Αφηρημένο

Πρόσφατα στοιχεία δείχνουν Myc – ένα πολύπλευρο παράγοντα μεταγραφής bHLHZip απελευθερωθεί στην πλειονότητα των ανθρώπινων καρκίνοι – ως στόχο προτεραιότητας για θεραπεία. Πώς να στοχεύσετε Myc είναι λιγότερο σαφής, δεδομένης της συμμετοχής της σε μια ποικιλία των βασικών λειτουργιών σε υγιή κύτταρα. Εδώ θα υποβάλει έκθεση σχετικά με το μηχανισμό δράσης της παρεμβολής μορίου Myc ονομαζόμενα Omomyc, η οποία κατέδειξε εκπληκτική θεραπευτική αποτελεσματικότητα σε διαγονιδιακά μοντέλα καρκίνου του ποντικιού

in vivo

. Omomyc δράση είναι διαφορετική από εκείνη που μπορεί να επιτευχθεί με γονιδιακή knockout ή παρεμβολή RNA, προσεγγίσεις σχεδιασμένο να μπλοκάρει όλες τις λειτουργίες ενός προϊόντος γονιδίου. Αυτό το μόριο – αντί – φαίνεται να προκαλεί μια άκρη ειδική διαταραχή που καταστρέφει κάποια πρωτεΐνη αλληλεπιδράσεις του κόμβου Myc και κρατά άλλους άθικτο, με αποτέλεσμα την αναμόρφωση της μεταγραφικό Myc. Omomyc στοχεύει επιλεκτικά Myc αλληλεπιδράσεις πρωτεΐνης: δεσμεύεται C- και N-myc, Max και Miz-1, αλλά δεν δεσμεύεται Mad ή επιλέξτε πρωτεΐνες HLH. Συγκεκριμένα, εμποδίζει Myc σύνδεση με υποκινητή E-κουτιά και τρανσενεργοποίηση των γονιδίων στόχων, διατηρώντας Miz-1 εξαρτάται από δέσμευση σε υποστηρικτές και διακαταστολής. Αυτό συνοδεύεται από ευρεία επιγενετικές αλλαγές, όπως η μείωση ακετυλίωση και αυξημένη μεθυλίωση σε H3 λυσίνη 9. Με την παρουσία του Omomyc, η interactome Myc διοχετεύεται στην καταστολή και τη δράση της φαίνεται να μεταβείτε από ένα προ-ογκογόνο σε ένα κατασταλτικό όγκου ενός. Δεδομένου του έκτακτου θεραπευτική επίδραση του Omomyc σε ζωικά μοντέλα, τα δεδομένα αυτά υποδεικνύουν ότι επιτυχώς στόχευση Myc για τη θεραπεία του καρκίνου μπορεί να απαιτεί μια παρόμοια δράση διπλή, προκειμένου να αποτραπεί Myc /Max σύνδεσης προς Ε-κουτιά και, ταυτόχρονα, να τηρούν την καταστολή γονιδίων ότι θα κατασταλεί από Myc

Παράθεση:. Savino Μ, Annibali D, Carucci Ν, Favuzzi Ε, Cole MD, Evan GI, et al. (2011) Ο μηχανισμός δράσης της Myc αναστολέα ονομάζεται Omomyc μπορεί να δώσει ενδείξεις για το πώς να Target Myc για Θεραπεία Καρκίνου. PLoS ONE 6 (7): e22284. doi: 10.1371 /journal.pone.0022284

Επιμέλεια: Laszlo Tora, Ινστιτούτο Γενετικής και Μοριακής και Κυτταρικής Βιολογίας, Γαλλία

Ελήφθη: 2 Νοεμβρίου, 2010? Αποδεκτές: 23 του Ιουνίου του 2011? Δημοσιεύθηκε: 21 Ιούλη 2011

Copyright: © 2011 Savino et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από ερευνητικές επιχορηγήσεις από AIRC, ASI, MIUR και Fondazione Guido Berlucchi (SN), μια αρκούδα Ανάγκες επιχορήγηση Παιδιατρικό Ίδρυμα Καρκίνου (LS), ένα CNR βραχυπρόθεσμη υποτροφιών κινητικότητας (SN) και από το CNR – Sapienza University υποτροφίες PhD (MS, DA). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

myc μετεγγραφικών ρυθμιστών – C-, Ν- και L-myc – είναι βασικές, έλικα-βρόχος-έλικα, φερμουάρ λευκίνης (bHLHZip) πρωτεΐνες που δεσμεύονται με μια σειρά από γονιδιωματικές θέσεις είτε επάγουν ή καταστέλλουν τη μεταγραφή του γονίδια σημαντικά για την ανάπτυξη των κυττάρων, το μεταβολισμό και διαφοροποίηση [1] – [4]. Αυτοί οι παράγοντες – ειδικά c-Myc και Ν-Myc – είναι απελευθερωμένη στην πλειονότητα των ανθρώπινων καρκίνων. Αυτό δεν είναι συνήθως οφείλεται σε

Myc

γονιδιακή μετάλλαξη, αλλά τα αποτελέσματα από την ανάντη μεταλλάξεις επηρεάζουν άλλα ογκογονίδια ή καταστολείς των όγκων. έτσι Myc δραστηριότητα φαίνεται ότι απαιτείται για την ανάπτυξη και συντήρηση της πλειοψηφίας των όγκων, ακόμη και όταν κινείται από άλλες αιτίες. Σε όγκων που διεγείρονται από Myc αυξητική ρύθμιση σε διαγονιδιακά ποντίκια, ακόμη και σύντομη Myc απενεργοποίησης ενεργοποιεί υποχώρηση του όγκου συνοδεύεται από αναστολή της ανάπτυξης, διαφοροποίησης, και την κατάρρευση του αγγειακού συστήματος του όγκου [5]. Myc λειτουργεί μέσα σε ένα ιδιαίτερα διασυνδεδεμένο δίκτυο interactome και μια πιθανή στρατηγική για τη στόχευση myc ογκογόνο λειτουργία είναι κυρίαρχη παρέμβαση των πρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεων myc. Από την άποψη αυτή, Myc τομέα ολιγομερισμού – η περιοχή bHLHZip – αποδείχθηκε ότι είναι ικανή να δεσπόζει αναστολής Myc μετασχηματισμού ικανότητα σε κύτταρα εμβρύου αρουραίου ινοβλαστών [6], [7]. Αυτός ο τομέας μεσολαβεί στην άμεση αλληλεπίδραση με Max και ειδική ακολουθία συνδέσεως με ειδικές σειρές συναίνεσης – τα κουτιά E – σε προαγωγούς των ενεργοποιημένων γονιδίων στόχων. Ο τομέας bHLHZip εμπλέκεται επίσης στην αλληλεπίδραση με άλλους εταίρους – όπως Miz-1 – που διαμεσολαβούν μεταγραφική καταστολή από Myc [4], [8]. Να παρεμβαίνει με Myc αλληλεπιδράσεων πρωτεΐνης-πρωτεΐνης, έχουμε αναπτύξει μια κυρίαρχη αρνητική μόριο με την εισαγωγή τεσσάρων επιλεγμένων μεταλλάξεων στην περιοχή bHLHZip της ανθρώπινης c-Myc. Το προκύπτον miniprotein οξύ 90 αμινο – ονομάζεται Omomyc για την ικανότητά του να σχηματίζει ομοδιμερή – είναι ικανή να αναστείλει c-Myc /ένωση Max, να επηρεάσει μεταγραφική ενεργοποίηση από το c-myc, και για την ενίσχυση της c-Myc εξαρτώμενη απόπτωση σε κύτταρα καλλιέργειας ιστού [9 ], [10]. Αποδείχθηκε για την πρόληψη της c-Myc επαγόμενη θηλωμάτωση

