Αφηρημένο

Ιστορικό

γ-ακτινοβολία είναι μια αποτελεσματική θεραπεία για Καρκίνος. Υπάρχουν ενδείξεις ότι η ακτινοθεραπεία υποστηρίζει όγκου-ειδικά ανοσία. Περιγράφηκε ότι η ακτινοβόληση επάγει de novo σύνθεση των πρωτεϊνών και ενισχύει παρουσίαση αντιγόνου, εμείς επομένως ερευνήθηκε κατά πόσον τα αποτελέσματα γ-ακτινοβολία σε αυξημένη έκφραση του καρκίνου όρχεων (CT) αντιγόνα και MHC-I, επιτρέποντας έτσι αποτελεσματική ανοσολογικού ελέγχου. Αυτό είναι σημαντικό, διότι η έκφραση της CT-αντιγόνα και ΜΗΟ-Ι σε κύτταρα όγκου είναι συχνά ετερογενής. Βρήκαμε ότι οι μεταβολές που προκαλούνται από γ-ακτινοβολία προάγουν την ανοσολογική αναγνώριση του όγκου, η οποία απεικονίζεται από την αυξημένη διείσδυση από λεμφοκύτταρα μετά την ακτινοθεραπεία.

μέθοδοι /Εκτίμηση

Συγκρίναμε την έκφραση της CT-αντιγόνα και ΜΗΟ-Ι σε διάφορες καρκινικές κυτταρικές γραμμές και φρέσκο ​​βιοψίες πριν και μετά

in vitro

ακτινοβολία (20 Gy). Επιπλέον, συγκρίναμε ζευγαρωμένα βιοψίες που ελήφθησαν πριν και μετά την ακτινοθεραπεία από ασθενείς σάρκωμα. Για να διερευνηθεί αν το τροποποιημένο έκφραση της CT-αντιγόνα και ΜΗΟ-Ι είναι ειδική για γ-ακτινοβολία ή αποτελεί μέρος μιας γενικευμένης απόκρισης στρες, αναλύσαμε την επίδραση της υποξίας, υπερθερμία και γενοτοξικό στρες στην έκφραση της CT-αντιγόνων και ΜΗΟ ΕΓΏ.

In vitro

ακτινοβόληση καρκινικών κυτταρικών σειρών και των νωπών βιοψιών όγκου που προκαλείται από μια υψηλότερη ή de ηονο έκφραση διαφορετικών CT-αντιγόνα και ένα υψηλότερο έκφραση του ΜΗΟ-Ι σε ένα χρόνο- και δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. Είναι σημαντικό ότι, δείχνουμε ότι η ακτινοβόληση των καρκινικών κυττάρων ενισχύει αναγνώρισή τους από όγκου-ειδικά CD8 + Τ κύτταρα. Η ανάλυση των βιοψιών ζεύγη που λαμβάνονται από μια σειρά ασθενών σάρκωμα πριν και μετά την ακτινοθεραπεία επιβεβαίωσαν τα ευρήματα μας και, επιπρόσθετα έδειξε ότι η ακτινοβόληση οδήγησαν σε υψηλότερη διείσδυση από λεμφοκύτταρα. Άλλες μορφές στρες δεν είχε αντίκτυπο στην έκφραση της CT-αντιγόνα ή MHC-Ι.

Συμπεράσματα

Τα ευρήματά μας υποδηλώνουν ότι η γ-ακτινοβολία προωθεί την ανοσολογική αναγνώριση του όγκου. Προτείνουμε, λοιπόν, ότι ο συνδυασμός ακτινοθεραπείας με θεραπείες που υποστηρίζουν όγκου ειδική ανοσία μπορεί να οδηγήσει σε αυξημένη θεραπευτική αποτελεσματικότητα

Παράθεση:. Sharma Α, Bode Β, Wenger RH, Lehmann Κ, Sartori ΑΑ, MOCH H, et al. (2011) γ-ακτινοβολία Προωθεί ανοσολογική αναγνώριση των καρκινικών κυττάρων μέσω της αυξημένης έκφρασης του Καρκίνου-Όρχεων αντιγόνα

In Vitro

και

In Vivo

. PLoS ONE 6 (11): e28217. doi: 10.1371 /journal.pone.0028217

Επιμέλεια: Ilya Ulasov, University of Chicago, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 2 Μάη του 2011? Αποδεκτές: 3 Νοέμβρη του 2011? Δημοσιεύθηκε: 29 Νοεμβρίου 2011

Copyright: © 2011 Sharma et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το Ludwig Institute for Cancer Research /Cancer Research Institute (Cancer Antigen Discovery Collaborative), του Ατλαντικού Philanthropies, το Ερευνητικό Ινστιτούτο Καρκίνου, το Ίδρυμα Hanne Λίμπερμαν, το Ίδρυμα Hartmann Muller, το Ίδρυμα Terry Fox και το Ίδρυμα Ellinger, Med Alumini Πανεπιστήμιο της Ζυρίχης (www.alumuni.uzh.ch). Alessandro Α Sartori υποστηρίζεται από την Vontobel-Ίδρυμα και με υποτροφία Ambizione από το Ελβετικό Εθνικό Ίδρυμα Επιστημών (SNSF). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

γ-ακτινοβολία ή ακτινοθεραπεία είναι ένα από τα πιο ευρέως χρησιμοποιούμενα θεραπείες για τον καρκίνο [1]. Η ακτινοβόληση επάγει το θάνατο των καρκινικών κυττάρων [2], [3], αλλά υπάρχει συσσώρευση αποδείξεις ότι προσαρμοστική ανοσία συμβάλλει σημαντικά στην αποτελεσματικότητα της ακτινοθεραπείας [4]. Για παράδειγμα, τα ακτινοβολημένα όγκων σε ασθενείς και σε ποντίκια συχνότερα διείσδυση λευκοκυττάρων από τα μη-εκπέμπον όγκους [5], [6], [7] και πολύ πρόσφατες μελέτες σε προκλινικά μοντέλα έδειξαν ότι η αποτελεσματικότητα της ακτινοθεραπείας εξαρτάται από την παρουσία των CD8

+ Τ κύτταρα [8]. Το γεγονός ότι οι όγκοι στοχευμένη και ελεγχόμενη από CD8

+ Τ κύτταρα προτείνεται από την αυξημένη συχνότητα εμφάνισης όγκου σε ανοσοκατασταλμένους ασθενείς [9], [10], [11] και από το γεγονός ότι όγκου-ειδικά ανοσία μπορεί να ανιχνευθεί σε ασθενείς με καρκίνο [12], [13], [14], [15]. Δεδομένου ότι η αναγνώριση των κυττάρων όγκου από τα CD8

