σε θεραπεία με (Ε) σισπλατίνης (0-150μg /ml) για 3 ώρες ή (F) καρβοπλατίνη (0-1800μg /ml) για 24 ώρες και αναλύθηκε στη συνέχεια χρησιμοποιώντας κομήτη δοκιμασίας. οικόπεδα κουτί δείχνουν στατιστική κατανομή των επιπέδων των βλαβών του DNA. Οι οριζόντιες γραμμές μέσα στα κουτιά αντιπροσωπεύουν την μέση αξίες και οι κατακόρυφες γραμμές που εκτείνονται πάνω και κάτω από το πλαίσιο δείχνουν μέγιστες και ελάχιστες τιμές, αντίστοιχα. Όλες οι δοκιμασίες πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν.

Η

Στη συνέχεια, χρησιμοποιώντας αυτές τις δοκιμασίες εξετάσαμε τις εγγενείς επίπεδα βλάβης του DNA σε χωρίς αγωγή PBMCs από τους τρεις ομάδες ατόμων (υγιείς εθελοντές, ασθενείς ευαίσθητους και ασθενείς ανθεκτικούς σε χημειοθεραπεία πλατίνα ). Τόσο γH2AX χρώση ανοσοφθορισμού και comet assay έδειξε σημαντικές διαφορές μεταξύ των τριών ομάδων ατόμων (όλα

P

& lt? 0,05? Πίνακα 3), με την εγγενή βλάβη του DNA να είναι υψηλότερη σε ασθενείς OC από ό, τι σε υγιείς εθελοντές. Είναι ενδιαφέρον ότι, σύμφωνα με τα αποτελέσματα από τις γραμμές πειράματα κύτταρο καρκινώματος των ωοθηκών, τα υψηλότερα επίπεδα των εγγενών βλάβη του DNA παρατηρήθηκαν σε ΜΚΠΑ από ασθενείς με ευαίσθητο σε σύγκριση με εκείνα ανθεκτικά σε μεταγενέστερη χημειοθεραπεία πλατίνα (γH2AX,

P

= 0,05? Κομήτη δοκιμασία,

P

= 0.003? Πίνακας 3? Σχ 4Α-D).. Ιδιαίτερα, χρησιμοποιώντας χρώση ανοσοφθορισμού γH2AX, οι ασθενείς πλατίνα ευαίσθητο παρουσίασαν 16,8 ± 2,3% θετικά κύτταρα, οι ασθενείς πλατίνα ανθεκτικά 8,9 ± 2,4%, ενώ υγιείς εθελοντές έδειξε 3.9 ± 1.2% θετικά κύτταρα (Πίνακας 3? Εικ. 4Α). Με τη χρήση κομήτη δοκιμασία, οι ασθενείς ευαίσθητοι σε χημειοθεραπεία πλατίνα έδειξε ΟΤΜ τιμές των 20,1 ± 5,5 αυθαίρετες μονάδες, πλατίνα ανθεκτικά 7,8 ± 2,5, ενώ υγιείς εθελοντές έδειξε 2.4 ± 1.1 μονάδες (Πίνακας 3? Εικ. 4C). Είναι ενδιαφέρον, για να επιβεβαιωθεί ότι οι διαφορές στα σήματα DDR είναι πραγματικά αντανακλαστική ευαισθησίας πλατίνας αντί τύπο όγκου, οι ασθενείς που φέρουν το ίδιο histotype χωρίστηκαν σε ευαίσθητα και ανθεκτικά σε θεραπεία πλατίνα και τα επίπεδα της ενδογενούς βλάβη του DNA συγκρίθηκαν. Αν και κάθε υποομάδα περιέχει ένα μικρό αριθμό δειγμάτων, τα αποτελέσματα έδειξαν ότι οι διαφορές στα επίπεδα ενδογενούς βλάβης DNA είναι αντανακλαστική της ευαισθησίας πλατίνα. Για παράδειγμα, σε μόνο ορώδες όγκους, χρησιμοποιώντας χρώση γH2AX, ευαίσθητους ασθενείς (

n

= 6) έδειξε υψηλότερα επίπεδα εγγενών βλαβών του DNA (μέση τιμή, 16,6% θετικά κύτταρα? Εύρος, 13,1 έως 23,2%) από ό, τι ανθεκτικά ασθενής (

n

= 1? 7,5%). Επιπλέον, σε σαφή καρκίνο των ωοθηκών κύτταρο μόνο, ευαίσθητη ασθενής (

n

= 1) παρουσίασαν 18,5% θετικά κύτταρα, ενώ ανθεκτικά ασθενείς (

n

= 3) μόνο 9,4% (εύρος, 6.3 -13,7%). Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν με τη χρήση κομήτη δοκιμασία.