in vivo

χωρίς να επηρεάζουν την ομοιοστασία του ιστού [11] που υποδηλώνει μια ικανότητα στόχευσης κυττάρων όγκου χωρίς να καταστραφεί το φυσιολογικό ιστό.

Παρά διάχυτη ρόλο του στην ανθρώπινη καρκίνο, Myc συναντήθηκε με αρκετό σκεπτικισμό ως θεραπευτικός στόχος από την απαίτηση της για τον πολλαπλασιασμό και τη συντήρηση των ενηλίκων διαμερισμάτων βλαστικών κυττάρων εγείρει ανησυχίες σχετικά με την τοξικότητα της αναστολής Myc για υγιείς ιστούς [12], [13]. Εν μέρει, χάρη στην εργασία επί Omomyc του δυναμικού των Myc ως ένας θεραπευτικός στόχος είναι πλέον διαδεδομένος. έχουν πολλές αμφιβολίες σχετικά με επιλεκτικότητα για τους όγκους έχουν διαλυθεί από μελέτες που δείχνουν ότι παροδικά αναστέλλοντας Myc στο δέρμα, εντερικό επιθήλιο και άλλους ιστούς δεν μεταβάλλει δραματικά την ομοιόσταση των ιστών [11], [14], [15]. Η αποτελεσματικότητα και η ασφάλεια του Myc στόχευσης

à la Omomyc

έχει οριστικά αποδειχθεί με αναστρέψιμη έκφραση Omomyc σε διαγονιδιακά μοντέλα [16], [17]. Συστημική έκφραση Omomyc εξασθενημένων πολλαπλασιασμού σε ταχέως διαιρούμενα ιστούς, αλλά αυτό ήταν καλά ανεκτή? ομοιοστασία του ιστού διατηρήθηκε, δεν απόπτωση παρατηρήθηκε σε φυσιολογικούς ιστούς και όλα παρενέργειες ήταν εύκολα αναστρέφεται μετά την απομάκρυνση Omomyc. Στο Ras με γνώμονα όγκους του πνεύμονα, η επίπτωση της Omomyc ήταν εντυπωσιακή. Ποντίκια συνεχώς εκφράζοντας Omomyc απέτυχαν να αναπτύξουν αδενοκαρκίνωμα του πνεύμονα. Σε ποντικούς που είχαν προηγουμένως αναπτυχθεί προχωρημένου καρκίνου, η επαγωγή της Omomyc προκάλεσε υποχώρηση του όγκου η οποία συνοδεύτηκε από μειωμένη πολλαπλασιασμό και αυξημένη απόπτωση του ιστού του όγκου [16]. Μια ανάλογη αντικαρκινική επίδραση βρέθηκε σε ιό πιθήκου 40 (SV40) καθοδηγούμενου μοντέλο παγκρεατικού όγκου των νησίδων [17], στον καρκίνο του μαστού (G. Evan, προσωπική επικοινωνία) και γλοιώματος (υπό προετοιμασία). Έτσι, το χειρισμό λειτουργία Myc παρόμοια με Omomyc θα μπορούσε να έχει τη δυνατότητα μιας αποτελεσματικής αντικαρκινικής στρατηγική για διάφορους τύπους όγκων.

Εν όψει των εντυπωσιακές ιδιότητες αυτού του μορίου, είναι εξαιρετικά σχετικοί με την διαλεύκανση του μηχανισμού δράσης της. Omomyc βιολογικές επιδράσεις είναι απλά τα αποτελέσματα των

tout court

Myc λειτουργία αφαίρεσης, όπως θα συμβεί με Myc γονίδιο ή knockouts mRNA; Είναι σαφές ότι, για να εξηγήσει τις αξιοσημείωτες ιδιότητες του Omomyc, είναι σημαντικό να καταλάβουμε αν αυτά προκύπτουν από την επιλεκτική στόχευση του interactome Myc και πώς έχουν επίπτωση στις Myc ενεργοποιηθεί και να κατασταλεί στόχους. Τα ζητήματα αυτά εξετάζονται στην παρούσα εργασία.

Τα στοιχεία μας δείχνουν ότι Omomyc δεν προκαλεί μια παγκόσμια αναστολή της Myc λειτουργία, αλλά δρα ως ακμή-ειδική διαταραχή του interactome Myc, διοχετεύοντας τη δράση της προς διακαταστολής. Αυτό μπορεί να είναι το κλειδί για την επιτυχία της ως αντικαρκινικού παράγοντα.