+ Τ κύτταρα εξαρτάται από την παρουσίαση των αντιγόνων που σχετίζονται με όγκο (ΤΑΑ) στο πλαίσιο των μορίων MHC-I, το συχνά-ετερογενή έκφραση του ΤΑΑ ή /και MHC-I εντός α όγκου επιδρά αρνητικά στην αποτελεσματικότητα του όγκου-ειδική ανοσία. Στην παρούσα μελέτη ζητήσαμε από το συγκεκριμένο ερώτημα αν η ακτινοβολία προκαλεί ή up-ρυθμίζει την έκφραση μιας εξέχουσας ομάδας ΤΑΑ, τα λεγόμενα CT-αντιγόνα. Οι CT-αντιγόνα αποτελούν εκτεταμένη οικογένεια αντιγόνων που εκφράζονται σε μια μεγάλη ποικιλία κακοηθειών, αλλά απουσιάζουν από τους υγιείς ιστούς, εκτός από τους όρχεις και πλακούντα [16], [17]. Οι ασθενείς με καρκίνο συχνά αναπτύσσουν αυθόρμητες ανοσολογικές αποκρίσεις προς CT-αντιγόνα, το οποίο απεικονίζει την ανοσογονικότητα τους [18]. Λόγω ανοσογονικότητα τους και περιορισμένο πρότυπο έκφρασης, τα CT-αντιγόνα θεωρούνται υποσχόμενους στόχους για ανοσοθεραπεία σε καρκινοπαθείς [19], [20]. Παρατηρήσαμε ότι η ακτινοβολία που προκαλείται από ένα υψηλότερο ή ένα

de novo

έκφραση διαφορετικών CT-αντιγόνα, καθώς και μια ρύθμιση προς τα πάνω της έκφρασης ΜΗΟ-Ι σε πολλαπλές καρκινικές κυτταρικές σειρές και σε φρέσκο,

ex vivo

ακτινοβοληθεί βιοψίες των όγκων. Είναι σημαντικό ότι, η σύγκριση των ζευγών τμημάτων του όγκου που λαμβάνεται από ασθενείς σάρκωμα πριν και μετά την ακτινοβόληση παρουσίασαν πάνω ρυθμισμένα ή

de novo

έκφραση του MHC-I και CT-αντιγόνα και η συνακόλουθη αύξηση του διηθητικών CD8

+ Τ κύτταρα , γεγονός που υποδηλώνει ότι η ακτινοβόληση κινητοποιεί τις τοπικές, ογκο-ειδικές ανοσοαποκρίσεις. Επιπλέον, τα ευρήματά μας υποδεικνύουν ότι ένας συνδυασμός ακτινοθεραπείας και ενεργητική ανοσοποίηση με σχετική CT-αντιγόνα μπορεί να είναι μία μέθοδος θεραπείας με υψηλότερη αποτελεσματικότητα σε σύγκριση με είτε μόνη θεραπεία.

Υλικά και Μέθοδοι

Δήλωση Ηθικής

Η επιτροπή δεοντολογίας «Ηθικά επιτροπή του καντονίου της Ζυρίχης» συγκεκριμένα ενέκρινε την εν λόγω μελέτη (μελέτη: EK-1017)..

Cells

Οι κυτταρικές σειρές

MDA-MB-469, MDA-MB-231 και MCF 7 (καρκίνος των κυττάρων του μαστού γραμμές), MCF 10Α (κανονικό κύτταρο μαστού γραμμή, απαθανάτισε, μη-μετασχηματισμένα), Saos, LM5, 143Β, ΕΟΕ, HU09, και M132 (οστεοσαρκώματος κυτταρικές γραμμές), Α549, Η460, Calu1 και Calu3 (πνεύμονας καρκινικές κυτταρικές σειρές), SK-MEL-37 (κυτταρική γραμμή μελανώματος) και PC3 και DU145 (κυτταρικές γραμμές καρκίνου του προστάτη) ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (Manassas, VA). Οι κυτταρικές γραμμές οστεοσαρκώματος ήταν ένα δώρο από τον Δρ Bruno Fuchs (Τμήμα Ορθοπεδικής, Πανεπιστημιακή Κλινική Balgrist, Ζυρίχη). Όλες οι κυτταρικές σειρές και βιοψίες καλλιεργήθηκαν σε μέσο RPMI 1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA) που περιέχει 10% ορό εμβρύου μόσχου (FBS? Sigma-Aldrich Corp. St. Louis, ΜΟ), L-γλουταμίνη και αντιβιοτικά. PC3 και DU145 καλλιεργήθηκαν σε μέσο DMEM (Invitrogen), που περιέχει 10% FBS, L-γλουταμίνη και αντιβιοτικά.

Πρωτογενή ανθρώπινα κύτταρα.

Ανθρώπινο ακροποσθίας κερατινοκύτταρα ελήφθησαν σαν δώρο από τον Dr. Onur Boyman (Τμήμα Δερματολογίας, Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο Ζυρίχης) και καλλιεργήθηκαν σε κερατινοκυττάρων μέσο χωρίς ορό (K-SFM? Invitrogen), τα συμπληρώματα (EGF Human Recombinant και εκχύλισμα υποφύσεως βοοειδούς? Invitrogen), L-γλουταμίνη και αντιβιοτικά όπως περιγράφεται [21] . Κανονική ανθρώπινους δερματικούς ινοβλάστες (NHDF) ελήφθησαν από Promocell GmbH (Χαϊδελβέργη, Γερμανία). Ανθρώπινα μικροαγγειακά ενδοθηλιακά κύτταρα (HMEC-1) ελήφθησαν σαν δώρο από τον Dr. Therese Resink (Τμήμα Βιοϊατρική, Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο της Βασιλείας) και καλλιεργήθηκαν σε τροποποιημένο Dulbecco μέσο Eagle (ϋΜΕΜ? Invitrogen) συμπληρωμένου με 5% FBS (Sigma-Aldrich ) και αντιβιοτικά. ινοβλάστες ανθρώπινου πνεύμονα (MRC-5) ελήφθησαν σαν δώρο από τον Dr. Giancarlo Marra (IMCR, Ζυρίχη) και αποκτήθηκαν αρχικά από Αποθετήρια Coriell Κυττάρων (Camden, NJ) και καλλιεργήθηκαν σε μέσο ΜΕΜ (Invitrogen), που περιέχει 15% FBS, L-γλουταμίνη και αντιβιοτικά. κύτταρα ZT-821 (πρωτογενή νεφρικά κύτταρα) δημιουργήθηκαν στο εργαστήριο μας από ένα και μόνο κυτταρικό εναιώρημα του υγιούς ιστού νεφρού. Τα κύτταρα NHDF και ZT-821 καλλιεργήθηκαν σε μέσο RPMI 1640 (Invitrogen) που περιέχει 10% FBS (Sigma-Aldrich), L-γλουταμίνη και αντιβιοτικά.