(Α) οικόπεδα Box δείχνει στατιστική κατανομή των επιπέδων της ενδογενούς βλάβης του DNA σε μη επεξεργασμένα ΜΚΠΑ χρησιμοποιώντας ανοσοφθορισμού ποσοτικοποίηση των γH2AX. HV, υγιείς εθελοντές? Sens: OC ασθενείς ευαίσθητοι σε επακόλουθη θεραπεία πλατίνα? Res: OC ασθενείς ανθεκτικοί σε επακόλουθη θεραπεία της πλατίνας. (Β) χαρακτηριστικές εικόνες από συνεστιακό ανάλυση laser μικροσκόπιο σάρωσης των PBMCs από τις τρεις ομάδες? ανώτερη εικόνες, χρώση γH2AX? κάτω εικόνες, πυρήνες κυττάρων επισημαίνονται με DAPI. οικόπεδα (C) Box δείχνει στατιστική κατανομή των επιπέδων της ενδογενούς βλάβης του DNA σε μη επεξεργασμένα ΜΚΠΑ χρησιμοποιώντας δοκιμασία αλκαλικής κομήτη. (Δ) Τυπικά κομήτη εικόνες από ανεπεξέργαστα PBMCs από τις τρεις ομάδες ατόμων. οικόπεδα Box δείχνει στατιστική κατανομή των επιπέδων της βλάβης του DNA σε PBMCs διεγείρονται σε πολλαπλασιασμό χρησιμοποιώντας ΡΗΑ και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με καρβοπλατίνη (0-1800μg /ml) για 24 ώρες, χρησιμοποιώντας (Ε) ανοσοφθορισμό ποσοτικοποίηση των γH2AX και ποσοτικός προσδιορισμός της αλκαλικής κομήτη (F). Οι οριζόντιες γραμμές μέσα στα κουτιά αντιπροσωπεύουν την μέση αξίες και οι κατακόρυφες γραμμές που εκτείνονται πάνω και κάτω από το πλαίσιο δείχνουν μέγιστες και ελάχιστες τιμές, αντίστοιχα. Όλες οι δοκιμασίες πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν.

Η

Για να εξεταστεί η αποδοτικότητα αποκατάστασης του DNA στις τρεις ομάδες ατόμων, μετά από 48 ώρες επώαση των PBMCs με 10 μg /ml ΡΗΑ, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με καρβοπλατίνη (0 -1800μg /ml) για 24 ώρες, μετά επωάστηκαν σε μέσο ελεύθερο φαρμάκου για 0-24 ώρες και της επαγόμενης βλάβης του DNA αναλύθηκε. Τόσο γH2AX χρώση ανοσοφθορισμού και comet assay έδειξε παρόμοια αποτελέσματα. Δηλαδή, σε όλα τα άτομα που αναλύθηκαν βλάβη του DNA φθάσει υψηλότερα επίπεδα στο τέλος της θεραπείας φαρμάκου, με βλάβη του DNA είναι υψηλότερη σε ασθενείς OC ό, τι σε υγιείς εθελοντές? ασθενείς πλατίνα ευαίσθητο έδειξαν υψηλότερα επίπεδα βλάβης του DNA από πλατίνα ανθεκτικά αυτά (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Στη συνέχεια, τα επίπεδα βλάβη του DNA εξαλείφθηκαν και η έκταση της επισκευής ήταν υψηλότερη σε υγιείς εθελοντές σε σύγκριση με τους ασθενείς. Είναι ενδιαφέρον ότι, σύμφωνα με τα αποτελέσματα από τα πειράματα κυτταρικές σειρές, οι ασθενείς πλατίνα ευαίσθητο έδειξε σημαντικά χαμηλότερη απόδοση επισκευής από πλατίνα ανθεκτικά αυτά (

P

& lt? 0,03). Ιδιαίτερα, χρησιμοποιώντας συνεστιακή μικροσκοπία οι εστίες γH2AX απομακρύνθηκαν με t

1/2 = 2.7 ± 0.5 ώρες στους υγιείς μάρτυρες, 8,8 ± 1,9 ώρες σε πλατίνα ανθεκτικά και 15,4 ± 3.2Η σε ασθενείς πλατίνα-κεφαλαίων.