Αποτελέσματα

Omomyc στοχεύει επιλεκτικά το Myc interactome

Η άμεση φυσική αλληλεπίδραση με την πρωτεΐνη bHLHZip Max είναι ζωτικής σημασίας για τη λειτουργία Myc : το συγκρότημα Myc /Max δεσμεύει DNA – αναγνωρίζοντας E-κουτιά – και λειτουργεί ως μεταγραφικός ενεργοποιητής [18]. Omomyc είναι σε θέση να homodimerize, για να σχηματίσει ετεροδιμερή με πρωτεΐνες c-Myc και Max, και να παρεμβαίνει με το σχηματισμό συμπλόκου c-Myc /Max και σύνδεσης προς Ε-boxes in vitro [9], [10]. Για την καλύτερη αντιμετώπιση Omomyc επιλεκτικότητα ερευνήσαμε την ικανότητά της να δεσμεύει Ν-Myc – που μοιράζεται ουσιαστική λειτουργική εφεδρεία με c-Myc και έχει σημαντικό ρόλο στο σχηματισμό όγκων στο νευρικό σύστημα -, Mad – μια αυστηρά σχετικό παράγοντα bHLHZip που διμερίζεται με τον Max, δεσμεύεται E-κουτιά και δρα ως μεταγραφικός καταστολέας [4] -, Εβρ και ID1 – δύο πρωτεΐνες HLH εκπρόσωπος μιας μεγάλης οικογένειας των μεταγραφικών ρυθμιστών εμπλακεί σε αναπτυξιακές διαδικασίες [19]. Για να εκτιμηθεί η ικανότητα να δεσμεύει Ν-Μγο πραγματοποιήσαμε ανοσοκαταβυθίσεις σε κύτταρα 293Τ που εκφράζουν εκτοπικά Omomyc συντηγμένο με το οιστρογόνο ER υποδοχέα ™ – Omomer [10] – μαζί με FLAG ετικέτα C- ή Ν-Myc. Βρήκαμε ότι Omomyc συνδέεται με Ν-Μγο παρομοίως με c-Myc (Σχήμα 1Α), σε συμφωνία με το εικονικό ταυτότητα των αλληλουχιών περιοχής bHLHZip αμινοξέων των πρωτεϊνών της οικογένειας Myc. Για να αξιολογηθεί δέσμευση σε Max, το Mad και των δύο πρωτεϊνών HLH Εβρ (μια πρωτεΐνη Ε) και ID1 πραγματοποιήσαμε αναλύσεις pull-down με GST-συνδέονται Max, Mad, Εβραίους και ID1 σε εκχυλίσματα κυττάρων 293Τ εκτοπικά εκφράζουν FLAG-tagged Omomyc. Λαμβάνοντας υπόψη ότι η δέσμευση σε Max ήταν ισχυρή, όπως αναφέρθηκε προηγουμένως [9], Omomyc σύνδεση με το Mad ήταν μόλις ορατό και δεσμευτική για Εβραίους και id1 ήταν μη ανιχνεύσιμη (Εικόνα 1Β). Το εξασθενημένο σήμα στο GST-Mad pull-down είναι πιθανόν να οφείλεται στις πολύ υψηλά επίπεδα έκφρασης FLAG-Omomyc στα επιμολυσμένα κύτταρα και δεν αντικατοπτρίζουν τις φυσιολογικές αλληλεπίδραση μεταξύ των δύο πρωτεϊνών. Περιληπτικά, βρήκαμε ότι ειδικότητα πρόσδεσης Omomyc για Max και Mad πρωτεΐνες ήταν η ίδια όπως Myc. Ομοίως με Myc, Omomyc δεν φαίνεται να αλληλεπιδρά με τις πρωτεΐνες HLH και ως εκ τούτου δεν δρα διαταράσσοντας δίκτυα πρωτεΐνη HLH ζωτικής σημασίας για τον έλεγχο της διαφοροποίησης [20] – [22]. Στη συνέχεια ζήτησαν wether Omomyc αλληλεπίδρασε με την υποξία παράγοντα 1-άλφα (HIF-1α), μια πρωτεΐνη που λειτουργεί ως ρυθμιστής κύριος μεταγραφικός της προσαρμοστικής απόκρισης υποξίας, παίζει σημαντικό ρόλο στην αγγειογένεση των όγκων και δείχνει μια σημαντική αλληλεπίδραση με Myc στη ρύθμιση πολλαπλών γλυκολυτικά γονίδια [23] – [25]. HIF-1α περιέχει έναν τομέα bHLH και ανταγωνίζεται Myc δια συνδέσεως με Max [24]. Για να διερευνήσουν Omomyc σύνδεση με HIF-1α πραγματοποιήσαμε ανοσοκαταβυθίσεις σε κύτταρα 293Τ εκτοπικά εκφράζουν FLAG ετικέτα Omomyc μαζί με HIF-1α. Βρήκαμε (Εικ. 1C) ότι Omomyc δεν δεσμεύει HIF-1α, ενώ Max έχει όπως αναφέρθηκε. Συνολικά, αυτά τα πειράματα δείχνουν σαφώς ότι Omomyc είναι Myc-Max-Mad δίκτυο ειδικών και – εντός αυτού του δικτύου – επηρεάζει επιλεκτικά Myc /Max διμερισμό, απαιτούνται για δέσμευση Myc στο E-κουτιά και μετενεργοποίηση ενός μεγάλου αριθμού γονιδίων

Α) Omomyc δεσμεύει c-Myc και Ν-Myc. Ανοσοαποτύπωση (WB) με αντισώματα FLAG και ER – όπως αναφέρεται – των ανοσοκαταβυθίσεις πραγματοποιήθηκαν με αντισώματα σημαία σε 293Τ κύτταρα επιμολυσμένα με FLAG-c-myc ή FLAG-Ν-Myc που εκφράζουν οι φορείς μαζί με τον φορέα έκφρασης Omomer. Β) Omomyc δεσμεύει Max, αλλά όχι τρελός και δύο αντιπροσωπευτικών πρωτεϊνών HLH. Ανοσοκηλίδωση (WB) με αντισώματα FLAG της GST προσδιορισμοί pull-down εκτελείται με GST, GST-MAX, GST-MAD, GST-ID 1 και GST-HEB (10 μg έκαστο) σε κύτταρα 293Τ επιμολυσμένα με τον φορέα έκφρασης FLAG-Omomyc. 293Τ κύτταρα επιμολυσμένα με ID2 ή FLAG-13I [65] που εκφράζουν φορείς χρησιμοποιήθηκαν ως θετικός έλεγχος για GST-HEB και GST-ID1, αντίστοιχα. Αποσπάσματα από βακτήρια που εκφράζουν His-MAX χρησιμοποιήθηκαν ως θετικοί μάρτυρες για GST-MAX και GST-MAD. C) Omomyc δεν δεσμεύει HIF-1α. Ανοσοαποτύπωση (WB) με HIF-1α, Max και FLAG αντισώματα – όπως αναφέρεται – των ανοσοκαταβυθίσεις πραγματοποιήθηκαν με αντισώματα σημαία σε 293Τ κύτταρα επιμολυσμένα με HIF-1α, Max και FLAG-Omomyc φορείς έκφρασης. Δ) Omomyc δεσμεύει Miz-1. Ανοσοαποτύπωση (WB) με Miz-1 και ER αντισώματα – όπως αναφέρεται – των ανοσοκαταβυθίσεις πραγματοποιήθηκαν με Miz-1 αντισωμάτων σε κύτταρα 293Τ συνεπιμολύνθηκαν με Miz-1 και Omomer φορείς έκφρασης