Η επεξεργασία των κυττάρων

ιονίζουσα ακτινοβολία.

τα κύτταρα και φρέσκο ​​βιοψίες των όγκων εκτέθηκαν σε γ-ακτινοβολία από ένα

πηγή 60Co. Οι δόσεις της ακτινοβολίας που χρησιμοποιείται περιγράφεται σε κάθε πείραμα.

Υπερθερμία.

Τα κύτταρα επωάστηκαν στους 42 ° C για 1 ώρα ή 5 ώρες και καλλιεργούνται στη συνέχεια για 72 ώρες στους 37 ° C. Τα επεξεργασμένα και μη επεξεργασμένα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία για ανάλυση με RT-qPCR.

υποξία.

Τα κύτταρα επωάστηκαν υπό συνθήκες υποξίας (1% O

2 νοί /νοί) σε μια υποξική εργασίας (InVivoO

2-400, Ruskinn Τεχνολογίας, Leeds, UK) για διαφορετικά χρονικά σημεία (8 ώρες, 48 ώρες ή 72 ώρες). Τα επεξεργασμένα και μη επεξεργασμένα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία για ανάλυση με RT-qPCR.

Γονοτοξική στρες.

Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία στους 37 ° C με 1 μg /mL σισπλατίνης (Sigma-Aldrich Corp . St. Louis, ΜΟ) για 24 ώρες ή με 15 μΜ ετοποσίδη (Sigma-Aldrich) για 1 ώρα ή με 150 μΜ μπλεομυκίνη (Sigma-Aldrich) για 1 ώρα. Αυτό το χρονικό σημείο θεωρήθηκε ως Τ

0. Στο τέλος της θεραπείας, το μέσο αντικαταστάθηκε με φρέσκο ​​μέσο καλλιέργειας χωρίς το φάρμακο. Τα κύτταρα στη συνέχεια καλλιεργήθηκαν για 72 επιπλέον ώρες στους 37 ° C. Καλλιέργειες ελέγχου υποβλήθηκαν σε επεξεργασία υπό παρόμοιες πειραματικές συνθήκες απουσία του φαρμάκου.

αναστολείς μικρού-μορίου πρωτεϊνικής κινάσης.

Μια συγκέντρωση παρακαταθήκης 10 mM σε 100% διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO) ειδικών αναστολείς για αταξία τηλαγγειεκτασία μεταλλαγμένη (ΑΤΜ), KU 55,933 (Tocris Bioscience, Ellisville, ΜΟ) και DNA-εξαρτώμενη καταλυτική υπομονάδα κινάσης πρωτεΐνης (DNA-PKcs), NU7441 (Tocris Bioscience) αραιώθηκαν σε συγκέντρωση εργασίας 10 μΜ σε 1% DMSO. Οι αναστολείς προστέθηκαν 1 ώρα πριν από την ακτινοβόληση, και αφέθηκαν στην καλλιέργεια διάρκεια του πειράματος. Καλλιέργειες ελέγχου υποβλήθηκαν σε επεξεργασία υπό παρόμοιες πειραματικές συνθήκες απουσία του φαρμάκου με 1% DMSO.

βιοψίες όγκων

Οι βιοψίες ελήφθησαν από το Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο της Ζυρίχης. Όλοι οι ασθενείς υποβλήθηκαν σε χειρουργική επέμβαση ως μέρος της συνήθους θεραπείας τους και υπέγραψαν την ενημερωμένη συγκατάθεση. Η επιτροπή δεοντολογίας «Ηθικά επιτροπή του καντονίου της Ζυρίχης» ειδικά εγκριθεί αυτή τη μελέτη (Μελέτη: EK-1017). Αμέσως μετά την εκτομή, βιοψίες κόπηκαν σε πολλά κομμάτια των 2-4 mm

3. Τα κομμάτια τυχαιοποιήθηκαν σε δύο παρτίδες και να τεθεί σε μέσο καλλιέργειας. Μία παρτίδα ακτινοβολήθηκε με μία μόνο δόση 20 Gy, ενώ η άλλη παρτίδα χρησίμευσε ως έλεγχος. Τα τεμάχια του όγκου καλλιεργήθηκαν για 72 ώρες μετά την

ex vivo

ακτινοβολία και η έκφραση του γονιδίου προσδιορίστηκε με ανάλυση RT-qPCR. Ζεύγη βιοψίες από σάρκωμα πριν και μετά την ακτινοβολία συλλέχθηκαν για άλλο σκοπό και ως εκ τούτου τα χρονικά σημεία συλλογής μετά από ακτινοθεραπεία κυμαινόταν μεταξύ 2-6 εβδομάδων. Οι όγκοι ακτινοβολήθηκαν

in vivo

με γραμμικό επιταχυντή και έλαβαν δόση 50-64 Gy.

εκχύλιση RNA και παρασκευή του cDNA

Το συνολικό RNA εξήχθη χρησιμοποιώντας το RNeasy Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA) και στη συνέχεια υπέστη πέψη με DNAse Ι (Invitrogen). Η συγκέντρωση και η καθαρότητα αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας το φασματοφωτόμετρο NanoDrop ND-1000 (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE). 150 ng του RNA μεταγράφηκε ανάστροφα χρησιμοποιώντας το υψηλής χωρητικότητας cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosciences, Foster City, CA). Το cDNA είτε χρησιμοποιήθηκε αμέσως για τις αντιδράσεις RT-qPCR ή αποθηκεύονται στους -20 ° C μέχρι τη χρήση. Όλα τα κιτ χρησιμοποιήθηκαν σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