Η

Μια βασική πτυχή της Myc. λειτουργία είναι μετακαταστολή πολλών γονιδίων που εμπλέκονται στον έλεγχο της ανάπτυξης, της διαφοροποίησης και καταστολή όγκου [4]. Αυτή η δραστηριότητα δεν φαίνεται να εμπλέκει δέσμευση σε E-κουτιά άμεση Myc. Myc προσλαμβάνεται στους φορείς προώθησης των καταπιεσμένων γονιδίων μόνο έμμεσα, κατά την αλληλεπίδραση με πρωτεΐνες που δεσμεύουν άμεσα σε τέτοιου είδους υποκινητές. Η πιο γνωστή από αυτές είναι Miz-1, μια πρωτεΐνη δακτύλου ψευδαργύρου που εμπλέκονται στην εξαρτώμενη Myc καταστολή των αναστολέων του κυτταρικού κύκλου – Ρ15-INK4b (εξαρτώμενη από κυκλίνη κινάση 4 αναστολέας Β) και p21 (CDKN1: εξαρτώμενη από κυκλίνη αναστολέα κινάσης 1) – και σε εξαρτώμενη Myc απόπτωση σε απόκριση στην απόσυρση αυξητικού παράγοντα [26] – [29]. Προφανώς σε συγκρότημα με τον Max, Myc επαφές περιοχή Miz-1 Ν-τερματικό μέσω του θέσεις αμινοξέων D394 και S405 [28] που βρίσκονται στην περιοχή HLH. Δεδομένου ότι αυτές οι περιοχές δεν έχουν μεταλλαχθεί σε Omomyc, υποθέσαμε ότι Omomyc διατήρησε την ικανότητα να δεσμεύουν Miz-1. Δοκιμάσαμε αυτή τη δυνατότητα μέσω ανοσοκαθίζησης σε κύτταρα 293Τ εκτοπικά εκφράζουν Omomer και Miz-1. Το Σχήμα 1D δείχνει ότι Omomyc αλληλεπιδρά άμεσα με Miz-1. Η ενδογενής Miz-1 αναφέρθηκε να συσσωρεύεται στο κυτταρόπλασμα των κυττάρων, με ένα μικρό κλάσμα στον πυρήνα? υπερέκφραση myc προκαλεί πυρηνική μετατόπιση του Miz-1 και την παγίδευση σε διακριτές subnuclear εστίες [30]. Για τη διερεύνηση της αλληλεπίδρασης και ενδοκυτταρικό εντοπισμό του Omomyc, Omomyc /Miz-1 και Omomyc /σύμπλοκα c-myc, εμείς κύτταρα 293Τ με FLAG ετικέτα Omomyc ή c-Myc πλασμιδίων που εκφράζουν από κοινού με πλασμίδια που εκφράζουν μη επισημασμένη Miz-1 και C-Myc, και ανιχνεύεται πρωτεΐνη εντοπισμός με ανοσοφθορισμό με αντι FLAG, c-Myc, και Miz-1 αντισώματα (Σχήμα 2). Σε κύτταρα επιμολυσμένα με μονά πλασμίδια έκφρασης, Miz-1 ήταν ως επί το πλείστον (περίπου 90%) εντοπίζεται στο κυτταρόπλασμα, όπως αναφέρθηκε προηγουμένως [30], Myc ήταν παρούσα αποκλειστικά στον πυρήνα, όπως αναμενόταν, και Omomyc ήταν σε μεγάλο βαθμό στον πυρήνα (περίπου 85% ) με ένα μικρό μέρος στο κυτταρόπλασμα (Εικόνα 2). Omomyc στερείται το σήμα πυρηνικού εντοπισμού των πρωτεϊνών Myc: μπορεί να εισέλθει στον πυρήνα λόγω του μικρού μεγέθους της, ή σε διμερισμό με ενδογενείς Myc ή Max. Όταν συν-επιμολύνονται, οι περισσότερες πρωτεΐνες Myc συν-εντοπισμένη με Omomyc στον πυρήνα? ένα κλάσμα Omomyc παρέμεινε στο κυτταρόπλασμα – μη συνδεδεμένη με Myc – πιθανόν να οφείλεται σε ένα υψηλότερο επίπεδο έκφρασης. Η έκτοπη έκφραση Myc προκάλεσε πυρηνική μετατόπιση του Miz-1 (περίπου 40%) και το σχηματισμό διακεκριμένων subnuclear εστιών, όπως αναφέρθηκε προηγουμένως [30]. Miz-1 εν μέρει μεταφερθεί στον πυρήνα με την παρουσία ενός υπερεκφρασμένης Omomyc επίσης (περίπου 35%). Η ενδογενής Miz-1 – η οποία είναι παρούσα σε μικρές ποσότητες μέσα στα κύτταρα [30]. – Θα είναι πιθανώς ως επί το πλείστον στον πυρήνα με την παρουσία ενός υπερεκφράζεται Myc ή Omomyc

Α) ανοσοφθορισμού μικροφωτογραφίες των κυττάρων 293Τ που μορφομετατρέπονται με Miz -1, c-myc, FLAG-c-Myc και FLAG-Omomyc πλασμιδίων που εκφράζουν – όπως αναφέρεται παραπάνω πάνελ – και χρωματίστηκαν με αντισώματα έναντι FLAG (πράσινο), Miz-1 (κόκκινο) και c-Myc (κόκκινο) όπως υποδεικνύεται στο εσωτερικό πάνελ. Πυρήνες από τα ίδια πεδία βάφτηκαν με μπλε με DAPI (4,6-διαμινο-2-φαινυλινδόλη). Β) Ο ποσοτικός προσδιορισμός των πειραμάτων φαίνεται στο Α), με βάση την εξέταση του πεδίου 15 μικροσκοπίας και τουλάχιστον τρεις βιολογικούς επαναλήψεις.