RT-qPCR

Η έκφραση της CT-αντιγόνα και ΜΗΟ-Ι αναλύθηκε χρησιμοποιώντας εκκινητές ανάλυση γονιδιακής TaqMan και TaqMan 1χ καθολική κύριο μείγμα (Applied Biosystems) σε μια ανακυκλωτή RotoGene (Corbett Έρευνας, Sydney, NSW). Το μίγμα της αντίδρασης (10 μL) αποτελείτο από 1 μι cDNA, 3.5 μΐ νερό, 0,5 μΙ εκκινητή και 5 μL TaqMan 1χ καθολική κύριο μείγμα. Χρησιμοποιήθηκαν οι ακόλουθες συνθήκες κύκλου: 2 λεπτά 50 ° C, 10 min 95 ° C, 45 κύκλοι των 15 s στους 95 ° C, 1 λεπτό 60 ° C. Η αλλαγή στα επίπεδα έκφρασης της CT-αντιγόνα και ΜΗΟ-Ι δίνεται ως η αύξηση στην έκφραση φορές με σύγκριση των τιμών δέλτα-Ct του επεξεργασμένου με εκείνη των μη επεξεργασμένων δειγμάτων μετά από κανονικοποίηση προς 18S rRNA. Ct τιμές & gt? 38 κύκλοι ερμηνευθούν έτσι ώστε το γονίδιο δεν εκφράζεται και πτυσσόμενο έκφραση & lt? 2 θεωρήθηκε ως καμία αλλαγή. Κάθε μία από τις κυτταρικές σειρές καρκίνου του μαστού και οστεοσάρκωμα ελέγχθηκαν σε δύο ανεξάρτητα πειράματα και το καρκίνωμα των πνευμόνων και τις κυτταρικές γραμμές καρκινώματος προστάτη σε ένα. Κάθε δείγμα φορτώθηκε εις διπλούν /τριπλούν για κάθε ένα από τα πειράματα RT-qPCR.

Η κυτταρομετρία ροής

Τα κύτταρα χρωματίστηκαν με ΡΕ-επισημασμένο αντι-HLA-A, B, C (κλώνος G46 -2,6, 1:100), FITC-επισημασμένο αντι-β2-μικροσφαιρίνη (κλώνος TU99, 1:100) (BD Pharmingen, San Diego, CA) και ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ? Sigma). Τα δείγματα μετρήθηκαν με ένα FACS Calibur (BD) και αναλύθηκαν με λογισμικό FlowJo (Treestar) μετά gating σε ζωντανά κύτταρα (ΡΙ-αρνητικό). Χρησιμοποιήθηκαν επίσης κατάλληλοι έλεγχοι ισοτύπου.

Ανοσοϊστοχημεία

φορμαλίνη σταθερό, ζευγαρωμένα τμήματα ιστού ενσωματωμένα σε παραφίνη που λαμβάνονται από ασθενείς σάρκωμα πριν και μετά την ακτινοβόληση βάφτηκαν με αντι-ανθρώπινα μονοκλωνικά αντισώματα ποντικού κατά του CD4 (κλώνος 1F6, 1:30, Zymed Laboratories Inc.), CD8 (κλώνος C8 /114Β, 1:100, ϋΑΚΟ Α /δ, Carpinteria, CA), γράνζυμο Β (κλώνος Gr Β-7, 1:25 ϋΑΚΟ Α /δ ), MHC-I (κλώνος C21, 1:1000, RDI Research Diagnostics, Inc.), CT7 (κλώνος CT7-33, 1:80, ϋΑΚΟ Α /δ), CT10 (κουνελιού πολυκλωνικό, 1:500, Proteintech Group, Inc.), NY-ESO-1 (κλώνος E978, 1:50, ΖΥΜΕϋ) και περφορίνης (κλώνος 5Β10, 1:20, Novocastra Laboratories Ltd). Οι τομές με αιματοξυλίνη, αφυδατώνονται και τοποθετημένα. Όλες οι τομές βάφτηκαν είτε με το αυτοματοποιημένο σύστημα Ventana Benchmark χρώσης (Ventana Medical Systems, Tucson, ΑΖ) χρησιμοποιώντας αντιδραστήρια Ventana για το σύνολο της διαδικασίας για NY-ESO-1, CT7, γρανζύμου Β, CD4, CD8 και περφορίνης και BondMax (Vison BioSystems , Newcastle upon Tyne, Ηνωμένο Βασίλειο) για την CT10 και MHC-I. UView (Ventana) ή Περιορισμού DAB (Vision BioSystems) χρησιμοποιήθηκαν ως χρωμογόνα εναντίον των πρωτογενών αντισωμάτων. Εικόνες από τις τομές που θα αγοράζονταν στην Zeiss-Axiovert 200 Μ (Carl Zeiss Light Microscopy Γκέτινγκεν, Gearmany) αντίστροφο μικροσκόπιο χρησιμοποιώντας σύστημα απεικόνισης Carl Zeiss Axiovision CD28. Οι χρώσεις βαθμολογήθηκαν σε μια κλίμακα από 0 έως 5 για την έκφραση του ΝΥ-ΕδΟ-1, MAGE-C1 /CT7, και MAGE-C2 /CT10 ως ποσοστό, με βάση τον αριθμό των θετικών κυττάρων που εκφράζουν το αντιγόνο με το συνολικό αριθμός των κυττάρων σε ένα πεδίο υψηλής ισχύος (HPF) με τη χρήση 40Χ αντικειμενικό φακό. Η βαθμολόγηση για έκφραση ΜΗΟ-Ι έγινε με βάση την ένταση της χρώσης. Τα διηθήματα όγκων υπολογίστηκαν ως ο αριθμός των κυττάρων που εκφράζουν CD4, CD8 και γρανζύμου ανά HPF χρησιμοποιώντας ένα αντικειμενικό 40Χ. Κάθε χρωματισμένο τμήμα αξιολογήθηκε σε πέντε διαφορετικές περιοχές (για λεπτομερή κατάλογο των βαθμολογιών βλέπε Πίνακα S4). Τρία άτομα εκτελεστεί το σκορ τυφλά και ανεξάρτητα για τις χρώσεις MHC-I και δύο άτομα που πραγματοποιήθηκε το σκορ τυφλά για τις άλλες χρώσεις.

ανοσοφθορισμού

Cells (10’000-20’000 κύτταρα 1 mL μέσου) απλώθηκαν σε επιμέρους τμήματα διαφάνειες πολιτισμό (BD Biosciences) να τηρούν τη διάρκεια της νύχτας. Τα κύτταρα στη συνέχεια σταθεροποιήθηκαν με 4% παραφορμαλδεΰδη για 15 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου, κατέστησαν διαπερατά με 0.1% TritonX-100 (Sigma-Aldrich) για 5 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου, και ακολούθησε αποκλεισμός με 10% BSA /PBS για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Τα κύτταρα στη συνέχεια επωάστηκαν με μονοκλωνικά αντισώματα ποντικού έναντι NY-ESO-1 (κλώνος E978, 1:500, Invitrogen) ή MAGE-C1 /CT7 (κλώνος CT7-33, 1: 500, Dako) σε 10% BSA /PBS για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου στο σκοτάδι, ακολουθούμενα από επώαση με FITC- επισημασμένο δευτερεύον αντίσωμα κατσίκας αντι-ποντικού IgG1 (Poly4053, 1:2000, Biolegend) για 15 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου στο σκοτάδι. Τα πλακίδια επιχρωματίστηκαν με 4 ‘, 6’-διαμιδινο-2-φαινυλινδόλης υδροχλωρική (ϋΑΡΙ, 1:500) για 2 λεπτά στο σκοτάδι και επιθεωρούνται χρησιμοποιώντας ένα Zeiss-Axiovert 200 Μ αντίστροφο μικροσκόπιο και ένα σύστημα απεικόνισης Carl Zeiss Axiovision CD28.

κηλίδος Western ανάλυση

ακτινοβολημένα και μη-ακτινοβολημένα κύτταρα ελέγχονται για την έκφραση της πρωτεΐνης με τη χρήση μονοκλωνικών αντισωμάτων ποντικού έναντι NY-ESO-1 (κλώνος E978, 1:500, Invitrogen) ή MAGE- Γ1 /CT7 (κλώνος CT7-33, 1: 500, Dako) και β-ακτίνης (κλώνος 4i374, 1:8000,

Santa Cruz

Biotech, CA). Η επίδραση της γονοτοξικούς παράγοντες και DNA-PKcs και της αναστολής ΑΤΜ, σχετικά με την επαγόμενη γ-ακτινοβολία γονιδιακής έκφρασης των κυττάρων αξιολογήθηκε με χρήση αντισωμάτων έναντι pS2056-DNA-PKcs (πολυκλωνικό κουνελιού φωσφο S2056-DNA-PKcs, 1:300, Abcam Inc, ΜΑ), Fanc-D2 (κλώνος Fl17, 1:200,

Santa Cruz

Biotech, CA), pS1981-ATM (κλώνος EP1890Y, 1:5000, Eitomics, CA) και pS15-p53 (κλώνος 16G8, 1:1000, Cell Signaling Technology, ΜΑ). Ακολουθούμενη από επώαση με το δευτερεύον αντίσωμα, πολυκλωνικό γίδινο αντι-ποντικού IgG1 HRP (Poly4053, 1:10000, Biolegend) ή HRP πολυκλωνικά κατσίκας αντι-κουνελιού (1:10000, Abcam). ECL αντιδραστήριο (Amersham, UK) χρησιμοποιήθηκε ως υπόστρωμα φωταύγειας.

Δοκιμασία αποκοκκίωση CD107a

Αναγνώριση κυττάρων που εκφράζουν ΝΥ-ΕδΟ-1 μετά από ακτινοβόληση με αντιγόνου-ειδικά CD8

+ Τ κύτταρα ελέγχθηκε χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία CD107a αποκοκκοποίηση. Τρία χ 10

5 NY-ESO-1

157-165 /HLA-A2-ειδικά CD8 κλωνοποιημένο

+ Τ κύτταρα (που παράγεται όπως περιγράφεται [22]) επωάστηκαν με 10

6 CFSE- επισημασμένο (1 μΜ) HLA-A2

+ MDA-MB-469 κύτταρα – που ήταν ή δεν είχαν ακτινοβοληθεί με 20 Gy 72 ώρες νωρίτερα – σε μία πλάκα μικροτίτλου στρογγυλού πυθμένος των 96 φρεατίων σε τελικό όγκο 200 μL RPMI + 10 % FCS και αντιβιοτικά παρουσία ΡΕ-επισημασμένο αντι-CD107a (1:20, BioLegend, SD, California). Ως θετικός έλεγχος, MDA-MB-469 κύτταρα φορτώθηκαν με 10

-6 Μ NY-ESO-1

157-165 πεπτίδιο. Δύο ανεξάρτητοι κλώνοι Τ κυττάρων (2A7 και 2B5) χρησιμοποιήθηκαν και όλες οι καλλιέργειες έγιναν εις διπλούν. Η επώαση διεξήχθη στους 37 ° C για 4 ώρες. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν και πλύθηκαν σε 2 mL FACS ρυθμιστικό (FB) που ακολουθείται από χρώση με Pacific Blue-επισημασμένο αντι-CD8 (BioLegend) σε 50 μL FB για 30 λεπτά στους 4 ° C. Τα κύτταρα πλύθηκαν μία φορά με 2 ml FB και επαναιωρήθηκαν σε 200 μL FB. Τα δείγματα μετρήθηκαν σε κυανό ADP9 (Beckman Coulter Inc, FL, USA) και αναλύθηκαν με λογισμικό FlowJo (Treestar).

Αποτελέσματα

In vitro

γ-ακτινοβολίας σε απότομη ανωφέρεια ρυθμίζει μεταγραφές της CT-αντιγόνα και ΜΗΟ-Ι μόρια

μαστού, οστεοσάρκωμα, των πνευμόνων και του καρκίνου του προστάτη και φυσιολογικό πρωτογενή κύτταρα εκτέθηκαν σε ακτινοβολία μονής δόσης 20 Gy, μετά από 72 ώρες τα κύτταρα συλλέχθηκαν και αναλύθηκαν για την έκφραση της CT-αντιγόνα και ΜΗΟ-Ι με RT-qPCR. Οι περισσότερες από αυτές τις κυτταρικές γραμμές καρκίνου που εκφράζονται μη ανιχνεύσιμο ή πολύ χαμηλά επίπεδα της CT-αντιγόνων υπό τυπικές συνθήκες καλλιέργειας. Σε αντίθεση, τα κύτταρα γ-ακτινοβολείται έδειξε