Η

Συνολικά, τα ευρήματα αυτά δείχνουν ότι η διαταραχή του interactome Myc από Omomyc δεν οδηγεί μόνο από την αναστολή της Myc δέσμευση Max – που απαιτείται για τη σύνδεση E-box και μετενεργοποίηση – αλλά και από την αλληλεπίδραση των Omomyc με Miz-1, ένας συνεργάτης σύνδεσης Myc εμπλέκονται στην διακαταστολής

Omomyc επηρεάζει το. μεταγραφική απόκριση των ινοβλαστών σε ορό διέγερση

Myc πρωτεΐνες είναι ικανά να συνδέονται με το 10-20% των γονιδιωματικών τόπων και για να ρυθμίζει έκφραση εκατοντάδων έως χιλιάδων γονιδίων. Omomyc φάνηκε να βλάψει την διενεργοποίηση του Myc ενεργοποιημένο γονίδιο στόχο

cad

στην Rat1 ινοβλάστες και να μην επηρεάζει αρνητική ρύθμιση της Myc κατασταλεί στόχο

GADD45

[10]. Για να πάρετε μια εικόνα για εκτεταμένες αλλαγές της γονιδιακής έκφρασης επηρεάζονται από Omomyc, αναλύσαμε την μεταγραφική απόκριση σε διέγερση των Rat1 ινοβλάστες σταθερά μολυνθεί με ένα Omomer παράγουν ή ένα άδειο ρετροϊό (RAT 1-Omomer και τα κύτταρα RAT 1-ελέγχου, αντίστοιχα ορό, όπως περιγράφεται στο [ ,,,0],10]). c-Myc είναι γνωστό ότι ρυθμίζεται προς τα κάτω από την ασιτία ορού και απότομα προκλήθηκε με προσθήκη ορού – μαζί με έναν αριθμό άλλων άμεσων πρώιμων γονιδίων – κορυφώνεται μετά από 1 έως 2 ώρες? επαγωγή c-Myc έχει ένα ρόλο στην κυτταρικό κύκλο επανείσοδο [31] – [33]. Εκτός από τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, η ανταπόκριση του ορού των ινοβλαστών ενσωματώνει άλλες διαδικασίες – e. σολ. επούλωση του τραύματος [34] – και γονιδίων που ρυθμίζονται ορού περιλαμβάνουν γονίδια που ρυθμίζονται από Myc καθώς και γονίδια που δεν είναι. Τα κύτταρα στερούνται ορού πριν από τη διέγερση του ορού και η έκφραση του mRNA αναλύθηκε κατά το χρόνο της εκ νέου προσθήκης ορού (χρόνος 0) και 90 ‘στη συνέχεια – ένα χρονικό σημείο κατά το οποίο η επαγωγή Myc είναι μέγιστη – έτσι ώστε η επαγωγή της άμεσης στόχου Myc πρέπει στενά ακολουθήστε την έκφραση του Myc. mRNA έκφραση αναλύθηκε μέσω μιας σειράς ολιγονουκλεοτίδιο που περιέχει ανιχνευτές για περίπου 7.000 αλληλουχίες πλήρους μήκους και 1000 (tags εκφρασμένη αλληλουχία) EST συστάδες. Τα δεδομένα είναι προσβάσιμα στη βάση δεδομένων GEO με τον ακόλουθο αριθμό ένταξης: GSE25039. τιμές έκφρασης σε σχέση mRNA (Διπλώστε Αλλαγές) υπολογίστηκαν λαμβάνοντας ως κύτταρα αναφοράς RAT 1-ελέγχου σε χρόνο 0? ελήφθησαν υπόψη μόνο τα γονίδια που δείχνει μια πολλαπλή μεταβολή τουλάχιστον τριών (ρυθμίζεται προς τα πάνω γονίδια) ή -3 (κατιούσα ρύθμιση γονιδίων). Κατά τη στιγμή της διέγερσης ορού, Omomer εκφράζουν και κύτταρα ελέγχου RAT 1 εμφανίζεται ένα σχεδόν πανομοιότυπο προφίλ γονιδιακής έκφρασης (Σχήμα 3, άνω). Σε 90 λεπτά από την επαγωγή του ορού 111 αλληλουχίες απορυθμίζεται και 96 προς τα κάτω σε κύτταρα RAT 1-ελέγχου. Εντυπωσιακά, ένας έντονη μειορύθμιση βρέθηκε σε κύτταρα RAT 1-Omomer: όσες από 516 γονιδιακές αλληλουχίες ρυθμίστηκαν προς τα κάτω και 143 ρυθμίζεται αυξητικά (Πίνακας S1). Συνολικά, ο συνολικός αριθμός των ακολουθιών των οποίων η έκφραση ήταν ή κατιούσα ρύθμιση με την παρουσία Omomyc μετά από 90 λεπτά της διέγερσης του ορού ανερχόταν σε 8,2% των ανιχνευτών στην διάταξη. Μεταξύ των αλληλουχιών κατιούσα ρύθμιση με την παρουσία Omomyc, 475 αντιπροσωπεύεται γονίδια με γνωστή GeneID (αναγνωριστικό γονίδιο) και 41 άλλες μεταγράφεται περιοχές. Για να μάθετε αν τα γονίδια μειωτικά παρουσία Omomyc επίσης επικυρωθεί Myc στόχους θα τους σε σχέση με το σύνολο των γονιδίων που περιλαμβάνονται στη βάση δεδομένων Myc Cancer Gene (www.myccancergene.org), μια συλλογή από Myc ανταποκρίνεται γονίδια εντοπίστηκαν σε ανεξάρτητες μελέτες μέσω μια ποικιλία από τεχνικές [35]. 115 (24%) των 475 γονιδίων μειωτικά παρουσία Omomyc εισήχθησαν στη βάση δεδομένων γονίδιο στόχο Myc: 45 εισήχθησαν ως απορυθμίζεται και 35 ως μειωτικά με Myc, ενώ το επάνω ή κάτω ρύθμιση των υπόλοιπων 35 γονίδια ήταν άγνωστη. Να επισημάνω την άμεση στόχους Myc μέσα στη λίστα των γονιδίων ρυθμίζεται προς τα κάτω με την παρουσία του Omomyc, ο κατάλογος διασταυρώθηκε με εκείνα από δύο μελέτες που χρησιμοποιούνται για την ανάλυση τσιπ για να καθορίσει το γονιδίωμα χωρητικότητα μεγάλη υποστηρικτής από Myc στα εμβρυϊκά βλαστικά (ES) κύτταρα [36], [37]. 31,5% των γονιδίων κατιούσα ρύθμιση με την παρουσία Omomyc είχε προαγωγοί που αναφέρθηκαν να δεσμεύονται άμεσα από Myc σε ES κύτταρα (τιμή-ρ: 1,3 × 10