de novo

ή επάνω ρυθμισμένη έκφραση διαφόρων CT-αντιγόνα με τυχαίο τρόπο (Εικόνα 1Α-D). Σε ένα πάνελ των τεσσάρων καρκίνο τύπους κυττάρων γραμμή, γ-ακτινοβολία βρέθηκε να έχει την πιο βαθιά επίδραση επί των κυτταρικών γραμμών καρκίνου του μαστού και του οστεοσαρκώματος και λιγότερο στις κυτταρικές σειρές καρκίνου του προστάτη. Η αυξητική ρύθμιση των MHC-I και CT-αντιγόνα κατά γ-ακτινοβολίας φαίνεται να είναι ένα ειδικό χαρακτηριστικό των κακοήθων κυττάρων, καθώς αυτό δεν παρατηρήθηκε σε κανένα από τα φυσιολογικά πρωτογενή κύτταρα που δοκιμάσαμε εδώ (ZT-812, ανθρώπινης ακροποσθίας κερατινοκύτταρα , HMEC-1, MRC-5, NHDF και MCF 10Α, Εικόνα S1A, S1B). Η κυτταρική γραμμή μελανώματος SK-MEL-37 είναι γνωστό ότι εκφράζουν όλα δοκιμαστεί CT-αντιγόνα υπό κανονικές συνθήκες καλλιέργειας και ως εκ τούτου περιλαμβάνεται ως θετικός μάρτυρας. Η ακτινοβολία αυτής της κυτταρικής γραμμής οδήγησε σε μια σαφή πάνω ρύθμιση όλων των CT-αντιγόνα και ΜΗΟ-Ι (δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Διαπιστώσαμε αυξημένη έκφραση της CT-αντιγόνα και ΜΗΟ-Ι ήδη 24 ώρες μετά την ακτινοβόληση σε ορισμένες περιπτώσεις και μια σταθερή αύξηση στην έκφραση του γονιδίου παρατηρήθηκε μέχρι και 96 ώρες μετά την ακτινοβόληση. Όπως παρατηρήσαμε σημαντική κυτταρικό θάνατο στις 96 ώρες μετά την ακτινοβόληση, πραγματοποιήσαμε αναλύσεις όλοι περαιτέρω σε 72 ώρες μετά την ακτινοβόληση. Όπως ακτινοθεραπεία μπορεί να δοθεί ως μία μόνο υψηλή δόση (20 Gy) ή ως κλασματοποιημένο δόσεις, εμείς ακτινοβολημένα επιλεγμένες κυτταρικές γραμμές (οι καρκίνου του μαστού κυτταρικές γραμμές ΜϋΑ-ΜΒ-469 και MCF7, καθώς και οι οστεοσαρκώματος κυτταρικές σειρές Saos, HOS, LM5 και 143Β, με 2 Gy ανά ημέρα επί 10 συνεχείς ημέρες. Το πρωτόκολλο αυτό είχε ως αποτέλεσμα σε παρόμοιες αλλαγή της CT-αντιγόνου και MHC-I έκφρασης όπως παρατηρείται με μία μόνο δόση των 20 Gy (Σχήμα S2A, S2B). μία εφάπαξ δόση των 20 Gy χρησιμοποιήθηκε σε όλα τα περαιτέρω πειράματα.

Καθιερωμένες κυτταρικές σειρές καρκίνου εξετέθησαν σε εφάπαξ δόση ακτινοβολίας 20 Gy και την έκφραση του mRNA της CT-αντιγόνα και ΜΗΟ-Ι προσδιορίσθηκε 72 ώρες αργότερα με RT-qPCR. (Α ) καρκίνου του μαστού κυτταρικές γραμμές, (Β) οστεοσαρκώματος κυτταρικές γραμμές, (Γ) καρκίνο του πνεύμονα κυτταρικές σειρές, (D) κυτταρικές σειρές καρκίνου του προστάτη. όλων των τιμών Ct κανονικοποιούνται προς 18S rRNA και τα δεδομένα παρουσιάζονται ως πολλαπλάσια αύξηση της έκφρασης σε ακτινοβολημένα σε σύγκριση με τα αντίστοιχα μη επεξεργασμένα δείγματα. Επειδή πλάσια έκφραση δεν μπορεί να υπολογιστεί για τα γονίδια που είναι

de novo

εκφράζεται κατά την ακτινοβόληση, βάζουμε τα σύμβολα σε αυτές τις περιπτώσεις πάνω από την λεπτή οριζόντια γραμμή στο (Α).

In vitro

γ-ακτινοβολίας up-ρυθμίζει CT-αντιγόνα και μόρια MHC-I στο επίπεδο της πρωτεΐνης

Για να επιβεβαιώσετε την ακτινοβολία που προκαλείται από την έκφραση της CT-αντιγόνα σχετικά με το επίπεδο της πρωτεΐνης, χρωματίσαμε ακτινοβολημένα και μη-ακτινοβολημένα MDA ΜΒ-469 κυττάρων με αντισώματα έναντι ΝΥ-ΕδΟ-1 και CT7 και ανέλυσαν την έκφραση του CT7 και ΝΥ-ΕδΟ-1 σε διαφορετικά χρονικά σημεία μετά την ακτινοβόληση με μικροσκοπία ανοσοφθορισμού και με κηλίδωση Western. Η κυτταρική γραμμή μελανώματος SK-MEL-37 εκφράζει ιδιοσυστατικά ΝΥ-ΕδΟ-1 και CT7 και χρησιμοποιήθηκε ως θετικός έλεγχος. Παρατηρήσαμε την

de novo

έκφραση τόσο των CT-αντιγόνα κατά την ακτινοβολία που αυξήθηκε με τον χρόνο (Σχήμα 2Α, 2Β), επιβεβαιώνοντας έτσι τα δεδομένα που ελήφθησαν από RT-qPCR. Η ακτινοβόληση του φυσιολογικό κύτταρο μαστού γραμμή ΜΟΡ10Α δεν οδήγησε σε αύξηση των επιπέδων NY-ESO-1 ή CT7 πρωτεΐνης (Σχήμα 2Β). Για να μελετηθεί η επίδραση της γ-ακτινοβολίας στην επιφάνεια έκφραση του MHC-I στο επίπεδο πρωτεΐνης, μπορούμε ακτινοβολημένα πολλαπλές καρκινικές κυτταρικές σειρές (καρκινώματος του μαστού και οστεοσάρκωμα) και φυσιολογικά πρωτογενή κύτταρα διαφόρων προελεύσεων, που ακολουθείται από κυτταρομετρίας ροής ανίχνευση της επιφανείας MHC-I , και παρατήρησε ότι η ακτινοβόληση οδήγησε σε εξαρτώμενη από το χρόνο αύξηση του ΜΗΟΙ επιφανειακή έκφραση σε διαφορετικές κυτταρικές γραμμές καρκίνου (Σχήμα 2C, 2D), αλλά όχι στα φυσιολογικά πρωτογενή κύτταρα (Σχήμα S1B).

(Α) Ανοσοφθορισμός του MDA-MB-469 και τα κύτταρα εκτίθενται σε μια μόνο δόση ακτινοβόλησης 20 Gy και χρωματίστηκαν με αντισώματα έναντι ΝΥ-ΕδΟ-1 και CT7 σε διαφορετικά χρονικά σημεία μετά την ακτινοβόληση 37 SK-MEL-. (Β) MDA-MB-469, SK-MEL-37 και MCF 10Α κυτταρικές γραμμές εκτέθηκαν σε μία μόνο δόση των 20 Gy και την έκφραση του ΝΥ-ΕδΟ-1 και CT7 αναλύθηκε με κηλίδωση Western 72 ώρες αργότερα. (Γ) του καρκίνου του μαστού και (Δ) κυτταρικές γραμμές οστεοσαρκώματος εξετέθησαν σε εφάπαξ δόση ακτινοβολίας 20 Gy και την έκφραση του HLA-ABC και β

2microglobulin ποσοτικοποιήθηκε σε διαφορετικά χρονικά σημεία μετά την ακτινοβόληση με κυτταρομετρία ροής. RAD: δείχνει γ-ακτινοβολίας

Η

Η ακτινοβολία των καρκινικών κυττάρων ενισχύει την αναγνώριση των κυττάρων Τ

in vitro

Η

Για να καθοριστεί αν η ακτινοβολία που προκαλείται από τα πάνω ρύθμιση. CT-αντιγόνα και τα αποτελέσματα MHC-I σε αυξημένη αναγνώριση από αντιγόνου-ειδικά CD8

+ Τ κύτταρα, μετρήθηκε αποκοκκοποίηση [23] – [24] του ΝΥ-ΕδΟ-1

157-165 /HLA-Α2- ειδικές κλωνοποιημένο CD8

+ Τ κυττάρων μετά από επώαση με ακτινοβολημένα και μη-ακτινοβολημένα HLA-A2

+ MDA-MB-469 κύτταρα καρκίνου του μαστού. MDA-MB-469 κύτταρα είναι αρνητικά για NY-ESO-1, αλλά γίνονται θετικές κατά την ακτινοβολία (Σχήμα 1Α, 2Α, 2Β). Βρήκαμε ότι τα ακτινοβολημένα μόνο MDA-MB-469 κυττάρων που επάγεται αποκοκκίωση των δύο ανεξάρτητων ΝΥ-ΕδΟ-1

157-165-ειδικά CD8

κλώνους + Τ κυττάρων (2A7, 2B5) (Σχήμα 3). Η ακτινοβόληση δεν αύξησε περαιτέρω την αποκοκκοποίηση όταν χρησιμοποιήθηκαν φορτωμένων με πεπτίδιο MDA-MB-469 κύτταρα (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα), υποδεικνύοντας ότι δεν είναι η ποσότητα του MHC-I, αλλά η ποσότητα του ΝΥ-ΕδΟ-1

157-165 παρουσιάζονται με MHC-I ήταν ο περιοριστικός παράγοντας σε μη-ακτινοβολημένα κύτταρα MDA-MB-469, το οποίο ταιριάζει με το γεγονός ότι η ακτινοβολία που προκαλείται

de novo

έκφραση του ΝΥ-ΕδΟ-1 σε MDA-MB-469 κύτταρα (Σχήμα 1Α, 2).

10

6 CFSE-επισημασμένο HLA-A2 + MDA-MB-469 κύτταρα καρκίνου του μαστού είχαν ακτινοβοληθεί ή όχι με μία απλή δόση 20 Gy και επωάστηκαν 72 ώρες αργότερα με 3 × 10

5 NY-ESO-1

157-165 /HLA-A2-ειδικών κλώνων CD8 + Τ κυττάρων (κλώνος 2A7 και ο κλώνος 2Β5) με την παρουσία ΡΕ-επισημασμένο αντι-CD107a-ΡΕ για 4 ώρες στους 37 ° C. Τα κύτταρα στη συνέχεια χρωματίστηκαν με Pacific Blue-επισημασμένο αντι-CD8- για 30 λεπτά στους 4 ° C. Φορτωμένα με πεπτίδιο κύτταρα MDA-MB-469 χρησιμοποιήθηκαν ως θετικός έλεγχος. Όλες οι καλλιέργειες εκτελέσθηκαν εις διπλούν. Η αποκοκκοποίηση μετρήθηκε ως ποσοστό CD107a

+ κύτταρα CD8

+ κυττάρων μετά gating επί CFSE-αρνητικά κύτταρα με κυτταρομετρία ροής.

Η

Ex vivo

ακτινοβόληση των νωπών βιοψίες όγκων επάγει αυξητική ρύθμιση της CT-αντιγόνα και ΜΗΟ-Ι

για να επεκτείνει τα ευρήματα μας σε κλινικά σχετικό υλικό, συλλέξαμε φρέσκο ​​βιοψίες όγκου από 23 διαφορετικούς ασθενείς με καρκίνο, κομμένο σε εκείνους τουλάχιστον 50 μικρά κομμάτια, και τυχαιοποιήθηκαν τους σε δύο πειραματικές ομάδες. Εμείς ακτινοβολείται μία ομάδα βιοψίες με 20 Gy, ενώ οι άλλοι υπηρέτησε ως έλεγχο, και ανέλυσε την έκφραση της CT-αντιγόνα και MHC-I 72 ώρες αργότερα με RT-qPCR και ανοσοϊστοχημεία. Αυτά τα αποτελέσματα επιβεβαίωσαν τα ευρήματα που ελήφθησαν με καρκινικές κυτταρικές σειρές, δηλαδή γ-ακτινοβολία συχνά προκαλούμενη αυξημένη έκφραση της CT-αντιγόνων και /ή MHC-I (Σχήμα 4Α, 4Β, Πίνακας S1). Σημαντικά, τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι ετερογενής έκφραση της CT-αντιγόνων και /ή MHC-I μπορεί να γίνει πιο ομοιογενής επάνω ακτινοθεραπεία, η οποία υποστηρίζει προφανώς ανοσολογικού ελέγχου του όγκου.

Φρέσκα μοσχεύματα όγκου από διαφορετικούς ασθενείς με καρκίνο (n = 23) έχουν ακτινοβοληθεί ή όχι με εφάπαξ δόση 20 Gy. Η διάγνωση των μεμονωμένων ασθενών παρουσιάζεται στον Πίνακα συμπληρωματική S1. (Α) Μετά από 72 ώρες, τα ακτινοβολημένα και ελέγχου μοσχεύματα αναλύθηκαν για την έκφραση του ΝΥ-ΕδΟ-1 και MHC-I με RT-qPCR. (Β) Αντιπροσωπευτικές τομές (αριθμός ασθενών 9 και 20) που απεικονίζει την έκφραση του ΝΥ-ΕδΟ-1 και MHC-I με ανοσοϊστοχημεία (20Χ μεγέθυνση). NR σημαίνει μη ακτινοβολούμενη και RAD υποδηλώνει αντίστοιχες ακτινοβολημένα τμήματα.

Η

In vivo

ακτινοβόληση των αποτελεσμάτων ανθρώπινου σαρκώματος σε αυξημένη έκφραση της CT-αντιγόνα και ΜΗΟ-Ι και σε διείσδυση λεμφοκυττάρων

Τέλος, συγκρίναμε την έκφραση της CT-αντιγόνα, MHC-Ι και τη διείσδυση από λεμφοκύτταρα σε 15 ζεύγη παραφίνη τομές που λαμβάνονται από ασθενείς σάρκωμα πριν και μετά την ακτινοθεραπεία με ανοσοϊστοχημεία. Βρήκαμε ότι ακτινοθεραπεία οδήγησε σε σημαντική προς τα πάνω ρύθμιση ή

de novo

έκφραση της CT-αντιγόνων ή /και μορίων MHC-I, η οποία συνοδεύτηκε από αυξημένη διείσδυση από λεμφοκύτταρα και έκφραση γρανζύμου σε 7/15 και 12 /15 δείγματα, αντίστοιχα (Σχήμα 5Α-Δ πίνακας S2, S3).