-24) σε σύγκριση με 19% στην απουσία του (P- αξία: 3 × 10

-2). Συνολικά, το 44,4% του Omomyc μειωτικά γονίδια αποδείχθηκε ότι ήταν γνήσια στόχους Myc είτε σύμφωνα με την Myc βάση δεδομένων γονιδίων στόχων ή την εισαγωγή των Myc δεσμεύεται υποστηρικτές σε κύτταρα ES (Venn διάγραμμα: Εικόνα 4Α). Τα γονίδια κοινά σε όλες τις τρεις ομάδες συγκεντρωμένα σε μία διάσταση στην Εικόνα 4Β. Ένα τέτοιο μεγάλο – αν και ατελής – επικάλυψη μεταξύ γονιδίων των οποίων τα κάτω ρύθμιση συσχετίστηκε με την ενεργοποίηση Omomer σε RAT 1 ινοβλάστες και επικυρωμένες Myc στόχων είναι ιδιαίτερα σημαντική. Αυτή η επικάλυψη είναι ελλιπής είναι συνεπής με άλλες αναλύσεις της έκφρασης και υπολογιστικά προέρχονται σειρές γονιδίων [38], [39], και αυτό μπορεί να οφείλεται εν μέρει σε άλλες επιδράσεις του ορού. Σχήμα 3 (μέση) δείχνει την κατάταξη σε λειτουργικές κατηγορίες με βάση GO (Gene Ontology) όρους. Όπως αναφέρθηκε για τα γονίδια που σχετίζονται με δραστικότητα c-Myc [36], [40], [41], τα γονίδια που επηρεάζονται από Omomyc εμπίπτουν σε πολλαπλές λειτουργικές κατηγορίες που περιλαμβάνουν την ανάπτυξη, το μεταβολισμό, την κυτταρική σηματοδότηση μονοπατιών, την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου, και την απόπτωση. Αξίζει να σημειωθεί ότι, τα γονίδια μειωτικά παρουσία Omomyc εμπλουτίστηκαν σε κατηγορίες – νουκλεοτιδίου και του μεταβολισμού νουκλεϊνικών οξέων – που είναι υπερεκπροσωπούνται μεταξύ των στόχων ρυθμίζεται αυξητικά από το c-Myc [36], [40] – [42], υποστηρίζοντας την ιδέα του Omomyc ως αναστολέας του Myc μεσολάβηση μετενεργοποίησης (Σχήμα 3, κάτω). Στόχοι είναι γνωστό ότι ρυθμίζονται από Myc και βρέθηκε να ρυθμίζεται προς τα κάτω από Omomyc περιλαμβάνουν γονίδια που κωδικοποιούν πρωτεΐνες που εμπλέκονται άμεσα στην μετάφραση και ριβοσώματος συναρμολόγηση – όπως τον παράγοντα έναρξης μετάφρασης Eif3s9, του παράγοντα επιμήκυνσης μετάφρασης Eef1a1, και την ριβοσωμική πρωτεΐνη L3 και S4 – καθώς και ως γονίδια που κωδικοποιούν μεταβολικά ένζυμα – ισοκιτρική αφυδρογονάση 2, γαλακτική αφυδρογονάση Β και φωσφογλυκερική κινάση 1 -, πρωτεΐνες που εμπλέκονται στην πρόοδο του κυτταρικού κύκλου – η ανάφαση-προώθηση συγκρότημα υπομονάδα Anapc5, κυκλίνη Β1 και Κυκλίνη D1 -, ​​η ΑΤΡάση /ελικάση DNA TIP49 (Ruvbl1) , και η HMGB1 δομική πρωτεΐνη χρωματίνης. HMGB1 έχει ένα σημαντικό ρόλο στην επαναμοντελοποίηση χρωματίνης και είναι ένας μεσολαβητής της φλεγμονής των οποίων υπερέκφραση συνδέεται με πολλούς τύπους όγκων [43]. TIP49 είναι ένας σημαντικός συμπαράγοντας Myc, που εμπλέκονται στην Myc μεταγραφικά και ογκογόνο λειτουργίες [44]. Αρκετά γονίδια βρέθηκαν να ρυθμίζεται προς τα κάτω από Omomyc και είναι γνωστό ότι είναι Myc κατασταλεί στόχοι κωδικοποιούν πρωτεΐνες που εμπλέκονται σε μονοπάτια σηματοδότησης, κυτταρική προσκόλληση και μεταγραφή – όπως Akt1, erbB2, c-Jun και τον παράγοντα υποδοχέα ανάπτυξης ινοβλαστών FGFR1 – ενώ

Mxi1

κωδικοποιεί μια πρωτεΐνη που αλληλεπιδρά με τον Max και ρυθμίζει αρνητικά τη λειτουργία Myc.

Mxi1

καταστέλλεται από Myc [45], αλλά ενεργοποιείται από HIF-1α [46], [47]. έχουν Ελαττώματα σε αυτό το γονίδιο έχουν αναφερθεί σε καρκίνο του προστάτη και σε μια υποομάδα γλοιοβλαστώματα [48], [49].

Omomyc προωθεί προς τα κάτω ρύθμιση πολλών γονιδίων. Κορυφή. Πολλά περισσότερα γονίδια ρυθμίστηκαν προς τα κάτω σε κύτταρα RAT 1 που εκφράζουν Omomer (Omomer) παρά σε κύτταρα που δεν (Control) σε 90 ‘μετά από διέγερση των ινοβλαστών RAT 1 ορού στην παρουσία της ταμοξιφαίνης. Ο αριθμός των προς τα πάνω ρυθμισμένη γονιδίων ήταν παρόμοια. κύτταρα RAT 1-ελέγχου σε χρόνο 0 ελήφθησαν ως αναφορά. Μέσης. Διανομής σε διαφορετικές κατηγορίες βιολογική διαδικασία – με βάση την ταξινόμηση Γονιδιακή Οντολογία – των γονιδίων ρυθμίζεται προς τα κάτω στο 90 ‘μετά από διέγερση ορού σε Omomer και τον έλεγχο των κυττάρων. Κάτω μέρος. Γονίδια που σχετίζονται με τον μεταβολισμό των νουκλεοτιδίων και νουκλεϊκών οξέων είναι η πλέον σημαντικά υπερεκπροσωπούνται – όπως υπολογίζεται από το λογισμικό Panther -. Μεταξύ των γονιδίων κατιούσα ρύθμιση με την παρουσία Omomyc (κύτταρα Omomer παρουσία ταμοξιφένη)

Η

Α) διάγραμμα Venn που απεικονίζει την αλληλεπικάλυψη μεταξύ των γονιδίων κατιούσα ρύθμιση από Omomyc στην παρούσα μελέτη, τα γονίδια που αναφέρονται ως στόχοι Myc στη βάση δεδομένων γονίδιο Myc στόχου (www.myccancergene.org), και τα γονίδια που αναφέρθηκαν να δεσμεύονται άμεσα από c-Myc σε ES κύτταρα [29], [38]. Εντός της βάσης δεδομένων του γονιδίου-στόχου myc και τα σύνολα δεδομένων των κυττάρων ES, ελήφθησαν υπόψη μόνο τα γονίδια που είχαν καθετήρα στη συστοιχία Affymetrix U34A. Β) Η επικάλυψη, καλή τη πίστει Myc γονιδίων στόχων εξήχθησαν από το σύνολο δεδομένων μας και συγκεντρωμένα σε μία διάσταση. Γ) Σχετικό επίπεδο έκφρασης (Fold Change) – μετράται με Real Time PCR σε 90 λεπτά μετά τη διέγερση του ορού με την παρουσία ή απουσία 4-ΟΗΤ – του

CCND1

,

Eif3s9

,

PGK1

,

Akt1

,

ErbB2

,

Gadd45a

,

Mxi1

mRNAs σε άγριου τύπου (αριστερά) και Myc null (δεξιά) RAT 1 κύτταρα που εκφράζουν ταμοξιφαίνη επαγώγιμων Omomyc (Omomer).

CCND1

,

Eif3s9

,

pGK1

αντιπροσωπεύουν Myc ενεργοποιηθεί στόχους?

Akt1

,

ErbB2

,

Gadd45a

,

Mxi1

αντιπροσωπεύουν Myc καταπιεσμένη στόχους. Έκφραση κατά τη στιγμή της προσθήκης του ορού (χρόνος 0) λήφθηκε ως σημείο αναφοράς για τον υπολογισμό της Fold Αλλαγή.

Η

Για να επικυρώσετε περαιτέρω τα ευρήματά μας, πραγματοποιήσαμε αναλύσεις Real Time PCR σε άγριου τύπου και ινοβλάστες Myc null Rat1 εκφράζοντας ταμοξιφένη επαγώγιμη Omomyc (Σχήμα 4C). Συγκρίναμε – σε 0 και 90 λεπτά της διέγερσης ορού – τα επίπεδα έκφρασης ενός επιλεγμένου δείγματος των γονιδίων επηρεάζεται από τη διέγερση του ορού που είναι γνωστό ότι είτε κατασταλεί –

Gadd45a

,

Mxi1

,

ErbB2

,

Akt1

– ή ενεργοποιείται –

PGK1

,

Eif3s9

,

CCND1

– από Myc [40], [45 ], [50]. Αυτά τα γονίδια, όπως και κάθε γονίδιο, δεν είναι αποκλειστικές στόχοι Myc, και άλλους παράγοντες μεταγραφής διαμορφωμένο ή όχι από τον ορό μπορεί να συνεισφέρει στη ρύθμιση τους. Βρήκαμε ότι τα επίπεδα έκφρασης των καταπιεσμένων στόχων

Gadd45a

,

Mxi1

,

ErbB2

και

Akt1

στα κύτταρα RAT 1 άγριου τύπου ήταν ανεπηρέαστη ή ακόμη και πιο καταπιεσμένη παρουσία Omomyc ενώ ρύθμιση προς τα άνω των ενεργοποιημένων στόχων

PGK1

,

Eif3s9

και

CCND1

τέθηκε σε κίνδυνο (Σχήμα 4C, αριστερά). Στα null κύτταρα Myc, βρήκαμε ότι Omomyc δεν επηρέασε σημαντικά την έκφραση του καταπιεσμένη και δεν επηρέασε δυσμενώς αυξορρύθμιση των ενεργοποιημένων στόχων (Σχήμα 4C, δεξιά). Ως εκ τούτου, η επίδραση της Omomyc στη μεταγραφή του Myc ενεργοποιούνται οι στόχοι φαίνεται να απαιτεί κάποια δραστηριότητα της Myc.

Εν ολίγοις, αυτά τα ευρήματα υποδεικνύουν ότι Omomyc δεν παγκόσμιο αναστέλλουν Myc λειτουργία στην μεταγραφική ρύθμιση των γονιδίων στόχων και δείχνουν ότι επιλεκτικά διαταράσσει το μεταγραφικό Myc από παρεμποδίζουν Myc ενεργοποίηση μέσω και της διατήρησης Myc μεσολάβηση καταστολή.

Omomyc επηρεάζει διαφορικά τρανσενεργοποίηση και καταστολής επηρεάζοντας δεσμευτική για τη στόχευση Myc υποκινητές γονιδίων

για την διερεύνηση των μηχανισμών που εμπλέκονται στη ρύθμιση των γονιδίων από Omomyc, εκτελέσαμε λουσιφεράσης προσδιορισμούς ρεπόρτερ και χρωματίνης ανοσοκαταβύθιση (μάρκας) σε δύο γονίδια που κωδικοποιούν την πυρηνίσκου νουκλεολίνης πρωτεΐνη και εξαρτώμενων από κυκλίνη ρ21 αναστολέα κινάσης, που αντιπροσωπεύουν αντίστοιχα γνήσια και άμεσοι στόχοι του Myc μεσολάβηση ενεργοποίησης και καταστολής [51], [52]. c-Myc είναι σε θέση να ενεργοποιήσει

νουκλεολίνη

μεταγραφή μέσω δύο εξαιρετικά συντηρημένες E-κουτιά στο ιντρόνιο 1 [51]. Για να δοκιμαστεί η ικανότητα του να αναστέλλει Omomyc Myc μεσολάβηση μεταγραφική ενεργοποίηση, πραγματοποιήσαμε προσδιορισμούς ρεπόρτερ σε κύτταρα 293Τ επιμολυσμένα με το πλασμίδιο ανταποκριτή λουσιφεράσης pNucL14 [51] – που περιέχει το ποντίκι

νουκλεολίνης

υποκινητή, το εξώνιο 1, ιντρονίου 1 και η πρώτα 8 nt του εξονίου 2 – μαζί με διαφορετικούς συνδυασμούς FLAG-c-Myc και πλασμιδίων έκφρασης Omomyc (Σχήμα 5Α). Βρήκαμε ότι Omomyc ανέστειλε Myc διαμεσολαβούμενη ενεργοποίηση της λουσιφεράσης σε ένα δοσοεξαρτώμενο τρόπο, ενώ δεν επηρέασε τη βασική δραστηριότητα της. Για να ελέγξετε αν η αναστολή της

νουκλεολίνη

διενεργοποίηση από Omomyc οφειλόταν σε μείωση των δεσμευτικών υποκινητή, μετρήσαμε την ποσότητα του Myc υποχρεωμένος να το