εγκλεισμένα σε παραφίνη τομές ιστών ζεύγη που λαμβάνονται από ασθενείς σάρκωμα (n = 15) πριν και μετά την ακτινοβολία αναλύθηκαν με ανοσοϊστοχημεία για το (Α) παρουσία CD8

+, CD4

+ και γρανζύμου

+ κύτταρα, (Β) έκφραση του CT7, ΝΥ-ESO-1 και CT10 και (C) MHC-I έκφραση. Οι CT-αντιγόνα βαθμολογήθηκαν ως το μέσο ποσοστό των ζωντανών κυττάρων που εκφράζουν το αντιγόνο με το συνολικό αριθμό των κυττάρων σε πέντε πεδία υψηλής ισχύος (στόχος 40Χ). Η διήθηση με λεμφοκύτταρα ελήφθη ως μέσος όρος με μέτρηση του αριθμού των κυττάρων που εκφράζουν CD4, CD8 και γρανζύμου σε πέντε πεδία υψηλής ισχύος, και MHC-I βαθμολογήθηκε με βάση την ένταση της χρώσης. (D) Αντιπροσωπευτικές τομές που δείχνει την έκφραση της CT-αντιγόνα και ΜΗΟ-Ι και διήθηση των λεμφοκυττάρων πριν και μετά την ακτινοθεραπεία με ανοσοϊστοχημεία. Που απεικονίζονται είναι: ασθενής F για την έκφραση του CT7, ασθενής Α για CT10, K ασθενή για NY-ESO-1, ασθενής Δ για CD4 και ΜΗΟ-Ι και Ε ασθενή για έκφραση CD8. NR σημαίνει μη-ακτινοβολούμενη και RAD δείχνει αντίστοιχη ακτινοβολημένα τμήματα. Pt: δείχνει τον αριθμό των ασθενών. η ενημέρωση του ασθενούς είναι εισηγμένη στο συμπληρωματικό πίνακα S2.

Η

Άλλες μορφές στρες δεν έχουν καμία επίδραση στην έκφραση της CT-αντιγόνα ή MHC-I

in vitro

Η

το άγχος και περιβαλλοντικές μεταβολές προκαλέσει αλλαγές στο μεταγραφικό προφίλ, προκειμένου να αντιμετωπίσουν αυτές τις επιθέσεις [25], [26], [27]. Όπως ακτινοβολία επάγει βλάβη του DNA, διερευνήσαμε κατά πόσον η επάνω ρυθμισμένη έκφραση των MHC-I και CT-αντιγόνα θα εμφανίζονται επίσης μετά την έκθεση των κυτταρικών γραμμών σε άλλες θεραπείες που επάγουν βλάβη του DNA, όπως η σισπλατίνη, ετοποσίδη και μπλεομυκίνη ραδιομιμητικού φαρμάκου. MDA-MB-469 και SK-MEL-37 κύτταρα κατεργάστηκαν χωριστά με καθένα από τους παράγοντες βλάβης του DNA και RNA επίπεδα παρακολουθήθηκαν σε διαφορετικά χρονικά σημεία μετά τη θεραπεία. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι κανένας από αυτούς τους παράγοντες επάνω ρυθμισμένη την έκφραση της CT-αντιγόνα και ΜΗΟ-Ι (Σχήμα S3b-D). Ωστόσο, τα γονίδια σήμα κατατεθέν pS15-p53 και Fanc-D2 ήταν πάνω ρυθμισμένα μετά τη θεραπεία, υποδεικνύοντας ότι αυτοί οι παράγοντες που προκαλείται στρες στη συγκέντρωση που χρησιμοποιήθηκε (Σχήμα S3A). Επιπλέον, ελέγξαμε το εάν άλλοι τύποι στρες σχετίζονται με τον καρκίνο, συμπεριλαμβανομένων αυξημένες θερμοκρασίες ή χαμηλά επίπεδα οξυγόνου, που προκαλείται από αυξημένη έκφραση της CT-αντιγόνων και /ή MHC-I. Βρήκαμε ότι καμία από αυτές τις θεραπείες επηρέασε την έκφραση της CT-αντιγόνα και MHC-I, ενώ το γονίδιο υπογραφή CA9 ήταν ρυθμισμένα προς τα πάνω (Σχήμα S4A, S4B). Μαζί, αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η αυξημένη έκφραση της CT-αντιγόνα και ΜΗΟ-Ι με καρκινικές κυτταρικές σειρές είναι μια συγκεκριμένη απάντηση σε γ-ακτινοβολία και δεν παρουσιαστεί μετά έκθεση σε άλλους επαγωγείς διαφόρων οδών αντίδραση στο στρες.

Τα μονοπάτια σηματοδότησης ΑΤΜ και ϋΝΑ-ΡΚ είναι επουσιώδεις για γ-ακτινοβολία επαγόμενη έκφραση της CT-αντιγόνα και ΜΗΟ-Ι

η ενεργοποίηση των οδών οδοφράγματος επιδιόρθωσης του DNA-ζημιά ως απάντηση σε γενοτοξικό προσβολή βοηθά στη διατήρηση της γονιδιωματική ακεραιότητα σε κύτταρα θηλαστικών [28]. βλάβη του DNA πυροδοτεί την ενεργοποίηση διαφόρων κινασών σερίνης /πρωτεΐνης θρεονίνης, οι οποίες αποτελούν τα πρωτογενή μετατροπείς στον καταρράκτη σηματοδότησης και της οποίας, αταξία τηλαγγειεκτασία μεταλλαγμένη (ΑΤΜ) και DNA-εξαρτώμενες κινάσες πρωτεΐνης (DNA-PKcs) είναι υψίστης σημασίας [29] . Η πρωτεϊνική κινάση ΑΤΜ είναι ένα κρίσιμο ενδιάμεσο σε μια σειρά κυτταρικών αποκρίσεων σε γ-ακτινοβολία και άλλες μορφές στρες [30]. έτσι Ερευνήσαμε αν η αυξητική ρύθμιση του CT-αντιγόνου και έκφραση ΜΗΟ-Ι σε απόκριση σε γ-ακτινοβολία εξαρτάται από την ενεργοποίηση των ΑΤΜ ή /και DNA-PKcs.