νουκλεολίνη

υποκινητή σε κύτταρα 293Τ επιμολυσμένα με

νουκλεολίνη

δημοσιογράφος, FLAG-c-Myc και Omomyc πλασμίδια που εκφράζουν. Ανάκτηση του

νουκλεολίνη

DNA συγκατακρημνίστηκε με Myc ποσοτικά με πραγματικού χρόνου PCR, χρησιμοποιώντας εκκινητές που βρίσκονται γύρω από τις δύο E-κουτιά στο

νουκλεολίνη

ιντρόνιο 1. Βρήκαμε ότι Omomyc προκάλεσε μείωση κατά 40% της ποσότητας του προαγωγού δεσμεύεται Myc (Σχήμα 5Β, αριστερά). Εκτός ανταγωνίζονται για ένωση Myc /Max, Omomyc είναι σε θέση να σχηματίσει ομοδιμερή καθώς και Omomyc /Max διμερή: μόνο οι τελευταίες συνδέονται E-κουτιά

in vitro

με υψηλή απόδοση [9]. Ως εκ τούτου, Omomyc μπορεί να επηρεάσει Myc δέσμευσης στο DNA μέσω δύο συγκλίνουσες μηχανισμούς: αναστολή της Myc /Max διμερισμό καθώς και άμεσο ανταγωνισμό για το E-box δεσμευτική. Για να αξιολογηθεί η δεύτερη, μετρήσαμε την ποσότητα του Omomyc δεσμεύεται στο

νουκλεολίνης

υποκινητή σε κύτταρα επιμολυσμένα με c-Myc και FLAG-Omomyc εκφράζουν πλασμίδια (Σχήμα 5Β, δεξιά). Βρήκαμε ότι Omomyc ήταν ειδικά προσληφθεί στο E-box που περιέχει περιοχή ενδονίου 1 και ότι ανταγωνίστηκε με c-Myc για δέσμευση σε αυτή την περιοχή. Συνολικά, αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι Omomyc μπορεί να επηρεάσει τρανσενεργοποίηση με διαχωριστικούς Myc σε σύμπλοκα ανίκανο να δεσμεύεται με E-κουτιά, καθώς και δρώντας – πιθανώς σε συνδυασμό με Max -. Ως ανταγωνιστικός αναστολέας της Myc /Max συμπλοκών για δέσμευση E-Box

Α) η δραστικότητα λουσιφεράσης του ποντικιού

νουκλεολίνης

ρεπόρτερ προαγωγού πλασμίδιο – pNucL14 – επιμολυσμένα σε κύτταρα 293Τ μαζί με FLAG-c-Myc και Omomyc φορείς έκφρασης. Τα δεδομένα κανονικοποιήθηκαν με συνεπιμόλυνση της PRL-ΤΚ λουσιφεράση της Renilla. Η βασική δραστηριότητα της δημοσιογράφος είχε οριστεί στην τιμή 100. Β) Ποσοτική ChIP δοκιμασία της Myc και Omomyc σύνδεση με το

νουκλεολίνη

περιοχή του υποκινητή (Ncl? Γκρίζες μπάρες). Αριστερά: δεσμευτική FLAG-c-Myc στα κύτταρα 293Τ επιμολυσμένα με το

νουκλεολίνη

δημοσιογράφος pNucL14 μαζί με FLAG-c-Myc και Omomyc πλασμίδια που εκφράζουν. Δεξιά: δεσμευτική FLAG-Omomyc σε 293Τ κύτταρα επιμολυσμένα με το

νουκλεολίνη

δημοσιογράφος μαζί με FLAG-Omomyc και c-Myc πλασμίδια που εκφράζουν. Μια περιοχή του

λουσιφεράσης

ακολουθία κωδικοποίησης (Luc? Μαύρες μπάρες) χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος. Οι ράβδοι αντιπροσωπεύουν το ποσοστό του DNA εισόδου ανοσοκαταβυθίστηκε, μετά την αφαίρεση του υποβάθρου. Οι αξίες των μαρκών εκφράζονται ως% του DNA των εισροών

Η

Για να διερευνήσουν πώς Omomyc μπορεί να ενεργήσει για την υποστήριξη Myc μεσολάβηση καταστολή, πραγματοποιήσαμε αναλύσεις για το ανθρώπινο

p21

υποστηρικτής -. Συγκεκριμένα η σειρά αποτελείται μεταξύ -194 και +16 από την θέση έναρξης μεταγραφής – κατά την οποία Myc έχει προσληφθεί από την πρωτεΐνη δάκτυλο ψευδαργύρου Miz-1 [27], [52]. Πραγματοποιήσαμε δοκιμασίες ρεπόρτερ και διαπίστωσε ότι η έκφραση λουσιφεράσης που κινείται από τον πλήρους μήκους ανθρώπινο

ρ21

υποκινητή – p21Cip1-Luc [53] – ανεστάλη με c-Myc και ότι Omomyc ήταν συνεργική με c-Myc (Σχήμα 6Α ). Είναι ενδιαφέρον ότι – ακόμη και στην απουσία ενός συνδιαμολυνθέν c-Myc – Omomyc προκάλεσε

p21

υποκινητή καταστολή σε επίπεδα παρόμοια με εκείνα που προκαλούνται από c-Myc. Ως εκ τούτου Omomyc είναι σε θέση να υποστηρίξει

p21

καταστολή προαγωγέα τόσο με την παρουσία και απουσία ενός υπερ-εκφράζεται c-Myc. Για να διερευνηθεί κατά πόσο αυτό σχετίζεται με αυξημένη πρόσδεση υποκινητή, πραγματοποιήσαμε προσδιορισμούς ChIP σε κύτταρα 293Τ επιμολυσμένα με τον ανταποκριτή ρ21 μαζί με FLAG-Myc και αυξανόμενη ποσότητα Omomyc πλασμιδίου. Παρατηρήσαμε ότι Omomyc αυξήθηκε σημαντικά ο-Μγο πρόσδεση στο -194 έως +16 περιοχή (Σχήμα 6Β, κορυφή). Είναι ενδιαφέρον ότι η αμοιβαία δοκιμασία σε κύτταρα επιμολυσμένα με FLAG-Omomyc και αυξανόμενη ποσότητα του c-myc πλασμιδίου έδειξαν ότι Omomyc ήταν ικανά να αλληλεπιδρούν με το ίδιο

περιοχή ρ21

προαγωγό (Σχήμα 6Β, κάτω). Σε αυτή την περίπτωση, Myc υπερέκφραση δεν ανταγωνίζονται με την σύνδεση Omomyc.